DE102006055990A1

DE102006055990A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Messung biologischer und elektronischer Eigenschaften einer Probe

Info

Publication number: DE102006055990A1
Application number: DE200610055990
Authority: DE
Inventors: Sven Dr. Ingebrandt; Norbert Wolters; Günter Dr. Wrobel; Herbert Dr. Bousack; Andreas Dr. Offenhäusser
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2006-11-24
Filing date: 2006-11-24
Publication date: 2008-05-29
Also published as: WO2008061489A1; EP2092319A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Messung biologischer Eigenschaften einer Probe, wobei die Probe mit dem Gate eines Feldeffekttransistors kontaktiert ist. Erfindungsgemäß ist vorgesehen, dass die Probe mit einer Wechselspannung beaufschlagt wird. Es hängt dann von der Beschaffenheit der Probe ab, inwieweit Ladungen auf das Gate übertragen werden. Das Vorhandensein derartiger Ladungen ist über den Feldeffekttransistor, beispielsweise durch einen Source-Drain-Strom, abfragbar. Mit der Erfindung kann die Antwort einer biologischen Probe auf eine Wechselspannung stromlos und daher sehr viel empfindlicher gemessen werden als durch Impedanzmessungen nach dem Stand der Technik, bei denen kleine Ströme zu messen sind. Es sind Untersuchungen an Einzelzellen oder auch Teilen von Zellen möglich, wo nach dem Stand der Technik ein ausreichend großes Signal nur an Zellverbünden mit vielen Zellen erzielt werden konnte.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Messung biologischer und elektronischer Eigenschaften einer Probe.
Stand der Technik
Biologische Eigenschaften zellulärer Proben werden auf elektrischem Weg unter anderem mit Impedanzsensoren gemessen. Dabei fließt zwischen einer Referenzelektrode und einer Arbeitselektrode ein kleiner Wechselstrom. Das Bewachsen der Arbeitselektrode mit einer biologischen Probe ändert den Wechselstromwiderstand des Systems (Impedanz) und damit den durch die Anordnung fließenden Strom. Diese Änderung wird gemessen. Eine derartige Messanordnung ist beispielsweise aus dem US-Patent 5,187,096 bekannt.
Nachteilig werden mit einer fortschreitenden Miniaturisierung der Elektroden und der Proben die zu messenden Ströme immer kleiner. Daher werden höhere Messfrequenzen notwendig, bei denen wiederum parasitäre Effekte der Zuleitungen und externe Störungen einen immer größeren Einfluss gewinnen. Dann reicht das Signal-Rausch-Verhältnis zur Untersuchung von einzelnen Zellen oder gar Teilen davon gegebenenfalls nicht aus.
Aufgabe und Lösung
Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, die Messung biologischer und elektronischer Eigenschaften einer Probe auf elektrischem Weg mit einem besseren Signal-Rausch-Verhältnis zu ermöglichen als dies nach dem Stand der Technik möglich ist.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Vorrichtung gemäß Hauptanspruch und ein Verfahren gemäß Nebenanspruch. Die Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ist Gegenstand eines weiteren Nebenanspruchs. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich jeweils aus den darauf rückbezogenen Unteransprüchen.
Gegenstand der Erfindung
Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst einen Feldeffekttransistor mit Kontaktierungsmitteln zur Kontaktierung der Probe mit dem Gate des Feldeffekttransistors.
Als Feldeffekttransistoren sind beispielsweise nicht-metallisierte open-gate Feldeffekttransistoren, insbesondere sogenannte innen-selektive Feldeffekttransistoren (ISFETs), metallisierte oder nicht metallisierte floating-gate Feldeffekttransistoren, metallisierte oder nicht metallisierte Nano-Feldeffekttransistoren, Carbon-Nano-Tube-Feldeffekttransistoren oder metallisierte oder nicht metallisierte Nanowires geeignet.
Als Kontaktierungsmittel ist jedes elektrisch leitende Element geeignet, welches mit dem Gate des Feldeffekttransistors verbunden ist und in Kontakt mit der Probe gebracht werden kann. Vorzugsweise werden hierzu wässrige Messlösungen oder Hydrogele bzw. Polyelektrolyte verwendet. Insbesondere kann die Gateelektrode selbst als Kontaktierungsmittel vorgesehen sein, auf dem die Probe unmittelbar aufgebracht werden kann.
Erfindungsgemäß sind Stimulationsmittel zur Beaufschlagung der Probe mit einer Wechselspannung vorgesehen. Diese Stimulationsmittel umfassen vorteilhaft eine in ein flüssiges oder gelförmiges Kontaktierungsmittel eingebrachte Referenzelektrode, wie beispielsweise einen chlorierten Silberdraht (Ag/AgCl-Elektrode), eine elektrochemische Referenzelektrode, einen Metalldraht, eine metallisierte Oberfläche einer Mikrofluidik-Kammer oder vorzugsweise mindestens eine auf dem Chip, welcher den Feldeffekttransistor beherbergt, integrierte Referenzelektrode. Es sind aber auch Stimulationsmittel geeignet, die unmittelbar auf die Probe aufgebracht oder in sie eingeführt sind, wie beispielsweise Patch-Clamps oder Intrazellularelektroden.
Da die Probe elektrisch zumindest teilweise zwischen die Stimulationsmittel und das Gate des Feldeffekttransistors geschaltet ist, hängt es von den jeweils konkreten Beschaffenheiten der Probe ab, inwieweit eine angelegte Wechselspannung zu einer Beaufschlagung des Gates mit einem Potential führt. Beispielsweise ändert die Probe die Eingangsimpedanz des Feldeffekttransistors. Die Ladungen, die das Potential am Gate hervorrufen, müssen nicht auf dem Gate konzentriert sein, sondern können beispielsweise auch auf dem Kontaktierungsmittel oder auf der damit kontaktierten Probe sitzen.
Das am Gate vorhandene Potential lässt sich mit Hilfe des Feldeffekttransistors direkt oder indirekt messen, vorzugsweise über die Stärke eines Stroms, der durch die Source-Drain-Strecke des Feldeffekttransistors fließt. Dieser Strom fließt nicht durch die Probe, da die Source-Drain-Strecke in einem Feldeffekttransistor vom Gate isoliert ist. Eine Änderung des Potentials auf dem Gate führt dann zu einer um den Verstärkungsfaktor des Feldeffekttransistors höheren Änderung des Stroms.
Es wurde erkannt, dass sich mit einer derartigen Vorrichtung die Antwort einer biologischen Probe auf eine angelegte Wechselspannung vorteilhaft ohne Stromfluss durch die Probe messen lässt. Nach dem US-Patent 5,187,096 wurde diese Antwort über die Impedanz der Probe gemessen, wobei ein sehr kleiner Strom floss. Dieser Strom floss in der Regel zumindest teilweise durch die Probe. Es wurde erkannt, dass die messtechnischen Schwierigkeiten bei der Messung dieser sehr kleinen Ströme der begrenzende Faktor für das Signal-Rausch-Verhältnis und damit auch für die Empfindlichkeit bei der Messung sehr kleiner Proben waren. Dies galt umso mehr, je länger die Wege waren, die der Strom bis zum ersten Messverstärker zurücklegen musste. Erfindungsgemäß wird die Antwort der Probe unmittelbar am Ort ihrer Entstehung durch den Feldeffekttransistor verstärkt. Die Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist damit groß genug, um Messungen an Einzelzellen, aber auch an Teilbereichen von Zellen oder auch nur Zellfragmenten, Zellmembranen, künstlichen Modellmembranen, Proteinen oder Biomolekülen durchführen zu können.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist ein Messinstrument zur Messung von Amplitude und Phase eines durch die Source-Drain-Strecke des Feldeffekttransistors fließenden Stroms vorgesehen, der hierzu vorzugsweise in einer ersten Verstärkerstufe mittels geeigneter Elektronik in eine Ausgangsspannung (V_out) gewandelt wird. Der Zeitverlauf dieser Größen enthält eine Faltung der Impedanz der Probe mit der Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors.
Unter der Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors im Sinne dieser Erfindung wird insbesondere der Frequenzgang eines durch die Source-Drain-Strecke fließenden Stroms oder einer davon abgeleiteten Größe in Abhängigkeit der Frequenz der Wechselspannung verstanden.
Ist diese Übertragungsfunktion bekannt, beispielsweise aus einer Messung ohne Probe, lässt sich die Faltung invertieren und die Impedanz der Probe durch Entfaltung ermitteln. Die Impedanz ist in der Biologie eine gängige Messgröße, so dass die Möglichkeit der Vorrichtung, diese zu bestimmen, die Vergleichbarkeit der Messergebnisse mit den Ergebnissen anderer Versuche deutlich erhöht.
In einer weiteren besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist das Messinstrument frequenzselektiv. Im einfachsten Fall kann dann lediglich der Strom gemessen werden, der die gleiche Frequenz hat wie die Wechselspannung, mit der die Probe beaufschlagt wird. Dies vermindert den Einfluss äußerer Störungen. Es ist mit einem frequenzselektiven Messinstrument aber auch möglich, auch simultan, auf anderen Frequenzen als der Frequenz der angelegten Wechselspannung zu messen. Insbesondere ist es möglich und sinnvoll, auf einem diskreten oder kontinuierlichen Spektrum von Frequenzen zu messen. Dann ist es insbesondere möglich, langsamere biologische Effekte zu verfolgen, die mehrere Frequenzkomponenten des Stroms verändern.
Ein Beispiel für derartige langsame biologische Effekte sind extrazelluläre Spannungen, die mit oder ohne äußere Stimulation an biologischen Zellen auftreten können. Diese Spannungen beaufschlagen das Gate des Feldeffekttransistors ebenfalls mit einem Potential. Die extrazellulären Spannungen ändern sich nur sehr langsam im Vergleich zu den typischen Frequenzbereichen, die zur Impedanzanalyse genutzt werden. Sie bewirken daher im durch die Source-Drain-Strecke fließenden Strom einen Anteil, der näherungsweise als Gleichstromanteil angesehen werden kann. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und hier insbesondere mit dem frequenzselektiven Messinstrument ist es möglich, die elektrische Aktivität der Probe und deren Antwort auf die Wechselspannung zeitgleich und unter Verwendung ein und desselben Feldeffekttransistors zu messen. Es kann auch ein und dasselbe Instrument, wie beispielsweise ein Lock-In-Verstärker, zur simultanen Messung von Amplitude und Phase bei verschiedenen Messfrequen zen vorgesehen sein. Ein Lock-In-Verstärker eignet sich insbesondere, um gleichzeitig einen Signalanteil mit einer bestimmten Messfrequenz und einen Signalanteil, der im Vergleich zu dieser Frequenz näherungsweise als Gleichstromanteil angesehen werden kann, zu charakterisieren. Es kann aber auch ein passiver Tiefpassfilter vorgesehen sein, um einen derartigen gleichstromähnlichen Anteil des Signals abzutrennen.
Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Anordnung umfasst zusätzlich Anregungsmittel zur Beaufschlagung der Probe mit einer weiteren elektrischen Spannung.
Unter Anregungsmitteln im Sinne dieser Erfindung werden solche Mittel verstanden, die die Probe mit einer ausreichend hohen Spannung in einer Weise beaufschlagen können, dass dadurch eine biologische Reaktion in der Probe hervorgerufen wird.
Als ein solches Mittel ist beispielsweise eine Patch-Clamp-Anordnung oder eine Intrazellularelektrode geeignet. Mit diesen Anregungsmitteln kann die mit der Vorrichtung messbare elektrische Aktivität der Probe unabhängig von einer laufenden erfindungsgemäßen Messung der sonstigen biologischen Eigenschaften stimuliert werden.
Vorteilhaft können Mittel zur Durchführung weiterer simultaner Messungen, wie beispielsweise Amperometrie, Voltammetrie, Coulombmetrie, Gravimetrie, Optometrie, Hallmessung, Atomic-Force Mikroskopie (AFM), Lichtmikroskopie, Temperatur-Sprungverfahren, Kalorimetrie oder 2-, 3- beziehungsweise 4-Polmessung, vorgesehen sein,.
Vorteilhaft umfasst die Anordnung mindestens einen weiteren Feldeffekttransistor, der insbesondere identisch zum ersten Feldeffekttransistor aufgebaut sein kann. Dann kann dieser genutzt werden, um die Übertragungsfunktion des Feldeffekt transistors als solcher (ohne Probe) sowie insbesondere die typische Drift des Ausgangssignals entweder zum Zweck einer späteren Signalverarbeitung zu ermitteln oder von vornherein durch differenzielle Messung mit dem Messsignal zu verrechnen. Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn beabsichtigt ist, die Impedanz der Probe durch Entfaltung zu bestimmen. Hierzu ist es insbesondere vorteilhaft, wenn der weitere Feldeffekttransistor elektrisch von der Probe isoliert ist. Die Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors ist beispielsweise von der Eingangsimpedanz des Feldeffekttransistors abhängig. Jegliche Änderungen der Impedanz der Strecke zwischen den Stimulationsmitteln und dem Gate des Feldeffekttransistors ändern dabei die Eingangsimpedanz des Feldeffekttransistors.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung umfasst die Vorrichtung Mittel zur Kontaktierung mehrerer Feldeffekttransistoren mit derselben Probe. Sind diese Mittel beispielsweise in einem Array von mindestens 2 bis zu mehreren Tausend Feldeffekttransistoren angeordnet, können beispielsweise viele Proben simultan vermessen werden. Es können aber auch ortsaufgelöste Messungen an einer ausgedehnten Probe durchgeführt werden. Beispielsweise kann die Antwort verschiedener Funktionsbereiche einer Zelle auf die Wechselspannung simultan studiert werden. Dies ist dem Umstand geschuldet, dass sich Feldeffekttransistoren herstellen lassen, die deutlich kleiner als eine Zelle sind. Typische Grössen biologischer Zellen sind 2 mm Durchmesser (Oozyten) bis zu 1 μm (Bakterien). Nanowires als kleinste vorstellbare Feldeffekttransistoren weisen typischerweise Durchmesser bis zu 10 nm auf.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung umfassen die Stimulationsmittel ein Flüssigkeitsreservoir. Ein solches Reservoir lässt sich beispielsweise herstellen, indem auf einen Chip, der den Feldeffekttransistor enthält, Glasringe feuchtigkeitsdicht aufgeklebt werden. Es können aber auch Einfräsungen oder Bohrungen in die Chip-Verkapselung feuchtigkeitsdicht eingebracht werden, so dass eine kleine Kulturschale mit Volumina von bevorzugt größer 0,1 μl, besonders bevorzugt größer 10 μl und ganz besonders bevorzugt von größer 100 μl entsteht. Das Reservoir sollte so groß sein, dass die Probe, der Feldeffekttransistor und die als Stimulationsmittel dienende Referenzelektrode vollständig benetzt sind.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführung der Erfindung ist das Flüssigkeitsreservoir geschlossen. Es kann einen Zu- bzw. einen Ablauf aufweisen (Mikrofluidik). Das Volumen sollte hierbei mindestens so groß sein, dass die Probe und die Referenzelektrode benetzt sind. Dadurch ist es möglich beispielsweise Zellgifte in steigenden Gradienten der Probe zuzuführen. Ebenso ist es vorteilhaft möglich, zwischen unterschiedlichen Substanzen innerhalb kürzester beziehungsweise definierter Zeiträume hin- und herzuschalten bzw. Sequenzen unterschiedlicher Fluide der Probe zuzuführen. Durch die Verwendung mikrofluidischer Systeme werden die zur Messung benötigten Volumina weiter verringert.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung umfassen die Kontaktierungsmittel ein Flüssigkeitsreservoir, welches insbesondere mit dem Reservoir identisch sein kann, das bereits Teil der Stimulationsmittel ist. Die Kontaktierung über eine Flüssigkeit ist einfach handhabbar, über die chemische Zusammensetzung der Flüssigkeit regelbar sowie rückstandsfrei wieder zu lösen.
Ein von den Stimulations- oder Kontaktierungsmitteln umfasstes Flüssigkeitsreservoir ist vorteilhaft mit einem Elektrolyten gefüllt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Messung biologischer Eigenschaften einer Probe sieht vor, die Probe mit einer Wechselspannung zu beaufschlagen. Dabei tauscht die Probe Ladungen mit dem Gate eines Feldeffekttransistors (FET) aus. Eine vom Potential am Gate des Feldeffekttransistors abhängige primäre physikalische Messgröße wird gemessen. Dabei führt eine Änderung des Potentials am Gate zu einer um einen Verstärkungsfaktor höheren Änderung der primären physikalischen Messgröße. Es kann insbesondere ein durch die Source-Drain-Strecke des Feldeffekttransistors fließender Strom als primäre physikalische Messgröße gemessen werden, wobei der Verstärkungsfaktor der übliche Verstärkungsfaktor des Feldeffekttransistors ist. Der Verstärkungsfaktor wird beispielsweise dadurch beeinflusst, dass die Probe die Eingangsimpedanz des Feldeffekttransistors ändert.
Die Frequenz der Wechselspannung, mit der die Probe beaufschlagt wird, liegt bevorzugt zwischen 0,1 Hz und 1 GHz, besonders bevorzugt zwischen 1 Hz und 100 MHz und ganz besonders bevorzugt zwischen 1 Hz und 10 MHz. Bei diesen Frequenzen sind die erwarteten Messeffekte am größten.
Die Amplitude der Wechselspannung, mit der die Probe beaufschlagt wird, liegt bevorzugt zwischen 0,001 mV und 10 V, besonders bevorzugt zwischen 0,1 mV und 1 V und ganz besonders bevorzugt zwischen 1 mV und 100 mV. Die Amplitude sollte so groß sein, dass eine ausreichende Übertragung und Verstärkung für den jeweils verwendeten Feldeffekttransistor gewährleistet ist. Eine Obergrenze ist bei einer eventuellen Beeinflussung bis hin zur Zerstörung der Probe durch eine Wechselspannung mit zu hoher Amplitude erreicht.
Die Amplitude der Wechselspannung wird vorteilhaft während der Messung konstant gehalten. Es ist aber auch möglich, etwa bei konstanter Frequenz der Wechselspannung die Amplitude zu variieren und somit im Hinblick auf die Amplitude Spektroskopie zu betreiben.
Es wurde erkannt, dass mit diesem Verfahren die Antwort einer biologischen Probe auf eine angelegte Wechselspannung ohne Stromfluss durch die Probe gemessen werden kann. Nach dem genannten Stand der Technik wurde diese Antwort über die Impedanz der Probe gemessen, wobei ein sehr kleiner Strom zumindest teilweise durch die Probe floss. Es wurde erkannt, dass die messtechnischen Schwierigkeiten bei der Messung dieser sehr kleinen Ströme der begrenzende Faktor für das Signal-Rausch-Verhältnis und damit auch für die Empfindlichkeit bei der Messung sehr kleiner Proben waren. Dies galt umso mehr, je länger die Wege waren, die der Strom bis zum ersten Messverstärker zurücklegen musste. Erfindungsgemäß wird die Antwort der Probe unmittelbar am Ort ihrer Entstehung durch den Feldeffekttransistor verstärkt. Die Empfindlichkeit ist damit groß genug, um Messungen an biologischen Proben wie Einzelzellen, Teilbereichen von Zellen, Zellfragmenten, Zellmembranen, künstlichen Modellmembranen, Proteinen oder Biomolekülen durchführen zu können.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird die Probe mit Wechselspannungen verschiedener Frequenzen beaufschlagt. Die Antwort einer Probe auf eine Wechselspannung ist im Allgemeinen frequenzabhängig. Aus dieser Frequenzabhängigkeit lassen sich biologische Eigenschaften der Probe ableiten.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden Amplitude und Phase der primären physikalischen Messgröße gemessen. Der Zeitverlauf dieser Größen enthält eine Faltung weiterer Kenngrößen der Probe mit der Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors.
Vorteilhaft wird der Zeitverlauf von Amplitude und Phase der primären physikalischen Messgröße über zwischen 1 und 100, bevorzugt zwischen 3 und 30 sowie besonders bevorzugt zwischen 5 und 10 Schwingungen der angelegten Wechselspannung gemessen. Diese Zeit stellt regelmäßig einen Kompromiss zwischen der notwendigen Messzeit und dem Informationsgehalt für die spätere Auswertung, beispielsweise zur Bestimmung der Impedanz, dar.
Vorteilhaft werden der Zeitverlauf der primären physikalischen Messgröße und die Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors zur Ermittlung weiterer Kenngrößen der Probe verarbeitet. Beispielsweise kann der Zeitverlauf der primären physikalischen Messgröße eine Faltung einer solchen Kenngröße mit der Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors darstellen. Sofern die Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors bekannt ist, beispielsweise durch eine vorherige Messung ohne Probe, kann die gesuchte Kenngröße dann durch eine Entfaltung, also eine Inversion des Faltungsprozesses, aus dem aufgenommenen Zeitverlauf erhalten werden. Die Übertragungsfunktion kann aber auch bereits während der Messung zumindest teilweise mit dem Zeitverlauf der primären physikalischen Messgröße verrechnet werden, beispielsweise, indem diese mit einem zweiten, nicht direkt mit der Probe kontaktierten Feldeffekttransistor differenziell gemessen wird, der vorzugsweise benachbart zum ersten Feldeffekttransistor angeordnet ist, beispielsweise im selben Array. Die Kenngröße kann aber beispielsweise auch ermittelt werden, indem ein die Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors enthaltendes mathematisches Modell des Zeitverlaufs der primären physikalischen Messgröße, welches die gesuchte Kenngröße als Parameter enthält, unter Variation dieses Parameters an den aufgenommenen Zeitverlauf gefittet wird. Diese Maßnahmen zur Verarbeitung des Zeitverlaufs der primären physikalischen Messgröße und der Übertragungsfunktion haben die Wirkung, dass die Übertragungsfunktion quasi aus dem Zeitverlauf herauskorrigiert wird.
Insbesondere kann aus der primären physikalischen Messgröße die Impedanz der Probe ermittelt werden, beispielsweise durch die oben beschriebene Verrechnung des Zeitverlaufs der primären Messgröße mit der Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors. Die Bestimmung der Impedanz mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhöht die Vergleichbarkeit der Messergebnisse mit den Ergebnissen anderer Versuche deutlich.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird eine weitere sekundäre physikalische Messgröße gemessen. Diese Messgröße stellt vorteilhaft ein Maß für eine elektrische Aktivität der Probe dar, die wiederum vorteilhaft Rückschlüsse auf die biologische Aktivität zulässt. Die elektrische Aktivität kann beispielsweise eine extrazelluläre Spannung sein, die entweder spontan oder als Reaktion auf die Beaufschlagung mit der Wechselspannung an der Probe anliegt. Die elektrische Aktivität der Probe und ihre Antwort auf die Wechselspannung werden vorteilhaft mit ein und demselben Feldeffekttransistor gemessen, was Fehler durch Abweichungen in den Eigenschaften verschiedener Transistoren vermeidet.
Vorteilhaft wird die Probe zur Stimulation elektrischer Aktivität mit einer weiteren elektrischen Spannung beaufschlagt, beispielsweise durch eine weitere externe Spannungsquelle, wie beispielsweise durch eine Kontaktierung mittels Patch-Clamp-Technik oder Intrazellular-Elektroden. Die weitere elektrische Spannung kann aber auch vorteilhaft gemeinsam mit der Wechselspannung angelegt werden, beispielsweise, indem die Wechselspannung auf eine Gleichspannung als weitere elektrische Spannung aufmoduliert wird.
Die sekundäre physikalische Messgröße kann beispielsweise ein im Vergleich zur Frequenz der Wechselspannung niederfrequenter Anteil des durch die Source-Drain-Strecke des Feldeffekttransistors fließenden Stroms sein. Dieser kann nähe rungsweise als Gleichstromanteil betrachtet werden.
Vorteilhaft können die primäre und die sekundäre physikalische Messgröße gleichzeitig gemessen werden. Dies ist besonders dann vorteilhaft, wenn die primäre physikalische Messgröße der durch die Source-Drain-Strecke des Feldeffekttransistors fließende Strom und die sekundäre physikalische Messgröße ein niederfrequenter, näherungsweise als Gleichstromanteil zu betrachtender Anteil dieses Stroms ist. Dann kann vorteilhaft ein Lock-In-Verstärker als Messinstrument gewählt werden.
Generell ist es vorteilhaft, den durch die Source-Drain-Strecke des Feldeffekttransistors fließenden Strom, oder allgemein die primäre physikalische Messgröße, bei anderen Frequenzen zu messen als der Frequenz der Wechselspannung. Insbesondere ist es vorteilhaft, ein Frequenzspektrum des Stroms, oder allgemein der primären physikalischen Messgröße, aufzunehmen. Aus diesem lässt sich dann der Strom bei der Frequenz der Wechselspannung als primäre physikalische Messgröße extrahieren. Als sekundäre physikalische Messgröße lassen sich niederfrequente Anteile extrahieren. Viele langsame biologische Effekte, wie beispielsweise extrazelluläre Aktivitäten, ändern den Strom bei mehreren Frequenzen, die niedrig im Vergleich zur Frequenz der Wechselspannung sind. Sie sind auf diese Frequenzen aufmoduliert, analog zu den Signalen in der Nachrichtentechnik, die auf Trägerfrequenzen aufmoduliert sind.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird eine Probe gewählt, die mehrere interagierende biologische Proben umfasst, wie beispielsweise mehrere Biomoleküle oder eine Zelle und ein auf diese Zelle wirkender Stoff, wobei dieser Stoff beispielsweise ein Protein oder auch ein chemischer Wirkstoff sein kann. Dann kann vorteilhaft die biologische Wirkung dieser Interaktion studiert werden. Bei spielsweise kann zunächst nur eine biologische Probe vorhanden sein und die andere Probe während der Messung hinzudosiert werden. So lassen sich zum Beispiel biomolekulare Bindungsreaktionen zwischen einem Antigen und dem dazugehörigen Antikörper studieren. Ebenso lassen sich Zellmembranen vor, während und nach der Zugabe biologischer oder künstlicher membrangängiger Proteine, wie beispielsweise Antibiotika, untersuchen.
Zur Manipulation der Probe, insbesondere zu ihrer Kontaktierung mit den Kontaktierungs- und/oder Stimulationsmitteln, können beispielsweise mikromechanische, optische und elektrokinetische Verfahren verwendet werden. Weitere mögliche Messmethoden wären z.B. Amperometrie, Voltammetrie, Coulombmetrie, Gravimetrie, Optometrie, Hallmessung, Atomic-Force Mikroskopie (AFM), Lichtmikrospkopie, Temperatur-Sprungverfahren, Kalorimetrie oder 2-, 3- beziehungsweise 4-Polmessung.
Vorteilhaft wird die Probe auf einen elektrisch mit dem Gate verbundenen Träger aufgebracht. Dieser Träger kann vorteilhaft aus einem Material bestehen, das gegen die in der Probe enthaltenen Substanzen beständiger ist als das Gate. Dann kann auch eine Probe gewählt werden, die das Gate selbst beispielsweise chemisch modifizieren würde. Zudem kann der Träger in beliebiger Weise mit der Probe präpariert und erst unmittelbar vor der Messung mit dem Gate verbunden werden. Die Verbindung des Trägers mit dem Gate kann vorteilhaft lösbar ausgestaltet sein. Dann können beispielsweise mehr Proben auf Trägern bevorratet werden als Feldeffekttransistoren zur Verfügung stehen.
Beispielsweise können Zellen, Biomoleküle, Proteine oder Teile davon in einer Suspension aufgebracht werden, die ein Nährmedium aufweisen kann. Die zu vermessenden Bestandteile setzen sich dann durch ihre Masse in der Lösung auf dem Bo den ab und adhärieren auf der Oberfläche des Trägers. Bereits dieser Vorgang der Adhäsion kann nach der elektrischen Verbindung des Trägers mit dem Gate analysiert werden.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung wird ein Träger mit Haftmitteln gewählt, die die Anhaftung der Probe unterstützen. Als Haftmittel sind beispielsweise Linker-Moleküle geeignet, die chemisch mit dem Träger und der Probe reagieren. Es sind aber auch beispielsweise Proteine, wie etwa Fibronectin, Polylysin, Laminin oder andere Proteine geeignet. Die Wahl eines Trägers mit Haftmittel ist insbesondere vorteilhaft, wenn die Probe Zellmembranen oder künstliche Lipidmembransysteme enthält. Dabei können die Membranen mit unterschiedlichen Methoden auf den Träger transferiert werden, wie beispielsweise durch selbstorganisierte Bildung von Monolagen, durch schichtweise Membranabscheidung oder als Langmuir-Film.
In einer weiteren besonders vorteilhaften Ausgestaltung wird ein Träger gewählt, auf dem die Haftmittel lateral strukturiert sind. Dann kann beispielsweise die Wanderung von Zellen entlang der lateralen Strukturen, die beispielsweise Linien oder Knoten umfassen können, beobachtet werden.
Ist die Probe vermehrungsfähig, so kann sie vor der Messung inkubiert werden, um die Anzahl der Zellen und damit die Signalstärke zu steigern. Dabei wird ein für das Zellwachstum ausreichendes Maß an Luftfeuchtigkeit und Kohlendioxid vorgelegt. Die Probe kann aber auch während der Messung inkubiert werden, um mit dem erfindungsgemäßen Verfahren den Vorgang der Zellteilung zu studieren.
Durch Messungen konnte belegt werden, dass beispielsweise die folgenden biologischen Eigenschaften von Proben mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem erfindungsgemäßen Verfahren gemessen werden können, wobei vorteilhaft die Vor richtung zur Durchführung des Verfahrens verwendet wird:

– elektrische Eigenschaften der Zelle;
– Auswirkungen biologischer, chemischer und physikalischer Einflussfaktoren, wie beispielsweise toxischer Substanzen, auf eine Zelle;
– elektrische Abdichteigenschaften zwischen Zelle und Oberfläche des Gates oder der Referenzelektrode
– Mikrobewegungen von Zellen;
– Signalübertragung von und zu sowie zwischen Zellen;
– Veränderung der chemischen Zusammensetzung einer Messlösung im Flüssigkeitsreservoir beziehungsweise zwischen der Zelle und der Oberfläche der Gates oder der Referenzelektrode;
– Zelladhäsion;
– Zellmotilität;
– Zellwanderung;
– Zellvitalität.

Bei einer geeigneten Auswertung ist auch die Untersuchung der folgenden, nach dem Stand der Technik bislang nur an Zellverbünden erfassbaren Eigenschaften und Vorgänge an Einzelzellen mit der Erfindung durchführbar:

– Abstand zwischen einer auf der Oberfläche eines Feldeffekttransistors oder der Referenzelektrode adhärierten Zelle und der jeweiligen Oberfläche;
– Apoptose;
– mutagenes Potential bekannter sowie unbekannter Substanzen;
– Signaltransduktion;
– Toxikologie;
– Zellstoffwechsel;
– Zellverhalten unter Strömung in fluidischen Systemen;
– Elektroporation der Zellen.

Bei einer geeigneten Auswertung erscheint auch die Untersuchung der folgenden, erfassbaren Eigenschaften und Vorgänge an Zellfragmenten, Zellmembranen, künstlichen Modellmembranen, Proteinen oder Biomolekülen mit der Erfindung durchführbar, die nach dem Stand der Technik bislang nicht erfasst werden konnten:

– Bildung von Zellmembranen bzw. künstlichen Modellmembranen;
– Spreitung und Fusion von Vesikeln;
– Domänenseparation in künstlichen Modellmembranen;
– Fluktuationen in Zellmembranen bzw. künstlichen Modellmembranen;
– Aktivität von Ionenkanälen;
– Pharmakologie an Ionenkanälen;
– Rekonstitution von Ionenkanälen bzw. Proteinen in Zellmembranen bzw. künstlichen Modellmembranen;
– Bildung von Poren in Ionenkanälen, der Zellmembranen bzw. künstlichen Modellmembranen;
– Elektroporation der Zellmembranen bzw. künstlichen Modellmembranen;
– Adhäsion von Biomolekülen an die Oberfläche;
– Bindungsassays von Biomolekülen;

Dabei können sämtliche Messungen orts- und zeitaufgelöst durchgeführt sowie zeitliche Veränderungen der jeweiligen Messgröße festgestellt werden.
Spezieller Beschreibungsteil
Nachfolgend wird der Gegenstand der Erfindung anhand von Figuren näher erläutert, ohne dass der Gegenstand der Erfindung dadurch beschränkt wird. Es ist gezeigt:
1: Blockschaltbild eines Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
2: Zwei mit der Vorrichtung aus 1 durchgeführte Messungen mit und ohne biologische Probe.
3: Änderung des Messsignals in Abhängigkeit der Salzkonzentration im Flüssigkeitsreservoir 3a.
4: Änderung der Nachweisempfindlichkeit für die Probe in Abhängigkeit der Salzkonzentration im Flüssig keitsreservoir 3a.
5: Normierte Übertragungsfunktionen zweier Feldeffekt transistoren 2, von denen lediglich einer mit einer Zelle bewachsen ist.
6: Nachweis einer Zellablösung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren.
7: Unterschied zwischen den Zeitverläufen der normierten Übertragungfunktion mit bzw. ohne Probe.
1 zeigt das Blockschaltbild eines Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung im Betrieb. Die Vorrichtung ist in diesem Ausführungsbeispiel als Sensor-Chip realisiert. Eine Zelle 1 ist mit dem Gate eines Feldeffekttransistors 2 kontaktiert. Der Feldeffekttransistor 2 umfasst einen Source-Anschluss 2a, einen Drain-Anschluss 2b und ein Gate 2c. Über der Zelle befindet sich ein Flüssigkeitsreservoir 3a, welches als kleine Kulturschale über der Gateoberfläche angeordnet ist. Eine Badelektrode 3 ist in dieses Flüssigkeitsreservoir 3a eingetaucht. Die Badelektrode 3 wird von einem Spannungs- und Frequenzgeber 4 mit einer Wechselspannung durchstimmbarer Frequenz beaufschlagt. Das Flüssigkeitsreservoir 3a, die Badelektrode 3 sowie der Spannungs- und Frequenzgeber 4 bilden zusammen eine Einheit, die das Stimulationsmittel darstellt. Die Kontaktierungsmittel umfassen auch einen Flüssigkeitsfilm zwischen dem Gate des Feldeffekttransistors und der Zelle 1. Eine Auslese- und Verstärkerelektronik 5 beaufschlagt die Source-Drain-Strecke des Feldeffekttransistors 2 mit einer Spannung und misst den durch diese Strecke fließenden Strom. Da in dem Feldeffekttransistor die Source-Drain-Strecke vom Gate isoliert ist, fließt dieser Strom nicht durch die Probe. Die Elektronik 5 wandelt den Strom dabei intern in eine Spannung um, so dass sie letztendlich eine Spannungsmessung durchführt. Die gemessene Spannung, die ein Maß für die Antwort der Probe auf die vom Spannungs- und Frequenzgeber 4 gelieferte Wechselspannung ist, sowie die Wechselspannung können von einer Auswerteeinheit 6 verarbeitet und dargestellt werden.
Ausführungsbeispiel 1: Einfluss der Anwesenheit einer biologischen Probe auf die Frequenzabhängigkeit der normierten Übertragungsfunktion
2 zeigt exemplarisch zwei mit der in 1 dargestellten Vorrichtung durchgeführte Messungen in logarithmischer Darstellung. In 2 ist jeweils die normierte Übertragungsfunktion V_sin/V_out gegen die Frequenz der angelegten Wechselspannung aufgetragen, wobei V_sin die an die Badelektrode 3 angelegte Wechselspannung und V_out die von der Auslese- und Verstärkerelektronik 5 gelieferte Ausgangsspannung ist. Der Feldeffekttransistor war vor der Messung zunächst gereinigt und mit dem Protein Poly-L-Lysin als Probe beschichtet worden. Danach wurde ein Flüssigkeitsreservoir mit einer wässrigen Elektrolytslösung (elektrophysiologische Standardlösung: 5 mM KCl, 140 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM Glucose, pH 7.4 eingestellt mit NaOH) gefüllt.
Die Übertragungsfunktion des Probe-Feldeffekttransistor-Systems wurde bei unterschiedlichen Frequenzen von f_sin = 1 Hz–750 kHz und einer Amplitude von V_sin = 20 mV gemessen (2, Kurve ➀). Aufgrund der Gesamtimpedanz des Systems Referenzelektrode, Probe mit Kontaktierungsmittel, Feldeffekttransistor und erste Verstärkerstufe wird das Stimulationssignal nur bis zu Frequenzen von etwa f_sin = 90 kHz verstärkt. Für höhere Frequenzen nimmt insbesondere der Feldeffekttransistor nicht mehr an der Gesamtsignalverstärkung dieses Systems teil und somit werden wesentlich geringere Ausgangssignale V_out gemessen. Dies gilt nur für diese momentan verwirklichte Ausführung des Messsystems und stellt keine grundsätzliche Beschränkung des Einsatzbereichs der Erfindung dar.
Die Kurve ➁ in 2 zeigt exemplarisch die Messung der normierten Übertragungsfunktion V_sin/V_out nach einer erneuten Reinigung der Oberfläche und somit nach der Entfernung der biologischen Probe (Protein) von der Oberfläche. Der prinzipielle Verlauf der Übertragungsfunktion des Wechselspannungssignals in den Feldeffekttransistor ist dem in Anwesenheit des Proteins auf dem Feldeffekttransistor (Kurve ➀ in 2) vergleichbar, jedoch erfolgt erst für Frequenzen oberhalb von f_sin = 300 kHz eine abnehmende Verstärkung von V_sin.
Die in 2 gezeigte Messung mit Probe (Protein) wurde mit veränderten Salzkonzentrationen in der Elektrolytlösung wiederholt. 3 zeigt die Ergebnisse dieser Messungen. Die Salzkonzentration nimmt von den Kurven ➀ bis ➇ ab:

➀ – unverdünnt
➁ – 1:1 verdünnt
➂ – 1:10 verdünnt
➃ – 1:20 verdünnt
➄ – 1:100 verdünnt
➅ – 1:200 verdünnt
➆ – 1:1000 verdünnt
➇ – 1:2000 verdünnt.

Als Verdünnungsmittel wurde jeweils destilliertes Wasser verwendet.
Es wird deutlich, dass sich hierdurch der Verlauf der normierten Übertragungsfunktion V_sin/V_out in Abhängigkeit der Frequenz verändert. Hierbei bilden der Widerstand der wässrigen Elektrolytlösung R_EL und die Kapazität der Leiterbahn des Feldeffekttransistors C_LB einen effektiven Tiefpass mit der Grenzfrequenz f_TP = 1/(2π × R_EL × C_LB). Es ist festzustellen, dass mit zunehmend geringerer Konzentration der Elektrolytlösung die Verstärkung der Übertragung des angelegten Wechselspannungssignals mit dem mit Poly-L-Lysin beschichteten Feldeffekttransistor bei zunehmend geringeren Frequenzen geringer wird.
Nach der Reinigung des Feldeffekttransistors (Entfernung der Probe) zeigt sich eine qualitativ vergleichbare Abhängigkeit der normierten Übertragungsfunktion von der Frequenz. Analog zu 2 entscheidet die An- oder Abwesenheit der Probe jedoch über die Grenzfrequenz, bis zu der eine ungehinderte Übertragung erfolgen kann. 4 zeigt die Differenz Δ(V_sin/V_out) der jeweiligen Übertragungsfunktionen in An- und Abwesenheit des Poly-L-Lysins für unterschiedliche Salzkonzentrationen (von ➀-➇ abnehmende Salzkonzentration der Elektrolytlösung). Die betragsmäßige Differenz, und damit die Empfindlichkeit der Messanordnung für den Nachweis des Vorhandenseins der Probe, wird mit abnehmender Salzkonzentration größer.
Es wird deutlich, dass sich die vorliegende Erfindung zum Nachweis von Biomolekülen wie beispielsweise Proteinen oder DNA eignet. Ebenso konnte eindeutig gezeigt werden, dass sich die vorliegende Erfindung zum Nachweis der Adhäsion von Biomolekülen auf den Feldeffekttransistoren eignet. Durch eine differentielle Messung ist sogar eine quantitative Aussage hinsichtlich der Menge der gebundenen Biomoleküle möglich.
Ausführungsbeispiel 2: Differentielle Messung zur Untersuchung der Eigenschaften einer Einzelzelle.
5 zeigt exemplarisch eine differentielle Messserie der normierten Übertragungsfunktion zweier unterschiedlicher, gleich beschichteter (Poly-L-Lysin) Feldeffekttransistoren auf demselben Sensor-Chip mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß 1. Einziger Unterschied zwischen beiden Feldeffekttransistoren ist, dass auf einem der Feldeffekttransistoren eine Zelle (HEK293) gewachsen ist (➀), während sich auf dem anderen Feldeffekttransistor keine Zelle befindet (➁). Dieser Chip wurde zwecks Inkubation nach Auftragung der Zellsuspension für die Dauer von drei Tagen in einem Brutschrank unter konstanter CO₂-Atmosphäre und konstanter Temperatur aufbewahrt.
Die normierte Übertragungsfunktion des Einzel-Zell-Feldeffekttransistor-Systems wurde bei unterschiedlichen Frequenzen von f_sin = 1 Hz–750 kHz und einer Amplitude von V_sin = 20 mV gemessen. Für den Feldeffekttransistor ohne Zelle erfolgt eine ungehinderte Gesamtsignalverstärkung des Systems, und die angelegten Wechselspannungssignale erfahren hierdurch eine höhere Verstärkung bis zu Frequenzen von etwa f_sin = 70 kHz; für höhere Frequenzen erfolgt ein wesentlich geringere Verstärkung der übertragenen Wechselspannungssignale (Kurve ➁). Für den Feldeffekttransistor mit der adhärierten Zelle ist ein signifikant unterschiedlicher Verlauf der Übertragungsfunktion festzustellen (Kurve ➀): Grundsätzlich führt die Zellabdeckung des Feldeffekttransistors zu einer unterschiedlichen Übertragungsfunktion des Wechselspannungssignals in den Feldeffekttransistor. In allen Fällen nimmt der Feldeffekttransistor schon bei wesentlich geringeren Frequenzen nicht mehr an der Gesamtsignalverstärkung des Systems teil, und die angelegte Wechselspannung wird nicht mehr verstärkt (hier: für Frequenzen oberhalb von f_sin = 10 kHz).
Aufgrund der gemessenen Übertragungsfunktion ist es durch eine geeignete Auswertung möglich, die elektrischen Abdichtungseigenschaften zwischen der Zelle und dem Feldeffekttransistor zu bestimmen. Für diese exemplarische Zelle ergab sich ein Abdichtwiderstand von etwa 1 MΩ.
Nach der Messung wurde der Sensor-Chip gereinigt, wobei sowohl die Zelle als auch die Beschichtungen entfernt wurden. Anschließend wurde erneut eine vollständige Messung des Frequenzgangs der normierten Übertragungsfunktion durchgeführt. Nach der Reinigung unterschieden sich die Übertragungsfunktionen der zuvor exemplarisch gezeigten Feldeffekttransistoren auf dem selben Sensor-Chip nicht mehr. Insofern ist eindeutig gezeigt, dass sich die vorliegende Erfindung zur Messung der Übertragungsfunktion sowie Veränderungen der Übertragungsfunktion durch die Anwesenheit von Einzel-Zellen auf den Feldeffekttransistoren eignet.
Ausführungsbeispiel 3: Messung des Zeitverlaufs einer Zellablösung.
6 zeigt exemplarisch eine zeitabhängige Messung der Veränderung der Übertragungsfunktion der beiden in 5 gezeigten Feldeffekttransistoren mit und ohne Zelle auf dem Feldeffekttransistor. Aufgetragen ist die normierte Übertragungsfunktion V_sin/V_out gegen die Zeit t. Als konstante Frequenz der Wechselspannung wurde f_sin = 200 kHz gewählt. Dies ist die Frequenz, bei der zwischen beiden Feldeffekttransistoren der maximale Unterschied in der Übertragungsfunktion festgestellt wurde (siehe 5). Die Amplitude der Wechselspannung betrug V_sin = 20 mV. Der Graph zeigt bis 240 s nur geringe Unterschiede zwischen den Übertragungsfunktions-Langzeitsignalen der Feldeffekttransistoren mit Zelle (Kurve ➀) und ohne Zelle (Kurve ➁).
Nach 240 Sekunden wurde in die Kulturschale auf dem Sensor-Chip 100 μl Trypsin gegeben (Konzentration: Pfeil markiert die Zugabe). In diesem Ausführungsbeispiel war die Kulturschale so groß ausgestaltet, dass dadurch die Gates beider Feldeffekttransistoren mit dem Trypsin benetzt wurden. Dieses Enzym hat zur Folge, dass sämtliche membranständigen Proteine der Zellen – unter anderem auch die Proteine, die für die Adhäsion der Zellen auf der Oberfläche verantwortlich sind – enzymatisch abgebaut werden. Nach einiger Zeit lösen sich die Zellen von der Oberfläche. Optisch ist dies mit einer zunehmenden Abkugelung der Zellen zu beobachten.
In der Messung hat die Zugabe des Trypsins einen signifikanten Effekt zur Folge: Die normierte Übertragungsfunktion der Wechselspannung nimmt für den Feldeffekttransistor mit der adhärierten Zelle deutlich zu und erreicht schließlich einen stationären Wert, der etwa 80 % höher als zu Beginn der Messung liegt. Demgegenüber verändert sich die Übertragungsfunktion für den Feldeffekttransistor ohne Zelle nur geringfügig während der Zugabe des Trypsins.
Es ist deutlich nachgewiesen, dass mit der vorliegenden Erfindung die Veränderung der Adhäsion einer Einzel-Zelle auf einen Feldeffekttransistor signifikant nachweisbar ist. Insofern eignet sich die vorliegende Erfindung zur Studie der sowohl der orts- und zeitaufgelösten Zelladhäsion, sowie der orts- und zeitaufgelösten Zellablösung. Somit ist es möglich, die Ablösung einer Zelle, gleich aus welchem Anlass, zu registrieren. Dies kann beispielsweise in der Toxikologie oder zum Nachweis des Vorhandenseins anderer die Zelläblösung auslösender Stoffe eingesetzt werden.
Ausführungsbeispiel 4: Nachweis von Mikrobewegungen einer Zelle.
7 zeigt das Ergebnis einer analog zu 5 durchgeführten Messung. Im Unterschied zu 5 wurde die normierte Übertragungsfunktion, analog zu 6, zeitabhängig gemessen. Im Unterschied zu 6 wurde während der Messung nicht in das System eingegriffen. Der obere Teil von 7 zeigt die normierte Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors mit Zelle, der untere Teil von 7 die des Feldeffekttransistors ohne Zelle. Die Übertragungsfunktionen sind jeweils gegen die Zeit t aufgetragen. Als konstante Frequenz der Wechselspannung wurde f_sin = 200 kHz gewählt. Dies ist die Frequenz, bei der zwischen beiden Feldeffekttransistoren der maximale Unterschied in der Übertragungsfunktion (siehe 4) festgestellt wurde. Die Amplitude der Wechselspannung betrug V_sin = 20 mV.
7 zeigt die in 6 nur geringfügig sichtbaren Unterschiede zwischen beiden Übertragungsfunktionen in Vergrößerung. Während für den Feldeffekttransistor ohne Zelle nur geringe Schwankungen zu registrieren sind (unten), sind für den Feldeffekttransistor mit Zelle schon deutliche Veränderungen in der Übertragungsfunktion festzustellen. Diese Veränderungen der Übertragungsfunktion lassen sich mit lokalen Mikrobewegungen der adhärierten Zelle korrelieren.
Insofern ist deutlich nachgewiesen, dass mit der vorliegenden Erfindung die Veränderung der Adhäsion einer Einzel-Zelle aufgrund von Mirkobewegungen der Zelle signifikant nachweisbar ist. Daher eignet sich die vorliegende Erfindung zur schnellen und effizienten Messung der Toxizität unbekannter Substanzen, da solche Mikrobewegungen der Zelle wie auch die Zellmotilität ein stark an die Zellvitalität gekoppelter Parameter ist, der durch toxische Substanzen signifikant geändert wird.
Die hier gezeigten Ausführungsbeispiele schränken die Erfindung nicht auf biologische Proben ein. Die Grundidee, für die stromlose Messung eines Wechselstromwiderstands einen Feldeffekttransistor einzusetzen, ist an jedem System realisierbar, das mit einer Wechselspannung beaufschlagt werden kann und das Ladungen mit dem Gate eines Feldeffekttransistors austauschen kann.

Claims

Vorrichtung zur Messung biologischer und elektronischer Eigenschaften einer Probe, umfassend einen Feldeffekttransistor (2) mit Kontaktierungsmitteln zur Kontaktierung der Probe mit dem Gate des Feldeffekttransistors, gekennzeichnet durch Stimulationsmittel (3, 3a, 4) zur Beaufschlagung der Probe (1) mit einer Wechselspannung.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch ein Messinstrument (5) zur Messung von Amplitude und Phase eines durch die Source-Drain-Strecke des Feldeffekttransistors fließenden Stroms.
Vorrichtung nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch ein frequenzselektives Messinstrument (5).
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch Anregungsmittel zur Beaufschlagung der Probe (1) mit einer weiteren elektrischen Spannung.
Vorrichtung nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch eine Patch-Clamp Konfiguration als Anregungsmittel.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 5, gekennzeichnet durch eine Intrazellularelektrode als Anregungsmittel.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend mindestens einen weiteren Feldeffekttransistor.
Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der weitere Feldeffekttransistor elektrisch von der Probe isoliert ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch Mittel zur Kontaktierung mehrerer Feldef fekttransistoren (2) mit derselben Probe (1).
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, gekennzeichnet durch Stimulationsmittel (3, 3a) umfassend ein Flüssigkeitsreservoir (3a).
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, gekennzeichnet durch Kontaktierungsmittel umfassend ein Flüssigkeitsreservoir (3a).
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, gekennzeichnet durch ein Flüssigkeitsreservoir (3a) mit einem Volumen größer 0,1 μl, insbesondere größer 100 μl.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, gekennzeichnet durch ein geschlossenes Flüssigkeitsreservoir (3a)
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, gekennzeichnet durch ein Flüssigkeitsreservoir (3a) mit einem Zu- und/oder einem Ablauf.
Verfahren zur Messung biologischer Eigenschaften einer Probe mit den Schritten: – die Probe (1) wird mit einer Wechselspannung beaufschlagt; – die Probe tauscht Ladungen mit dem Gate eines Feldeffekttransistors (2) aus; – eine vom Potential am Gate des Feldeffekttransistors (2) abhängige primäre physikalische Messgröße wird gemessen.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass eine Wechselspannung mit einer Frequenz zwischen 0,1 Hz und 1 GHz, insbesondere zwischen 1 Hz und 10 MHz, gewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine Wechselspannung mit einer Amplitude zwischen 0,001 mV und 10 V, insbesondere zwischen 1 mV und 100 mV, gewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplitude der Wechselspannung während der Messung konstant gehalten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (1) mit Wechselspannungen verschiedener Frequenzen beaufschlagt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass Amplitude und Phase der primären physikalischen Messgröße gemessen werden.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Zeitverlauf von Amplitude und Phase der primären physikalischen Messgröße über zwischen 1 und 100, insbesondere über zwischen 5 und 10 Schwingungen der angelegten Wechselspannung gemessen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass ein durch die Source-Drain-Strecke des Feldeffekttransistors (2) fließender Strom als primäre physikalische Messgröße gemessen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Zeitverlauf der primären physikalischen Messgröße und eine Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors (2) zur Ermittlung weiterer Kenngrößen der Probe verarbeitet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass aus der primären physikalischen Messgröße die Impedanz der Probe (1) ermittelt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass eine weitere sekundäre physikalische Messgröße gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass eine sekundäre physikalische Messgröße gewählt wird, die ein Maß für eine elektrische Aktivität der Probe (1) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (1) zur Stimulation elektrischer Aktivität mit einer weiteren elektrischen Spannung beaufschlagt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass ein im Vergleich zur Frequenz der Wechselspannung niederfrequenter Anteil des durch die Source-Drain-Strecke des Feldeffekttransistors (2) fließenden Stroms als sekundäre physikalische Messgröße gewählt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass primäre und sekundäre physikalische Messgröße gleichzeitig gemessen werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass eine Probe (1) gewählt wird, die mindestens zwei interagierende biologische Proben umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (1) auf einen elektrisch mit dem Gate verbundenen Träger aufgebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass ein Träger mit Haftmitteln gewählt wird, die die Anhaftung der Probe (1) unterstützen.
Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass ein Träger gewählt wird, auf dem die Haftmittel lateral strukturiert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (1) inkubiert wird.
Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 15 bis 34.