WO2022043136A1 - Vorrichtung und verfahren zur detektion von einem wassertransport durch mindestens eine schicht biologischer zellen - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur detektion von einem wassertransport durch mindestens eine schicht biologischer zellen Download PDF

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WO2022043136A1
WO2022043136A1 PCT/EP2021/072849 EP2021072849W WO2022043136A1 WO 2022043136 A1 WO2022043136 A1 WO 2022043136A1 EP 2021072849 W EP2021072849 W EP 2021072849W WO 2022043136 A1 WO2022043136 A1 WO 2022043136A1
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WO
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container
electrodes
biological cells
aqueous solution
layer
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PCT/EP2021/072849
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Kathrin HAJEK
Joachim Wegener
Florian URBAN
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Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V.
Universität Regensburg
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/02—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance
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    • G—PHYSICS
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells

Definitions

  • a device for detecting water transport through or across at least one layer of biological cells containing a first and second container, the second container being at least partially arranged inside the first container, so that two separate compartments are formed.
  • the bottom of the second container consists at least in areas of a flat, water-permeable substrate for growing biological cells, and the bottom of the first container has a pair of electrodes whose electrodes each have an electrical connection that leads to a space outside the first container .
  • the first parameter is the permeability of the cell layer for molecular probes and is characterized by the so-called permeability coefficient (“P E value”) (unit: in cm/s).
  • the second parameter is the electrical resistance of a cell layer and describes the permeability of the cell layer for inorganic ions (unit: ⁇ .cm 2 ).
  • the third parameter is the permeability of the cell layer for water molecules and is generally described in terms of the hydraulic conductivity L p or the osmotic water permeability coefficient P OS (unit: cm/s), depending on whether the water flow is due to a hydrostatic gradient or an osmotic gradient is induced along the cell layer.
  • the focus is primarily on the water transport through the cell layer as a result of an osmotic gradient across the cell layer, which is quantified by the osmotic water permeability coefficient P OS , because it is easier to determine experimentally.
  • High P OS values indicate a particularly high water permeability of a cell layer. High P OS values are obtained especially for cell layers of kidney cells.
  • the degree of water permeability of a cell layer is primarily defined by certain water-permeable proteins (so-called water channels) in the cell membrane of individual cells in the cell layer.
  • water channels are, for example, aquaporins.
  • the aquaporins change the permeability of the cell layer to water significantly.
  • the biosynthesis of a certain number of aquaporins is therefore used by biological cells as a control element in order to adapt the water permeability of the cell membrane of the biological cells to their physiological needs.
  • Aquaporin malfunctions, for example as a result of a corresponding gene mutation, lead to various diseases such as visual impairments, epileptic seizures or obesity. Aquaporins are even associated with tumor growth and tumor spread in the body. As a result, aquaporins are increasingly coming into focus as target proteins (target) for finding active ingredients for the treatment of these diseases.
  • target proteins target
  • the water transport (or water flow) through a biological cell layer describes the water flow through the biological cell, ie through a first biological membrane on a first side of a biological cell (eg an upper side) into the biological cell and a water flow over min - at least one second biological membrane of the biological cell (eg an underside) out of the biological cell, ie a flow of water through at least two cell membranes.
  • This flow of water does not necessarily change the volume of the biological cell, since the outflow of water can be the same as the inflow of water.
  • the situation is different, for example, when determining a transmembrane water transport (or water flow), which is not the subject here, but which is nevertheless briefly described here.
  • the determination of the Membrane water flow only examines either the water transport from a cell into an extracellular space or from an extracellular space into a cell, ie with this type of water flow only water flow through a single cell membrane is examined. Since the biological cells inevitably change their volume during this investigation of the water flow due to the inflow or outflow of water, the transmembrane water flow can be determined quite simply by determining a volume increase or volume decrease of the biological cells due to a change in volume of the biological cells detect cells.
  • the biological cells to be examined are first cultivated on a porous, water-permeable substrate that is arranged in the bottom of a liquid container.
  • a liquid container is often referred to as a "Transwell insert", where the porous, water-permeable substrate in its bottom is often a porous polymer membrane. Due to the water permeability of the porous substrate on which the biological cells are cultivated before the measurement, the biological cells not only have access to an aqueous solution on their upper side, but also on their underside.
  • the liquid container is inserted into a second, larger liquid container and held by it in such a way that the porous, water-permeable substrate is at a certain distance from it. sen bottom.
  • the liquid container used thus separates the resulting device into two liquid half-spaces, namely a liquid half-space above the biological cell layer (upper or apical compartment) and a liquid half-space below the biological cell layer (lower or basal compartment).
  • the porous, water-permeable substrate is designed according to the number and size of the pores in such a way that it does not significantly affect the measurement of the water permeability of a cell layer.
  • the cell layer is intended to be the layer or entity that determines the rate of water transport between these two compartments.
  • P OS value water permeability coefficient
  • the system attempts to compensate for this non-equilibrium state by forcing water in the direction of higher osmolarity, whereby the water flow is forced through in the case of a confluent cell layer, in which the cells are arranged side by side without any gaps on the porous, water-permeable substrate the biological cells of the cell layer must take place.
  • the water permeability coefficient of the biological cell layer can be determined from the experimentally determined rate of this water transport through the biological cell layer.
  • a thin glass capillary is used which is fluidically connected to one of the two liquid half-spaces.
  • the flow of water through the cell layer triggered by the osmotic gradient changes the liquid level in both compartments.
  • the water flow can be directly quantified based on the change in the liquid meniscus in the glass capillary.
  • the exact level of the meniscus is analyzed completely automatically using an electro-optical method.
  • This technique is a direct measurement method, but it is technically complex and difficult to parallelize. For simultaneous testing of several cell layers under different conditions at medium to high Throughput, such devices or methods cannot be used economically and inexpensively.
  • a non-cell-permeable fluorophore is placed in one of the two compartments.
  • FITC-, TRITC- or TexasRedTM-treated dextrans are usually used for this purpose. Due to the flow of water through the cell layer, there is either a dilution effect or a concentration effect of the fluorophore in the relevant compartment and thus changes in the fluorescence intensity over time. The change in the fluorescence intensity is measured by taking a liquid sample from the compartment in which the fluorescence marker is located. The amount of water transported into or out of the compartment can be determined from the course of the fluorescence intensity over time and converted to P OS values.
  • a disadvantage here is that the samples have to be taken from the fluorophore-added compartment at certain time intervals, which is time-consuming and information is lost between these time intervals, resulting in poor temporal resolution.
  • manual sampling is error-prone, which means that the reproducibility of the results obtained is low.
  • the biological cell layer can be disturbed by the repeated manual removal of a sample, ie for example the temperature, the pH value and/or the gas atmosphere in the measurement system can be changed, which can lead to significant artefacts and physiologically irrelevant measurement results .
  • the possible sample throughput per time is also severely limited with this procedure due to the manual removal of samples. On top of that, just at one High throughput, the costs for using the fluorophore can be high.
  • the presence of the fluorophore can in principle develop its own biological effect, which can interfere with the measurement result and also falsify the determination of the effect of a substance that was specifically added to the measurement system in order to examine its influence on the water transport of the cell layer.
  • the devices and methods known in the prior art also have the disadvantage that they cannot detect the water transport across a cell layer in a spatially resolved manner along the lateral extent of the cell layer, but rather the water transport can only be detected integrally, ie ultimately an average value various local individual water transport values are determined.
  • a spatially resolved determination of the water transport along the lateral extent of the cell layer would be advantageous since the water barrier function of the cell layer is not necessarily distributed homogeneously over the entire area of the cell layer. It would therefore be desirable to be able to test the entire surface of the cell layer at several points of the cell layer for its water barrier function in a spatially resolved manner in order to obtain information about a lateral distribution of the water permeability coefficients along the cell layer.
  • such a measurement would be less susceptible to imperfections or defects in the cell layer, since these can be easily identified via the spatial resolution and can be ignored in the assessment.
  • a device for detecting water transport through at least one layer of biological cells having at least one detection chamber which a) contains at least one first container for receiving liquid; and b) includes at least a second reservoir for receiving liquid at least partially disposed within said first reservoir; wherein a bottom of the at least one second container consists at least in regions of a flat, water-permeable substrate, wherein the surfaces of this substrate are suitable for allowing biological cells to grow, and wherein the at least one second container is arranged in this way in the at least one first container is that a lower compartment is formed in the at least one first container and an upper compartment is formed in the at least one second container; characterized in that a bottom of the at least one first container has at least one pair of electrodes, the electrodes of the at least one pair of electrodes each having an electrical connection which leads to a space outside the first container.
  • water transport means “water flow”, ie the term “water transport” means passive transport of water through the at least one layer of biological cells, which also includes passive transport via water channels can include in the cell membranes of the biological cells.
  • the device according to the invention allows non-invasive detection of water transport across at least one biological cell layer in a simple, fast, robust and reproducible manner with a high time resolution.
  • the temporal resolution of the examination that is possible with the device according to the invention is in the range of a few seconds and consequently provides precise information on the course of the cellular water transport over time.
  • an electrical resistance eg an impedance measurement
  • the measurement is carried out in a non-invasive manner, so that the cells being examined are not influenced or damaged by the measurement and the cellular water transport can also be tracked over a long measurement period without falsifying the measurement result.
  • the measurement with the device according to the invention can be completely computer-controlled and requires no further intervention by a user after an osmolyte has been added to the first and/or second container. Repeated removal of a sample, which disturbs the cell culture and inevitably involves disruption of the temperature and the gas and moisture atmosphere, is not necessary or eliminated.
  • the device according to the invention can be characterized in that the device has at least two, at least four, at least eight, at least 16, at least 32, at least 64 or at least 96 of these detection chambers, the detection chambers preferably being arranged side by side on a plate and the respective electrical connections of the respective pairs of electrodes into a space outside the plate, in particular into a space below the plate.
  • Plate can be designed as a so-called well plate.
  • the advantage of the large number of detection chambers is that the water transport can be measured in parallel (simultaneously) via at least one layer of biological cells, whereby the biological layers can differ from detection chamber to detection chamber or the biological layers of the respective detection chambers can be the same and the respective detection chambers differ in the composition of the liquid liquids in the first and/or second container (e.g. different active substances in the liquids).
  • the device according to the invention thus enables a simultaneous (automated) measurement with high parallelization and thus a significantly higher sample throughput than with known devices.
  • This embodiment is therefore particularly advantageous for pharmaceutical studies and biomedical research, in which high sample throughput represents a decisive economic criterion.
  • the device according to the invention can be characterized in that the bottom of the at least one first container has at least two, preferably at least three, particularly preferably at least four, very particularly preferably at least five, in particular at least six, optionally at least ten pairs of electrodes, wherein the electrodes of the respective pairs of electrodes each have an electrical connection leading to a space outside the first container.
  • the advantage here is that a spatially resolved detection of the water transport through the at least one layer of biological cells is possible, ie the water transport can be resolved in the lateral direction along the layer, thereby revealing local differences in the water transport along the lateral extent of the layer be able.
  • the device according to the invention can be characterized in that the lower compartment has a further electrode, preferably a planar film electrode, and the upper compartment has a further electrode, preferably a stamp electrode, the further electrode of the lower compartment preferably being located at the bottom of the at least one is arranged in the first container and/or the further electrode of the upper compartment is preferably held in the upper compartment via a holder or is arranged on an inner side wall of the at least one second container.
  • the other electrodes in the upper and lower compartments have, in particular, an electrical connection via which they can be electrically connected to a measuring device.
  • This embodiment has the advantage that, in addition to the water transport through the at least one layer of biological cells, the transepithelial electrical resistance (TER) can be determined via the at least one layer of biological cells.
  • P OS value degree of water transport
  • TER value transepithelial electrical resistance
  • Both the TER value and the P OS value can each be determined by measuring the electrical conductivity (preferably an electrical impedance).
  • the TER value provides (integral) information about the permeability of the cell layer vs. inorganic ions
  • the P OS value provides (also spatially resolved) information about the water permeability of the cell layer. Both parameters can be obtained from the same at least one layer of biological cells and can thus be directly correlated with one another.
  • the at least one first container of the device according to the invention is preferably dimensionally stable up to a temperature of 120.degree.
  • the advantage here is that the at least one first container of the device can be autoclaved, i.e. can be sterilized by the action of temperature without the first container being structurally damaged by this treatment. Furthermore, this temperature stability allows the pair of electrodes of the at least one first container to be applied to the first container by means of photolithographic structuring.
  • the at least one first container of the device can contain or consist of plastic and/or glass, the plastic preferably being selected from the group consisting of polycarbonate, polyethylene terephthalate, polystyrene, polymethyl methacrylate, polytetrafluoroethylene, polyurethane and mixtures and combinations thereof.
  • the at least one second container can be designed as a disposable material.
  • the advantage here is that the at least one second container can be disposed of after a measurement and does not have to be sterilized for a further measurement.
  • the at least one pair of electrodes on the bottom of the first container preferably contains or consists of two film electrodes. The two film electrodes are preferably coplanar.
  • the two film electrodes can be essentially round. Furthermore, the two film electrodes can each (on a side facing the second container) have an area in the range from 0.01 to 5.0 mm 2 , preferably 0.02 to 1.0 mm 2 , particularly preferably 0.05 to 0 .50 mm 2 , in particular 0.10 to 0.25 mm 2 . Apart from this, the two film electrodes can have a distance from one another at their closest point which is in the range from 50 to 1000 ⁇ m, preferably 100 to 600 ⁇ m, particularly preferably 200 to 400 ⁇ m, in particular 300 ⁇ m.
  • the device according to the invention can also be characterized in that the at least one pair of electrodes on the bottom of the first container is dimensionally stable up to a temperature of 120.degree.
  • the advantage here is that the first container can be autoclaved, i.e. can be sterilized by the action of temperature without the at least one pair of electrodes of the first container being damaged by this treatment.
  • the at least one pair of electrodes can have an electrical resistance of at most 100 ⁇ /square.
  • the at least one pair of electrodes can contain or consist of a material selected from the group consisting of metal, electrically conductive metal compound, carbon, electrically conductive plastic and combinations thereof, with the material particularly preferably being selected from the group consisting of Gold, titanium, indium tin oxide, graphene, polyaniline, polypyrrole, polythiophene, PEDOT, and combinations thereof, where the material is optionally doped and/or chemically modified.
  • the electrical connection of the electrodes of the at least one pair of electrodes can contain or consist of an electrical cable. Furthermore, the electrical connection can be dimensionally stable up to a temperature of 120 °C.
  • the advantage here is that the first container can be autoclaved, ie can be sterilized by the action of temperature without the electrical connection of the at least one pair of electrodes of the first container being damaged by this treatment.
  • the electrical connection preferably has an electrical resistance of at most 100 ⁇ /square.
  • the electrical connection contain or consist of a material that is selected from the group consisting of metal, electrically conductive metal compound, carbon, electrically conductive plastic and combinations thereof, the material being particularly preferably selected from the group consisting of gold, titanium, indium Tin oxide, graphene, polyaniline, polypyrrole, polythiophene, PEDOT and combinations thereof, where the material is optionally doped and/or chemically modified.
  • the electrically conductive connection can also have electrical insulation made from an electrically non-conductive material, preferably in the form of a jacket or coating around or over an electrical line.
  • the electrical connection is electrically conductively connected to a device for measuring an electrical conductivity, the device preferably being configured for measuring an electrical impedance.
  • the flat, water-permeable substrate of the second container can contain or consist of plastic and/or glass, the plastic being particularly preferably selected from the group consisting of polycarbonate, polyester, polyethylene terephthalate, polystyrene, polymethyl methacrylate, collagen-coated Polytetrafluoroethylene, polyurethane and mixtures and combinations thereof, the plastic being in particular polycarbonate.
  • the flat, water-permeable substrate of the second container can have continuous pores with an average pore diameter in the range from 0.1 to 10.0 ⁇ m, preferably 0.2 to 7.5 ⁇ m, particularly preferably 0.4 to 5.0 ⁇ m, optionally 0.4 to 3.0 ⁇ m.
  • the advantage of these pore diameters is that on the one hand water can flow through the pores and on the other hand the biological cells are retained, i.e. they remain on the substrate during the water transport.
  • the flat, water-permeable substrate of the second container can have continuous pores with a pore density of at least 10 5 pores per cm 2 , preferably at least 10 6 pores per cm 2 , particularly preferably 10 6 to 10 8 pores per cm 2 .
  • Higher pore densities are advantageous because they allow a more precise detection of the water transport through the at least one layer of biological cells and also in the spatially resolved detection of the Allow water transport in the lateral direction along the at least one layer of biological cells finer spatial resolution.
  • the flat, water-permeable substrate of the second container can have a height in the range from 5 to 100 ⁇ m, preferably in the range from 10 to 50 ⁇ m, particularly preferably 15 to 30 ⁇ m, perpendicular to its flat extension.
  • this height range ensures sufficiently high mechanical stability to support the at least one layer of biological cells and, on the other hand, only forms a short passage distance for water through the substrate. The latter allows time-dependent changes in water transport to be recorded with a high time resolution.
  • the flat, water-permeable substrate of the second container can have at least one layer of biological cells on a side facing away from the first compartment and/or on a side facing the first compartment.
  • This embodiment has the advantage that the detection of water transport through the at least one layer of biological cells can be started without the biological cells having previously grown onto the flat, water-permeable substrate. The measurement can therefore be started more quickly.
  • the at least one layer of biological cells is confluent, ie there is at least one layer of biological cells without gaps.
  • the at least one layer of biological cells can be a single layer (monolayer) of biological cells or it can be a plurality of layers of biological cells lying one on top of the other (eg a biological tissue).
  • the at least one layer can contain or consist of cells which either have no water transport protein in their cell membrane or have at least one water transport protein in their cell membrane, the water transport protein being in particular at least one aquaporin.
  • the advantage of the second case is that the water transport through the layer of biological cells can be measured under the influence of the water transport protein.
  • the quantitative contribution of the water transport protein to the water transport through the at least one layer of biological cells can also be calculated from the difference between the two determined degrees of water transport.
  • the device can include a temperature control unit which is configured to keep the temperature of the device constant, the temperature control unit preferably being a (e.g. external) heating unit, in particular a heating cabinet.
  • the temperature control unit preferably being a (e.g. external) heating unit, in particular a heating cabinet.
  • the advantage here is that the user does not need an additional temperature control unit in order to keep the temperature of the device constant.
  • a method for detecting water transport through at least one layer of biological cells comprising the steps of a) providing a device according to the invention, the flat, water-permeable substrate of the second container on a side facing away from the first compartment and/or or has at least one layer of biological cells on a side facing the first compartment; b) Electrically connecting the electrodes of the at least one pair of electrodes to a device for measuring electrical conductivity (e.g.
  • the method can be characterized in that the device used in the method for measuring an electrical conductivity is configured for measuring an electrical impedance.
  • a change in the electrical impedance over time is currently measured.
  • the electrical impedance is particularly preferably measured at an AC voltage amplitude of ⁇ 50 mV.
  • the electrical impedance is preferably measured at an AC voltage frequency of ⁇ 10 4 Hz, preferably an AC voltage frequency in the range from 10 4 to 10 6 Hz, in particular 10 5 Hz.
  • the electrical impedance is measured at an AC voltage frequency of ⁇ 10 4 Hz, preferably 0.1 to 10 Hz, in particular 1 Hz, when the first compartment is or is filled with an aqueous solution Redox pair, preferably K 2 [Fe(CN) 6 ] IK 3 [Fe(CN) 6 ] contains.
  • the method can be characterized in that the first aqueous solution and/or the second aqueous solution contains a buffer which has a buffering effect in the range from pH 7 to 8. Furthermore, the first and/or second aqueous solution can contain a salt, preferably NaCl and KCl. In addition, the first and/or second aqueous solution can have a temperature in the range from >0° C. to 55° C., preferably a temperature in the range from 10° to 45° C., particularly preferably a temperature in the range from 30° C. to 40 °C, in particular a temperature of 37 °C.
  • the different osmolarity of the second aqueous solution from the first aqueous solution is preferably set via a different concentration of a soluble molecule selected from the group consisting of uncharged molecules that do not pass through the cell membrane, with the soluble molecule being particularly preferably selected from the group consisting of disaccharides, oligosaccharides, polysaccharides and combinations thereof.
  • the soluble molecule is selected from the group consisting of sucrose, mannitol, inulin and combinations thereof.
  • the method can be characterized in that the first and/or the second aqueous solution contains an active substance which is assumed to have an effect on the transport of water through the at least one layer of biological cells.
  • an active substance which is assumed to have an effect on the activity of a water transport protein, in particular an aquaporin, in the cell membrane of the biological cells.
  • a water transport protein in particular an aquaporin
  • the discovery of selective and non-toxic aquaporin inhibitors in the biomedical. Great importance is attached to research. It is hypothesized that inhibitors of the water channel AQP1 can limit tumor spread and tumor growth, and that inhibitors against AQP4 can prevent brain swelling secondary to stroke.
  • the embodiment of the method described here can make the identification of new and improved aquaporin inhibitors significantly easier and more efficient.
  • the use of a measurement of an electrical conductivity is also proposed for the detection of water transport over at least one layer of biological cells.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of a device for detecting osmotically induced water transport via a confluent monolayer of biological cells from the prior art.
  • Biological cells are cultivated on the flat, water-permeable substrate of the second container (here a "Transwell insert” from Corning) until a confluent single layer of the biological cells has formed.
  • the second container is then placed in the first
  • the osmolarity of the aqueous solution in the upper compartment ie above the layer of biological cells
  • is compared to the osmolarity of the aqueous solution in the lower compartment e.g.
  • the rate of water flow over time is shown in de n devices from the prior art either by measuring the change in the water level in a riser over time ( Figure 1, top right) or by measuring the change in fluorescence intensity of a fluorescent dye in the aqueous solution in the upper compartment ( Figure 1, bottom right).
  • the determined rate of water flow over time provides information about the water transport coefficient of the monolayer of biological cells.
  • Figure 2 shows a schematic left of a device according to the invention for impedi- metric detection of osmotically induced water transport via a confluent single layer of biological cells 4.
  • the structure of the device is identical to Figure 1, with the difference that the first compartment 5 has no fluidic connection to a riser must have and no fluorescent marker must be present in the second compartment 6, and the bottom of the container, which forms the first compartment, has at least one pair of electrodes 7, the electrodes of the at least one pair of electrodes 7 each having an electrical connection 8, which leads to a space outside the first container 5 .
  • These electrical connections 8 are electrically conductively connected to a device for determining the electrical conductivity (eg an impedance measuring device, not shown).
  • FIG. 2 The right shows an alternative embodiment in which the electrical connections 8 are formed outside the first container 5 by two large-area, square film electrodes 8 (shown hatched on the right in FIG. 2).
  • the leads are covered with an electrically insulating photopolymer, while the two square film electrodes 8 and the two circular electrodes of the electrode pair 7 are uncovered.
  • the distance between the two center points of the electrodes of the pair of electrodes 7 is 800 ⁇ m and the distance between their closest points is 300 ⁇ m.
  • FIG. 3A schematically shows a section of a side view of a device according to the invention.
  • One electrode of the pair of electrodes (gold layer) is shown, which is partially covered with an electrically insulating photopolymer in the direction of the flat, water-permeable substrate.
  • FIG. 3B shows a typical impedance spectrum that can be obtained with a device according to the invention.
  • the frequency range that is sensitive for determining the water flow was between 10 4 - 10 6 Hz, in which the total impedance of the system is dominated by the electrolyte resistance. It can be seen that the osmotically induced water flow changes the electrical resistance of the solution in the first compartment. In the embodiment described here, 10 5 Hz (100 kHz) has proven to be the most suitable detection frequency.
  • FIG. 1 schematically shows a section of a side view of a device according to the invention.
  • One electrode of the pair of electrodes gold layer
  • an electrically insulating photopolymer in the direction of the flat, water-
  • 3C describes the impedance spectrum shown under FIG. 3B with the aid of an electrical equivalent circuit diagram.
  • the electrode-electrolyte interface (1 - 10 4 Hz) is described by a so-called constant phase element (CPE).
  • CPE constant phase element
  • the resistance of the aqueous solution in the first compartment (R bulk ) dominates the spectrum in the frequency range 10 4 - 10 6 Hz.
  • the two superimposed spectra show the change in frequency-dependent impedance caused by an osmotically induced water flow from below above.
  • FIG. 4 shows the result of an experiment in which a confluent single cell layer of the epithelial cell line MDCK-II is arranged on the flat, water-permeable substrate, while the second aqueous solution in the upper compartment of the device is hyperosmolar compared to the first aqueous ing solution was chosen in the lower compartment of the device.
  • Example 1 Method for detecting water transport through a cell layer at a measuring frequency f of > 10 4 Hz
  • the device according to the invention shown here as an example has a pair of electrodes in a central position on the floor of the chamber.
  • the coplanar electrodes of the electrode pair are made from sputtered gold films with subsequent lithographic structuring.
  • Gold is chemically inert, biocompatible, has very good electrical conductivity and the interface impedance corresponds to a good approximation of an ideally polarizable electrode.
  • the leads which are also made of gold, are coated with an insulating polymer.
  • the lithographically introduced gaps in the polymer define the electrochemically active electrodes.
  • the electrical connection of the electrodes to the measuring electronics (impedance analyzer) is made possible with the help of two rectangular contact sections made of gold (cf. Figure 2, right).
  • the impedance analysis is carried out, for example, using a commercially available impedance analyzer.
  • At least one layer of biological cells is grown on a surface of the flat, water-permeable substrate of the second container.
  • the flat, water-permeable substrate serves as a mechanical support for the biological cell layer.
  • the second container and its porous polymer membrane together with the pair of electrodes enclose a small liquid compartment at the bottom of the first container, the exact volume of which is determined by the distance between the porous polymer membrane and the surface of the pair of electrodes, the distance between the pair of electrodes and the thickness of the is defined as an insulating polymer film applied to the electrical connections.
  • the lower compartment containing the electrode structure is filled with a first aqueous solution and the upper compartment with a second aqueous solution, with the first and second aqueous solutions initially being isotonic, i.e. having the same osmolarity. Then, measurement of an electric conductivity of the first aqueous solution with the lapse of time is made to obtain a baseline.
  • an osmolyte (eg in an aqueous liquid) is added to the first and/or second aqueous solution so that the osmolarity of the first aqueous solution differs from the osmolarity of the second aqueous solution.
  • This measure causes water transport to be induced through the biological cell layer.
  • the electrolyte composition changed by an osmotically induced water flow thus leads to a corresponding change in the electrical resistance between the two electrodes of the electrode pair, which can be registered with the aid of the measurement electronics. Consequently, the electrical conductivity (e.g. electrical impedance) of the first aqueous solution is measured over time to provide a quantitative measure of the degree of water flux. From the changes in electrical conductivity over time (e.g. impedance), the amount of water transported and the water permeability coefficient for the examined cell layer can be determined directly, i.e. without using a fluorophore as a label, with a high temporal resolution.
  • electrical conductivity e.g. electrical impedance
  • the frequency of the applied AC voltage is varied and the AC resistance (impedance) between the two coplanar electrodes of the pair of electrodes is determined as a function of this frequency (see FIG. 3B).
  • the resulting impedance spectrum can be described using an electrochemical model (see FIG. 3C).
  • the medium to low frequency range (1 - 10 4 Hz) is characterized in a double-logarithmic plot by an impedance that increases linearly with decreasing frequency, which is dominated by the electrode-electrolyte interface. This section of the spectrum can be described with a so-called constant phase element (CPE).
  • CPE constant phase element
  • the high-frequency range (10 4 - 10 6 Hz) is dominated by the electrical resistance of the aqueous solution in the first compartment (R bulk ) and can be used to determine the water flow. Consequently, the flow of water across a cell layer can be altered by the associated change in Resistance or conductivity can be detected in this frequency range.
  • the most suitable readout parameter is the change in conductivity, ie the change in the reciprocal value of the real part of the impedance IZI at a frequency of 100 kHz.
  • An amplitude of the alternating voltage of less than 50 mV (pp) guarantees that the measurement itself has no influence on the cells located on porous polymer membranes in the measuring device.
  • the measuring setup is calibrated with standard solutions.
  • the standard solutions used are KCI solutions of different concentrations, whose individual conductivities were determined independently using a standardized conductivity measuring cell.
  • the cell constant determined in this way for the structure described here makes it possible to convert every change in conductivity into a change in the electrolyte concentration and thus draw conclusions about the amount of water transported.
  • the time constant and the signal swing can be determined from the application of the measurement data (see FIG. 4) by adapting a saturation function. Both parameters can then be converted into the water permeability coefficient of the examined cell or tissue layer according to a published protocol.
  • FIG. 4 shows the measurement data for a total of five increasingly hyperosmolar stimulations and the data from a control.
  • the water permeability coefficients can be calculated from the time constant of the increase in conductivity and the measured signal swing.
  • Example 2 Method for detecting water transport across a cell layer at a measurement frequency f of ⁇ 10 kHz
  • This method requires the measurement of the complex impedance at a measurement frequency of f > 10 kHz (in example 1 it is 100 kHz), whose real part Re(Z) is then converted into the corresponding, time-dependent conductivity of the electrolyte.
  • the measurement is possible at a measurement frequency of less than 10 kHz.
  • the redox couple K 2 [Fe(CN) 6 ] / K 3 [Fe(CN) 6 ] is added to the buffer of the lower compartment in equimolar amounts, for example in a concentration of 1 mM, and the electrodes required for impedance measurement are connected made of gold films, e.g. with a thickness of 100 nm.
  • the presence of the redox couple induces a charge transfer across the otherwise ideally polarized electrode-electrolyte interface, which can be seen in the impedance spectrum by a flattening of the curve towards low frequencies and can be quantified.
  • the spectrum shown in FIG. 2 would not increase linearly to lower frequencies, but would change to a horizontal (frequency-independent impedance profile).
  • the intersection of the horizontal with the Y-axis is determined by the concentration of the redox couple and is called the charge-transfer resistance Rct .
  • the concentration-dependent R ct can advantageously be expressed by the real part of the impedance R e (Z), which is directly correlated therewith, at a correspondingly low frequency (eg 1 Hz).
  • the volume concentration of the redox couple in the bottom compartment increases and the charge transfer resistance Rct , which is directly correlated with it, decreases accordingly.
  • the water flow through the cell layer can therefore be determined in a very similar way to the embodiment described in Example 1 by adding a redox mediator and determining the concentration-dependent charge transfer resistances.
  • the reading out does not take place here at high frequencies of >10 kHz (specifically: 100 kHz), but at low frequencies of below 10 kHz (specifically: 1 Hz).
  • Example 3 Method for detecting water transport across a cell layer at several locations in the cell layer (spatially resolved determination)
  • the water permeability coefficient can only be quantified as an integral quantity for a given cell layer, i.e. only an average of the water permeability coefficient over the entire lateral extent of the cell layer can be given.
  • a lateral spatial resolution along the cell layer which can indicate a possible heterogeneity of the water permeability coefficient at different points of the cell layer, has not yet been experimentally accessible.
  • the determination of the P OS is not limited to one pair of electrodes per cell layer, ie several pairs of electrodes (e.g. an electrode pair array) can be placed below the cell layer, which allow a corresponding measurement at different positions below the cell layer and there - make accessible with a spatial resolution.
  • the detection of the water flow can be measured at five different points along the lateral extension of the cell layer (simultaneously) and thus a spatially resolved measurement of the water transport along the lateral expansion of the cell layer.
  • Example 4 Method of detecting water transport and transepithelial electrical resistance (TER) across a cell layer
  • the experimental determination of the transepithelial electrical resistance requires a confluent cell layer on the flat, water-permeable substrate, so that two liquid hemispheres arise above and below the cell layer.
  • a stamp electrode can be immersed in the upper compartment and a flat film electrode attached to the bottom of the lower compartment.
  • Such an electrode configuration for measuring TER and P OS can be easily generated using established structuring techniques.
  • parallel and quasi-simultaneous measurements of TER and P OS are possible in one measurement setup for the first time and allow the water permeability of a cell layer to be combined with its barrier function against inorganic ions.
  • osmolyte e.g. sucrose

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Abstract

Es wird eine Vorrichtung zur Detektion von einem Wassertransport durch bzw. über mindestens eine Schicht biologischer Zellen bereitgestellt, enthaltend einen ersten und zweiten Behälter, wobei der zweite Behälter zumindest teilweise innerhalb des ersten Behälters angeordnet ist, sodass zwei getrennte Kompartimente entstehen. Der Boden des zweiten Behälters besteht zumindest bereichsweise aus einem flächigen, wasserdurchlässigen Substrat zum Aufwachsen biologischer Zellen und der Boden des ersten Behälters weist ein Elektrodenpaar auf, dessen Elektroden jeweils eine elektrische Verbindung aufweisen, die in einen Raum außerhalb des ersten Behälters führt. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung lässt sich ein Wassertransport über mindestens eine Schicht biologischer Zellen auf eine einfache, schnelle, robuste und reproduzierbare Art und Weise mit einer hohen zeitlichen Auflösung detektieren. Es wird zudem ein Verfahren zur Detektion von einem Wassertransport über mindestens eine Schicht biologischer Zellen vorgestellt.

Description

Vorrichtung und Verfahren zur Detektion von einem Wassertransport durch mindestens eine Schicht biologischer Zellen
Es wird eine Vorrichtung zur Detektion von einem Wasserstransport durch bzw. über mindestens eine Schicht biologischer Zellen bereitgestellt, enthaltend ei- nen ersten und zweiten Behälter, wobei der zweite Behälter zumindest teil- weise innerhalb des ersten Behälters angeordnet ist, sodass zwei getrennte Kompartimente entstehen. Der Boden des zweiten Behälters besteht zumin- dest bereichsweise aus einem flächigen, wasserdurchlässigen Substrat zum Aufwachsen biologischer Zellen und der Boden des ersten Behälters weist ein Elektrodenpaar auf, dessen Elektroden jeweils eine elektrische Verbindung auf- weisen, die in einen Raum außerhalb des ersten Behälters führt. Mit der erfin- dungsgemäßen Vorrichtung lässt sich ein Wassertransport über mindestens eine Schicht biologischer Zellen auf eine einfache, schnelle, robuste und repro- duzierbare Art und Weise mit einer hohen zeitlichen Auflösung detektieren. Es wird zudem ein Verfahren zur Detektion von einem Wassertransport über min- destens eine Schicht biologischer Zellen vorgestellt. Die Beurteilung der Barrierefunktion von Zellverbänden (z.B. Gewebeverbän- den) spielt bei der Erforschung und Entwicklung neuer Medikamente eine fun- damentale Rolle, insbesondere bei dem gezielten Transport von Medikamen- ten an ihren Wirkort. Zell-basierte biomedizinische Studien bedienen sich im Wesentlichen dreier Parameter zur quantitativen Beschreibung der Barriere- funktion von Zellschichten in Zellverbänden.
Der erste Parameter ist die die Permeabilität der Zellschicht für molekulare Sonden und wird durch den sog. Permeabilitätskoeffizienten („PE-Wert") cha- rakterisiert (Einheit: in cm/s).
Der zweite Parameter ist der elektrische Widerstand einer Zellschicht und be- schreibt die Permeabilität der Zellschicht für anorganische Ionen (Einheit: Ω.cm2).
Der dritte Parameter ist die Permeabilität der Zellschicht für Wassermoleküle und wird generell mit Hilfe der hydraulischen Leitfähigkeit Lp oder dem osmo- tischen Wasserpermeabilitätskoeffizienten POS (Einheit: cm/s) in Abhängigkeit davon beschrieben, ob der Wasserfluss durch einen hydrostatischen Gradien- ten oder einen osmotischen Gradienten entlang der Zellschicht induziert wird.
Zur Beurteilung der Wasserpermeabilität einer Zellschicht steht wegen der leichteren experimentellen Bestimmbarkeit vor allem der Wassertransport durch die Zellschicht infolge eines osmotischen Gradienten über die Zellschicht im Fokus, der quantifiziert wird durch den osmotischen Wasserpermeabilitäts- koeffizienten POS. Hohe POS-Werte deuten hierbei eine besonders hohe Was- serdurchlässigkeit einer Zellschicht an. Hohe POS-Werte werden insbesondere für Zellschichten von Nierenzellen erhalten.
Der Grad der Wasserpermeabilität einer Zellschicht wird neben den Eigenschaf- ten der Membranlipide der Zellschicht vor allem durch bestimmte wasserper- meable Proteine (sog. Wasserkanäle) in der Zellmembran einzelner Zellen der Zellschicht definiert. Bekannte Wasserkanäle sind beispielsweise Aquaporine. Je nach Anzahl und Subtyp der Aquaporine in der Zellmembran von Zellen einer Zellschicht verändern die Aquaporine die Durchlässigkeit der Zellschicht für Wasser signifikant. Die Biosynthese einer bestimmten Zahl von Aquaporinen wird von biologischen Zellen darum als Steuerungselement genutzt, um die Wasserdurchlässigkeit der Zellmembran der biologischen Zellen an ihre physi- ologischen Bedürfnisse anzupassen.
Aquaporin-Fehlfunktionen, beispielsweise infolge einer entsprechenden Gen- Mutation, führen zu unterschiedlichen Krankheiten, wie Sehbehinderungen, epileptischen Anfallen oder Fettsucht. Sogar mit Tumorwachstum und Tumo- rausbreitung im Körper werden Aquaporine in Verbindung gebracht. Dadurch gelangen Aquaporine zunehmend auch als Zielproteine (Target) für die Wirk- stofffindung zur Behandlung dieser Erkrankungen in den Fokus.
Das funktionelle Screening von möglichen Wirkstoffen zur Beeinflussung der Aktivität von Aquaporinen ist allerdings sehr schwierig, weil zur Messung der Wasserpermeabilität von Zellschichten bislang nur eine unzureichende Mess- technik vorhanden ist. Die im Stand der Technik hierzu bekannten Vorrichtun- gen und Verfahren sind aufwändig, wenig robust, verfügen über eine schlechte zeitliche Auflösung, ermöglichen keine laterale Ortsauflösung entlang der Oberfläche einer Zellschicht und sind für eine schnelle Überprüfung eines Was- sertransports durch mindestens eine Schicht biologischer Zellen mit mittlerem bis hohem Durchsatz ungeeignet.
Der Wassertransport (bzw. Wasserfluss) durch eine biologische Zellschicht be- schreibt den Wasserfluss durch die biologische Zelle hindurch, d.h. durch eine erste biologische Membran auf einer ersten Seite einer biologischen Zelle (z.B. einer Oberseite) in die biologische Zelle hinein und einen Wasserfluss über min- destens eine zweite biologische Membran der biologischen Zelle (z.B. einer Un- terseite) aus der biologischen Zelle heraus, also einen Wasserfluss durch min- destens zwei Zellmembranen. Durch diesen Wasserfluss ändert die biologische Zelle ihr Volumen nicht zwangsweise, da der Ausstrom von Wasser gleich hoch sein kann wie der Einstrom von Wasser.
Anders verhält es sich beispielsweise bei einer Bestimmung eines transmemb- ranalen Wassertransports (bzw. Wasserflusses), um den es hier nicht gehen soll, aber der hier dennoch kurz beschrieben wird. Die Bestimmung des trans- membranalen Wasserflusses untersucht lediglich entweder den Wassertrans- port aus einer Zelle heraus in einen Extrazellularraum hinein oder aus einem Extrazellularraum in eine Zelle hinein, d.h. bei dieser Art des Wasserflusses wird nur ein Wasserfluss durch eine einzige Zellmembran untersucht. Da die biolo- gischen Zellen bei dieser Untersuchung des Wasserflusses durch das Einströ- men bzw. Ausströmen von Wasser zwangsläufig ihr Volumen ändern, lässt sich der transmembranale Wasserfluss durch eine Volumenänderung der biologi- schen Zellen recht einfach über die Bestimmung einer Volumenzunahme oder Volumenabnahme der biologischen Zellen ermitteln.
Schwieriger gestaltet sich die Bestimmung des Wassertransports über eine bi- ologische Zellschicht, da hierfür eine reine Ermittlung der Volumenzunahme o- der Volumenabnahme der Zellen nicht ausreicht. Grund hierfür ist, dass bei die- ser Untersuchung des Wassertransports das Wasser die Zelle so passieren kann, dass gar keine Volumenänderung der biologischen Zellen einer Zell- schicht auftritt (Fall: Einstrom von Wasser = Ausstrom von Wasser). Für eine Erfassung des Wassertransports über eine biologische Zellschicht ist damit eine andere Messtechnik notwendig.
Zur Bestimmung des Wassertransports über eine bzw. mehrere biologische Zellschicht(en) sind im Stand der Technik grundsätzlich zwei Vorrichtungen bzw. Verfahren bekannt. Bei beiden Varianten werden die zu untersuchenden biologischen Zellen zunächst auf einem porösen, wasserpermeablen Substrat kultiviert, der im Boden eines Flüssigkeitsbehälters angeordnet ist. Ein solcher Flüssigkeitsbehälter wird oft als „Transwell-Einsatz" bezeichnet, wobei es sich bei dem porösen, wasserpermeablen Substrat in dessen Boden häufig um eine poröse Polymermembran handelt. Durch die Wasserpermeabilität des porösen Substrats, auf dem die biologischen Zellen vor der Messung kultiviert werden, haben die biologischen Zellen nicht nur auf ihrer Oberseite, sondern auch auf ihrer Unterseite Zugang zu einer wässrigen Lösung.
Nach der Kultivierung der Zellen auf dem porösen, wasserdurchlässigen Sub- strat am Boden des Flüssigkeitsbehälters wird der Flüssigkeitsbehälter in einen zweiten, größeren Flüssigkeitsbehälter eingesetzt und von diesem so gehalten, dass das poröse, wasserdurchlässige Substrat einen gewissen Abstand zu des- sen Boden aufweist. Der eingesetzte Flüssigkeitsbehälter trennt somit die re- sultierende Vorrichtung in zwei Flüssigkeitshalbräume auf, nämlich einen Flüs- sigkeitshalbraum über der biologischen Zellschicht (oberes bzw. apikales Kom- partiment) und einen Flüssigkeitshalbraum unterhalb der biologischen Zell- schicht (unteres bzw. basales Kompartiment). Das poröse, wasserpermeable Substrat ist nach Anzahl und Größe der Poren so ausgelegt, dass es die Messung der Wasserpermeabilität einer Zellschicht nicht nennenswert beeinflusst, die Zellschicht soll die für den Wassertransport geschwindigkeitsbestimmende Schicht oder Entität zwischen diesen beiden Kompartimenten sein.
Zur Ermittlung des Wasserpermeabilitätskoeffizienten (POS-Wert) ist es be- kannt, einem der beiden Flüssigkeitshalbräume eine in Bezug auf den anderen Flüssigkeitshalbraum nicht-isotone Lösung zuzugeben, um einen osmotischen Gradienten zwischen oberem und unterem Kompartiment und damit senkrecht zur flächigen Zellschicht zu generieren. Diesen Nicht-Gleichgewichtszustand versucht das System auszugleichen, in dem Wasser in die Richtung der höheren Osmolarität getrieben wird, wobei der Wasserfluss im Falle einer konfluenten Zellschicht, bei der die Zellen ohne Zwischenraum nebeneinander auf dem po- rösen, wasserpermeablen Substrat angeordnet sind, zwangsweise durch die bi- ologischen Zellen der Zellschicht erfolgen muss. Aus der experimentell be- stimmten Rate dieses Wassertransportes durch die biologische Zellschicht hin- durch kann der Wasserpermeabilitätskoeffizienten der biologischen Zellschicht ermittelt werden.
Bei einer ersten im Stand der Technik bekannten Vorrichtung bzw. einem ers- ten im Stand der Technik bekannten Verfahren wird eine dünne Glaskapillare eingesetzt, die fluidisch mit einem der beiden Flüssigkeitshalbräume verbun- den ist. Der durch den osmotischen Gradienten ausgelöste Wasserfluss durch die Zellschicht verändert den Flüssigkeitsstand in beiden Kompartimenten. Für das mit dem Steigrohr verbundene Kompartiment kann der Wasserfluss direkt anhand der Veränderung des Flüssigkeitsmeniskus in der Glaskapillare quanti- fiziert werden. In der Regel wird der genaue Meniskusstand mittels einer elektro-optischen Methode vollständig automatisiert analysiert. Bei dieser Technik handelt es sich um eine direkte Messmethode, die jedoch technisch aufwändig und nur schwer parallelisierbar ist. Zur gleichzeitigen Testung meh- rerer Zellschichten unter verschiedenen Bedingungen bei mittlerem bis hohem Durchsatz sind solche Vorrichtungen bzw. Verfahren nicht wirtschaftlich und nicht kostengünstig einsetzbar. Beispielsweise müsste in einem parallelen An- satz jeweils ein Steigrohr an jeder der Testvorrichtungen angebracht werden und jedes dieser Steigrohre zeitaufgelöst überwacht werden, was eine Vielzahl von elektro-optischen Detektionseinheiten erfordern würde. Diese Technik ist somit eher für Projekte der Grundlagenforschung mit geringen Durchsätzen ge- eignet. Für ein Hochdurchsatz-Screening großer Molekülbibliotheken, z.B. zur Identifizierung von Modulatoren von Aquaporinen, sind diese Vorrichtungen und Verfahren weder praktikabel noch wirtschaftlich.
Bei einer zweiten im Stand der Technik bekannten Vorrichtung bzw. einem zweiten im Stand der Technik bekannten Verfahren wird ein nicht-zellperme- ables Fluorophor in eines der beiden Kompartimente gegeben. Üblicherweise werden hierfür in der einschlägigen Literatur FITC-, TRITC- oder TexasRed™-ge- la beite Dextrane verwendet. Aufgrund des Wasserflusses durch die Zellschicht kommt es entweder zu einem Verdünnungseffekt oder zu einem Aufkonzent- rierungseffekt des Fluorophors im entsprechenden Kompartiment und damit zu Änderungen der Fluoreszenzintensität mit der zeit. Die Änderung der Fluo- reszenzintensität wird durch Entnahme einer Flüssigkeitsprobe aus dem Kom- partiment, in welchem sich der Fluoreszenzmarker befindet, gemessen. Aus dem zeitlichen Verlauf der Fluoreszenzintensität kann die in das Kompartiment hinein- oder aus dem Kompartiment heraustransportierte Wassermenge be- stimmt und zu POS-Werten umgerechnet werden.
Ein Nachteil hierbei ist, dass die Proben in bestimmten Zeitabständen aus dem mit dem Fluorophor versetzen Kompartiment entnommen werden müssen, was zeitaufwändig ist und Informationen zwischen diesen Zeitabständen verlo- ren gehen lässt, was eine schlechte zeitliche Auflösung bewirkt. Zudem ist die manuelle Probenentnahme fehleranfällig, wodurch die Reproduzierbarkeit der erhaltenen Ergebnisse gering ist. Ferner kann die biologische Zellschicht durch die wiederholte manuelle Entnahme einer Probe gestört werden, d.h. beispiels- weise kann die Temperatur, der pH-Wert und/oder die Gasatmosphäre in dem Messsystem verändert werden, was zu signifikanten Artefakten und physiolo- gisch irrelevanten Messergebnissen führen kann. Darüber hinaus ist auch bei diesem Vorgehen der mögliche Probendurchsatz pro Zeit durch die manuelle Entnahme von Proben stark limitiert. Dazu kommt, dass gerade bei einem Hochdurchsatz die Kosten für den Einsatz des Fluorophors hoch ausfallen kön- nen. Abgesehen davon kann die Anwesenheit des Fluorophors grundsätzlich eine eigene biologische Wirkung entfalten, welche das Messergebnis stören kann und zudem auch die Ermittlung der Wirkung einer Substanz verfälschen kann, die dem Messsystem gezielt zugegeben wurde, um deren Einfluss auf den Wassertransport der Zellschicht zu untersuchen.
Die im Stand der Technik bekannten Vorrichtungen bzw. Verfahren haben zu- dem den Nachteil, dass durch sie der Wassertransports über eine Zellschicht nicht ortsaufgelöst entlang der lateralen Ausdehnung der Zellschicht erfasst werden kann, sondern der Wassertransport nur integral erfasst werden kann, d.h. letztlich ein Mittelwert verschiedener lokaler Einzelwerte des Wassertrans- ports bestimmt wird. Eine ortsaufgelöste Ermittlung des Wassertransports ent- lang der lateralen Ausdehnung der Zellschicht wäre jedoch vorteilhaft, da die Wasserbarriere-Funktion der Zellschicht nicht zwangsläufig homogen über die gesamte Fläche der Zellschicht verteilt ist. Es wäre daher wünschenswert, die gesamte Fläche der Zellschicht an mehreren Punkten der Zellschicht ortsaufge- löst auf ihre Wasserbarriere-Funktion testen zu können, um Informationen über eine laterale Verteilung der Wasserpermeabilitätskoeffizienten entlang der Zellschicht zu erlangen. Ferner wäre eine solche Messung weniger anfällig gegenüber Störstellen oder Defektstellen in der Zellschicht, da diese über die Ortsauflösung leicht identifiziert werden können und bei der Bewertung außer Acht gelassen werden können.
Zusammenfassend wird festgehalten, dass im Stand der Technik keine Vorrich- tung und kein Verfahren verfügbar ist, mit der/dem eine Bestimmung des Was- sertransportes über eine Zellschicht auf eine einfache, schnelle, robuste und reproduzierbare Art und Weise mit einer hohen zeitlichen und einer hohen ört- lichen Auflösung möglich ist.
Ausgehend hiervon war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vor- richtung und ein Verfahren zur nicht-invasiven Detektion von einem Wasser- transport über eine Zellschicht bereitzustellen, welche die Nachteile aus dem Stand der Technik nicht aufweisen. Insbesondere sollte es mit der Vorrichtung und dem Verfahren möglich sein, einen Wassertransport über eine biologische Zellschicht auf eine einfache, schnelle, robuste und reproduzierbare Art und Weise mit einer hohen zeitlichen Auflösung zu bestimmen. Bevorzugt sollte auch eine hohe örtliche Auflösung der Detektion möglich sein.
Die Aufgabe wird gelöst durch die Vorrichtung mit den Merkmalen von An- spruch 1, das Verfahren mit den Merkmalen von Anspruch 12 und die Verwen- dung mit den Merkmalen von Anspruch 16. Die abhängigen Ansprüche zeigen vorteilhafte Weiterbildungen auf.
Erfindungsgemäß wird eine Vorrichtung zur Detektion von einem Wassers- transport durch mindestens eine Schicht biologischer Zellen, aufweisend min- destens eine Detektionskammer, die a) mindestens einen ersten Behälter zur Aufnahme von Flüssigkeit enthält; und b) mindestens einen zweiten Behälter zur Aufnahme von Flüssigkeit enthält, der zumindest teilweise innerhalb des ersten Behälters angeordnet ist; wobei ein Boden des mindestens einen zweiten Behälters zumindest bereichs- weise aus einem flächigen, wasserdurchlässigen Substrat besteht, wobei die Oberflächen dieses Substrats dazu geeignet sind, biologische Zellen wachsen zu lassen, und wobei der mindestens eine zweite Behälter dergestalt in dem mindestens einen ersten Behälter angeordnet ist, dass im mindestens einen ersten Behälter ein unteres Kompartiment entsteht und im mindestens einen zweiten Behälter ein oberes Kompartiment entsteht; dadurch gekennzeichnet, dass ein Boden des mindestens einen ersten Behäl- ters mindestens ein Elektrodenpaar aufweist, wobei die Elektroden des min- destens einen Elektrodenpaars jeweils eine elektrische Verbindung aufweisen, die in einen Raum außerhalb des ersten Behälters führt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff „Wassertrans- port" ein „Wasserfluss" verstanden, d.h. mit dem Begriff „Wassertransport" ist ein passiver Transport von Wasser durch die mindestens eine Schicht biologi- scher Zellen, der auch einen passiven Transport über Wasserkanäle in den Zell- membranen der biologischen Zellen einschließen kann, umfasst. Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt eine nicht-invasive Detektion eines Wassertransports über mindestens eine biologische Zellschicht auf eine einfa- che, schnelle, robuste und reproduzierbare Art und Weise mit einer hohen Zeit- auflösung. Die zeitliche Auflösung der mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung möglichen Untersuchung liegt im Bereich einiger weniger Sekunden und liefert folglich präzise Informationen zum Zeitverlauf des zellulären Wassertranspor- tes. Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann eine Messung eines elektri- schen Widerstands (z.B. eine Impedanzmessung) über eine elektrische Kontak- tierung des Elektrodenpaars der Vorrichtung unter Einsatz geringer Spannungs- amplituden erfolgen. Zudem erfolgt die Messung auf nicht-invasive Art und Weise, sodass die untersuchten Zellen durch die Messung nicht beeinflusst o- der geschädigt werden und der zelluläre Wassertransport auch über einen lan- gen Messzeitraum ohne eine Verfälschung des Messergebnisses verfolgt wer- den kann.
Die Messung mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann vollständig Compu- ter-kontrolliert ablaufen und erfordert nach einer Zugabe eines Osmolyten in den ersten und/oder zweiten Behälter keine weiteren Eingriffe eines Benutzers. Ein wiederholtes und die Zellkultur störendes Entnehmen einer Probe mit einer damit unweigerlich einhergehenden Störung derTemperatur und der Gas- und Feuchtigkeitsatmosphäre ist nicht nötig bzw. entfällt.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die Vorrichtung mindestens zwei, mindestens vier, mindestens acht, mindestens 16, mindestens 32, mindestens 64 oder mindestens 96, dieser Detektionskam- mern aufweist, wobei die Detektionskammern bevorzugt nebeneinander auf einer Platte angeordnet sind und die jeweiligen elektrischen Verbindungen der jeweiligen Elektrodenpaare in einen Raum außerhalb der Platte, insbesondere in einen Raum unterhalb der Platte, führen. Platte kann als sog. Well-Platte aus- gestaltet sein. Der Vorteil an der Vielzahl an Detektionskammern ist, dass pa- rallel (gleichzeitig) der Wasserstransport über jeweils mindestens eine Schicht biologischer Zellen gemessen werden kann, wobei sich die biologischen Schich- ten von Detektionskammer zu Detektionskammer unterscheiden können bzw. die biologischen Schichten der jeweiligen Detektionskammern gleich sein kann und sich die jeweiligen Detektionskammern in der Zusammensetzung der Flüs- sigkeiten im ersten und/oder zweiten Behälter unterscheiden (z.B. unterschied- liche Wirkstoffe in den Flüssigkeiten). Die erfindungsgemäße Vorrichtung er- möglicht somit eine gleichzeitige (automatisierte) Messung mit hoher Paralleli- sierung und damit einen deutlich höheren Probendurchsatz als mit bekannten Vorrichtungen. Diese Ausgestaltungsform ist damit insbesondere für pharma- zeutische Studien und die biomedizinische Forschung von Vorteil, in der hohe Probendurchsätze ein entscheidendes wirtschaftliches Kriterium darstellen.
Ferner kann die erfindungsgemäße Vorrichtung dadurch gekennzeichnet sein, dass der Boden des mindestens einen ersten Behälters mindestens zwei, be- vorzugt mindestens drei, besonders bevorzugt mindestens vier, ganz besonders bevorzugt mindestens fünf, insbesondere mindestens sechs, optional mindes- tens zehn, Elektrodenpaare aufweist, wobei die Elektroden der jeweiligen Elektrodenpaare jeweils eine elektrische Verbindung aufweisen, die in einen Raum außerhalb des ersten Behälters führt. Vorteil hierbei ist, dass eine orts- aufgelöste Detektion des Wasserstransports durch die mindestens eine Schicht biologischer Zellen möglich ist, d.h. der Wassertransport kann in lateraler Rich- tung entlang der Schicht aufgelöst werden, wodurch lokale Unterschiede im Wassertransport entlang der lateralen Ausdehnung der Schicht aufgedeckt werden können. Dies erlaubt Rückschlüsse auf die Homogenität der mindes- tens einen Schicht biologischer Zellen im Hinblick auf die Wasserpermeabilitäts- eigenschaften und ermöglicht zudem statistisch besser abgesicherte Ergeb- nisse, da Defektstellen in der Schicht (z.B. Löcher in einer ansonsten konfluen- ten Schicht) aufgedeckt und bei der Betrachtung ausgeklammert werden kön- nen.
Zudem kann die erfindungsgemäße Vorrichtung dadurch gekennzeichnet sein, dass das untere Kompartiment eine weitere Elektrode, bevorzugt eine planare Filmelektrode, aufweist und das obere Kompartiment eine weitere Elektrode, bevorzugt eine Stempelelektrode, aufweist, wobei die weitere Elektrode des unteren Kompartiments bevorzugt am Boden des mindestens einen ersten Be- hälters angeordnet ist und/oder die weitere Elektrode des oberen Komparti- ments bevorzugt über eine Halterung in dem oberen Kompartiment gehalten wird oder an einer inneren Seitenwand des mindestens einen zweiten Behäl- ters angeordnet ist. Die weitere Elektrode im oberen und unteren Komparti- ment weisen insbesondere eine elektrische Verbindung auf, über die sie elektrisch mit einem Messgerät verbunden werden können. Diese Ausgestal- tungsform hat den Vorteil, dass neben dem Wassertransport durch die mindes- tens eine Schicht biologischer Zellen der transepithelialen elektrischen Wider- stand (TER) über die mindestens eine Schicht biologischer Zellen bestimmt wer- den kann. Anders als bei Vorrichtungen aus dem Stand der Technik sind somit keine zwei unabhängigen Vorrichtungen bzw. Messungen nötig, um den Grad des Wassertransports (POS-Wert) und den transepithelialen elektrischen Wider- stand (TER-Wert) zu ermitteln. Sowohl der TER-Wert als auch der POS-Wert las- sen sich jeweils über eine Messung der elektrischen Leitfähigkeit (bevorzugt ei- ner elektrischen Impedanz) bestimmen. Der TER-Wert liefert (integrale) Infor- mationen über die Permeabilität der Zellschicht ggü. anorganischen Ionen, während der POS-Wert (auch ortsaufgelöste) Informationen über die Wasser- permeabilität der Zellschicht ermöglicht. Beide Parameter können von dersel- ben mindestens einen Schicht biologischer Zellen erhalten werden und somit direkt miteinander korreliert werden.
Der mindestens eine erste Behälter der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist be- vorzugt bis zu einer Temperatur von 120 °C formstabil. Vorteil hierbei ist, dass der mindestens eine erste Behälter der Vorrichtung autoklavierbar ist, d.h. über Temperatureinwirkung sterilisiert werden kann, ohne dass der erste Behälter durch diese Behandlung strukturell beschädigt wird. Ferner erlaubt es diese Temperaturstabilität, das Elektrodenpaar des mindestens einen ersten Behäl- ters über eine photolithographische Strukturierung auf dem ersten Behälter aufzubringen.
Der mindestens eine erste Behälter der Vorrichtung kann Kunststoff und/oder Glas enthalten oder daraus bestehen, wobei der Kunststoff bevorzugt ausge- wählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polycarbonat, Polyethylenterephtha- lat, Polystyrol, Polymethylmethacrylat, Polytetrafluorethylen, Polyurethan und Mischungen und Kombinationen hiervon. Entsprechendes kann für den min- destens einen zweiten Behälter gelten. Zudem kann der mindestens eine zweite Behälter als Einwegmaterial ausgestaltet sein. Vorteil hierbei ist, dass der mindestens eine zweite Behälter nach einer Messung entsorgt werden kann und nicht für eine weitere Messung sterilisiert werden muss. Das mindestens eine Elektrodenpaar am Boden des ersten Behälters enthält bevorzugt zwei Filmelektroden oder besteht daraus. Bevorzugt sind die beiden Filmelektroden koplanar. Die beiden Filmelektroden können im Wesentlichen rund ausgestaltet sein. Ferner können die beiden Filmelektroden jeweils (an ei- ner zum zweiten Behälter gerichteten Seite) eine Fläche im Bereich von 0,01 bis 5,0 mm2, bevorzugt 0,02 bis 1,0 mm2, besonders bevorzugt 0,05 bis 0,50 mm2, insbesondere 0,10 bis 0,25 mm2, aufweisen. Abgesehen davon können die bei- den Filmelektroden an ihrem nächsten Punkt zueinander einen Abstand zuei- nander aufweisen, der im Bereich von 50 bis 1000 μm, bevorzugt 100 bis 600 μm, besonders bevorzugt 200 bis 400 μm, insbesondere 300 μm, liegt.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann ferner dadurch gekennzeichnet sein, dass das mindestens eine Elektrodenpaar am Boden des ersten Behälters bis zu einer Temperatur von 120 °C formstabil ist. Vorteil hierbei ist, dass der erste Behälter autoklavierbar ist, d.h. über Temperatureinwirkung sterilisiert werden kann, ohne dass das mindestens eine Elektrodenpaar des ersten Behälters durch diese Behandlung beschädigt wird. Das mindestens eine Elektrodenpaar kann einen elektrischen Widerstand von maximal 100 Ω/square aufweisen. Ferner kann das mindestens eine Elektrodenpaar ein Material enthalten oder daraus bestehen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Metall, elektrische leitfähige Metallverbindung, Kohlenstoff, elektrisch leitfähiger Kunststoff und Kombinationen hiervon, wobei das Material besonders bevor- zugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gold, Titan, Indium-Zinn- Oxid, Graphen, Polyanilin, Polypyrrol, Polythiophen, PEDOT und Kombinatio- nen hiervon, wobei das Material optional dotiert und/oder chemisch modifi- ziert ist.
Die elektrische Verbindung der Elektroden des mindestens einen Elektroden- paars, die in einen Raum außerhalb des ersten Behälters führt, kann ein elekt- risches Kabel enthalten oder daraus bestehen. Ferner kann die elektrische Ver- bindung bis zu einer Temperatur von 120 °C formstabil sein. Vorteil hierbei ist, dass der erste Behälter autoklavierbar ist, d.h. über Temperatureinwirkung ste- rilisiert werden kann, ohne dass die elektrische Verbindung des mindestens ei- nen Elektrodenpaars des ersten Behälters durch diese Behandlung beschädigt wird. Die elektrische Verbindung weist bevorzugt einen elektrischen Wider- stand von maximal 100 Ω/square auf. Ferner kann die elektrische Verbindung ein Material enthalten oder daraus bestehen, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Metall, elektrische leitfähige Metallverbindung, Kohlen- stoff, elektrisch leitfähiger Kunststoff und Kombinationen hiervon, wobei das Material besonders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gold, Titan, Indium-Zinn-Oxid, Graphen, Polyanilin, Polypyrrol, Polythiophen, PEDOT und Kombinationen hiervon, wobei das Material optional dotiert und/o- der chemisch modifiziert ist. Die elektrisch leitfähige Verbindung kann zudem eine elektrische Isolation aus einem elektrisch nicht-leitfähigen Material auf- weisen, bevorzugt ausgestaltet als Mantel oder Beschichtung um oder über eine elektrische Leitung. In einer bevorzugten Ausgestaltung ist die elektrische Verbindung elektrisch leitend mit einer Vorrichtung zur Messung einer elektri- schen Leitfähigkeit verbunden, wobei die Vorrichtung bevorzugt zur Messung einer elektrischen Impedanz konfiguriert ist.
Das flächige, wasserdurchlässige Substrat des zweiten Behälters kann Kunst- stoff und/oder Glas enthalten oder daraus bestehen, wobei der Kunststoff be- sonders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polycarbonat, Polyester, Polyethylenterephthalat, Polystyrol, Polymethylmethacrylat, Kol- lagen-beschichtetes Polytetrafluorethylen, Polyurethan und Mischungen und Kombinationen hiervon, wobei der Kunststoff insbesondere Polycarbonat ist.
Abgesehen davon kann das flächige, wasserdurchlässige Substrat des zweiten Behälters durchgängige Poren mit einem mittleren Porendurchmesser im Be- reich von 0,1 bis 10,0 μm, bevorzugt 0,2 bis 7,5 μm, besonders bevorzugt 0,4 bis 5,0 μm, optional 0,4 bis 3,0 μm, aufweisen. Vorteil an diesen Porendurch- messern ist, dass einerseits Wasser durch die Poren strömen kann und ande- rerseits die biologischen Zellen zurückgehalten werden, d.h. während dem Wassertransport auf dem Substrat verbleiben.
Darüber hinaus kann das flächige, wasserdurchlässige Substrat des zweiten Be- hälters durchgängige Poren mit einer Porendichte von mindestens 105 Poren pro cm2, bevorzugt mindestens 106 Poren pro cm2, besonders bevorzugt 106 bis 108 Poren pro cm2, aufweisen. Höhere Porendichten sind vorteilhaft, da sie eine exaktere Erfassung des Wassertransports durch die mindestens eine Schicht bi- ologischer Zellen erlauben und zudem bei der ortsaufgelösten Detektion des Wassertransports in lateraler Richtung entlang der mindestens einen Schicht biologischer Zellen eine feinere Ortsauflösung ermöglichen.
Ferner kann das flächige, wasserdurchlässige Substrat des zweiten Behälters senkrecht zu seiner flächigen Ausdehnung eine Höhe im Bereich von 5 bis 100 μm, bevorzugt im Bereich von 10 bis 50 μm, besonders bevorzugt 15 bis 30 μm, aufweisen. Dieser Höhenbereich stellt einerseits eine ausreichend hohe mecha- nische Stabilität sicher, um die mindestens einen Schicht biologischer Zellen zu stützen, und bildet andererseits nur eine kurze Passierstrecke für Wasser durch das Substrat hindurch. Letzteres erlaubt es, zeitabhängige Änderungen des Wassertransports mit einer hohen Zeitauflösung zu erfassen.
Das flächige, wasserdurchlässige Substrat des zweiten Behälters kann an einer dem ersten Kompartiment abgewandten Seite und/oder an einer dem ersten Kompartiment zugewandten Seite mindestens eine Schicht biologischer Zellen aufweisen. Diese Ausgestaltungsform hat den Vorteil, dass mit der Detektion von einem Wasserstransport durch die mindestens eine Schicht biologischer Zellen begonnen werden kann, ohne die biologischen Zellen vorher auf das flä- chige, wasserdurchlässige Substrat aufzuwachsen. Es kann also schneller mit der Messung begonnen werden.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform ist die mindestens eine Schicht biolo- gischer Zellen konfluent, d.h. es handelt sich um mindestens eine lückenlose Schicht biologischer Zellen. Die mindestens eine Schicht biologischer Zellen kann eine Einzelschicht (Monolayer) biologischer Zellen sein oder es kann sich um mehrere, übereinanderliegende Schichten biologischer Zellen (z.B. ein bio- logisches Gewebe) handeln. Ferner kann die mindestens eine Schicht Zellen enthalten oder daraus bestehen, die entweder kein Wassertransportprotein in ihrer Zellmembran aufweisen oder mindestens ein Wassertransportprotein in ihrer Zellmembran aufweisen, wobei es sich bei dem Wassertransportprotein insbesondere um mindestens ein Aquaporin handelt. Vorteil des ersten Falls ist, dass der Wassertransport durch die Schicht biologischer Zellen unabhängig von einem Wassertransportprotein erfasst werden kann. Vorteil des zweiten Falls ist, dass der Wassertransport durch die Schicht biologischer Zellen unter Einfluss des Wassertransportproteins gemessen werden kann. Werden beide Bestimmungen bei einer ansonsten identischen Schicht biologischer Zellen durchgeführt, kann zudem durch den Unterschied der beiden bestimmten Was- sertransportgrade der quantitative Beitrag des Wassertransportproteins zum Wassertransport durch die mindestens eine Schicht biologischer Zellen berech- net werden.
Die Vorrichtung kann eine Temperierungseinheit umfassen, die dazu konfigu- riert ist, die Temperatur der Vorrichtung konstant zu halten, wobei es sich bei der Temperierungseinheit bevorzugt um eine (z.B. externe) Heizeinheit, insbe- sondere einen Wärmeschrank, handelt. Vorteil hierbei ist, dass der Benutzer keine weitere Temperierungseinheit benötigt, um die Temperatur der Vorrich- tung konstant zu halten.
Erfindungsgemäß wird zudem ein Verfahren zur Detektion von einem Wasser- transport durch mindestens eine Schicht biologischer Zellen vorgestellt, umfas- send die Schritte a) Bereitstellen einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, wobei das flächige, wasserdurchlässige Substrat des zweiten Behälters an einer dem ersten Kompartiment abgewandten Seite und/oder an einer dem ersten Kompar- timent zugewandten Seite mindestens eine Schicht biologischer Zellen auf- weist; b) Elektrisches Verbinden der Elektroden des mindestens einen Elektroden- paares mit einer Vorrichtung zur Messung einer elektrischen Leitfähigkeit (z.B. über ein elektrisches Verbinden von deren elektrischer Verbindung, die in einen Raum außerhalb des ersten Behälters führt, mit einer Vorrich- tung zur Messung einer elektrischen Leitfähigkeit); c) Befüllen des ersten Kompartiments mit einer ersten wässrigen Lösung, die eine elektrische Leitfähigkeit aufweist, wobei die elektrische Leitfähigkeit der ersten wässrigen Lösung bevorzugt maximal 20 mS/cm beträgt; d) Befüllen des zweiten Kompartiments mit einer zweiten wässrigen Lösung, die eine elektrische Leitfähigkeit aufweist, wobei die zweite wässrige Lö- sung eine zur ersten wässrigen Lösung identische Osmolarität aufweist und wobei die elektrische Leitfähigkeit der zweiten wässrigen Lösung bevorzugt maximal 20 mS/cm beträgt; e) Messung einer elektrischen Leitfähigkeit der ersten wässrigen Lösung im Verlauf der zeit, um eine Basislinie zu erhalten; f) Zugabe eines Osmolyten (der z.B. in einer Flüssigkeit vorliegt) zur ersten und/oder zweiten wässrigen Lösung, sodass sich die Osmolarität der ersten wässrigen Lösung von der Osmolarität der zweiten wässrigen Lösung un- terscheidet; g) Messung einer elektrischen Leitfähigkeit der ersten wässrigen Lösung im Verlauf der zeit; h) Bestimmung eines Unterschieds der elektrischen Leitfähigkeit zur erhalte- nen Basislinie im Verlauf der Zeit, wobei aus dem Unterschied Informatio- nen über den Wassertransport durch die mindestens eine Schicht biologi- scher Zellen abgeleitet werden; wobei insbesondere die Schritte b) bis d) in beliebiger Reihenfolge durchge- führt werden und die Schritte e) bis h) in der angegebenen Reihenfolge durch- geführt werden.
Das Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die in dem Verfahren verwendete Vorrichtung zur Messung einer elektrischen Leitfähigkeit zur Mes- sung einer elektrischen Impedanz konfiguriert ist. Insbesondere wird in den Schritten e) und g) eine Änderung der elektrischen Impedanz im Verlauf derzeit gemessen. Besonders bevorzugt wird die elektrische Impedanz bei einer Wech- selspannungsamplitude von < 50 mV gemessen. Ferner wird die elektrische Im- pedanz bevorzugt bei einer Wechselspannungsfrequenz von ≥ 104 Hz, bevor- zugt einer Wechselspannungsfrequenz im Bereich von 104 bis 106 Hz, insbeson- dere 105 Hz, gemessen. Alternativ ist es bevorzugt, dass die elektrische Impe- danz bei einer Wechselspannungsfrequenz von < 104 Hz, bevorzugt 0,1 bis 10 Hz, insbesondere 1 Hz, gemessen wird, wenn das erste Kompartiment mit einer wässrigen Lösung befüllt wird oder ist, die ein Redoxpaar, bevorzugt K2[Fe(CN)6] I K3[Fe(CN)6], enthält.
Das Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die erste wässrige Lö- sung und/oder die zweite wässrige Lösung einen Puffer enthält, der eine Puf- ferwirkung im Bereich von pH 7 bis 8 aufweist. Ferner kann die erste und/oder zweite wässrige Lösung ein Salz, bevorzugt NaCI und KCl, enthalten. Darüber hinaus kann die erste und/oder zweite wässrige Lösung eine Temperatur im Bereich von > 0 °C bis 55 °C, bevorzugt eine Temperatur im Bereich von 10 ° bis 45 °C, besonders bevorzugt eine Temperatur im Bereich von 30 °C bis 40 °C, insbesondere eine Temperatur von 37 °C, aufweisen. Die unterschiedliche Osmolarität der zweiten wässrigen Lösung zur ersten wässrigen Lösung wird bevorzugt über eine unterschiedliche Konzentration von einem löslichen Molekül eingestellt, das ausgewählt ist aus der Gruppe beste- hend aus ungeladenen, nicht-zellmembrangängigen Molekülen, wobei das lös- liche Molekül besonders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Disacchariden, Oligosacchariden, Polysacchariden und Kombinationen hier- von. Insbesondere ist das lösliche Molekül ausgewählt aus der Gruppe beste- hend aus Saccharose, Mannitol, Inulin und Kombinationen hiervon.
Das Verfahren kann dadurch gekennzeichnet ein, dass die erste und/oder die zweite wässrige Lösung einen Wirkstoff enthält, von dem angenommen wird, dass er einen Einfluss auf den Wassertransport durch die mindestens eine Schicht biologischer Zellen ausübt. Bevorzugt handelt es sich hierbei um einen Wirkstoff, von dem angenommen wird, dass er einen Einfluss auf die Aktivität eines Wassertransportproteins, insbesondere eines Aquaporins, in der Zell- membran der biologischen Zellen ausübt. Beispielsweise wird dem Auffinden von selektiven und nicht-toxischen Aquaporin-Inhibitoren in der biomedizini- schen. Forschung eine große Bedeutung beigemessen. Es wird vermutet, dass Inhibitoren des Wasserkanals AQP1 die Tumorverbreitung und das Tumor- wachstum einschränken können und dass Inhibitoren gegen AQP4 Gehirn- schwellungen infolge von Schlaganfällen verhindern können. Die hier beschrie- bene Ausgestaltungsform des Verfahrens kann die Identifikation neuer und ver- besserter Aquaporin-Inhibitoren maßgeblich erleichtern und effizienter gestal- ten.
Erfindungsgemäß wird zudem die Verwendung einer Messung einer elektri- schen Leitfähigkeit, bevorzugt einer impedimetrischen Messung, zur Detektion von einem Wasserstransport über mindestens eine Schicht biologischer Zellen vorgeschlagen.
Anhand der nachfolgenden Figuren und Beispiele soll der erfindungsgemäße Gegenstand näher erläutert werden, ohne diesen auf die hier dargestellten, spezifischen Ausführungsformen einschränken zu wollen. Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur Detektion von osmotisch induzierten Wassertransport über eine konfluente Einzelschicht bio- logischer Zellen aus dem Stand der Technik. Auf dem flächigen, wasserdurch- lässigen Substrat des zweiten Behälters (hier ein „Transwell-Insert" der Fa. Cor- ning) werden biologische Zellen kultiviert, bis sich eine konfluente Einzelschicht der biologischen Zellen ausgebildet hat. Der zweite Behälter wird anschließend in den ersten Behälter der Vorrichtung transferiert, wodurch zwei voneinander getrennte Flüssigkeitskompartimente entstehen, d.h. ein oberes und ein unte- res Kompartiment. Die Osmolarität der wässrigen Lösung im oberen Komparti- ment (d.h. über der Schicht der biologischen Zellen) wird gegenüber der Osmo- larität der wässrigen Lösung im unteren Kompartiment erhöht (z.B. durch Zu- satz der o.g. Osmolyte wie z.B. Saccharose, Mannitol oder Innulin). Durch den osmotischen Gradienten zwischen dem oberen und unteren Kompartiment wird ein Wasserfluss vom unteren zum oberen Kompartiment induziert, der zwangsweise durch die Einzelschicht der biologischen Zellen erfolgen muss. Der Grad des Wasserflusses im Verlauf der Zeit wird in den Vorrichtungen aus dem Stand der Technik entweder über eine Messung der Änderung des Wasserspie- gels in einem Steigrohr im Verlauf der Zeit bestimmt (Figur 1, rechts oben) oder über Messung derÄnderung einer Fluoreszenzintensität eines Fluoreszenzfarb- stoffs in der wässrigen Lösung im oberen Kompartiment bestimmt (Figur 1, recht unten). Der bestimmte Grad des Wasserflusses im Verlauf der Zeit gibt Aufschluss über den Wassertransportkoeffizienten der Einzelschicht der biolo- gischen Zellen.
Figur 2 zeigt links schematisch eine erfindungsgemäße Vorrichtung zur impedi- metrischen Detektion von osmotisch induziertem Wassertransport über eine konfluente Einzelschicht biologischer Zellen 4. Der Aufbau der Vorrichtung ist identisch zur Figur 1, mit dem Unterschied, dass das erste Kompartiment 5 keine fluidische Verbindung zu einem Steigrohr aufweisen muss und im zweiten Kompartiment 6 kein Fluoreszenzmarker vorhanden sein muss, und der Boden des Behälters, der das erste Kompartiment ausbildet, mindestens ein Elektro- denpaar 7 aufweist, wobei die Elektroden des mindestens einen Elektroden- paars 7 jeweils eine elektrische Verbindung 8 aufweisen, die in einen Raum au- ßerhalb des ersten Behälters 5 führt. Diese elektrische Verbindungen 8 sind elektrisch leitend mit einer Vorrichtung zur Bestimmung der elektrischen Leit- fähigkeit (z.B. ein Impedanzmessgerät, nicht dargestellt) verbunden. Figur 2 rechts zeigt eine alternative Ausgestaltungsform, in der die elektrischen Ver- bindungen 8 außerhalb des ersten Behälters 5 durch zwei großflächige, quad- ratische Filmelektroden 8 ausgebildet sind (schraffiert in Figur 2 rechts darge- stellt). Die zwei quadratischen Filmelektroden 8 sind elektrisch leitend über elektrischen Zuleitungen (schwarz dargestellt) mit dem Elektrodenpaar 7, das hier von zwei kleinflächigen, koplanaren und kreisförmigen (d = 500 μm) Filmelektroden gebildet wird (schraffiert dargestellt), die am Boden des ersten Behälters 5 angeordnet sind, verbunden. Die Zuleitungen sind mit einem elektrisch isolierenden Photopolymer bedeckt, während die zwei quadrati- schen Filmelektroden 8 sowie die beiden kreisförmigen Elektroden des Elektro- denpaars 7 unbedeckt sind. Die Entfernung der beiden Mittelpunkte der Elekt- roden des Elektrodenpaars 7 beträgt in dieser Ausführungsform 800 μm und der Abstand an ihren nächsten Punkten zueinander 300 μm.
Figur 3A zeigt schematisch einen Ausschnitt einer Seitenansicht auf eine erfin- dungsgemäße Vorrichtung. Es ist eine Elektrode des Elektrodenpaars (Gold- schicht) dargestellt, die in Richtung des flächigen, wasserdurchlässigen Sub- strats bereichsweise mit einem elektrisch isolierenden Photopolymer bedeckt ist. Figur 3B zeigt ein typisches Impedanzspektrum, das mit einer erfindungs- gemäßen Vorrichtung erhalten werden kann. Der für die Bestimmung des Was- serflusses sensitive Frequenzbereich lag hier zwischen 104 - 106 Hz, in dem die Gesamtimpedanz des Systems vom Elektrolytwiderstand dominiert wird. Es ist erkennbar, dass der osmotisch induzierte Wasserfluss den elektrischen Wider- stand der Lösung im ersten Kompartiment ändert. Als am besten geeignete De- tektionsfrequenz haben sich in der hier beschriebenen Ausführungsform 105 Hz (100 kHz) herausgestellt. Figur 3C beschreibt das unter Figur 3B gezeigte Impe- danzspektrum mit Hilfe eines elektrischen Ersatzschaltbildes. Die Elektrode- Elektrolyt-Grenzfläche (1 - 104 Hz) wird durch ein sog. konstantes Phasenele- ment (CPE) beschrieben. Der Widerstand der wässrigen Lösung im ersten Kom- partiment (Rbulk) dominiert das Spektrum im Frequenzbereich 104 - 106 Hz. Die beiden übereinander gelegten Spektren zeigen die Veränderung der frequenz- abhängigen Impedanz durch einen osmotisch-induzierten Wasserfluss von un- ten nach oben. Figur 4 zeigt das Ergebnis eines Experimentes, bei dem eine konfluente Einzel- zellschicht der epithelialen Zelllinie MDCK-II auf dem flächigen, wasserdurch- lässigen Substrat angeordnet ist, während die zweite wässrige Lösung im obe- ren Kompartiment der Vorrichtung hyperosmolar gegenüber der ersten wäss- rigen Lösung im unteren Kompartiment der Vorrichtung gewählt wurde. Die Hyperosmolarität im oberen Kompartiment wurde hier durch Zugabe von Sac- charose in die wässrige Lösung des oberen Kompartiments erzeugt und führt zu einem Wasserfluss vom unteren Kompartiment in das obere Kompartiment, in Folge dessen die Leitfähigkeit im unteren Kompartiment als Funktion der Zeit ansteigt. Dargestellt ist die zeitabhängige Änderung der Leitfähigkeit bei einer Messfrequenz von 100 kHz im unteren Kompartiment, die nach der Einstellung der Hyperosmolarität bei t = 0 min. beginnt.
Beispiel 1 - Verfahren zur Detektion von einem Wassertransport durch eine Zellschicht bei einer Messfrequenz f von > 104 Hz
Die hier beispielhaft dargestellte erfindungsgemäße Vorrichtung weist in zent- raler Position auf dem Boden der Kammer ein Elektrodenpaar auf. In dem hier beschriebenen Ausführungsbeispiel sind die koplanaren Elektroden des Elekt- rodenpaars aus aufgesputterten Goldfilmen mit anschließender lithographi- scher Strukturierung gefertigt. Gold ist chemisch inert, biokompatibel, sehr gut elektrisch leitfähig und die Grenzflächenimpedanz entspricht in guter Näherung einer ideal polarisierbaren Elektrode. Die Elektrodenstruktur besteht aus zwei gleich großen, koplanaren, kreisförmigen Filmelektroden (d= 500 μm), die auf dem Boden der Messvorrichtung zentral unterhalb der Zellschicht lokalisiert sind.
Die Zuleitungen, die ebenfalls aus Gold bestehen, sind mit einem isolierenden Polymer überzogen.
Die lithographisch eingeführten Aussparungen im Polymer definieren die elekt- rochemisch aktiven Elektroden. Die elektrische Verbindung der Elektroden zur Messelektronik (Impedanzanalysator) wird mit Hilfe zweier rechteckiger Kon- taktabschnitte aus Gold ermöglicht (vgl. Figur 2, rechts). Die Messkammer wird durch eine zellkompatible Berandung (z.B. Glasring mit d = 2 cm), die auf das Trägersubstrat geklebt wird, definiert.
Die Impedanzanalyse erfolgt zum Beispiel mit Hilfe eines handelsüblichen Impe- danzanalysators.
Vor dem Durchführen der Messung wird mindestens eine Schicht biologischer Zellen auf einer Oberfläche des flächigen, wasserdurchlässigen Substrats des zweiten Behälters aufgewachsen. Das flächige, wasserdurchlässige Substrat dient hierbei als mechanische Unterstützung für die biologische Zellschicht. In der erfindungsgemäßen Vorrichtung liegt nun ein Flüssigkeitshalbraum ober- halb der Zellschicht (oberes Kompartiment) und ein Flüssigkeitshalbraum un- terhalb der Zellschicht (unteres Kompartiment) vor.
Der zweite Behälter und dessen poröse Polymermembran schließen mit dem Elektrodenpaar am Boden des ersten Behälters ein kleines Flüssigkeitskompar- timent ein, dessen genaues Volumen durch den Abstand des der porösen Poly- mermembran zur Oberfläche des Elektrodenpaars, dem Abstand des Elektro- denpaars und der Dicke des auf die elektrischen Verbindungen aufgebrachten, isolierenden Polymerfilms definiert ist.
Zur Durchführung der Messung wird das die Elektrodenstruktur enthaltende untere Kompartiment mit einer ersten wässrigen Lösung und das obere Kom- partiment mit einer zweiten wässrigen Lösung befüllt, wobei die erste und zweite wässrige Lösung zunächst isotonisch sind, d.h. die gleiche Osmolarität aufweisen. Dann wird eine Messung einer elektrischen Leitfähigkeit der ersten wässrigen Lösung im Verlauf der Zeit durchgeführt, um eine Basislinie zu erhal- ten.
Nach Erhalt der Basislinie wird zur ersten und/oder zweiten wässrigen Lösung ein Osmolyt (z.B. in einer wässrigen Flüssigkeit) zugegeben, sodass sich die Os- molarität der ersten wässrigen Lösung von der Osmolarität der zweiten wässri- gen Lösung unterscheidet. Diese Maßnahme bewirkt, dass ein Wassertransport durch die biologische Zellschicht induziert wird. Bei osmotischer Stimulation der Zellen durch Zugabe von Saccharose oder Mannitol in das obere Kompartiment oberhalb der Zellschicht wird ein Wasser- transport von unten nach oben durch die Zellschicht induziert. Dadurch nimmt die Elektrolytkonzentration im unteren Kompartiment unterhalb des Filters und damit dessen Leitfähigkeit zu, so dass nach Aufnahme der Basislinie und einer entsprechenden Kalibration der elektrischen Leitfähigkeit aus den zeitabhängi- gen Messwerten direkt auf den effektiven Wasserfluss zurückgeschlossen wer- den kann (siehe Figur 3A).
Die durch einen osmotisch induzierten Wasserfluss veränderte Elektrolytzu- sammensetzung führt also zu einer entsprechenden Änderung des elektrischen Widerstands zwischen den beiden Elektroden des Elektrodenpaars, der mit Hilfe der Messelektronik registriert werden kann. Folglich wird die elektrische Leitfähigkeit (z.B. der elektrischen Impedanz) der ersten wässrigen Lösung im Verlauf der Zeit gemessen, um ein quantitatives Maß für den Grad des Wasser- flusses zu erhalten. Aus der zeitlichen Änderungen der elektrischen Leitfähig- keit (z.B. Impedanz) lässt sich direkt, d.h. beispielsweise ohne die Verwendung eines Fluorophors als Label, die transportierte Wassermenge, sowie der Was- serpermeabilitätskoeffizient, für die untersuchte Zellschicht mit einer hohen zeitlichen Auflösung bestimmen.
Beim impedimetrischen Detektionsprinzip wird die Frequenz der angelegten Wechselspannung variiert und der Wechselstromwiderstand (Impedanz) zwi- schen den beiden koplanaren Elektroden des Elektrodenpaars als Funktion die- ser Frequenz bestimmt (siehe Figur 3B). Das resultierende Impedanzspektrum kann mit Hilfe eines elektrochemischen Modells (siehe Figur 3C) beschrieben werden. Der mittel- bis niederfrequente Bereich (1 - 104 Hz) ist bei doppelt- logarithmischer Auftragung charakterisiert durch eine mit abnehmender Fre- quenz linear ansteigende Impedanz, die durch die Elektrode-Elektrolyt-Grenz- fläche dominiert wird. Dieser Abschnitt des Spektrums kann mit einem sog. konstanten Phasenelement (constant phase element = CPE) beschrieben wer- den. Der hochfrequente Bereich (104- 106 Hz) wird vom elektrischen Wider- stand der wässrigen Lösung im ersten Kompartiment (Rbulk) dominiert und kann zur Bestimmung des Wasserflusses herangezogen werden. Folglich kann der Wasserfluss über eine Zellschicht durch die damit einhergehende Änderung des Widerstandes bzw. der Leitfähigkeit in diesem Frequenzbereich detektiert wer- den.
Als am besten geeigneter Ausleseparameter dient in dieser Ausführungsform die Änderung der Leitfähigkeit, also die Änderung des Reziprokwertes des Re- alteils der Impedanz IZI bei einer Frequenz von 100 kHz. Eine Amplitude der Wechselspannung kleiner 50 mV (pp) garantiert, dass die Messung selbst kei- nen Einfluss auf die in der Messvorrichtung auf porösen Polymermembranen befindlichen Zellen hat. Zur Umrechnung der experimentell ermittelten Leitfä- higkeitswerte in die Elektrolytkonzentration und daraus weiter zur Menge des transportierten Wassers wird eine Kalbration des Messaufbaus mit Standardlö- sungen durchgeführt.
Bei den verwendeten Standardlösungen handelt es sich um unterschiedlich konzentrierte KCI-Lösungen, deren individuelle Leitfähigkeiten mit einer nor- mierten Leitfähigkeitsmesszelle unabhängig bestimmt wurden. Die auf diese Weise ermittelte Zellkonstante für den hier beschriebenen Aufbau erlaubt es, jede Leitfähigkeitsänderung in eine Änderung der Elektrolytkonzentration um- zurechnen und somit auf die Menge an transportiertem Wasser zurückzuschlie- ßen. Aus der Auftragung der Messdaten (s. Figur 4) lassen sich durch Anpassung einer Sättigungsfunktion die Zeitkonstante und der Signalhub bestimmen. Beide Messgrößen können dann nach einem publizierten Protokoll in den Was- serpermeabilitätskoeffizienten der untersuchten Zell- oder Gewebeschicht um- gerechnet werden.
Figur 4 zeigt die Messdaten für insgesamt fünf zunehmend hyperosmolare Sti- mulationen sowie die Daten einer Kontrolle. Aus der Zeitkonstanten des Leitfä- higkeitsanstiegs und dem gemessenen Signalhub lassen sich die Wasserpeme- ablitätskoeffizienten berechnen.
Beispiel 2 - Verfahren zur Detektion von einem Wassertransport über eine Zellschicht bei einer Messfrequenz f von < 10 kHz
Dieses in Beispiel 1 beschriebene Verfahren verlangt die Messung der komple- xen Impedanz bei einer Messfrequenz von f > 10 kHz (in Beispiel 1 sind es 100 kHz), deren Realteil Re(Z) dann in die entsprechende, zeitabhängige Leitfähig- keit des Elektrolyten umgerechnet wird.
In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Messung bei einer Messfrequenz von kleiner als 10 kHz möglich.
Hierfür wird dem Puffer des unteren Kompartimentes das Redoxpaar K2[Fe(CN)6] / K3[Fe(CN)6] in äquimolaren Mengen, beispielsweise in einer Kon- zentration von 1 mM, zugesetzt und die zur Impedanzmessung notwendigen Elektroden werden aus Goldfilmen gefertigt, z.B. mit einer Dicke von 100 nm.
Die Anwesenheit des Redoxpaares induziert einen Ladungsübertritt über die ansonsten ideal polarisierte Elektrode-Elektrolyt-Grenzfläche, der sich im Impe- danzspektrum durch ein Abflachen der Kurve hin zu niedrigen Frequenzen zu erkennen gibt und quantifizierbar ist. Das in Figur 2 gezeigt Spektrum würde in diesem Fall nicht linear zu kleineren Frequenzen ansteigen, sondern in eine Ho- rizontale (frequenzunabhängiger Impedanzverlauf) übergehen.
Der Schnittpunkt der Horizontalen mit der Y-Achse wird durch die Konzentra- tion des Redoxpaares bestimmt und als Charge-Transfer-Widerstand Rct be- zeichnet. Der konzentrationsabhängige Rct lässt sich vorteilhaft durch den di- rekt damit korrelierten Realteil der Impedanz Re(Z) bei einer entsprechend niedrigen Frequenz (z.B. 1 Hz) ausdrücken.
Ist das Redoxpaar im unteren Kompartiment vorhanden und ein osmotisch in- duzierter Wasserfluss von unten nach oben setzt ein, so nimmt die Volumen- Konzentration des Redoxpaares im unteren Kompartiment zu und der damit direkt korrelierte Charge-Transfer Widerstand Rct nimmt entsprechend ab.
Es lässt sich also in ganz ähnlicher Weise zur in Beispiel 1 beschriebenen Aus- führungsform über den Zusatz eines Redoxmediators und der Bestimmung der konzentrationsabhängigen Charge-Transfer-Widerstände der Wasserfluss durch die Zellschicht bestimmen. Im Gegensatz zum in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erfolgt das Auslesen hier nicht bei hohen Frequenzen von > 10 kHz (speziell: 100 kHz), sondern bei niedrigen Frequenzen von unter 10 kHz (speziell: 1 Hz).
Für die hier benötigten Assay-Zeiten und die Konzentrationen des Redoxpaares K2[Fe(CN)6] / K3[Fe(CN)6] sind keine Interferenzen zwischen dem Redoxpaar und der untersuchten Zellen erkennbar gewesen.
Beispiel 3 - Verfahren zur Detektion von einem Wassertransport über eine Zellschicht an mehreren Orten der Zellschicht (ortsaufgelöste Bestimmung)
In Vorrichtungen aus dem Stand der Technik kann der Wasserpermeabilitäts- koeffizient nur als integrale Größe für eine gegebene Zellschicht quantifiziert werden, d.h. es kann nur ein Durchschnitt des Wasserpermeabilitätskoeffizien- ten über die gesamte laterale Ausdehnung der Zellschicht angegeben werden. Eine laterale Ortsauflösung entlang der Zellschicht, die eine mögliche Hetero- genität des Wasserpermeabilitätskoeffizienten an verschiedenen Stellen der Zellschicht anzeigen kann, ist bislang experimentell nicht zugänglich.
Die Bestimmung des POS ist jedoch nicht auf ein Elektrodenpaar pro Zellschicht limitiert, d.h. unterhalb der Zellschicht lassen sich auch mehrere Elektroden- paare (z.B. ein Elektrodenpaar-Array) platzieren, die eine entsprechende Mes- sung an verschiedenen Positionen unterhalb der Zellschicht erlauben und da- mit eine Ortsauflösung zugänglich machen.
Wenn beispielsweise fünf voneinander unabhängige Elektrodenpaare unter- halb der Zellschicht am Boden des ersten Behälters angeordnet werden, kann die Detektion des Wasserflusses an fünf verschiedenen Stellen entlang der la- teralen Ausdehnung der Zellschicht (simultan) gemessen werden und somit eine ortsaufgelöste Messung des Wassertransports entlang der lateralen Aus- dehnung der Zellschicht erfolgen.
Durch eine weitere Erhöhung der Elektrodenpaarzahl am Boden des ersten Be- hälters unterhalb der Zellschicht kann der Grad der Ortsauflösung noch weiter gesteigert werden. Beispiel 4 - Verfahren zur Detektion von einem Wassertransport und von ei- nem transepithelialen elektrischen Widerstand (TER) über eine Zellschicht
Die experimentelle Bestimmung des transepithelialen elektrischen Widerstan- des (TER) verlangt analog zur Bestimmung des Wasserpermeabilitätskoeffizien- ten POS eine konfluente Zellschicht auf dem flächigen, wasserdurchlässigen Sub- strat, so dass zwei Flüssigkeitshalbräume oberhalb und unterhalb der Zell- schicht entstehen.
In diesen beiden Flüssigkeitshalbräumen werden nun zwei zusätzliche Elektro- den platziert, so dass eine impedanzspektroskopische Messung über die Zell- schicht erfolgen kann und daraus der TER abgeleitet werden kann. Hierzu kann eine Stempelelektrode in das obere Kompartiment eingetaucht werden und eine flächige Filmelektrode am Boden des unteren Kompartimentes angebracht werden.
Eine solche Elektrodenkonfiguration zur Messung von TER und POS lässt sich mit den etablierten Strukturierungstechniken problemlos erzeugen. Dadurch sind erstmalig parallele und quasi-simultane Messungen von TER und POS in einem Messaufbau möglich und erlauben die Wasserpermeabilität einer Zellschicht mit ihrer Barrierefunktion gegenüber anorganischen Ionen zu kombinieren.
Bezugszeichenliste
1: Schicht biologischer Zellen;
2: erster Behälter;
3: zweiter Behälter;
4: flächiges, wasserdurchlässiges Substrat;
5: unteres Kompartiment;
6: oberes Kompartiment;
7: Elektrodenpaar (bzw. ein Teil davon);
8: elektrische Verbindung des Elektrodenpaars;
9: Osmolyt (z.B. Saccharose);
10: osmotische Stimulation;
11: Messung über Glaskapillare (gemäß Stand der Technik); 12: Messung über Fluorszenzfarbstoffverdünnung (gemäß Stand der Tech- nik);
13: Glaskapillare;
14: Fluoreszenzfarbstoff; 15: elektrisch isolierendes Photopolymer.

Claims

Patentansprüche
1. Vorrichtung zur Detektion von einem Wasserstransport durch mindes- tens eine Schicht biologischer Zellen, aufweisend mindestens eine De- tektionskammer, die a) mindestens einen ersten Behälter zur Aufnahme von Flüssigkeit enthält; und b) mindestens einen zweiten Behälter zur Aufnahme von Flüssigkeit enthält, der zumindest teilweise innerhalb des ersten Behälters an- geordnet ist; wobei ein Boden des mindestens einen zweiten Behälters zumindest bereichsweise aus einem flächigen, wasserdurchlässigen Substrat be- steht, wobei die Oberfläche des Substrats dazu geeignet ist, biologi- sche Zellen wachsen zu lassen, und wobei der mindestens eine zweite Behälter dergestalt in dem mindes- tens einen ersten Behälter angeordnet ist, dass im mindestens einen ersten Behälter ein unteres Kompartiment entsteht und im mindestens einen zweiten Behälter ein oberes Kompartiment entsteht; dadurch gekennzeichnet, dass ein Boden des mindestens einen ersten Behälters mindestens ein Elektrodenpaar aufweist, wobei die Elektro- den des mindestens einen Elektrodenpaars jeweils eine elektrische Verbindung aufweisen, die in einen Raum außerhalb des ersten Behäl- ters führt.
2. Vorrichtung gemäß dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Vorrichtung mindestens zwei, mindestens vier, min- destens acht, mindestens 16, mindestens 32, mindestens 64 oder min- destens 96, dieser Detektionskammern aufweist, wobei die Detekti- onskammern bevorzugt nebeneinander auf einer Platte angeordnet sind und die jeweiligen elektrischen Verbindungen der jeweiligen Elektrodenpaare in einen Raum außerhalb der Platte, insbesondere in einen Raum unterhalb der Platte, führen.
3. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Boden des mindestens einen ersten Behäl- ters mindestens zwei, bevorzugt mindestens drei, besonders bevorzugt mindestens vier, ganz besonders bevorzugt mindestens fünf, insbe- sondere mindestens sechs, optional mindestens zehn, Elektrodenpaare aufweist, wobei die Elektroden der jeweiligen Elektrodenpaare jeweils eine elektrische Verbindung aufweisen, die in einen Raum außerhalb des ersten Behälters führt.
4. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das untere Kompartiment eine weitere Elektro- de, bevorzugt eine planare Filmelektrode, aufweist und das obere Kompartiment eine weitere Elektrode, bevorzugt eine Stempelelektro- de, aufweist, wobei die weitere Elektrode des unteren Kompartiments bevorzugt am Boden des mindestens einen ersten Behälters angeord- net ist und/oder die weitere Elektrode des oberen Kompartiments be- vorzugt über eine Halterung in dem oberen Kompartiment gehalten wird oder an einer inneren Seitenwand des mindestens einen zweiten Behälters angeordnet ist.
5. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine erste Behälter i) bis zu einerTemperatur von 120 °C formstabil ist; und/oder iij Kunststoff und/oder Glas enthält oder daraus besteht, wobei der Kunststoff bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polycarbonat, Polyethylenterephthalat, Polystyrol, Polymethylme- thacrylat, Polytetrafluorethylen, Polyurethan und Mischungen und Kombinationen hiervon.
6. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Elektrodenpaar am Boden des ersten Behälters zwei Filmelektroden enthält oder daraus besteht, die bevorzugt i) koplanar sind; und/oder ii) im Wesentlichen rund ausgestaltet sind; iii) jeweils eine Fläche im Bereich von 0,01 bis 5,0 mm2, bevorzugt 0,02 bis 1,0 mm2, besonders bevorzugt 0,05 bis 0,50 mm2, ins- besondere 0,10 bis 0,25 mm2, aufweisen; und/oder iv) an ihrem nächsten Punkt zueinander einen Abstand zueinander aufweisen, der im Bereich von 50 bis 1000 μm, bevorzugt 100 bis 600 μm, besonders bevorzugt 200 bis 400 μm, insbesondere 300 μm, liegt.
7. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Elektrodenpaar am Boden des ersten Behälters i) bis zu einerTemperatur von 120 °C formstabil ist; und/oder ii) einen elektrischen Widerstand von maximal 100 Ω/square auf- weist; und/oder iii) ein Material enthält oder daraus besteht, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Metall, elektrische leitfähige Metallver- bindung, Kohlenstoff, elektrisch leitfähiger Kunststoff und Kombi- nationen hiervon, wobei das Material besonders bevorzugt ausge- wählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gold, Titan, Indium-Zinn- Oxid, Graphen, Polyanilin, Polypyrrol, Polythiophen, PEDOT und Kombinationen hiervon, wobei das Material optional dotiert und/oder chemisch modifiziert ist.
8. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrische Verbindung der Elektroden des mindestens einen Elektrodenpaars i) bis zu einer Temperatur von 120 °C formstabil ist; und/oder ii) einen elektrischen Widerstand von maximal 100 Ω/square auf- weist; und/oder iii) ein Material enthält oder daraus besteht, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Metall, elektrische leitfähige Metall- verbindung, Kohlenstoff, elektrisch leitfähiger Kunststoff und Kombinationen hiervon, wobei das Material besonders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gold, Titan, Indium- Zinn-Oxid, Graphen, Polyanilin, Polypyrrol, Polythiophen, PEDOT und Kombinationen hiervon, wobei das Material optional dotiert und/oder chemisch modifiziert ist; und/oder iv) elektrisch leitend mit einer Vorrichtung zur Messung einer elektri- schen Leitfähigkeit verbunden ist, wobei die Vorrichtung bevor- zugt zur Messung einer elektrischen Impedanz konfiguriert ist.
9. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserdurchlässige Substrat des zweiten Be- hälters i) Kunststoff und/oder Glas enthält oder daraus besteht, wobei der Kunststoff besonders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe be- stehend aus Polycarbonat, Polyester, Polyethylenterephthalat, Po- lystyrol, Polymethylmethacrylat, Kollagen-beschichtetes Polytetra- fluorethylen, Polyurethan und Mischungen und Kombinationen hiervon, wobei der Kunststoff insbesondere Polycarbonat ist; und/oder ii) durchgängige Poren mit einem mittleren Porendurchmesser im Bereich von 0,1 bis 10,0 μιτι, bevorzugt 0,2 bis 7,5 μιτι, besonders bevorzugt 0,4 bis 5,0 μιτι, optional 0,4 bis 3,0 μιτι, aufweist; und/oder iii) durchgängige Poren mit einer Porendichte von mindestens 105 Po- ren pro cm2, bevorzugt mindestens 106 Poren pro cm2, besonders bevorzugt 106 bis 108 Poren pro cm2, aufweist; und/oder iv) senkrecht zu seiner flächigen Ausdehnung eine Höhe im Bereich von 5 bis 100 μm, bevorzugt im Bereich von 10 bis 50 μm, beson- ders bevorzugt 15 bis 30 μm, aufweist; und/oder v) als Einwegmaterial ausgestaltet ist.
10. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das flächige, wasserdurchlässige Substrat des zweiten Behälters an einer dem ersten Kompartiment abgewandten Seite und/oder an einer dem ersten Kompartiment zugewandten Seite mindestens eine Schicht biologischer Zellen aufweist, wobei die min- destens eine Schicht biologischer Zellen bevorzugt i) konfluent ist; und/oder ii) eine Einzelschicht biologischer Zellen ist oder aus mehreren, über- einanderliegenden Schichten biologischer Zellen besteht; und/oder iii) Zellen enthält oder daraus besteht, die entweder kein Wasser- transportprotein in ihrer Zellmembran aufweisen oder mindestens ein Wassertransportprotein in ihrer Zellmembran aufweisen, wo- bei es sich bei dem Wassertransportprotein insbesondere um mindestens ein Aquaporin handelt.
11. Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung eine Temperierungseinheit um- fasst, die dazu konfiguriert ist, die Temperatur der Vorrichtung kon- stant zu halten, wobei es sich bei der Temperierungseinheit bevorzugt um eine Heizeinheit, insbesondere einen Wärmeschrank, handelt.
12. Verfahren zur Detektion von einem Wassertransport durch mindestens eine Schicht biologischer Zellen, umfassend die Schritte a) Bereitstellen einer Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das flächige, wasserdurchlässige Substrat des zweiten Behälters an einer dem ersten Kompartiment abgewand- ten Seite und/oder an einer dem ersten Kompartiment zugewand- ten Seite mindestens eine Schicht biologischer Zellen aufweist; b) Elektrisches Verbinden der Elektroden des mindestens einen Elekt- rodenpaars mit einer Vorrichtung zur Messung einer elektrischen Leitfähigkeit; c) Befüllen des ersten Kompartiments mit einer ersten wässrigen Lö- sung, die eine elektrische Leitfähigkeit aufweist; d) Befüllen des zweiten Kompartiments mit einer zweiten wässrigen Lösung, die eine elektrische Leitfähigkeit aufweist, wobei die zwei- te wässrige Lösung eine zur ersten wässrigen Lösung identische Osmolarität aufweist; e) Messung einer elektrischen Leitfähigkeit der ersten wässrigen Lö- sung im Verlauf der Zeit, um eine Basislinie zu erhalten; f) Zugabe eines Osmolyten zur ersten und/oder zweiten wässrigen Lösung, sodass sich die Osmolarität der ersten wässrigen Lösung von der Osmolarität der zweiten wässrigen Lösung unterscheidet; g) Messung einer elektrischen Leitfähigkeit der ersten wässrigen Lö- sung im Verlauf der Zeit; h) Bestimmung eines Unterschieds der elektrischen Leitfähigkeit zur erhaltenen Basislinie im Verlauf der zeit, wobei aus dem Unter- schied Informationen über den Wassertransport durch die mindes- tens eine Schicht biologischer Zellen abgeleitet werden; wobei insbesondere die Schritte b) bis d) in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden und die Schritte e) bis h) in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden.
13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Vor- richtung zur Messung einer elektrischen Leitfähigkeit zur Messung ei- ner elektrischen Impedanz konfiguriert ist, wobei bevorzugt in den Schritten e) und g) eine Änderung der elektrischen Impedanz im Ver- lauf der Zeit gemessen wird, wobei die elektrische Impedanz beson- ders bevorzugt i) bei einer Wechselspannungsamplitude von ≤ 50 mV gemessen wird; und/oder ii) bei einer Wechselspannungsfrequenz von > 104 Hz, bevorzugt einer Wechselspannungsfrequenz im Bereich von 104 bis 106 Hz, insbe- sondere 105 Hz, gemessen wird, oder, wenn das erste Komparti- ment mit einer wässrigen Lösung befüllt wird oder ist, die ein Re- doxpaar, bevorzugt K2[Fe(CN)6] / K3[Fe(CN)6], enthält, bei einer Wechselspannungsfrequenz von < 104 Hz, bevorzugt 0,1 bis 10 Hz, insbesondere 1 Hz, gemessen wird.
14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekenn- zeichnet, dass die erste wässrige Lösung und/oder die zweite wässrige Lösung i) einen Puffer enthält, der eine Pufferwirkung im Bereich von pH 7 bis 8 aufweist; und/oder ii) ein Salz enthält, bevorzugt NaCI und KCl enthält; und/oder iii) eine Temperatur im Bereich von > 0 °C bis 55 °C, bevorzugt eine Temperatur im Bereich von 10 ° bis 45 °C, besonders bevorzugt ei- ne Temperatur im Bereich von 30 °C bis 40 °C, insbesondere eine Temperatur von 37 °C, aufweist; wobei die unterschiedliche Osmolarität der zweiten wässrigen Lösung zur ersten wässrigen Lösung bevorzugt über eine unterschiedliche Konzentration von einem löslichen Molekül eingestellt wird, das aus- gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ungeladenen, nicht- zellmembrangängigen Molekülen, wobei das lösliche Molekül beson- ders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Disac- chariden, Oligosacchariden, Polysacchariden und Kombinationen hier- von, wobei das lösliche Molekül insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Saccharose, Mannitol, Inulin und Kombinatio- nen hiervon.
15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekenn- zeichnet, dass die erste und/oder zweite wässrige Lösung einen Wirk- stoff enthält, von dem angenommen wird, dass er einen Einfluss auf den Wassertransport über die mindestens eine Schicht biologischer Zellen ausübt, bevorzugt einen Wirkstoff, von dem angenommen wird, dass er einen Einfluss auf die Aktivität eines Wassertransportproteins, insbesondere eines Aquaporins, in der Zellmembran der biologischen Zellen ausübt.
16. Verwendung einer Messung einer elektrischen Leitfähigkeit, bevorzugt einer impedimetrischen Messung, zur Detektion von einem Wassers- transport über mindestens eine Schicht biologischer Zellen.
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