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BEMERKUNG BEZÜGLICH DER
VON DER ÖFFENTLICHEN
HAND GEFÖRDERTER
FORSCHUNG UND ENTWICKLUNG
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Diese
Erfindung erfolgte unter dem Vertrag DAMD17-03-C-0085, der gewährt wurde
von dem Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA). Die Regierung
hat eine nicht-exklusive
Lizenz an dieser Erfindung erworben.
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QUERBEZUG
ZU ENTSPRECHENDEN ANMELDUNGEN
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Die
Erfindung beansprucht die Priorität der U.S. Provisional Application
Serial Nr. 60/618,259, mit der Bezeichnung „Integrated Sensing Array
to Obtain a Biofingerprint",
die am 14. Oktober 2004 angemeldet worden ist und der U.S. Provisional
Application Serial Nr. 60/625,721 vom 8. November 2004 mit dem Titel „Suspended
Membrane Sensing Array".
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HINTERGRUND DE ERFINDUNG
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1. Gebiet
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Identifizierung von
biologischen Einheiten, insbesondere ein integriertes Feld von elektronischen
Sensorelementen, das einen Bio-Fingerabdruck
eines Analyts ausgibt.
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2. Diskussion
des Standes der Technik
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Eine
schnelle Identifikation von sehr geringen Konzentrationen eines
Bereichs von Molekülen
ist für manche
Gebiete der Wissenschaft und Technologie wichtig. Vielversprechende
Verfahren schließen
das elektrische Aufzeichnen von Feldern von Zellen, molekulare Rezeptoren
auf Flächen
mit zugehörigen
Reportermolekülen
und auf Fluoreszenz basierende Techniken ein. Gegenwärtige Sensorarchitekturen
erfordern jedoch hochspezifische Rezeptoren (beispielsweise Antikörper), die
schwierig zusammenzustellen, teuer und durch das Rauschen durch
nicht-spezifische Bindungen begrenzt sind und weiter unter der Eigenschaft
leiden, dass dann, wenn die Empfindlichkeit erhöht wird, die Selektivität beeinträchtigt wird,
was zu falschen Identifizierungen führt.
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Die
Verwendung eines Feldes von teilweise spezifischen Einmolekülsensorelementen
schafft einen Weg zum Erzeugen von Biofingerprints von einer sehr
kleinen Anzahl von Zielmolekülen.
Anfängliche
Arbeiten schlossen die Verwendung von nicht-biologischen Röhrchen ein,
die als Filter dienen, um einzelne Moleküle zu detektieren. Martin et
al. entwickelten kleinen Gold-Nanoröhrchen in einem Versuch zur
Messung des Stromes, der durch ausreichend kleine Einmoleküle erzeugt
wird, die das Röhrchen
erreichen und den Strom von Elektrolytionen, die bei einer angelegten
Spannung fließen,
vermindern. Die Röhrchen
waren in der Ordnung von mehreren Nanometern. Obwohl sie im Durchmesser
ausreichend klein waren, um einzelne Moleküle zu detektieren, würde die
Länge des
Röhrchens
mehr als einem Molekül
zu einem Zeitpunkt zulassen und so eine Einmoleküldetektion verhindern.
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Bayley
verwendet technisch hergestellte biologische Proteinporen zum Binden
eines einzelnen Moleküls.
Die geringe Größe der Pore
erlaubt es lediglich einem Molekül
zur Zeit einzutreten, während
technisch kovalent verbundene Sensorteilchen einen Bereich von molekularen
Bindungsantworten über
eine Klasse von Analyten ermöglichen.
Sobald ein Analytmolekül
gefangen wird, kann ein charakteristisches Zeitintervall und eine
Abnahme des Stromes in dem pA-Berich gemessen werden. Obwohl diese
Arbeit ein großer
Fortschritt ist in Richtung auf einen Biosensor darstellt, ist die
Arbeit bei dem elektronischen Ausleseverfahren und der Stabilität der Bilipidmembran
für den
Erfolg dieser Art von Sensor kritisch. Weiter ist ein System, das
in der Lage ist mehrere Poren in ein Feld einzubringen, erforderlich,
um die Genauigkeit, die Sensitivität und den Verwendungsbereich
für diese
Anwendung zu erhöhen.
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Eines
der Hauptproblem in diesem Bereich stellen heute die verfügbaren elektronischen
Ausleseverfahren dar. Stromverfahren wie der übliche Goldstandard, das Patchklemmen,
verwendet ein DC-Verfahren und widerstandsfähige Elektroden, um Messungen
auszuführen.
Aufgrund der Gigaabdichtungserfordernisse ist das ein Feld extrem
schwerfällig
und bietet keine machbare Option für das Feldsystem, das für diese
Art von Sensor erforderlich ist. Ein Feld ist notwendig, um Mechfachsensorelemente
zum Einfangen mehrerer Analyte gleichzeitig zu erlauben. Zusätzlich könnte die
Ansprechzeit verringert werden und die Genauigkeit erhöht werden,
wenn verschiedene Sensorelemente ausgebildet sind, um dasselbe Analyt
zu detektieren.
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Ein
weiteres Verfahren des elektronischen Auslesens ist die elektrochemische
Impedanzspektroskopie. Dieses Verfahren verwendet Daten in dem Frequenzbereich
zum Modellieren einen äquivalenten
Schaltkreises. Die Schwäche
dieses Systems besteht darin, dass es nicht Stromsignale in dem
Zeitbereich messen kann. Diese Information ist kritisch bei der
Verwendung des Proteinporenverfahrens und der Einmolekülerkennung.
Das Stromsignal für
die Proteinporen, das oben diskutiert worden ist, ist in der Größenordnung
von pA und der Dauer von ungefähr
5 ms. Die Zeitbereichmessung ist daher kritisch, um diese Ereignisse
zu sehen. Das vorgeschlagene System würde ein AC-Ausleseverfahren
anwenden, um in der Lage zu sein, diese Ereignisse klar zu erkennen
und damit eine größere Empfindlichkeit
und eine schnellere Antwortzeit zu erlauben.
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Ein
zusätzliches
kritisches Problem bei den Stromverfahren dreht sich um die bilipide
Membran. Mehrere Gruppen haben gezeigt, dass Bilipidmembranen auf
einem Substrat angeordnet werden können, das ein Loch übergreift
und es Proteinporen erlaubt, eine Proteinpore einzusetzen. Diese
Membranen sind jedoch extrem fragil und empfindlich gegenüber einer
Vibration, wenn ein großes
Loch, größer als
wenige Mikron, zu überzugreifen
ist. Dieses Merkmal macht ein robustes System schwierig. Ein Verfahren
zum Verringern der Größe der Bohrung,
die die Membran überspannt,
könnte
jedoch die Lebensdauer der Membran erheblich verlängern, vielleicht
unendlich. Zusätzlich
würde ein
System, das dazu in der Lage ist, eine Membran über diese kleinen Löcher zu
spannen, in der Größenordnung
von 20 Nanometern, und der erforderliche Gigaabdichtungswiderstand
würde kritisch
sein für
die Feldausbildung, die wir vorschlagen. Weiter würde die
Verwendung dieser kleinen Membranen auch die Empfindlichkeit des
Systems erhöhen.
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Andere
Gruppen haben versicht, die Stabilität des Bilipids durch Anbinden
an eine Goldelektrode zu erhöhen.
Es hat jedoch keine Arbeit eine Strommessung gezeigt, die sich aus
einer Proteinpore ergibt, die in die Membran eingesetzt ist und
durch eine untere Elektrode gemessen wird. Zusätzlich zu dem Fehlen eines wirksamen
Auslesesystems ist die angebundene Membran schnellen Nernst-Potential-Effekten
aufgrund des kleinen Volumens, das zwischen der Membran und der
Elektrode besteht, unterworfen. Um diese Technologie brauchbar zu
machen, ist ein Mittel zum Reduzieren dieser Potentialeffekte erforderlich.
Wenn das Stromsystem diese Technologie verwendet, benötigt es
ein innovatives Verfahren eines AC-Porenstroms zum Reduzieren dieses
Nernst-Potential-Effekts. Zusätzlich
würde das
Anwenden dieser Ausbildung in einem Feld weiter die Nützlichkeit
dieser Technologie verbessern.
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Während Gruppen
bei der Verringerung der Größe der Membranen
bis hinab auf den Mikronbereich erfolgreich waren und Experimente
beschrieben worden sind, die die Verwendung von Submikronelektroden beschreiben,
ist die Gesamtgröße der verwendeten
Apparatur heute in der Größenordnung
von Zentimetern. Ein wichtiges Merkmal des Sensierens der Aktivität von Einsensorkanälen oder
-poren ist es, dass die Dimensionen der Fluidkammer, die Analytlösung des
Sensorsystems beinhaltet, theoretisch auf die Submikrongröße reduziert
werden kann. Unter der Annahme einer festen Menge des verfügbaren Analyts
ist die Empfindlichkeit des Sensorsystems umgekehrt proportional
zu dem Volumen, das für
ein Experiment erforderlich ist. Es ist daher eine kritische Frage,
wie klein das Analytvolumen gemacht werden kann.
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Ein
Beispiel einer Abwägung
des Systems ist der Abstand zwischen den Sensorkanälen oder
-einheiten in einem Feld, wo eine einzige Analytkammer verwendet
wird, um alle Sensoreinheiten abzudecken. In diesem Fall ist je
kleiner der Feldabstand, umso kleiner das Volumen der Analytkammer
und umso kleiner die Menge des benötigten Analyts. Jedoch erfordert
an einem bestimmten Punkt das Reduzieren des Mitte-zu-Mitte-Abstands
zwischen den Sensoreinheiten eine Verringerung der Größe der Sensoreinheiten
selbst. Ein Reduzieren der Größe der Sensoreinheiten
reduziert die Zeit, während
der das System arbeiten kann, bevor mit dem Nernst-Potential verbundene
Konzentrationseffekte auftreten. Während einige Kompensationsmessungen
gemacht werden können,
etwa das Umkehren des Vorzeichens des Ionenflusses in dem System,
addieren sie die Komplexität
des Systems. Das Bestimmen der Größe des Sensoreinheitsfeldes
und des Abstandes zwischen den Sensoreinheiten ist eine komplexe
Sache, die eine Abwägung
zwischen vielen konkurrierenden Effekten betrifft.
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Eine
andere Abwägung
bei dem System ist die zwischen der Sensitivität des Systems und der Antwortzeit
zu sehen. Je höher
die Sensitivität
des Systems ist, umso mehr Zeit benötigt es für eine positive Antwort oder
die Annahme einer negativen Antwort. Beispielsweise wäre die Antwortzeit
für eine
Analytkonzentration von 1 nM 1000 mal schneller als die Antwortzeit
für eine
Analytkonzentration von 1 pM. Es muss daher eine kritische Entscheidung
basierend auf der Anwendung bei dem Erstellen eines Ausgleichs zwischen
der Empfindlichkeit und der Antwortzeit durchgeführt werden. Weiter kann die
vorgeschlagene Korrekturmessung, wie eine Verringerung des Probemvolumens,
die effektive Konzentration in dem System erhöhen und so die Antwortzeit
verringern, während
die Empfindlichkeit weiter erhöht
wird.
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Weitere
Komplikationen ergeben sich aus der Herstellung eines Membransensorsystems.
Biologische Membranen und Proteinporen erfordern eine sorgfältige und
genaue Überwachung
der physikalischen Bedingungen um die erstgenannten auszubilden
und die zweiten einzusetzen. In dem Fall, dass eine künstliche Membran
verwendet wird, ist das Einsetzen der Pore ein komplexer Prozess,
der die Verwendung von gut kontrollierten Fluidkörpern als auch elektrischen
Potentialen und Feldern erfordert. Je kleiner die Gesamtgröße des Systems
ist, umso schwieriger ist es, diese Parameter zu steuern und umso
schwieriger ist die Herstellung des Membransensorsystems.
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Interpretationen
eines Systems vermittelt durch Änderungen
der Kapazität
der Membran oder Änderungen
in dem Ionenfluss durch einen Kanal oder eine Pore in der Membran
sind abhängig
von der Kenntnis der Membran, des Kanals oder der Pore, die der
jeweilgen Sensoreinheit zugehörig
sind. Vorbekannte Verfahren des Bewirkens dieses direkten Einsetzens
einer bestimmten Proteinpore in eine bestimmte Sensoreinheit haben
das aufeinander folgende Einsetzen von individuellen Proteinporen
oder Arten von Proteinporen und/oder komplexe mikrofluide Systeme
erfordert, um den individuellen Sensoranordnungen zu entsprechen. Diese
Anforderungen gelten für
jede Sensoreinheit. Derartige Verfahren sind komplex sowohl unter
dem Gesichtspunkt des Herstellens des Systems als auch unter dem
Gesichtspunkt der Montage des Systems.
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Darauf
basierend besteht ein Erfordernis für ein System, das ein Feld
von Membranen und Porensensoreinheiten einschließt in einer Art, die die Menge
des erforderlichen Analyts minimiert, während das System zu vernünftigen
Kosten hergestellt werden kann. Weiter besteht ein Bedarf an einem
Feld aus einer Membran und Porensensoreinheiten, das dazu eingerichtet
ist, ein einziges Analyt oder mehrere Analyte gleichzeitig zu messen,
um einen Fingerabdruck zu erstellen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung ist darauf gerichtet, es diskreten Sensorelementen
möglich
zu machen, das Vorhandensein von Einmolekülen, die in ein Feld eingebracht
sind, für
eine maximale Detektionsempfindlichkeit in der minimalen Antwortzeit
zu optimieren.
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Ein
Feld von Sensorelementen ist in einer Analytkammer angeordnet. Die
Antwort jedes Sensorelements wird durch eine bestimmte Sensorelektrode
ausgelesen. Das System ist sehr einfach konstruiert und konzipiert
als eine Reihe von drei Schichten, es muss aber nicht so angeordnet
sein. Eine obere Schicht definiert eine Fluidkammer oder eine Analytkammer.
Eine mittlere Schicht beinhaltet die Sensorelemente und eine dritte
Schicht bildet die elektronischen Ausleseelemente.
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Die
Analytkammer beinhaltet ein Elektrolyt und das zu erkennende Analyt,
falls vorhanden, und etwaige vermittelnde chemische Stoffe. Im Allgemeinen
wird das Analyt von der Umgebung oder der interessierenden Quelle
aufgenommen und wird in eine flüssige
Form durch verschiedene Verfahren, die für die Erfindung nicht spezifisch
sind, reduziert.
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Die
Sensorelemente sind mit der Analytkammer in Kontakt. Das Loch wird
von einem kleinen Loch durchstoßen,
dass es einem Strom von Elektrolytionen erlaubt, unter einer geeigneten
angelegten Spannung zu strömen.
Vorzugsweise sind molekularspezifische Rezeptoren in dem Loch angeordnet,
um den Elektrolytstrom bei dem Vorhandensein eine spezifischen Moleküls zu modulieren.
Für einige
Analyten und Anwendungen kann jedoch alleine der Effekt aufgrund
des Vorhandenseins eines spezifischen Moleküls innerhalb des Lochs ein
geeignetes Signal erzeugen. Weiter ist zu berücksichtigen, dass eine Änderung
der Leitfähigkeit
der Barriere selbst oder das Einsetzen einer Proteinpore in die
Barriere, die direkt von dem Anlayt vermittelt wird, zu einer Änderung
des Elektrolytstroms in der Messkammer führen kann, diese sind daher
mögliche
Detektionsmechanismen. Zur Vereinfachung werden diese Strommodulationsgebilde
und -mechanismen hier kopiert unter dem Begriff „Pore".
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In
dem Feld wird jedes Sensorelement so bezeichnet, dass es einen Grad
an Spezifizität
für ein
interessierendes Analyt hat. In Abhängigkeit von der Natur des
Sensorelementes kann die Spezifizität Erreichen von einer Antwort
auf lediglich ein Analyt, auf einer Antwort auf eine Klasse von
Analyten oder einer Antwort auf einen Störer und nicht das interessierende
Analyt. Die Antwort ist eine natürliche
Eigenschaft der Pore oder kann mit dieser versehen werden. Der Ausgang
des Feldes liefert einen Fingerabdruck des Analyts oder der Gruppe
von Analyten, die in der Anlaytkammer vorhanden sind. Die individuellen
Sensorelementausgänge können mit
einem geeigneten Algorithmus kombiniert werden, um eine optimierte
Antwort für
ein oder mehrere Suchanalyte zu erzeugen.
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Es
gibt zwei beispielhafte Barrierenausbildungen. Die schwebende Ausbildung,
bei der die Barriere eine Öffnung über ein
größeres Volumen überspannt
und die gestützte
Ausbildung, bei der die Barriere in ständigem Kontakt mit einem Polymer
oder einer wässrigen
Stütze
ist, die mit dem Einbringen von oder Funktionieren der Pore kompatibel
ist. Der Fall einer einfachen Öffnung
in einem festen Metall ohne Membran oder Pore ist ein Unterfall
der schwebenden Ausbildung, wobei das feste Material, das die Öffnung begrenzt,
im Allgemeinen dünn
ist und einen großen
lateralen Abstand abdeckt, um das Messkammervolumen zu definieren.
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Vorzugsweise
besteht die Barriere des Sensorelements aus einer biologisch kompatiblen
dünnen Membran
wie einer Zweischicht-Lipidmembran (BLM) oder einer Membran bestehend
aus Polymethylsiloxan (PDS). Eine Proteinpore, etwa Alphahemolysin
oder Maxi K ist in die Membran eingebaut, obwohl andere Ionenkanäle, Transporter
oder andere geeignete biologische Stoffe verwendet werden könnten. Sowohl
in dem schwebenden als auch in dem gestützten Fall ist die Membran
im allgemeinen größer als
die Messkammer des Sensorelements und die Pore muss eingeführt werden
und/oder rückgehalten
werden, um an dem erforderlichen Ort in der Membran zu bleiben.
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Die
Antwort der Pore muss den Elektrolytstrom durch diese in die zugehörige Messkammer
in Antwort auf ein Suchanalyt modulieren. In manchen Fällen wird
die Sensorkammer durch ein Volumen definiert, das durch Ätzen oder
anders in einem festen Material eingebracht ist. In anderen Fällen sind
die oberen, die unteren und die Randgrenzen der Messkammer durch
unterschiedliche Materialien ausgebildet, etwa einer Zweischicht-Lipidmembran,
einem Siliziumwafer bzw. einem Polymer. Der Elektrolytstrom wird über eine
Elektrode gemessen, die mit dem Elektrolyt in der Messkammer gekoppelt
ist. Die gesamte Dicke der Sensorkammer und seine spezifische Ausbildung
hängen
von der Barrierenausbildung und der gesamten Konstruktion des Messelements
ab. Um das Volumen des Analyts, das in der Analytkammer sein muss,
zu minineren, müssen die
Sensorelemente so nah wie möglich
aneinander und so klein wie möglich
sein. Um ein Übersprechen
zu minimieren, müssen
die Impedanz der Sensorelektrode zu den anderen Feldelementen und
zu der Analytkammer sorgfältig
kontrolliert werden.
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Wenn
das System kompakt sein muss, ist es bequem, Elektroden unter Verwendung
von üblichen
Mikrofabrikationstechniken auf eine Siliziumglas oder einem anderen
geeigneten Substrat auszubilden. In Abhängigkeit von einer bestimmten
Ausbildung der Sensorelemente sind die Elektroden in der Sensorschicht ausgebildet
oder sind auf der Bodenfläche
der Analytkammer hergestellt. Falls erforderlich, sind ein oder
mehrere aktive Verstärkerelemente
(d. h., Transistoren) in dem Gesamtaufbau vorgesehen in großer Nähe von der zugehörigen Sensorelektrode.
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Um
jede Elektrode ist ein Steuerring auf der elektronischen Schicht
ausgebildet oder in der unmittelbaren Nähe der Barriere auf einer Oberseite
der Sensorschicht. Das Potential dieses Rings ist vorzugsweise eingestellt
zum Minimieren der Antwortzeit des Systems durch Aufbringen einer
geeigneten Spannung zum Anziehen der interessierenden Analyte zu
den Sensorelementen. Zusätzlich
kann eine Falschalarmfunktion vorgesehen sein durch Abstoßen von
störenden
Spezien. Auch kann das Potential des Rings durch eine Rückkopplung
gesteuert sein zum Minimieren der Kopplung der Sensorelektrode gegenüber Streupotentialen
zum Verbessern der Empfindlichkeit. Eine weitere Verwendung des
Steuerrings ist in den Endstufen des Montagesystems, bei dem das
Potential des Rings eingestellt wird zum Anziehen oder Zurückweisen
von spezifischen Poren, wodurch ein spezifischer Typ der Pore auf
spezifische Elemente des Feldes gerichtet wird. Um dies zu tun,
ist die Pore mit einer Chargengruppe in einer dem Fachmann bekannten
Art und Weise markiert. Nachdem die Pore in einem DC-Potential eingesetzt
ist, wird es auf den Ring aufgebracht zum Verankern der Pore in
der Membran.
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Um
das Volumen der Sensorkammer so klein wie möglich zu machen, ist es erforderlich,
die Ionenkonzentration in der Kammer zu kontrollieren. Zwei Effekte
müssen
berücksichtigt
werden. Zunächst
der Aufbau der Konzentration eines bestimmten Ions (beispielsweise
K+) relativ zu der Analytkammer, die zu
einem Nernst-Potential über
die Barriere und Pore führt.
Zweitens wird bei einer kapazitiven Elektrode die Ladung der Ionen,
die den Strom tragen, weder an der Elektrode ausgetauscht noch aufgehoben
durch die Freisetzung weiterer Ionen an der Elektrode. Es wird daher
eine Nettoladung, die den Ionen zugehörig ist, aufgebaut, was zu
einer entsprechenden Spannung in Bezug auf die Analytkammer (d.
h., über
die Pore) führt.
Bei kleinen Sensorelementen ist die Kapazität der Sensorkammer beherrscht
durch die Kapazität
der Barriere und der Sensorelektrode. Infolgedessen haben unterschiedliche
Sensorelemente im Wesentlichen die gleiche Kapazität, obwohl
zu erwarten ist, dass unterschiedliche Sensorelemente erheblich
unterschiedliche Sensorkammervolumen haben.
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Kapazitive
Elektroden, die mit einem AC-Porenstrom gekoppelt sein können, können verwendet
werden, um den Problemen, die sich mit den Nernst-Potentialen und
quasi-elektrostatischen
Spannungen ergeben, zu begegnen. Zusätzlich zum Umkehren der Porenstromrichtung
bei Frequenzen, die viel tiefer sind als die Porensignalfrequenz,
werden in der internationalen Patentanmeldung PCT US2005/026181
mit der Bezeichnung „Method
an Apparatus for Sensing a Time Varying Current Through an Ion Channel" vom 22. Juli 2005
beschrieben, wonach es auch möglich
ist, den Porenstrom bei Frequenzen zu betreiben, die viel höher sind
als die Porensignalfrequenz und dann die Zeitabhängigkeit des Porensignals durch
Demodulieren dieser Trägerfrequenz
rückzugewinnen.
Diese beiden Techniken erlauben die Messung von Picoampereänderungen in
dem Porenstromsignal in dem Bereich mit einer Zeitauflösung in
der Größenordnung
von 0,1 ms.
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Obwohl
die kapazitiven Sensorelektroden aufgrund ihrer verbesserten Stabilität aufgrund
des Fehlens einer elektrochemischen Reaktion mit dem Elektrolyt
bevorzugt sind, ist es in machen Fällen auch nützlich, auch eine ohmsche Elektrode
in dem Sensorvolumen einzubauen und eine ohmsche Referenzelektrode
in dem Analytvolumen. Eine solche Elektrode schafft eine DC-Spannungsreferenz
für die
verwendeten Elektoden zum Verstärken
(Auslesen des Potentials) der Sensorelektrode und schafft ein Mittel
zum Begrenzen des Aufbaus des DC-Potentials über der Pore. Weiter ist es
in den Fällen,
in denen lange Betriebsdauern für
das Feld nicht erforderlich sind, möglich, eine Sensorelektrode
zu schaffen, die eine ohmsche elektrische Verbindung mit dem Elektrolyt
schafft.
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Weitere
Aufgaben, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden
deutlicher aus der nachfolgenden eingehenden Beschreibung eines
bevorzugten Ausführungsbeispiels
in Verbindung mit den Zeichnungen, wobei einander entsprechende
Bezugszeichen zu entsprechenden Teilen in den verschiedenen Ansichten
gehören.
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KURZE ERLÄUTERUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
schematisch ein Sensorsystem mit Sensorelementen zum Messen eines
Bio-Fingerabdrucks eines Analyts nach einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
der Erfindung;
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2 zeigt
schematisch ein Sensorelement von 1 in einer
schwebenden Membranausbildung;
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3 zeigt
schematisch ein Sensorelement von 1 in einer
geschützten
Membranausbildung;
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4 zeigt
schematisch ein Sensorelement von 1 in einer
schwebenden Membranausbildung unter Verwendung einer Öffnung in
einem festen Material;
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5 zeigt
das Sensorelement von 1 mit einer Bezugselektrode;
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6 ist
eine Darstellung, die einen Porenstrom als eine Funktion der Zeit
für verschiedene
Sensorkammervolumen zeigt;
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7 ist
ein Schaltdiagramm, das ein Beispiel einer Schaltung zeigt, die
den Porenstrom mit einer relativ hohen Frequenz moduliert und sodann
die Änderung
in dem Strom, der in Abhängigkeit
von dem Porenwiderstand fließt,
misst;
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8 ist
eine Darstellung, die ein simuliertes Signal der Strommodulation,
die von der Schaltung von 7 erzeugt
wird, ist, zeigt;
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9 ist
eine Darstellung, die das simulierte Signal von 8 nach
der Demodulation und einem 4-Pol Bessel Tiefpass-Filter zeigt;
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10 zeigt
ein Sensorelement einer schwebenden Ausbildung nach der vorliegenden
Erfindung mit einem Steuerring;
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11 zeigt
ein Sensorelement einer schwebenden Ausbildung der vorliegenden
Erfindung mit einem Steuerring;
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12 zeigt
ein Sensorsystem mit einer schwebenden Membran nach der vorliegenden
Erfindung, wobei eine Sensorkammer über einen engen Zwischenkammerkanal
zum Füllen
einer Kammer verbunden ist;
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13 zeigt
mehrere Sensorkammern in einem Feld;
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14 zeigt
ein Diagramm eines Modells einer Leitung, die verwendet wird, um
die dynamische Systemantwort nach der vorliegenden Erfindung zu
berechnen;
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15 ist
eine Darstellung, die ein moduliertes Eingangssignal zeigt, das
an einem Punkt B der Schaltung gemessen wird;
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16 ist
eine Darstellung, die ein äquivalentes
Spannungsrauschen für
alle Komponenten zeigt, wenn eine Pore in einem offenen Zustand
ist, (Rp = 1 GΩ);
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17 zeigt
eine Unterschicht, die eine Sensorkammer in der schwebenden Ausbildung
zeigt;
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18 zeigt
eine Sensorkammer von 17 mit einer zusätzlichen
Isolationsschicht; und
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19 ist
eine Darstellung, die die Systemsensitivität zeigt unter der Annahme einer
Separation von 50 μm
und 25 × 4
Sensoreinheiten in einem Feld für
ein nM-Analyt.
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EINGEHENDE
BESCHREIBUNG DES BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSBEISPIELS
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Es
wird jetzt auf die 1–4 Bezug
genommen. In diesen ist ein System dargestellt mit Sensorelementen 20, 21 und 22,
die jeweils eine Sensorelektrode 30, 31 bzw. 32 in
Form einer Sensorschicht 35 haben. Die Elemente können in
einem Feld 37 angeordnet sein. Eine Analytkammer 40 ist
oberhalb der Sensorschicht 35 angeordnet. Sensorelektroden 30, 31, 32 sind
in Sensorkammern 50, 51 bzw. 52 angeordnet.
Jede Kammer 50, 51, 52 beinhaltet ein
Sensorvolumen 55, 56, 57 eines Elektrolyts.
Eine Barriere oder Membran 60 deckt eine Öffnung 65 ab,
die in dem Sensor 50 angeordnet ist und erstreckt sich
weiter über
die anderen Sensorkammern 51 und 52. Um jede Elektrode 30, 31, 32 ist
ein Steuerring 70, 71, 72 vorgesehen.
Sensorelemente 20, 21, und 22 bestehen
aus drei Schichten. Einer elektronischen Schicht 75, eine
Sensorschicht 35, die das Sensorelement 20 einschließt und die
Membran 60 mit einem zentralen Bereich 70 mit
einer darin angeordneten Pore 80, und einer fluidischen
Schicht 100. Die elektronische Schicht 75 und
die Sensorschicht 35 bestehen vorzugsweise aus unterschiedlichen
Substraten und sind gemeinsam an einem geeigneten Punkt bei der Herstellung
des Systems 10 miteinander verbunden. Das Konstruieren
des Systems 10 der unterschiedlichen Schichten 35, 75 und 100 schafft
ein erhebliches Maß an
Modularität
und Herstellungsbequemlichkeit, die Erfindung ist jedoch nicht auf
individuelle Schichten beschränkt,
es kann als ein Einsubstrat konstruiert sein, falls erwünscht. Es
wird bedacht, dass in den meisten Fällen die Membran 60 in
situ hergestellt werden wird unter Verwendung von Fluiden, die in
die Analytkammer 40 eingeführt wird. Entsprechend wird
die Pore 80 in die Analytkammer 40 eingesetzt
und wird in der Membran selbstansetzend oder selbstmontierend sein.
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Das
System, das durch die Erfindung gelehrt wird, wird vorzugsweise
mit einer von zwei grundsätzlichen
Barrierekonfigurationen ausgebildet, nämlich schwebend oder gestützt. Wie in
weiteren Einzelheiten unten beschrieben werden wird, besteht der
erhebliche Unterschied zwischen den Systemen unter Verwendung der
alternativen Konfigurationen darin, dass sie zwar annähernd denselben
Bereich einnehmen, die Sensorkammer 50 jedoch bei der schwebenden
Konfiguration viel tiefer ist und dass eine Fluidzugangsleitung
und eine Füllleitung
erforderlich sind, um das Füllsensorvolumen 55 der
schwebenden Konfiguration zu füllen,
wie dies unten beschrieben werden wird. Die Wahl, ob die schwebende
oder die gestützte
Konfiguration zu wählen ist,
hängt von
einer Anzahl von Faktoren einschließlich des oder der interessierenden
Analyts bzw. Analyte, den Umgebungsbedingungen, der erforderlichen
Robustheit des Systems und der gewünschten Sensitivität ab. Ein
wissenschaftlicher Fortschritt ist in diesem Feld gegeben, der relative
Nutzen der beiden Konfigurationen wird sich möglicherweise ändern. Bei
dem bevorzugten Ausführungsbeispiel
ist das System 10 dazu in der Lage, die beiden alternativen
Konfigurationen der Barriere aufzunehmen.
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Es
wird jetzt auf die 2 und 3 Bezug
genommen, in denen die schwebende Konfiguration bzw. die gestützte Konfiguration
dargestellt sind. Bei dem bevorzugten Ausführungsbeispiel weist das System 10 eine
Membran 60, etwa eine Zweischichtlipidmembran auf, die über die
Sensorkammer 50 in der Sensorschicht 35 abgedichtet
ist. Die Membran 60 ist vorzugsweise derart kontinuierlich,
dass die Membran 60 alle Elemente 20, 21, 22 des
Feldes 37 abdeckt, oder aber ein Satz von kleineren Membranen
(nicht gezeigt), die eine oder mehrere Sensorkammer 50, 51, 52 abdecken.
Bis zu fünf
Poren 80 sind in der Region 78 der Membran 60.
Die Pore 80 kann eine Proteinpore, ein Ionenkanal, ein
Transporter oder ein anderes derartiges Gebilde sein.
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Zugehörig mit
jedem Sensorvolumen 55, 56, 57 ist ein
Bereich 78 der Membran 60, die im Wesentlichen über der
Sensorkammer 50, 51, 52 zentriert ist,
wo die Pore 80 für
die für
den richtigen Betrieb angeordnet sein muss. Die Poren 80 werden
in dem Bereich 78 angeordnet entweder durch Diffusion oder
durch elektrophoretische oder elektroosmotische Kräfte, bis
sie ihre richtige Position erreichen. Die Steckkraft ist vorzugsweise
elektrostatisch aufgrund der angelegten elektrischen Felder oder
die Pore 80 kann durch ein (nicht gezeigtes) Verankerungsmolekül angebunden
sein.
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Bei
dem normalen Betrieb wird das Elektrolyt, das das gelöste Analyt
oder Störspezien
beinhaltet, falls vorhanden, in die Analytkammer 40 geführt und
verbleibt in der Kammer 40 für einen Zeitraum, der ausreichend
ist, um eine ausreichende statistische Wahrscheinlichkeit zu haben,
das eine geeignete Anzahl von Analyteinfängen auftreten wird, d. h.,
dass eine ausreichende Anzahl von Poren 80 von Analytmolekülen erreicht
werden. Sodann wird das Elektrolytmedium mit einem frischen Elektrolytmedium/Analyt
ersetzt. Das Elektrolyt in der Analytkammer 40 und im Allgemeinen
mit dem System 10 wird wiederholt in die Ausgangskonzentration
rückgesetzt
in einer zeitlichen Größenordnung
von Minuten oder weniger.
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Um
einen Analytstrom durch die Poren 80 zu erreichen, weist
das System 10 weiter eine Referenzelektrode 150 auf,
die an einem geeigneten Ort in der Analytkammer 40 angeordnet
ist, wie in 5 gezeigt. Beispielsweise vereinfacht
das Platzieren sowohl der Sensorelektrode 30 als auch der
Referenzelektrode 150 auf der Elektronikschicht 75 die
elektronische Verbindung des Systems 10 mit der Datengewinnungs-
und Aufzeichnungselektronik (nicht gezeigt). Gemeinsam bilden die
Sensorkammer 50, der Bereich 78 der Barriere 60,
der die Pore 80 beinhaltet und die Sensorelektrode 30 eine
einzelne Sensoreinheit 20. Die Sensorelektrode und die
Referenzelektrode sind entweder ohmsch (Faradayisch) oder kapazitiv
mit dem Elektrolytmedium des Systems 10 gekoppelt. Eine
ohmsche Elektrode hat den Vorteil einer Gleichstrom (DC) Kopplung,
jedoch den Nachteil des Vorhandenseins einer Korrosionsintereaktion,
in der die Elektrode selbst sich in dem Elektrolytmedium löst. Im Gegensatz
dazu hat eine kapazitive Elektrode keinen Ionenaustausch mit dem
Elektrolytmedium und korrodiert daher nicht. Wenn eine kapazitive
Elektrode verwendet wird, ist es erforderlich, den elektrischen
Strom, der durch die Pore 80 strömt, als Wechselstrom (AC) auszubilden.
Dies hat den weiteren Nutzen, dass das Umkehren der Richtung des
Ionenflusses durch die Pore 80 den Aufbau einer Ionenkonzentration
und einer elektrostatischen Ladung in der der Sensor 50 verhindert,
wie unten diskutiert werden wird. Es sollte beachtet werden, dass
ein AC-Betrieb auch bei ohmschen Elektroden verwendet werden kann
und, falls erforderlich, sowohl die kapazitive als auch ohmsche
Elektroden, wie sie beispielsweise durch 31 und 160 in der
Sensorkammer 51 von 5 gezeigt
sind, wobei diese in die Sensorkammer 50 eingeschlossen
sind, um die Vorteile zu erreichen und die Nachteile bei dem tatsächlichen
Betrieb zu berücksichtigen.
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Wenn
ein Einrichtungs-DC-Porenstrom angelegt wird, wird eine ständige Änderung
der Ionenkonzentration in der Sensorkammer 50 gegeben sein.
Eine derartige Konzentrationsänderung
bewirkt ein Nernstpotential über
der Membran 60, das dem elektrischen Feld, das den Porenstrom
antreibt, entgegengesetzt ist. Die Größe des Nernst-Potentials hängt von
der Zeitdauer ab, in den der Porenstrom geschlossen ist, zuzüglich einer
anfänglichen
Ionenkonzentration des Elektrolytmediums. Der Porenstrom ist als
eine Funktion über
die Zeit für
unterschiedliche Sensorkammervolumen in 6 gezeigt.
Wie in 6 erkennbar ist, wird der Strom für feste
Antriebsspannungen auf seinen halben Wert in etwa 5 Tagen reduziert
für eine
Sensorkammer mit 50 μm
Durchmesser, jedoch nach lediglich 10 Stunden für eine Kammer mit einem Durchmesser
von 10 μm,
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Wenn
die Größe des Sensorvolumens 55 abnimmt,
können
die Konzentrationseffekte limitiert werden. Für ein 5 nm × 10 μm × 10 μm Sensorkammer wird ein Porenstrom
von einzeln geladenen Ionen von 100 pA und eine anfängliche
Konzentration von 0,1 M die Nernstspannung auf 29% der Antriebsspannung
nach 1 ms ansteigen, nach 10 ms ist sie 80%.
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Ein
Verfahren zur Berücksichtigung
des Aufbaus des Nernst-Potentials ist die Erhöhung der Spannung, die über die
Pore 80 angelegt wird. Die erforderliche Spannung wird
durch Beobachten des Porenstroms zum Sicherstellen eines konstanten
Stroms eingestellt. Dieses Verfahren ist jedoch dadurch begrenzt,
dass es ein Mittel zum Anlegen erheblicher Spannungen (> 20 V) erfordern kann,
um die Betriebslebensdauer der Sensorelemente 20, 21, 22 erheblich
zu verlängern.
In der internationalen Patentanmeldung PCT/US2005/026181 mit dem
Titel „Method
and Apparatus for Sensing a Time Varying Current Through an Ion
Channel", die am
22. Juli 2005 eingereicht worden ist, die hier durch Bezugnahme
eingeschlossen wird, werden kapazitive Elektroden verwendet, die
mit einem AC-Porenstrom gekoppelt sind, um diese Probleme zu berücksichtigen,
die mit Nernst-Potentialen und quasi-elektrostatischen Spannungen zusammenhängen. Zusätzlich zu
dem Umkehren der Porenstromrichtung bei Frequenzen, die viel tiefer
sind als die Porensignalfrequenz ist es weiter möglich, den Porenstrom bei Frequenzen
zu betreiben, die viel höher
sind als die Porensignalfrequenz und dann die Zeitabhängigkeit
des Porensignals durch Modulieren dieser Trägerfrequenz rückzugewinnen,
wie unten diskutiert werden wird.
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Ein
elektrostatischer Aufbau der Nettoladung, die mit diesen Ionen in
dem Elektrolytmedium zugehörig sind,
ist ein mögliches
Problem. Die elektrische Kapazität
des Sensorvolumens 55 wird durch die Kapazität über den
Barrierenbereich 78 mit der Analytkammer 40 und
der Sensorelektrode 30 beherrscht. Infolgedessen haben
unterschiedliche Systemkonfigurationen zwar erheblich unterschiedliche
Sensorvolumen, jedoch im wesentlichen dieselbe Kapazität.
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Wenn
nicht ausgeglichene geladene Ionen sich in dem Elektrolytvolumen 55 ansammeln,
wird die Spannung in Bezug auf die Elektrolytkammer 40 (d.
h., über
die Pore) durch die Kapazität
des Sensorvolumens bestimmt. Für
eine Kapazität
von 10 Picofarad (pF) und einem Ionenstrom von 100 pA beträgt die Sensorkammerspannung
(d. h., relativ zu der Analytkammer) nach 1 ms 10 Millivolt (mV).
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Bei
einem in eine Richtung fließender
Porenstrom ist das Sensorvolumen 55 kleiner. Es besteht
eine inherente Abwägung
zwischen der Systemsensitivität,
die zunimmt aufgrund einer kleineren Analytkammer und der Betriebslebensdauer.
Um so kleiner um so empfindlicher das System 10 wird, um
so geringere Zeit kann es arbeiten. Bei dem System 10 liegt
die bevorzugte Größe der Messkammer 50 in
dem Bereich von 50 μm
bis 300 μm
im Durchmesser mit einer Tiefe in dem Bereich von 10 μm bis 300 μm, wenn es
einen in eine Richtung fließenden
Strom verwendet und es ist in der Größe durch die Sensorkammer 50 begrenzt.
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Wenn
ein AC-Strom verwendet wird, ist der zeitliche Durchschnitt des
Ionstroms null und es werden so Konzentrationseffekte vermieden.
Eine untere Seite besteht darin, dass die durchschnittliche elektrophoretische
Kraft, die durch die Spannungsdifferenz zwischen der Sensorelektrode 30 und
der Referenzelektrode 150 gebildet wird, ebenfalls null.
Dies wird erreicht durch ein Anpassen der AC-Wellenform zum Optimieren des
Flusses des Analyts zu der Pore 80. In einem Beispiel wird
ein angelegtes elektrisches Feld in einem relativ geringen Ausmaß für eine Zeitdauer
angelegt, um es dem Analyt zu erlauben, die Pore 80 zu
erreichen und wird sodann auf ein höheres Ausmaß umgeschaltet für eine entsprechend
kurze Zeitdauer zum Ausgleichen des Nettoionenstroms in die zugehörige Sensorkammer 50.
Nach der längeren
Umkehrzeitdauer wird das elektrische Feld ausgeschaltet, um die
Analytverteilung zu erlauben, um ein Gleichgewicht in dem elektrolytischen
Medium über
die Diffusion zu erreichen, während
kein Nettostrom von Elektrolytionen in die Pore 80 strömt.
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Es
gibt zwei zusätzliche
Wege zum Implementieren einer AC-Messung des Stroms durch die Pore 80. Das
erste Verfahren ist das Treiben eines Stroms über ein separates Elektrodensystem
und die Verwendung einer unabhängigen
Sensorelektrode 160, die in 5 am besten
erkennbar ist, zum Messen des Aufbaus einer Spannung in der Sensorkammer 50,
wie in 6 gezeigt. Das zweite Verfahren ist die Verwendung
einer hohen Frequenz (1 kHz bis 100 kHz) Sondenstrom zum Messen
der Impedanz der Pore 80 in einem kurzen Zeitmaßstab verglichen
mit der Antwortzeit der Pore 80. Das erste Verfahren (Spannungssensorverfahren) wird
in der PCT/LTS2005/026181 beschrieben. Das zweite Verfahren (Impedanzsensorverfahren)
beruht auf dem Modulieren des Porenstroms bei einer relativ hohen
Frequenz und ein anschließendes
Messen der Änderung
in dem Strom, der unabhängig
von dem Porenwiderstand fließt.
Die Sondenereignisse liegen beispielsweise in der Größenordnung
von 0,1 ms, eine Frequenz in der Größenordnung von 10 kHz ist bevorzugt.
Die Impedanzsondenausbildung erlaubt die Verwendung einer einzigen
Elektrode in dem Sensorvolumen.
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Ein
Beispiel einer Schaltung für
das Impedanzsensorverfahren, das oben beschrieben worden ist, ist in 7 gezeigt. 7 zeigt
den direkten Widerstand Rb des Elektrolytmediums zwischen der Sensorelektrode 30 und
der Bezugselektrode 150 und die Membrankapazität Cm, die
dem Bereich 78 eigen ist. Ein Signal wird ausgelesen als
die Spannung über
einen Stromsensorwiderstand Rs an dem Punkt B. Das Signal an dem Punkt
B wird mit einem Mischer M1 und einem Oszillator V3 demoduliert.
Die Hochfrequenzkomponenten des Signals werden sodann mit einem
Tiefpassfilter U2 ausgefiltert.
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Ein
simuliertes Signal der Strommodulation, die durch das Porenumschalten
für die
Schaltung von 7 erzeugt worden ist, wird in 8 gezeigt
[der Porenstrom ist um 3 Picovolt (pV) zur Verdeutlichung versetzt].
Der Porenstrom moduliert zwischen nahezu null bis zu einem Maximum
von 1 Picoampere (pA) bei einer Änderung
des Quellenstroms um etwa einen Faktor 2. Der Ausgang dieses demodulierten
Signals nach einem 4-Pol-Bessel Tiefpassfilter ist in 9 gezeigt.
Das Signal skaliert linear für
unterschiedliche Porenströme
und Verstärkungen.
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Das
Impedanzsensorverfahren hat die wichtige Eigenschaft, dass das demodulierte
Signal, das in 9 gezeigt ist, von der Kapazität der Membran
unabhängig
ist. Das Verhältnis
des Pore-offen bis
Pore-geschlossen-Signal vor der Demodulation hat eine erhebliche
Abhängigkeit
von dem Widerstand Rb, der in 7 gezeigt
ist. Vorzugsweise ist Rb größer als
100 Megaohm (MΩ).
Für eine
Porenstrom 100 pApp (Picoampere Spitze zu Spitze) ergibt ein Rb
Senkwert von 100 MΩ 5
pApp des Modulationsstroms und ein Rauschen von 0,485 pApp, was
zu einem Signal/Rausch-Verhältnis
von ungefähr
10 führt.
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Ein
weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Messung von zwei
orthogonalen Komponenten der modulierten Porenantwort in Bezug auf
den angelegten schwingenden Porenstrom. Dies erlaubt verbesserte
Messung der Spektraldichte der Widerstandsschwankungen ohne eine
ausdrückliche
Bestimmung von anderen Rauschquellen in dem Auslesesystem. Zur Anwendung
dieses Verfahrens zur Messung des mit der Zeit variierenden Widerstands
einer Pore des Spektrums über
kurze überlappende
Zeitintervalle wird berechnet und analysiert auf die Änderung
in der Spektralenergie bei der Frequenz des Übergangs zwischen Zuständen mit
hoher und tiefer Konduktanz.
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Die
Mess- und Bezugselektroden 30 und 150, die verwendet
werden zum Antreiben des Stromes durch die Pore 80 schaffen
auch eine elektrophoretische Kraft auf die Analytmoleküle in dem
elektrolytischen Medium, wenn die Analytmoleküle geladen werden oder durch
die elektroosmotische Kraft, die mit einem Ionenfluss in dem System 10 erzeugt
wird. Ein Vorteil der kompakten Systemausbildung nach der vorliegenden Erfindung
besteht darin, dass die elektrischen Felder, die in dem Elektrolytmedium
innerhalb des Systems 10 erzeugt werden, viel größer sein
können
als die die in dem Stand der Technik vorhanden sind. Beispielsweise ist,
wenn ein Volt (V) über
eine Strecke von 100 μm
angelegt wird, das elektrische Feld 104 Volt
pro Meter (V/m). Die elektrischen Felder, die in dem Elektrolytmedium
innerhalb des Systems 10 erzeugt werden, können also
erheblich erhöht
werden gegenüber
denjenigen, die in dem Stand der Technik üblicherweise verwendet werden.
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Zusätzliche
Elektroden können
hinzugefügt
werden, um eine weitere elektrostatische Kontrolle zu ermöglichen.
Vorzugsweise ist um das Sensorvolumen 50 ein leitender
Steuerring 70. Das Potential des Rings 70 wird
kontrolliert zur Bewirkung einer elektrophoretischen Kraft zum Anziehen
oder Zurückweisen
des Analyts in Richtung auf das Sensorvolumen 50 in dem
Fall, dass das Analyt beladen wird. Alternativ wird das Potential
des Rings 70 durch Rückkopplung
gesteuert zum Minimieren einer Kopplung der Sensorelektrode an die
Streupotentiale zum Verbessern der Sensibilität, wie dies in der internationalen
Patentanmeldung von Hibbs et al. mit der Bezeichnung „System
for Measuring the Electric Potential of a Voltage Source", angemeldet am 22.
September 2005, gelehrt wird.
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Eine
weitere Verwendung eines Steuerrings 70 ist es, einem spezifischen
Bohrer 80 zu ermöglichen, auf
ein bestimmtes Element 20 des Feldes 37 gerichtet
zu werden. Die Pore 80 muss eine Nettoladung haben oder
in für
den Fachmann bekannter Weise mit einer Ladungsgruppe gekennzeichnet
sein, so dass das Potential des Rings 70 vorzugsweise gesetzt
ist, um die gewünschten
Poren anzuziehen oder zurückzuweisen. Wenn
eine Pore 80 einmal eingesetzt ist, wird ein DC-Potential
auf den Ring 70 zu dem Verankern der Pore 80 in
der Membran 60 angelegt. Das Verfahren mit dem elektrischen
Feld ist viel einfacher als Techniken zum Bewirken des direkten
Einsatzes einer bestimmten Proteinpore in eine bestimmte Sensoreinheit über ein
komplexes mikrofluidisches System mit der Möglichkeit zum Adressieren individueller
Sensorelemente 20, 21, 22. Ein alternatives
Verfahren zum Bestimmen des Orts des Feldes einer bestimmten Pore 80 ist
das Anlegen des Analyts, das von der Pore 80 erkannt wird
und zum Beobachten, welche Pore oder Poren die erwartete Antwort gibt.
Weiter kann bei einem geeigneten Markieren optische Mittel verwendet
werden zum Bestimmen des Orts der individuellen Sensoreinheiten.
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Die
so beschriebenen Elemente sind für
eine Verwendung mit Poren aller bekannten Arten und zwei grundlegenden
Barrierenausbildungen. Die Möglichkeit
der Verwendung sehr kleiner Sensorvolumen ermöglicht die Anwendung der Erfindung
mit zukünftigen
Ausbildungen der Barriere und der Pore und das System sollte nicht
betrachtet werden auf eine bestimmte Form. Die Verwendung der Erfindung
und der spezifischen Hinzufügungen
zu diesen zur Verwendung mit schwebenden oder gestützten Barrierenausbildungen
werden unten beschrieben.
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Schwebende
Konfiguration
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Es
wird zunächst
auf 10 Bezug genommen, in der ein Sensorelement 220 in
einer schwebenden Konfiguration gezeigt ist. In dem bevorzugten
Ausführungsbeispiel
ist ein Substrat 235 mit einer darin angeordneten Sensorkammer 250 ausgebildet.
Die Kammer 250 ist mit einer Membran 260 bedeckt,
die über
einer Öffnung 265 ausgebildet
ist. In manchen Fällen,
etwa bei einer Zweischicht-Lipidmembran könnte die Membran 260 in
dem Durchmesser der Öffnung 265 oder
der Bohrung sein, wie in 11 gezeigt.
Jedenfalls liegt die Pore innerhalb der Öffnung, die von der Mündung geschaffen
wird. Die 10 und 11 zeigen
den Steuerring 270 auf der oberen Fläche der Sensorschicht 235.
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Ein
vollständiges
System 10 mit einer schwebenden Membran nach der vorliegenden
Erfindung ist in 12 gezeigt mit einer Analytkammer 340.
Es ist erkennbar, dass die Sensorkammer 350 über den
engen Zwischenkammerkanal 352 verbunden ist, um die Kammer 354 zu
füllen.
Die Füllkammer 354 ist
mit einer Analytkammer 340 über einen Kanal 356 verbunden,
um ein Mittel zum Ausgleichen des Druckes über eine Sensorkammerbarriere
oder -membran 360 auszugleichen und damit Vibrationseffekte
auf das System 10 zu minimieren. Weiter schafft der Zwischenkammerkanal 352 ein
Mittel zum Füllen
der Sensorkammer 350 mit einem elektrolytischen Medium
in dem Fall, dass die Öffnung 365 sehr
klein ist und nur eine sehr geringe Flussrate erlaubt. Weiter schafft
der Zwischenkammerkanal 352 ein Mittel zum Anheben und
zum Verringern des Fluidausmaßes,
um die Ausbildung einer Zweischicht-Lipidmembran 360 zu
erleichtern.
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Der
Zwischenkammerkanal 352 ist so lang und so klein im Querschnitt
wie möglich
ausgebildet, um die elektrische Impedanz des Weges von der Sensorkammer 350 zu
der Analytkammer 340 über
die fluidische Schicht 370 zu erlauben. Dieser Weg kürzt die
elektrische Impedanz der Kammer 360 wirksam und ist daher wichtig
bei dem Steuern der elektrischen Eigenschaften des Systems. Es ist
im Stand der Technik gut bekannt, dass die Membranimpedanz in einem
schwebenden Membransystem ist, außer der Pore, in der Größenordnung
von 1 Gigaohm (GΩ)
und vorzugsweise höher,
um robuste Messungen zu erlauben. Zum Erhöhen der Nettoimpedanz des Zwischenkammerkanals 352 über den
interessierenden Frequenzbereich wird eine spannungsgesteuerte Elektrode 378 in
der Füllkammer 354 angeordnet
und auf der Spannung der Sensorkammer 350 durch Rückkopplung
gehalten. Einfache Analysen zeigen, dass dieses Verfahren ein Faktor
von 100 in der Zunahme der Impedanz des Zwischenkammerkanals 352 erlaubt.
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In 13 wird
eine Schicht 440 mit Durchbohrungen 445 mit einem
Substrat 447 verbunden, das Sensorkammern 450, 451 definiert.
Die Membran 460 ist über
eine zweite Schicht 440 ausgebildet. Zum Minimieren des
Volumens der Analytkammer 465 werden mehrere Sensorkammern 450, 451 gemeinsam
durch kurze fluidische Wege 455 und einen einzigen Zwischenkammerkanal 457 und
Füllkammer
(nicht gezeigt), die für alle
Sensorkammern 450, 451 gebildet wird, verbunden.
Ansonsten benötigt
die Hinzufügung
der Zwischenkammerkanäle
eine Zunahme in dem Abstand zwischen den Sensorelementen. Auch wenn
die Zwischenkammerkanäle
selbst sehr eng sind (beispielsweise < 10 μm)
verlangt die praktische Herstellung gemeinsam mit einer zuverlässigen Abdichtung
der Kanäle
mit einer Isolation im Gigaohmbereich von den anderen Elementen eine
relativ große
Trennung zwischen den Sensorkammern. Der Extraraum führt zu einer
Zunahme bezüglich des
Volumens der Analytkammer 40 und eine entsprechende Reduktion
der Empfindlichkeit des Sytems 10.
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Das
Verbinden der mehreren Sensorkammern durch einen fluidischen Weg
steht jedoch nicht für
eine einfache Ausbildung der Pore und der Membran, wie sie in dem
Stand der Technik beschrieben worden ist, da viele Proteinporen
von Bedeutung gewöhnlicher
Weise in dem offenen Zustand vorhanden sind mit einer Leitfähigkeit
von einem Nanosiemens (nS) oder einem Widerstand in der Größenordnung
von 1 GΩ.
Das Verbinden einer Sensorkammer 450 zu einer anderen Sensorkammer 451 schafft
einen elektrischen Weg von 1 GΩ zu
der Analytkammer 440 parallel mit der interessierenden
Pore. Für
ein Feld von 10 Sensoreinheiten wäre der Nettokurzschluss einer
einzelnen Pore 480 durch die anderen Sensoreinheiten in
der Größenordnung
von 100 Megaohm (GΩ),
was das Aufzeichnen einer einzelnen Messeinheit undurchführbar macht.
Für 1000
Elemente wäre
der Kurzschlusswiderstand 1 GΩ.
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Zum
Reduzieren des Effekts eines Kurzschlusses des Koppelns von Sensorelementen
miteinander werden Löcher 485 mit
einem sehr engen Durchmesser gebildet, wie in 13 gezeigt
ist, wodurch der Reihenwiderstand mit jeder zugehörigen Pore 480 zunimmt.
Beispielsweise ist der Widerstand eines Lochs mit einem Durchmesser
von 10 μm
in einer 6 μm
zweiten Schicht 440 in der Größenordnung von 100 GΩ. Zum Einstellen
des erforderlichen Reihenwiderstands werden die Kombination aus
der Querschnittsfläche
der Pore 445 und der Elektrolytleitfähigkeit wie gewünscht eingestellt.
In jedem Fall ist ein Widerstand des Lochs 445 von wenigstens
n × 1
GΩ bevorzugt,
um eine geeignete Isolation der Pore 480 zu erreichen,
wobei n die Anzahl der Messelemente in dem Feld ist. Mit dem kontrollierten
Widerstand ist es möglich,
viele Sensorelemente durch kurzschließende fluidische Wege zwischen
den Elementen zu verbinden und einen einzigen Zwischenkammerkanal 457 zu
verwenden zum Verbinden des außen
gelegenen Fluidreservoirs.
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Da
es nicht erforderlich ist, die einzelnen Sensorkammern 450, 451 fluidisch
in dem GΩ Ausmaß zu isolieren,
ist es nicht erforderlich, die zweite Schicht 440 auf der
Oberseite jeder Sensorkammer 450 abzudichten. Stattdessen
ist es nur erforderlich, einen äußeren Durchmesser
der zweiten Schicht 440 abzudichten, um eine Gesamtisolation
des verbundenen Sensorkammerfeldes von der Analytkammer zu isolieren.
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Diese
Abdichtung ist in 13 bei 491 gezeigt.
Die Übereinstimmung
mit dem am meisten bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung
wird eine einzige mechanische Verbindung an dem äußeren Rand der zweiten Schicht 440 verwendet,
die es erlaubt, eine relativ große Breite für den Verbindungsbereich zu
verwenden bei einer Vereinfachung des Abdichtvorgangs. Insbesondere
vereinfacht das Verwenden einer Einschichtabdichtung 491 statt
einer Mehrzahl von kleinen Abdichtungen erheblich die Herstellung
des Systems und minimiert die Trennung zwischen den Sensorkammern 450, 451,
wodurch das Volumen des Analyts, das in die Analytkammer eingeführt werden
muss, reduziert wird. In Übereinstimmung
mit der Erfindung hat der Zwischenelementkanal 445 einen
weitaus größeren Widerstand
als der Widerstand entlang einer einzelnen Sensorkammer 450,
was sicherstellt, dass der meiste des Stroms, der durch eine bestimmte
Pore 480 strömt, an
der der Pore zugehörigen
Elektrode 495 ankommt, wodurch eine Identifizierung der
Aktivität
einer einzelnen Pore 480 erlaubt wird.
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Typischerweise
ist der Reihenwiderstand mit einer Pore bei einer schwebenden Membran
und einem Patchklemmsystem spezifisch vermieden zum Minimieren des
Rauschens und der maximalen Bandbreite des Systems. Die Verwendung
eines sehr kleinen Bereichs der über
das Loch schwebenden Barriere nach der Vorliegenden Erfindung reduziert
das Erfordernis etwas. Beispielsweise ist die Kapazität, die mit
einer Pore in einer 50 μm
Zweischicht-Lipidmembran
liegt, in der Größenordnung
von 100 Picofarad (pF), während
die Kapazität,
die parallell mit einer Pore in einer Zweischicht-Lipidmembran liegt
mit einem Durchmesser von 50 Nanometern (nm) in der Größenordnung
von 0,01 Femptofarad (fF). Die Zunahme des Widerstands wird jedoch weiter überwunden
durch Verwendung eines kapazitiven Ausleseschemas, in dem das elektrische
Potential des verwendeten Elektrolytmediums in der Sensorkammer 450 durch
eine Elektrode 495 gemessen wird, die das Elektrolytmedium
in einer kapazitiven statt einer ohmschen Weise koppelt. Die Impedanz
der kapazitiven Elektrode 495 und dem zugehörigen Erststufenverstärker sind
hoch und daher hat ein hoher Widerstand des Lochs 445 in
Reihe mit einer gegebenen Pore 480 einen minimalen Effekt.
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Ein
Model eines Schaltkreises, der verwendet wird, um die dynamische
Systemantwort bei der vorliegenden Erfindung gemessen, ist in 14 gezeigt.
Ein Kanalwiderstand Ra in der Größenordnung
von 10 GΩ wird
absichtlich über
den Kurzschlußfluidweg 455 addiert,
wie in 13 gezeigt. Eine simulierte
Antwort für eine
AC-Modulation und Demodulation bei dem Impedanzsondenverfahren bei
Verwendung des Schaltkreismodells von 14 ist
in 15 gezeigt. Die Kapazität der Membran (Cm) wurde auf
1 fF eingestellt, um den Effekt der Streukapazität zu erlauben. Wesentliche
Punkte entlang der Modellschaltung sind in 14 als Punkte
B und C bezeichnet. Punkt B zeigt ein Signal, das mit einem Mischer
M1 und einem Oszillator V3 demoduliert ist. Punkt C zeigt das Signal
nach dem Demodulieren und Filtern über einen Tiefpassfilter (LPF)
bei U2. Das modulierte Eingangssignal, das an dem Punkt B gemessen
wird vor der Demodulation ist in 15 gezeigt.
Das Schalten dieses Porenzustands ist deutlich erkennbar auch bei
einer Addition des zusätzlichen 10
GΩ Zugangswiderstands
von dem kurzgeschlossenen Fluidweg 455. Dieses Signal wird
demoduliert zur Erzeugung eines Signals, das in 9 gezeigt
ist, äquivalent
ist.
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Das
berechnete äquivalente
Spannungsrauschen für
alle Komponenten dann, wenn eine Pore in einem offenen Zustand ist
(Rp = 1 GΩ)
ist in
16 gezeigt. Das Rauschen in
einem geschlossenporigen Zustand ist geringer und der Beitrag von
dem addierten Zwischenkammerkanalwiderstand vernachlässigbar
verglichen mit der Impedanz in dem geschlossenporigen Zustand. Das
projizierte Signal, das Rauschen und das Signal/Rausch-Verhältnis mit
und ohne dem zugefügten
Widerstand für
einen aufgebrachten Porenstrom von 0,707 pa
ms für eine Pore,
die zwischen einem Widerstandszustand von 1 GΩ (offen) und 300 GΩ (geschlossen) umschaltet,
sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle
1: Zusammenfassung
der Systemsimulation für
einen zugefügten
Reihenwiderstand
- * Rauschen basierend auf einem offenporigen
Zustand
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In
Tabelle 1 wurde das Rauschen in einer kHz Bandbreite erhalten durch
Integration des Rauschspektrums von 9 kHz bis 11 kHz und ist äquivalent
zu dem Rauschen, das an dem Punkt B in 14 gemessen wurde.
Der Signalpegel wird als Amplitude der 10 kHz Quelle an dem Punkt
B genommen für
die unterschiedlichen Porenzustände.
Ein Addieren eines hohen Reihenwiderstands mit der Pore verbessert,
wie sich aus der Tabelle 1 ergibt, das Signal/Rausch-Verhältnis des
Systems um den Faktor 2 zusätzlich
zu dem Schaffen der Möglichkeit
die Sensorkammern gemeinsam in einem Feld zu koppeln.
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Gestützte Konfiguration
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Bei
der gestützten
Konfiguration des bevorzugten Ausführungsbeispiels ist ein System 500,
das eine Membran 560, etwa einer Zweischicht-Lipidmembran
mit einer Pore 580 von einer kontinuierlichen Unterschicht
gestützt,
die aus einem Polymer, einem Wasserpolster oder einem anderen geeigneten
Material gefertigt ist. Im Gegensatz zu der Konfiguration mit einer
schwebenden Membran weist die Unterschicht kein Loch auf, um den
Einschluss der Pore 580 zu ermöglichen und ein Vorragen der
Pore 580 durch die Membran 560, sondern es ist
stattdessen ein Material mit einer ausreichenden Fluidität oder Elastizität zum Aufnehmen
des Körpers
der Pore. In der gestützten
Konfiguration definiert die Unterschicht die Messkammer, wie in 17 gezeigt.
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Ein
wesentliches Designmerkmal des gestützten Membransystems 500 ist
das Isolieren einer Sensoreleketrode 585 von dem Elektrolytmedium
einer Analytkammer 587. Die Isolation der Sensorelektrode 585 wird
vorzugsweise verbessert, indem die Membran 560 die Sensorelektrode 585 überlappt,
wodurch die Länge des
Weges zwischen der Sensorelektrode 585 und dem Elektrolyt
in der Analytkammer 587 vergrößert wird. Eine Analyse legt
nahe, dass dann, wenn die Größe der Membran
vergrößert wird,
der direkte Widerstand der Messelektrode 585 der Analytkammer 587 (d.
h., nicht über
die Pore 580) bei ungefähr
dem Zehnfachen des Wertes stabilisiert, der gefunden wurde, wenn
die Membran 560 der Messeleketrode 585 in der
Größe gleich ist.
Um sich an diesen Grenzwert anzunähern, ist der Durchmesser der
Membran 560 vorzugsweise in der Größenordnung das Fünffache
des Durchmessers der Sensorelektrode 585. Für eine Sensorelektrode
mit einem Durchmesser von 1 μm
ist der Grenzwiderstand (shunt) ungefähr 5 Megaohm (GΩ) und umso
kleiner die Messelektrode umso höher
ist der Shuntwiderstand. Es ist daher schwierig, eine Gigaabdichtung
einfach durch Erhöhen
des Durchmessers der Membran 560 zu erreichen. Eine weitere
Zunahme des lateralen Überlappens hat
einen direkten Effekt auf die Größe der Analytkammer 587 und
damit die Empfindlichkeit des Systems 10.
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Eine
Isolation der Sensorelektrode 585 kann auch verbessert
werden durch ein Querverbinden der Polymergurte 590 oder
ein anderes Ändern
des Mechanismus der Membrananbringung an die elektronische Schicht 594,
um so den Rand der Membran um einzelne Sensorelektroden 585 abzudichten.
Vorzugsweise wird eine Gruppe von Polymergurten 590 von
einer genauen Kettenlänge
an die Elektrode 585 gebondet und weist die Stütze für die Membran 560 auf.
Zusätzlich
wird eine Barriere aus einem Isolationsmaterial 595 vorzugsweise
um die Elektrode 585 gebildet, um so einen ohmschen Kontakt
zwischen dem Elektrolytvolumen, das durch den gegurteten Bereich
definiert wird und der Analytkamer 587 zu verhindern, wie
in 18 gezeigt. Ein weiteres Verfahren des Isolierens
der Sensorelektrode 585 von dem lateralen Widerstandweg
und der Membran 560 wird auf das Potential des Steuerrings 599 bestimmt
unter Verwendung einer Rückkopplung
von der Sensorelektrode 585.
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Feldgröße und Abwägungsaspekte
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Das
sich ergebende Feld von Sensorelementen erlaubt es einem Verwender
komplexe biologische Fingerabdrücke
(Biofingerabdrücke)
zu gewinnen, die charakteristisch sind für das Vorhandensein bestimmter Krankheiten,
Toxine, biologischer Antworten usw. Derartige Biofingerabdrücke sind
nicht auf einen einzelnen Typ von Analyten beschränkt.
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In
den meisten Fällen
ist das beschriebene System durch die Diffusionsrate der Analytmoleküle in dem Elektrolytmedium
begrenzt. Die Interaktionsrate der Analyte und der Poren ist so
proportional zu der Analytkonzentration. Bei dem Vorhandensein von
anderen Effekten erfordert eine gegebene erwünschte Antwortzeit eine spezifische
Konzentration wie sie bestimmt ist durch die zugehörige Konstante
des gewünschten
Analyts und des Sensorelements. Beispielsweise ist eine durchschnittliche
zugehörige
konstante Rate von 108 (1/M-sec) eine nM
Lösung
erforderlich zur Bewirkung einer schnellen (1 Sekunde) Antwortzeit.
Dieses Verhältnis
gegeben wird die absolute Menge des Analyts, das in einer vernünftigen
Zeitdauer detektiert wird, bestimmt durch das Volumen der Analytkammer.
Diese Kammer deckt vorzugsweise das gesamte Sensorfeld ab und ist so
bestimmt durch die Anzahl der Sensoreinheiten, ihren Abstand voneinander
und ihre individuelle Größe. Unter
der Annahme eines Abstands zwischen den Elementen von 50 μm und 25 × 4 Sensorelementen
in einem Feld ist die Beziehung zwischen der maximalen seitlichen Erstreckung
der Sensoreinheit und der sich ergebenden Sensorsensitivität für 1 nM Analyt
in 19 gezeigt.
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Für eine Sensorelementdimension
von 100 μm
ist die Sensitivität
einer einzelnen Sensoreinheit abgeschätzt als in der Größenordnung
von 1 Attomol (amol) und 100 amol für ein Feld mit 100 Einheiten.
Für eine geschützte Membran,
wie sie in dem bevorzugten Ausführungsbeispiel
beschrieben worden ist, kann es möglich sein, eine laterale Größe von 10 μm zu erreichen
mit einer sich ergebenden Sensitivität in der Größenordnung von 0,2 amol für eine einzelne
Sensoreinheit und 2 amol für
ein Feld mit 100 Einheiten.
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Diese
Abschätzung
setzt nicht eine Reduktion in der akzeptablen Analytkonzentration
von der Elektrophorese voraus. Für
eine Reduktion eines Faktors von 10 in der Antwortzeit aufgrund
einer elektrophoretischen Lieferung des Analyts könnte die
erforderliche Konzentration um den Faktor 10 reduziert werden, was zu
einer entsprechenden Verbesserung in der Sensitivität führt.
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Die
besondere Konstruktion des Sensorsystems nach der vorliegenden Erfindung
ermöglicht
die Konstruktion jedes Sensorsystems auf einem einzelnen Chip, Glas
oder einem anderen geeigneten Substrat ohne die Verwendung von komplexen
adressierbaren Mikrofluiden. Die Verwendung einer AC-Auslesung ermöglicht sehr
kleine Sensorelementvolumen, was zu extrem hohen Feldsensitivitäten führt. Die
Verwendung einer allgemeinen Membranarchitektur bewirkt die Verwendung
eines weiten Bereichs von Poren. Diese Flexibilität erlaubt
eine schnelle Änderung
der Zusammensetzung für
das Sensorfeld durch Verwendung von unterschiedlichen Poren. Durch
Schaffen dieser Vorteile überbrückt die
Erfindung wirksam den Spalt zwischen den biologischen Sensormöglichkeiten
auf Nanometerebene und modernen mikroelektronischen Verfahren auf
der Mikronebene.
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Obwohl
die Erfindung unter Bezugnahme auf ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel
beschrieben worden ist, versteht es sich, dass verschiedene Änderungen
und/oder Abwandlungen bei der Erfindung durchgeführt werden können, ohne
sich von dessen Grundgedanken zu lösen. Im Allgemeinen kann die
Erfindung lediglich durch den Schutzbereich der nachfolgenden Ansprüche begrenzt
werden.
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ZUSAMMENFASSUNG
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Ein
integriertes Feld (37) von elektrischen Sensorelementen
(20, 21, 22) gibt einen Bio-Fingerabdruck eines
Analyts aus. Das System (10) ist vorzugsweise aus einer
Reihe von drei Schichten (35, 75, 100)
aufgebaut, es muss aber nicht so angeordnet sein. Eine obere Schicht
(100) definiert ein erstes Fluid oder eine Analytkammer
(40), eine mittlere Schicht (35) beinhaltet die
Sensorelemente (20, 21, 22) und eine
dritte Schicht (75) beinhaltet elektronische Ausleseelemente.
Die Analytkammer (40) beinhaltet ein Elektrolyt und ein
zu erkennendes Analyt. Die Sensorelemente (20, 21, 22)
sind optimiert für
eine maximale Detektionsgeschwindigkeit bei einer minimalen Antwortzeit.
Die Antwort jedes Sensorelements (20, 21, 22)
wird durch eine bestimmte Sensorelektrode (30, 31, 32)
ausgelesen. Um jede Elektrode (30, 31, 32)
ist ein Steuerring (70) angeordnet. Das Potential des Steurrings
(70) wird eingestellt zum Anziehen der interessierenden
Analyte an die Sensorelemente (20, 21, 22).
