DE102016222510B4

DE102016222510B4 - Vorrichtung zum Detektieren von Target-Biomolekülen

Info

Publication number: DE102016222510B4
Application number: DE102016222510.3A
Authority: DE
Inventors: Christiaan Gunter Alwyn Viviers; Willem Jacobus Perold; Leon Milner Theodore Dicks; Giles Hubert Coyle Maybery
Original assignee: Stellenbosch University
Current assignee: Stellenbosch University
Priority date: 2015-11-18
Filing date: 2016-11-16
Publication date: 2023-10-19
Anticipated expiration: 2036-11-17
Also published as: ZA201607865B; US10302637B2; CN106706712A; RU2634388C1; CN106706712B; DE102016222510A1; US20170138934A1

Abstract

Vorrichtung (1, 31, 100) zum Detektieren von Target-Biomolekülen umfassend eine elektrisch leitende Membran (3, 103, 207) mit einer biologischen Erkennungskomponente, die so ausgeführt ist, dass sie ein darauf immobilisiertes Target-Biomolekül bindet, wobei die Membran mittels Elektroden (7, 107) mit einer elektrischen Schaltung (200) verbunden ist; eine Spannungsquelle (203) zum Liefern einer Spannung innerhalb der elektrischen Schaltung; und eine Widerstandsüberwachungsvorrichtung (205), die so ausgeführt ist, dass sie den Widerstand der Membran überwacht, wenn ein ausgewähltes Volumen einer Fluidprobe der Membran zugeführt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran (3, 103, 207) an einer nichtleitenden Halterung (9, 109) montiert ist, die so ausgeführt ist, dass sie die Membran derart lösbar aufnimmt und hält, dass diese mit den Elektroden (7, 107) in Kontakt kommt.

Description

QUERVERWEIS ZU VERWANDTEN ANMELDUNGEN
Diese Anmeldung beansprucht Priorität gegenüber der vorläufigen südafrikanischen Patentanmeldung Nummer 2015/08499 , eingereicht am 18. November 2015, die hier durch Verweis einbezogen ist.
GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Detektieren von Target-Biomolekülen. Insbesondere betrifft sie eine Vorrichtung zum Detektieren von Target-Biomolekülen durch Messen einer Veränderung der Leitfähigkeit einer elektrisch leitenden Membran, auf die eine biologische Erkennungskomponente zum Binden des Target-Biomoleküls aufgebracht ist.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Frühdiagnose von pathogenen Infektionen kann helfen, die Anzahl von Krankheits- und Todesfällen, die durch pathogene Infektionen bei Menschen verursacht werden, zu verringern. Infektionen können ferner durch die Detektion von Krankheitserregern in Wasser oder Lebensmitteln vor dem Verzehr verringert werden. Herkömmliche Verfahren zur Detektion von Pathogenen, wie z. B. eine Polymerase-Kettenreaktion, immunologiebasierte Verfahren und Kultur- und Koloniezählung, benötigen generell eine lange Zeit, bis genaue Ergebnisse bereitgestellt werden und können teuer und an entlegenen Orten unzugänglich sein. Zum Behandeln dieses Problems ist eine Vielzahl von Biosensoren entwickelt worden, die Biomoleküle zu Diagnose- oder Qualitätskontrollzwecken detektieren.
Elektrochemische Biosensoren sind Sensoren, die zum Detektieren von Target-Biomolekülen, welche in einer Lösung schweben, mittels der molekularen Erkennung verwendet werden. Ein typischer elektrochemischer Biosensor weist mindestens eine Elektrode mit auf der Oberfläche der Elektrode immobilisierten biologischen Erkennungskomponenten auf, die in der Lage sind, sich an Target-Biomoleküle in der Lösung zu binden oder einen Komplex mit diesen zu bilden. Die biologischen Erkennungskomponenten können zum Beispiel Pathogene oder Antigene, Antikörper, Enzyme oder Nukleinsäuren sein. Die Biosensoren sind so ausgeführt, dass sie Veränderungen in der Leitfähigkeit der Elektrode aufgrund des Bindens oder der Komplexbildung von Biomolekülen aus einer Lösung mit den biologischen Erkennungskomponenten, die auf der Elektrode immobilisiert sind, messen. Tatsächlich werden Veränderungen des Widerstands der Elektrode, wenn diese in einer elektrischen Schaltung geschaltet ist, an die eine konstante Potenzialdifferenz und Strom angelegt sind, gemessen.
Jüngste Entwicklungen auf dem Gebiet der elektrochemischen Biodetektion haben zur Verwendung von sogenannten „Elektrotextilien“, die Membranen sind, welche Polymerfasern aufweisen, die mit einer leitenden Polymerbeschichtung beschichtet sind, als Elektrode geführt. Die Mikrofasern bieten einen großen Flächenbereich für die Immobilisierung einer wesentlichen Menge an biologischen Erkennungskomponenten auf der Oberfläche der Elektrode.
Der Anmelder kennt ein System im Labormaßstab, bei dem eine Elektrotextilie in eine Pufferlösung getaucht und mittels leitender Metallklemmen, die als Elektroden dienen, mit einer Schaltung verbunden wird. Sowohl die Elektrotextilie als auch die Klemmen werden in eine Lösung getaucht, die Natriumchlorid-, Kaliumchlorid-, Natriumphosphat- und Kaliumphosphatsalze enthält. Die Probenlösung, die zu detektierende Biomoleküle enthält, wird dann der Pufferlösung hinzugefügt, und es werden Veränderungen in der Leitfähigkeit der Elektrotextilie nach dem Hinzufügen der Probenlösung gemessen. Die eingetauchten Elektroden beteiligen sich jedoch an elektrochemischen Reaktionen mit den Salzen in der Lösung und produzieren dabei wesentliche Hintergrundeffekte während des Detektionsprozesses, wodurch die Empfindlichkeit des Systems verringert wird. Infolge des Eintauchens in eine Salzlösung sind die Elektroden ferner für eine Degradation über die Zeit anfällig, die durch Redoxreaktionen auf der Oberfläche der Elektroden verursacht wird. Das System benötigt ferner ein relativ großes Volumen an Pufferlösung, das außerhalb einer Laborumgebung nicht so einfach zur Verfügung stehen kann.
Generell sind bestehende Systeme, bei denen Elektrotextilien für die Detektion von Biomolekülen verwendet werden, komplexe Systeme im Labormaßstab, die nicht für die Verwendung im Freien oder zur Wiederverwendung geeignet sein können und nicht empfindlich genug sein können, um bei sehr kleinen Fluidproben verwendet zu werden. Es besteht somit weiterhin Bedarf an einer kosteneffektiven, vielseitig verwendbaren, empfindlichen und robusten Vorrichtung zum Detektieren des Vorhandenseins von Biomolekülen. Idealerweise muss die Vorrichtung von relativ einfachem Aufbau und leicht zu verwenden sein, so dass sie im Freien verwendet werden kann, um schnell Biomoleküle zu detektieren, die mit einer pathogenen Infektion oder Kontamination verbunden sind.
US 2015/0309024 A1 offenbart ein Verfahren zum Nachweis eines Krankheitserregers in einer Probe. Der Erreger aus der Probe wird mit mindestens einem Erkennungselement eingefangen. Die Probe wird in eine mikrofluidische Vorrichtung auf Papierbasis eingeführt, auf der beabstandete Elektroden angeordnet sind. Eine Impedanzgröße der Probe wird über die beabstandeten Elektroden gemessen, um das Vorhandensein des Erregers in der Probe nachzuweisen. Eine verwandte mikrofluidische Vorrichtung und ein System auf Papierbasis werden ebenfalls offenbart.
McGRAW, Shannon K. et al., A Resistance Based Biosensor That Utilizes Conductive Microfibers for Microbial Pathogen Detection. In: Open Journal ofApplied Biosensors, 2012,Vol.1, p. 36-43 beschreibt, dass Escherichia coli O157:H7 (E. coli O157:H7) einer der wichtigsten Krankheitserreger für die Entwicklung von Schnelldiagnosesystemen für Lebensmittel- und Wasserproben ist. Das Ziel der beschriebenen Forschung ist die Entwicklung eines schnellen, neuartigen elektrochemischen Biosensors, der auf der Verwendung von Polypropylen-Mikrofasermembranen basiert, die mit einem leitfähigen Polypyrrol beschichtet und mit Antikörpern funktionalisiert sind. Mithilfe von Glutaraldehyd werden pathogen spezifische Antikörper kovalent an leitfähige Mikrofasermembranen gebunden, die dann blockiert werden. Die funktionalisierten Membranen werden dann E. coli O157:H7-Zellen ausgesetzt. Wenn eine Spannung an das System angelegt wird, führt die Anwesenheit des eingefangenen Erregers auf der Faseroberfläche zu einer Erhöhung des Widerstands an der Elektrodenoberfläche, was ein positives Ergebnis anzeigt.
Die vorstehende Diskussion des Hintergrunds der Erfindung dient nur zum Erleichtern des Verständnisses der vorliegenden Erfindung. Es sei darauf hingewiesen, dass die Diskussion nicht der Bestätigung oder Anerkennung dient, dass ein Material, auf das Bezug genommen worden ist, zum Prioritätsdatum der Anmeldung auf dem Sachgebiet allgemein bekannt war.
KURZFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß der Erfindung wird eine Vorrichtung zum Detektieren von Target-Biomolekülen bereitgestellt, umfassend eine elektrisch leitende Membran mit einer biologischen Erkennungskomponente, die so ausgeführt ist, dass sie ein darauf immobilisiertes Target-Biomolekül bindet, wobei die Membran mittels Elektroden mit einer elektrischen Schaltung verbunden ist; eine Spannungsquelle zum Liefern einer Spannung innerhalb der elektrischen Schaltung; und eine Widerstandsüberwachungsvorrichtung, die so ausgelegt ist, dass sie den Widerstand der Membran überwacht, wenn ein ausgewähltes Volumen einer Fluidprobe der Membran zugeführt wird.
Die Membran ist an einer nichtleitenden Halterung montiert, die so ausgeführt ist, dass sie die leitende Membran derart lösbar aufnimmt und hält, dass diese mit den Elektroden in Kontakt kommt. Weitere Merkmale sorgen dafür, dass die Halterung eine Kammer begrenzt, die die Membran aufnimmt; dass sich die Elektroden in die Kammer erstrecken, um mit der darin aufgenommenen Membran in Kontakt zu kommen; dass die Halterung einen Einlass für die Zuführung des ausgewählten Volumens der Fluidprobe zu der Membran aufweist; und dass das ausgewählte Volumen der Fluidprobe zwischen 10 und 1000 µl liegt.
Noch weitere Merkmale sorgen dafür, dass die Membran aus inhärent elektrisch leitendenden Fasern oder Polymerfasern, die mit einer elektrisch leitenden Beschichtung beschichtet sind, gebildet ist; und dass die elektrisch leitende Beschichtung eine Polymerbeschichtung ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypyrrol, Polythiophen, Polyanilin und Polyacetylen, wahlweise mit einem Dotiermittel.
Noch weitere Merkmale sorgen dafür, dass die biologische Erkennungskomponente durch ein Vernetzungsmittel auf die Membran aufgebracht ist; und dass die biologische Erkennungskomponente ein Antigen zum wirkungsmäßigen Binden eines Target-Antikörpers oder ein Antikörper zum wirkungsmäßigen Binden eines Target-Antigens ist.
Weitere Merkmale sorgen dafür, dass die Vorrichtung einen Controller aufweist, der so ausgeführt ist, dass er maschinenlesbare Anweisungen an die Spannungsquelle zum Anlegen einer Spannung ausgibt, und ferner so ausgeführt ist, dass er maschinenlesbare Anweisungen an die Widerstandsüberwachungsvorrichtung zum Überwachen und zum Aufnehmen von Ablesewerten des Widerstands über die Membran ausgibt; dass der Controller so ausgeführt ist, dass er maschinenlesbare Anweisungen an eine Signalisierungskomponente ausgibt, die die Detektion eines Target-Biomoleküls signalisiert, wenn von der Widerstandsüberwachungsvorrichtung ein Widerstand gemessen wird, der über einem vorbestimmten Schwellwiderstand liegt, welcher ein Widerstand der Membran ist, wenn keine Fluidprobe der Membran zugeführt wird; dass der Controller so ausgeführt ist, dass er die Ablesewerte des Widerstands über die Membran verarbeitet, um die Menge an Biomolekülen in der Probe zu quantifizieren und einen Grad an Kontamination oder Infektion der Fluidprobe zuzuordnen; und dass der Controller eine Nutzerschnittstelle und eine Anzeige zum Anzeigen eines Signals, einer quantifizierten Menge an Biomolekülen und/oder eines Grads an Kontamination oder Infektion aufweist.
Ein weiteres Merkmal sorgt dafür, dass die Widerstandsüberwachungsvorrichtung eine Spannungsmessvorrichtung ist, die über die Membran geschaltet ist, und dass der Widerstand der Membran aus einem Spannungsabfall ermittelt wird, der über die Membran gemessen wird.
Noch ein weiteres Merkmal sorgt dafür, dass die Vorrichtung tragbar und batteriebetrieben ist.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Detektieren eines Target-Biomoleküls unter Verwendung der oben beschriebenen Vorrichtung geschaffen, das die folgenden Schritte umfasst:

Zuführen eines ausgewählten Volumens einer Fluidprobe zu einer elektrisch leitenden Membran, auf der eine biologische Erkennungskomponente, die so ausgeführt ist, dass sie ein Target-Biomolekül bindet, immobilisiert ist;
Überwachen des Widerstands der Membran; und
wenn der Widerstand über einem Schwellwiderstand liegt, Signalisieren der Detektion des Target-Biomoleküls.

Eine Ausführungsform der Erfindung wird nun nur beispielhaft mit Bezug auf die beiliegenden Zeichnungen beschrieben.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
In den Zeichnungen zeigen:

1 eine dreidimensionale Explosionsansicht einer Ausführungsform einer Vorrichtung zum Detektieren von Target-Biomolekülen gemäß der Erfindung;
2 eine dreidimensionale Explosionsansicht der Ausführungsform von 1 mit verschiedenen Komponenten in ihren relativen Positionen;
3 eine dreidimensionale Ansicht der Ausführungsform von 1 in einem zusammengebauten Zustand;
4 eine Querschnittansicht der Ausführungsform von 1 in einem zusammengebauten Zustand;
5 eine dreidimensionale Ansicht der Ausführungsform von 1 in einem zusammengebauten Zustand und einen Controller;
6 eine dreidimensionale Explosionsansicht einer weiteren Ausführungsform einer Vorrichtung für die Detektion von Biomolekülen;
7 eine Unteransicht einer Halterung, die mit Elektroden versehen ist;
8 eine Draufsicht der Halterung von 7;
9 eine dreidimensionale Ansicht einer Halterung, die mit einer Abdeckung zusammengebaut ist;
10 ein schematisches Schaltbild einer elektrischen Schaltung einer Ausführungsform der Erfindung;
11 ein Diagramm mit Darstellung des Widerstands von drei unterschiedlichen leitenden Membranen, die mittels des gleichen Prozesses aufbereitet werden, als Funktion der Zeit;
12 ein Diagramm mit Darstellung des Widerstands von drei leitenden Membranen, auf die das Vernetzungsmittel Glutaraldehyd aufgebracht ist, als Funktion der Zeit;
13 ein Diagramm mit Darstellung des Widerstands von drei unterschiedlichen leitenden Membranen, auf die das Vernetzungsmittel Glutaraldehyd und ein Lysozym-Protein aufgebracht sind, als Funktion der Zeit;
14 ein Diagramm mit Darstellung des Widerstands als Funktion der Zeit von vier unterschiedlichen leitenden Membranen mit Lysozym, auf die 200 µl einer 313,6-µl/ml-Antikörperlösung aufgebracht worden ist;
15 ein Diagramm mit Darstellung von vier grafischen Darstellungen des Widerstands als Funktion der Zeit von vier unterschiedlichen leitenden Membranen mit Lysozym, auf die 200 µl einer 15,8-µl/ml-Antikörperlösung aufgebracht worden ist;
16 ein Diagramm mit Darstellung von vier grafischen Darstellungen des Widerstands als Funktion der Zeit von vier unterschiedlichen leitenden Membranen mit Lysozym, auf die 200 µl einer 0,8-pl/mI-Antikörperlösung aufgebracht worden ist;
17 ein Diagramm des Widerstands als Funktion der Zeit einer leitenden Membran mit Lysozym, auf die 200 µl einer 15,8-µl/ml-Antikörperlösung, die einen für Lysozym nichtspezifischen Antikörper enthält, aufgebracht worden ist;
18 ein Diagramm mit Darstellung von kombinierten grafischen Darstellungen des Widerstands der Membran als Funktion der Zeit für jede der unterschiedlichen Konzentrationen von Antikörperlösung, die auf die Membran aufgebracht ist (313,6, 15,8 und 0,8 µl/ml); ferner mit einer kombinierten grafischen Darstellung für das Aufbringen eines nichtspezifischen Antikörpers und einer Lösung, die keine Antikörper enthält, jeweils als positive und negative Kontrolle;
19 ein Diagramm mit Darstellung der ersten fünf Minuten der kombinierten grafischen Darstellungen des Widerstands als Funktion der Zeit von 18;
20 ein Diagramm mit Darstellung des Anstiegs des Widerstands der Membran nach den ersten fünf Minuten als Funktion einer bakteriellen Konzentration; und
21 eine grafische Darstellung der Veränderung des Widerstands von papierbasierten Membranen von einem Basislinien-Widerstand im Anschluss an das Hinzufügen einer Anti-Lysozym-Antikörper-Lösung zu der papierbasierten Membran, auf der Lysozym immobilisiert ist.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG MIT BEZUG AUF DIE ZEICHNUNGEN
Mit der Erfindung wird eine Vorrichtung zum Detektieren von Target-Biomolekülen in einem Fluid unter Verwendung einer elektrisch leitenden Membran mit einer biologischen Erkennungskomponente bereitgestellt, die so ausgeführt ist, dass sie ein Target-Biomolekül, das auf dieser immobilisiert ist, bindet. Die Membran ist mittels Elektroden, die aus einem leitenden Metall, wie z. B. Gold, Kupfer oder Platin, gefertigt sind, mit einer elektrischen Schaltung verbunden. Eine Spannungsquelle, die in der Schaltung geschaltet ist, liefert eine Spannung zu der Membran, welche so ausgewählt ist, dass sie in einem Spannungsbereich liegt, der generell keine Denaturierung oder Degradation der biologischen Erkennungskomponente, die auf der Membran immobilisiert ist, bewirkt. Eine Widerstandsüberwachungsvorrichtung überwacht den Widerstand der Membran, wenn ein ausgewähltes Volumen einer Fluidprobe, von der angenommen wird, dass sie ein Biomolekül enthält, das in der Lage ist, sich mit der biologischen Erkennungskomponente zu vereinigen, der Membran zugeführt wird. Die Widerstandsüberwachungsvorrichtung kann eine Spannungsmessvorrichtung sein, die über die Membran geschaltet ist. Der Widerstand der Membran wird dann aus einem Spannungsabfall über die Membran ermittelt.
Die Membran ist auf einer nichtleitenden Halterung montiert. Die Halterung ist so ausgeführt, dass sie die leitende Membran derart lösbar aufnimmt und hält, dass sich die leitende Membran zwischen den Elektroden erstreckt. Die Elektroden können an der Halterung angebracht oder einstellbar gesichert sein, damit sie sich von der Halterung in Richtung der Membran erstrecken. Die Membran kann sandwichartig zwischen den Elektroden oder zwischen den Elektroden und der Halterung angeordnet sein. Die Elektroden sind auf geeignete Weise positioniert, um mit der Membran in Kontakt zu kommen, und können mittels einer geeigneten Vorspanneinrichtung, wie z. B. einer Feder, in eine Position vorgespannt sein, in der sie mit der Membran in Kontakt kommen. Die Halterung kann eine Kammer begrenzen, die die Membran aufnimmt, um die Membran gegen die Umgebung zu schützen, und die eine relativ konstante Testumgebung in dieser bietet. Die Elektroden erstrecken sich dann von der Halterung in die Kammer, wo sie mit der Membran in Kontakt kommen. Falls erforderlich, kann die Halterung Zugangsports aufweisen, durch die sich die Schaltungsverdrahtung durch die Halterung zu den Elektroden in der Kammer erstreckt.
Die Halterung kann einen Einlass begrenzen für die Zuführung des ausgewählten Volumens der Fluidprobe, das vorzugsweise im Bereich zwischen 10 und 1000 µl, vorzugsweise zwischen 100 und 300 µl liegt, zu der Membran. Der Einlass kann so positioniert sein, dass das ausgewählte Volumen der Fluidprobe einer zentralen Region der Membran zugeführt wird, und kann entlang der Länge der Halterung zwischen den Elektroden positioniert sein.
Die Membran kann aus inhärent elektrisch leitenden Polymerfasern oder Fasern, die mit einer elektrisch leitenden Beschichtung beschichtet sind, gefertigt sein. Die Membran kann aus sehr feinen rohrförmigen Kohlenstoff-Nanofasern mit einem hohen Grafitgehalt gefertigt sein, die wärmebehandelt sind, damit chemisch aufgedampfter Kohlenstoff karbonisiert wird, der auf der Oberfläche der Nanofasern, wie z. B. Pyrograf®-III-LHT, vorhanden ist. Alternativ können die Polymerfasern Natur- oder Kunstfasern sein, die mit einer elektrisch leitenden Beschichtung, wie z. B. einer polymeren Beschichtung, beschichtet sind, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypyrrol, Polythiophen, Polyanilin und Polyacetylen. Im Fall von Naturfasern kann die Membran aus Zellulosefasern gefertigt sein, die in Papier mit einer ausgewählten Dicke gedrückt sind und die mit einer leitenden Beschichtung beschichtet sind. Alternativ können synthetische Polymerfasern aus Polypropylen mit einer elektrisch leitenden Beschichtung beschichtet sein.
Die biologische Erkennungskomponente kann ein Antigen, Antikörper, Enzym, eine Nukleinsäure oder ein anderer Typ von Biomolekül sein. Die biologische Erkennungskomponente ist so ausgeführt, dass sie in der Lage ist, ein Target-Biomolekül zu binden. Die biologische Erkennungskomponente weist somit eine Bindungsstelle auf, die zu einer Bindungsstelle auf dem Target-Biomolekül komplementär ist. Zum Beispiel kann die biologische Erkennungskomponente ein Antikörper, wie z. B. ein Anti-E.coli-Antigen sein, das ein Antigen, wie z. B. E.coli-Bakterien, wirkungsmäßig bindet, um eine E.coli-Kontamination in einer Wasserprobe zu detektieren. Alternativ kann die biologische Erkennungskomponente ein Antigen, wie z. B. E.coli, sein, das den Anti-E.coli-Antikörper bindet, um eine Infektion in einer von einem Tier stammenden Fluidprobe zu detektieren. In dem Fall, in dem die biologische Erkennungskomponente eine Nukleinsäure ist, kann diese zum Detektieren des Vorhandenseins eines Target-Virus verwendet werden.
Die biologische Erkennungskomponente ist mit einem geeigneten Vernetzungsmittel auf der leitenden Membran aufgebracht. Jedes geeignete Vernetzungsmittel kann zum Vernetzen der biologischen Erkennungskomponente mit der Membran in Abhängigkeit von der Identität und Natur der biologischen Erkennungskomponente bzw. der Membran verwendet werden. Das Vernetzungsmittel sollte die korrekten chemischen funktionellen Gruppen sowohl zum Binden der leitenden Fasern über funktionelle Gruppen, die auf der Oberfläche der Mikrofasern vorgesehen sein können, als auch zum Binden der ausgewählten biologischen Erkennungskomponente, vorzugsweise durch kovalente Bindungen, die eine relativ starke Vernetzung bieten, aufweisen.
Die Vorrichtung kann einen Controller aufweisen, der so ausgeführt ist, dass er maschinenlesbare Anweisungen an die Spannungsquelle zum Anlegen einer Spannung ausgibt und maschinenlesbare Anweisungen zu der Widerstandsüberwachungsvorrichtung zum Überwachen und zum Aufnehmen der Ablesewerte des Widerstands über die Membran ausgibt. Die Vorrichtung kann ferner eine Signalisierungskomponente aufweisen, und in diesem Fall ist der Controller ferner so ausgeführt, dass er maschinenlesbare Anweisungen an eine Signalisierungskomponente ausgibt, die die Detektion eines Target-Biomoleküls signalisiert, wenn ein Widerstand von der Spannungsmessvorrichtung gemessen wird, der über einem vorbestimmten Schwellwiderstand liegt. Der vorbestimmte Schwellwiderstand kann so gesetzt sein, dass er entspricht: einem Widerstand der Membran, wenn keine Fluidprobe der Membran zugeführt wird; einem Widerstand der Membran, wenn ein Kontrollfluid, das im Wesentlichen keine Biomoleküle enthält, der Membran zugeführt wird; oder einem Widerstand der Membran, wenn ein Kontrollfluid, das Biomoleküle enthält, die die biologische Erkennungskomponente nicht erkennt oder bindet, der Membran zugeführt wird. Die Vorrichtung kann eine zweite Kontrollmembran aufweisen, deren Widerstand überwacht und gemessen wird, um den Schwellwiderstand zu ermitteln, der zum genaueren Bewerten der Veränderung des Widerstands der ersten Membran relativ zu demjenigen, der für die zweite Membran gemessen wird, verwendet wird. Die Halterung kann auf geeignete Weise ausgelegt sein, damit sie die zweite Membran aufnehmen und halten kann und damit sie mit einem zweiten Satz von Elektroden und einer Schaltungsverdrahtung versehen sein kann. Die Halterung kann erforderlichenfalls ferner einen zweiten Einlass für die Zuführung einer Kontrolllösung zu der zweiten Membran aufweisen.
Der Controller kann so ausgeführt sein, dass er die Ablesewerte des Widerstands über die Membran verarbeitet, um die Menge an Biomolekülen in der Probe zu quantifizieren und einen Grad an Kontamination oder Infektion der Fluidprobe zuzuordnen. Der Controller kann ferner eine Nutzerschnittstelle und eine Anzeige, wie z. B. eine LCD- (LCM1602-) Anzeige zum Anzeigen eines Signals, einer quantifizierten Menge an Biomolekülen und/oder eines Grads an Kontamination oder Infektion aufweisen.
Die Vorrichtung kann eine tragbare Point-of-Care-Vorrichtung sein, die von einer tragbaren Energiequelle, wie z. B. Batterien oder Solarpaneelen, mit Energie versorgt wird. Die Energiequelle kann so ausgeführt sein, dass sie gleichzeitig die Spannung den Elektroden, die mit der Membran verbunden sind, zuführt und den Controller und die Widerstandsüberwachungsvorrichtung mit Energie versorgt.
Eine Ausführungsform einer Vorrichtung (1) für die Detektion von Biomolekülen ist in 1 bis 5 gezeigt und weist im Wesentlichen eine rechteckige leitende Membran (3) von ungefähr 30 mm x 15 mm mit einer ausgewählten biologischen Erkennungskomponente, wie z. B. einem Antigen oder Antikörper, die auf ihrer Oberfläche immobilisiert ist, auf. Bei dieser Ausführungsform ist die Membran (3) aus Polypropylen-Mikrofasern mit einer Dicke von 50 g/m² gefertigt. Die Mikrofasern sind so angeordnet, dass sie eine aufgeschmolzene Spinnvlies-Textilmembran bilden. Die Mikrofasern der Membran werden im Wesentlichen gleichförmig mit einer leitenden Beschichtung, insbesondere einer polymeren Beschichtung, unter Verwendung eines Prozesses zur wässrigen Abscheidung beschichtet. Die leitende Beschichtung ist eine dotierte Polypyrrol-Beschichtung, die durch die Copolymerisation der Membran-Mikrofasern mit einer Pyrrol-Monomerlösung, die 3-Thiophenessigsäure (3TAA) enthält, erhalten wird. 3TAA stellt das Einschließen der funktionellen Gruppen sicher, die sich kovalent mit Vernetzungsmitteln und/oder direkt mit biologischen Erkennungskomponenten vernetzen können, um die biologischen Erkennungskomponenten auf der Oberfläche der Mikrofasern der Membran zu immobilisieren. Im Anschluss an die Copolymerisation werden die Mikrofasern mit einer 5-Sulfosalicylsäure in Gegenwart einer Eisen(III)-chlorid-Lösung dotiert.
Ein Vernetzungsmittel, bei dieser Ausführungsform Glutaraldehyd, wird zum Binden der biologischen Erkennungskomponente an die Membran verwendet. Glutaraldehyd ist gegenüber Amingruppen reaktiv, die normalerweise auf Biomolekülen, wie z. B. Proteinen, zu finden sind. Die leitende Membran (3), auf der die biologische Erkennungskomponente immobilisiert ist, ist mittels einer elektrischen Verdrahtung (5), die mit leitenden Elektroden (7) verbunden ist, mit einer elektrischen Schaltung verbunden. Bei dieser Ausführungsform sind die Elektroden in Form von Stiften aus Gold ausgebildet. Die Membran (3) ist in einer Kammer (11) aufgenommen, die von einer Halterung (9) begrenzt wird. Die Kammer (11) ist komplementär zu der Membran (3) ausgebildet. Die Halterung (9) ist aus einem nichtleitenden Material, wie z. B. einem Kunststoffmaterial, gefertigt. Die Halterung (9) weist eine Abdeckung (13) auf, die die Membran (3) in der Kammer (11) einschließt. Die Abdeckung (13) ist unter Verwendung geeigneter Befestigungsteile oder Befestigungsmittel, bei dieser Ausführungsform Schrauben (15), an einem offenen Ende der Kammer (11) gesichert.
Die Halterung (9) weist einen Träger (17) für die Elektroden (7) auf, der so ausgeführt ist, dass er in der Kammer (11) aufgenommen ist. Der Träger weist Fixierformationen in Form von Öffnungen (19) auf, durch die sich die Elektroden (7) erstrecken. Die Öffnungen (19) sind in einem ausgewählten Abstand voneinander beabstandet, damit die Elektroden so positioniert sind, dass sich die Membran in einem zusammengebauten Zustand zwischen diesen erstreckt. Der Träger (17) ist von einer Vorspanneinrichtung in Form von Federn (21), die zwischen der Abdeckung (13) und dem Träger (17) betätigbar sind, in Richtung der Membran (3) vorgespannt. Die Federn (21) spannen die Elektroden wirkungsmäßig in Richtung der Membran vor, um einen Kontakt zwischen den Elektroden (7) und der Membran (3), die sich an dem Basisteil der Kammer (11) befindet, aufrechtzuerhalten. Die Membran (3) wird zwischen den Elektroden (7) und dem Basisteil der Halterung (9) festgehalten. Die Elektroden (7) sind so angeordnet, dass sie mehr oder weniger den gleichen Druck auf die Membran (3) aufbringen, um die Genauigkeit der Ablesewerte des Widerstands der Membran (3) zu verbessern.
Die Abdeckung (13) der Halterung (9) begrenzt ferner einen Einlass (23) für die Zuführung einer Fluidprobe zu einer zentralen Region der verwendeten Membran. Der Einlass (23) ist so angeordnet, dass er sich entlang der Länge der Halterung (9) zwischen den Elektroden (7) befindet. Die Abdeckung (13) begrenzt einen Kanal (25), der in gestrichelten Linien in 1 und 2 gezeigt ist und am deutlichsten in 4 gezeigt ist. Der Kanal (25) leitet die Fluidprobe auf die verwendete Membran (3). Der Kanal (25) erstreckt sich durch ein Fenster (27) in dem Träger (17) in Richtung der Membran (3) und endet wirkungsmäßig über der Membran (3).
Eine Ausführungsform einer Vorrichtung (31) zum Detektieren von Biomolekülen, die einen Controller aufweist, ist in 5 gezeigt. Die Halterung (9), die die Membran und sämtliche in 1 bis 4 gezeigten zusammengebauten Komponenten enthält, wird in einen Hohlraum (33) eingesetzt, der in dem Körper einer tragbaren Rechnervorrichtung (35) ausgebildet ist. Komplementäre Fixierformationen (37) auf der Halterung (9) und der Rechnervorrichtung (35) stellen sicher, dass die Halterung (9) in dem Hohlraum (33) festgehalten wird. Der Körper der Rechnervorrichtung weist eine Öffnung (41) auf, die mit dem Einlass (23) der Halterung (9) ausgerichtet ist, wenn die Halterung in dem Hohlraum (33) aufgenommen ist, um Zugang zu dem Einlass (23) zwecks Zuführung einer zu testenden Fluidprobe durch die Öffnung (41) und in den Einlass (23) zu bieten, so dass sie auf die verwendete Membran (3) weitergeleitet werden kann.
Die Halterung (9) weist zwei elektrische Kontakte (39) auf, die so angeordnet sind, dass sie eine elektrische Verbindung zwischen den Elektroden und der Widerstandsüberwachungsvorrichtung sicherstellen, so dass der Widerstand der Membran überwacht und aufgezeichnet werden kann.
Der Controller, vorzugsweise ein Mikrocontroller, ist so ausgeführt, dass er maschinenlesbare Anweisungen an eine Spannungsquelle zum Anlegen einer Spannung an die Membran ausgibt und maschinenlesbare Anweisungen an die Widerstandsüberwachungsvorrichtung zum Überwachen und zum Aufnehmen von Ablesewerten des Widerstands über die Membran nach der Zuführung eines ausgewählten Volumens der Fluidprobe zu der Membran ausgibt. Der Controller ist ferner so ausgeführt, dass er die Ablesewerte des Widerstands über die Membran verarbeitet, um das Vorhandensein von Biomolekülen zu signalisieren und/oder die Menge an Biomolekülen in der Probe zu quantifizieren und einen Grad an Kontamination oder Infektion der Fluidprobe zuzuordnen. Der Controller kann ferner eine Nutzerschnittstelle (43) für eine Nutzereingabe aufweisen. Eine LDC-Anzeige (45) ist zum Anzeigen eines Signals, einer quantifizierten Menge an Biomolekülen und/oder eines Grads an Kontamination oder Infektion vorgesehen. Bei einer alternativen Ausführungsform kann die Nutzerschnittstelle so ausgeführt sein, dass sie eine gleichzeitige Eingabe und Ausgabe durch den Nutzer ermöglicht. Die Ausführungsform von 5 findet Anwendung als tragbare Point-of-Care-Vorrichtung zum Detektieren von Target-Biomolekülen und wird von einer Batterie mit Energie versorgt. Die Vorrichtung kann ferner so ausgeführt sein, dass sie seriell oder drahtlos mit einer anderen Vorrichtung, wie z. B. einem Personalcomputer oder einem Smartphone, kommuniziert.
Eine weitere Ausführungsform einer Vorrichtung (100) für die Detektion von Biomolekülen ist in 6 bis 9 gezeigt und weist eine generell quadratische leitende Membran (103) von ungefähr 30 x 30 mm mit einer ausgewählten biologischen Erkennungskomponente, die darauf immobilisiert ist, auf. Die leitende Membran (103), auf der die biologische Erkennungskomponente immobilisiert ist, ist mittels einer elektrischen Verdrahtung (105), die mit leitenden Elektroden (107) in Form von Platten aus Kupfer verbunden ist, mit einer elektrischen Schaltung verbunden. Die Elektroden (107), die in gestrichelten Linien in 6 gezeigt sind, sind 17 mm voneinander beabstandet und an einer Halterung (109) fixiert. Eine Abdeckung (111) wirkt mit der Halterung zusammen, und die Membran (103) wird zwischen der Abdeckung (111) und den Elektroden (107), die an der Halterung (109) fixiert sind, festgehalten, wenn die Halterung (109), die Membran (103) und die Abdeckung (111) zusammengebaut sind.
Die nichtleitende Halterung (109), an der die Elektroden angebracht sind, ist in 7 und 8 gezeigt und ist vorzugsweise aus Kunststoff hergestellt. Die Halterung weist Zugangsports (117), die in 8 gezeigt sind, mit einem Radius von 1 mm auf zum Bieten von Zugang für die elektrische Verdrahtung (105), die sich durch die Halterung (109) erstreckt. Die Halterung weist ferner einen Einlass (115) mit einem Radius von 2,2 mm auf, der sich für die Zuführung der Fluidprobe zu einer zentralen Region der verwendeten quadratischen Membran zwischen den Elektroden (107) befindet.
Der Einlass (115) in der Halterung (109), der einen Einlass bietet, steht mit einer 17 x 17 mm großen Ausnehmung (121) in Verbindung, die von der Halterung begrenzt wird und über die sich die Membran in einem zusammengebauten Zustand der Vorrichtung erstreckt. Die Zuführung durch den Einlass (115) in die Ausnehmung (121), die von der Halterung begrenzt wird, und auf die Membran kann durch Pipettieren des ausgewählten Volumens der Fluidprobe und Injizieren derselben in den Einlass (115) unter Verwendung einer Mikropipette erfolgen. Wenn keine Mikropipette zur Verfügung steht, können einige Tropfen der Fluidprobe durch den Einlass auf die Membran getropft werden. Als ungefähre Richtlinie bezüglich des Volumens der Fluidprobe, die tropfenweise aufgebracht werden kann, gelten ungefähr vier Tropfen Flüssigkeit, was mehr oder weniger gleich 200 µl ist.
Die Halterung (109) ist so ausgeführt, dass sie mit der Abdeckung (111) zusammenwirkt, um die leitende Membran so lösbar aufzunehmen und zu halten, dass sich diese zumindest teilweise über die Elektroden erstreckt, um mit den Elektroden in Kontakt zu kommen. Die Halterung (109) und die Abdeckung (111) sind in 9 in zusammengebautem Zustand gezeigt, wobei sich die elektrische Verdrahtung (105) in Richtung der Elektroden, die an der Halterung (109) angebracht sind, erstreckt. Die Halterung (109) ist so gestaltet und bemessen, dass sie zumindest teilweise in einer Innenkammer der Abdeckung (111) so aufgenommen ist, dass die Elektroden, die an der Oberfläche der Halterung (109) angebracht sind, im Wesentlichen deckungsgleich mit einer Innenfläche der Abdeckung (111) gegenüber den Elektroden sind, wenn die Halterung (109) und die Abdeckung (111) zusammengebaut sind. Die Abdeckung (111) drückt gegen die Elektroden (107), wenn sie mit der Halterung (109) zusammengebaut ist, wodurch die Membran zwischen den Elektroden und der Abdeckung (111) festgehalten wird. Die Halterung (109) weist zwei Schultern (125) auf, die sich von entgegengesetzten Seiten der Halterung (109) erstrecken und die sich, wenn sie mit der Abdeckung (111) zusammengebaut sind, über einen Abschnitt einer Außenfläche (127) der Abdeckung (111) erstrecken, um das Maß zu begrenzen, in dem die Halterung in die Abdeckung (111) eingesetzt wird.
Die Abdeckung (111) stellt sicher, dass die unmittelbare Umgebung der Membran standardisiert ist, um einen Kontakt des Nutzers mit der Membran während der Messungen zu begrenzen. Idealerweise muss die Abdeckung der Halterung die gleiche Kraft auf die Membran und die Elektroden aufbringen, wenn sie mit der Halterung zusammengreift. Bei dieser Ausführungsform weist die Abdeckung ein 18 x 18 mm großes Fenster (135) auf, das einem Nutzer Zugang zu der Membran zwecks Entfernens oder Modifizierens derselben ermöglicht. Bei einer alternativen Ausführungsform kann die Abdeckung ein geschlossenes Ende aufweisen.
Eine Ausführungsform einer elektrischen Schaltung, mit der die elektrische Verdrahtung der Vorrichtung verbunden ist, ist schematisch in 10 dargestellt. Die elektrische Schaltung (200) weist eine Spannungsquelle (203) auf, die eine Spannung an die Elektroden und somit an die Membran (207) anlegt, welche als Widerstandselement dient. Aufgrund der Natur von biologischen Molekülen und biologischen Zellen wird eine Spannung zwischen 0,2 V und 0,8 V aufgebracht, um eine Beschädigung der biologischen Erkennungskomponente zu vermeiden. Ein zweites variables Widerstandselement (209) ist mit der Spannungsquelle (203) in Reihe geschaltet. Der Widerstand des variablen Widerstandselements (209) ist bekannt und kann so eingestellt sein, dass er ungefähr mit dem erwarteten Widerstand über die Membran (207) korreliert ist. Eine Widerstandsüberwachungsvorrichtung (205) ist als Teil der Schaltung vorgesehen und so ausgeführt, dass sie den Widerstand der Membran überwacht, während von der Spannungsquelle (203) eine Spannung an die Membran angelegt wird, wenn ein ausgewähltes Volumen der Fluidprobe einer zentralen Region der Membran zugeführt wird.
Die Fluidprobe ist eine solche, die auf das Vorhandensein von Biomolekülen zu testen ist, welche in der Lage sind, sich an die biologischen Erkennungskomponenten, die auf der Membran immobilisiert sind, zu binden. Die Fluidprobe kann ein biologisches Fluid, das von einem Menschen oder einem Tier stammt, eine Wasserprobe oder eine Lebensmittelprobe sein, die so aufbereitet worden ist, dass sie eine geeignete fließfähige Probe bildet. Die Fluidprobe kann eine Pufferlösung, wie z. B. eine phosphatgepufferte Salzlösung, aufweisen.
Bei Verwendung wird durch das spezifische Binden eines Biomoleküls an eine biologische Erkennungskomponente ein größerer molekularer Komplex produziert, der normalerweise nicht elektrisch leitend ist, wodurch die Leitfähigkeit der Membran über den Bereich der Bindung gesenkt wird. Die Detektion der Komplexe ist möglich aufgrund der Messung eines erhöhten Widerstands und einer erhöhten Veränderungsrate des Widerstands über die Membran. Das Biomolekül, das die Membran zu detektieren in der Lage ist, ist vom Typ oder der exakten biologischen Erkennungskomponente, die auf der Membran immobilisiert ist, abhängig.
Die Vorrichtung für die Detektion von Biomolekülen kann bei einem Verfahren zum Detektieren von Biomolekülen verwendet werden. Ein solches Verfahren umfasst bei einem ersten Schritt das Bereitstellen einer Fluidprobe, die potenziell ein Target-Biomolekül enthält. Als Nächstes wird die Fluidprobe der Membran der hier beschriebenen Vorrichtung zugeführt, wonach der Widerstand der Membran über eine ausgewählte Zeitperiode überwacht und aufgezeichnet wird. Wenn der Widerstand über einen Schwellwiderstand ansteigt, der von einem Controller ermittelt wird, wird ein Signal von einer Signalisierungskomponente produziert, um eine positive Detektion eines Target-Biomoleküls, von dem bekannt ist, dass es mit einer ausgewählten biologischen Erkennungskomponente interagiert und sich an diese bindet, zu signalisieren.
Es wird ein beispielhaftes Verfahren zur Messung von primären Anti-Lysozym-Antikörpern in Probenlösungen beschrieben. Bei dieser Vorrichtung ist die biologische Erkennungskomponente Lysozym, das mit der leitenden Membran vernetzt ist.
BEISPIELE
Beispiel 1
Die Fähigkeit der Vorrichtung zum Detektieren des Vorhandenseins eines AntioLysozym-Antikörpers ist mit einer Membran getestet worden, auf der Lysozym als biologische Erkennungskomponente immobilisiert ist.
Verfahren
1. Vorbereitung der leitenden Membran
Ein Platte aus einem aufgeschmolzenen Spinnvlies aus Polypropylen-Mikrofasern mit einer Dicke von 50 g/m² wurde in eine 90 x 90 mm große quadratische Platte geschnitten. Die Mikrofasern der Platte wurden mit einer leitenden Beschichtung versehen, die dotierte Polypyrrol-Copolymere umfasste. Das Pyrrol-Monomer wurde mit einer Carboxylsäure-funktionalen 3-Thiophenessigsäure (3TAA) copolymerisiert. Eine 3TAA-Lösung mit einer Konzentration von 10 mg/ml wurde mit 10 % Pyrrol gemischt, und die Mikrofaserplatte wurde einige Sekunden lang in die Lösung getaucht und dann herausgenommen. Danach wurde die Mikrofaserplatte in ein Glasreaktionsgefäß platziert, das 30 ml von 0,1 M Eisen(III)-chlorid-Lösung (FeCl_s) in entionisiertem Wasser enthielt. Ein Volumen von 1 ml von 0,1 M 5-Sulfosalicylsäure (5SSA), die als Dotiermittel diente, wurde für jeweils 10 ml FeCl₃, das als Oxidans diente, hinzugefügt. Die Reagenzien konnten 30 Minuten lang bei Raumtemperatur reagieren, wobei sie sanft umgerührt wurden, um zu ermöglichen, dass eine oxidative Polymerisierung des Pyrrol-Monomers erfolgte. Die Mikrofaserplatte wurde dann herausgenommen und mit entionisiertem Wasser gewaschen und konnte 4 Stunden lang trocknen.
2. Glutaraldehyd-Aufbringung
Die beschichteten leitenden Mikrofaserplatten wurden in kleinere 30 mm x 30 mm große Membranen geschnitten. Die kleineren Membranen wurden mit destilliertem Wasser gewaschen und konnten fünf Minuten lang trocknen. Die Platten wurden in 2,5 mM Glutaraldehydlösung getaucht und eine Stunde lang bei 4 °C inkubiert, wonach die Mikrofasermembranen erneut mit destilliertem Wasser gewaschen wurden und 10 Minuten lang trocknen konnten.
3. Lysozym-Immobilisierung
Die leitenden, mit Glutaraldehyd beschichteten Mikrofasermembranen wurden mit destilliertem Wasser gewaschen und konnten fünf Minuten lang trocknen. Eine Lysozymlösung wurde in sterilen Glasbehältern mit 100 µg/ml Lysozym, abgeleitet aus Hühnereiweiß-Protein (Roche, Mannheim, Deutschland) in einer phosphatgepufferten Salzlösung (1X PBS), die 137 mmol/l NaCl, 2,7 mmol/l KCI, 10 mmol/l Na₂HPO₄ und 1,8 mmol/l KH₂PO₄ umfasste, hergestellt.
Die Membranen wurden 10 Sekunden lang mit 1X PBS gespült und dann in die Lysozymlösung getaucht und 2 Stunden lang bei 4 °C inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation wurden die Mikrofasermembranen mit 1X PBS gewaschen und konnten 10 Minuten lang trocknen.
Die Menge an biologischen Erkennungskomponenten, in diesem Fall Lysozym, das auf der Membran immobilisiert ist, ist proportional zu der Menge an Glutaraldehyd, das an den Mikrofasern der Membran vorhanden ist. Je mehr biologische Erkennungskomponenten auf der Membran sind, desto größer ist die Empfindlichkeit der Vorrichtung aufgrund des Potenzials für eine stärkere molekulare Bindung von Biomolekülen. Daher wird bevorzugt, eine wesentliche Menge an Lysozym auf der Membran zu immobilisieren. Wenn jedoch die Membran zu lange in der Lysozymlösung verbleibt, kann sich das Glutaraldehyd aufgrund der Auflösung von der Membran lösen. Es hat sich herausgestellt, dass die Rate der Lysozymanbindung an das Vernetzungsmittel normalerweise die Rate der Auflösung von Glutaraldehyd in der 1 X PBS-Lösung übersteigt.
4. Herstellung der Halterung und der Abdeckung
Zum Halten der Membran und zum Bieten einer standardisierten Testumgebung zum Messen des Widerstands der Membran wurde eine Halterung, die mit einer Abdeckung zusammenwirkt, unter Verwendung von AutoCad™ ausgelegt, und die Halterung und die Abdeckung wurden durch dreidimensionales Drucken unter Verwendung eines 3D-Druckers MakerBot™ Replicator Z18 (2009 - 2015 MakerBot Industries, LLC One MetroTech Center, 21st Floor, Brooklyn, NY 11201 USA) hergestellt.
5. Aufbereitung der Fluidprobe: die Antikörperlösung
Unterschiedliche Konzentrationen von Primär-Anti-Lysozym-Antikörper-Lösungen wurden aufbereitet: 313,6, 31,6, 15,8 und 0,8 µl/ml. Die Antikörperlösungen wurden durch Verdünnen einer kleinen Menge des primären Antikörpers in 10X PBS auf die gewünschte Konzentration hergestellt.
6. Vorbereitung zu Messungen
Zum Sicherstellen, dass sämtliche Messungen standardisiert waren, wurden 300 oder 500 µl PBS den unterschiedlichen Membranen zugeführt, so dass die Membranen vor den Messungen gleichermaßen mit PBS gesättigt waren. Eine Membran wurde dann auf der Halterung platziert und mit der Abdeckung abgedeckt. Widerstandsmessungen wurden durch Verbinden der Membran, die mittels der oben beschriebenen Verfahren vorbereitet worden ist, über die Elektroden, die an der Halterung angebracht waren, mit der in 10 gezeigten elektrischen Schaltung durchgeführt. Ein Oszilloskop (Tektronix TDS 1002b) wurde zum Messen der Potenzialdifferenz über die Membran verwendet. Das Oszilloskop war mit einem Computer verbunden, der die Ergebnisse verarbeitet hat.
Es wurde konstant 0,5 V ausgewählt, und die Spannungsquelle wurde auf diesen Wert gesetzt. Die zu jedem Zeitpunkt gemessene Spannung konnte zum Berechnen des Widerstands der Membran mittels des Ohmschen Gesetzes verwendet werden, wobei R = V/I, wobei R der Widerstand ist, V die Potenzialdifferenz (oder Spannung) über die Membran ist und I der Strom in der Schaltung ist. Der Widerstand der Membran wurde aus der Differenz zwischen der angelegten Spannung und der in der Schaltung gemessenen Spannung berechnet. Unter Anwendung des Kirchoff-Gesetzes wurde die folgende Gleichung für den oben beschriebenen Versuchsaufbau ermittelt: $- V_{i} + V_{R} + V_{f} = 0$
wobei V_i die Quellenspannung ist, V_R die Spannung über das variable Widerstandselement ist und Vf die Differenz zwischen der angelegten Spannung und der gemessenen Spannung (dem Spannungsabfall) über die Membran ist. Die vorstehende Gleichung kann erweitert werden auf: $V_{i} = R_{s} \times i + V_{f}$
V_f wurde kontinuierlich mittels des Oszilloskops gemessen. Mit i, dem Strom, als der einzigen unbekannten Variablen und unter Anwendung des Ohmschen Gesetzes (R = V/I) konnten die zwei Gleichungen kombiniert werden, um den Widerstand zu jeder gegebenen Zeit zu berechnen: $R_{f} = \frac{V_{f} R_{s}}{- V_{f} + V_{i}}$
Bei einem erwarteten Widerstand einer Membran im Bereich von 1000 Ω wurde der Widerstand des variablen Widerstandselements (R_s) mit 1000 Ω gewählt. Bei Messung des Spannungsabfalls über die Membran mittels des Oszilloskops konnte der Widerstand der Membran unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet werden $R_{f} = \frac{V_{f} \times 1000}{- V_{f} + 0,5}$
Unter Verwendung von Matlab™ und Control System Toolbox^® wurden die Widerstandsmesswerte (Spannungsabfälle) aufgezeichnet und analysiert.
Nach ungefähr 10 Sekunden des Anlegens einer Spannung an die Membran wurden 200 µl Antikörperlösung mit einer gewählten Konzentration durch den Durchlass in der Halterung hinzugefügt, um die Lösung der Membran zuzuführen. Die primären Anti-Lysozym-Antikörper binden sich an das Lysozym zum Bilden eines Antigen-Antikörper-Komplexes, bei dem sich herausgestellt hat, dass er bis zu einer Stunde lang vorhanden war. Somit wurde, nachdem der Antikörper hinzugefügt worden war, der Widerstand eine Stunde lang gemessen und aufgezeichnet.
7. Datenerfassung
Vier unterschiedliche Sätze von Daten aus den folgenden Versuchen wurden erfasst:

(a) Widerstand der Membran mit der leitenden Beschichtung;
(b) Widerstand der leitenden Membranen mit darauf aufgebrachtem Glutaraldehyd;
(c) Widerstand der leitenden Membranen sowohl mit darauf aufgebrachtem Glutaraldehyd als auch Lysozym; und
(d) Widerstand der leitenden Membranen mit aufgebrachten Glutaraldehyd, Lysozym und unterschiedlichen Konzentrationen von Antikörper.

Jeder dieser Versuche wurde an einem Satz von drei bis vier verschiedenen Membranen durchgeführt, die zum Bewerten der Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und deren Genauigkeit mittels des gleichen Prozesses vorbereitet wurden. Die Daten aus jedem Test wurden interpretiert, und es wurde ein Diagramm mit Anzeige des Widerstands über die Zeit erstellt.
In den grafischen Darstellungen, die in dem nachstehenden Ergebnisabschnitt aufgezeigt sind, werden die Messwerte zwischen der Startzeit des Versuchs, die der Moment ist, in dem eine Lösung der Membran, über die eine Spannung angelegt ist, zugeführt wird, und einer Minute nicht gezeigt. Es hat sich herausgestellt, dass das Hinzufügen der Lösung während dieser Zeitperiode zu anomalen und fehlerhaften Widerstandsmesswerten, die nichtlinear waren, führte. Die anomalen Ablesewerte sind zu erwarten, da es schwierig ist, die Zuführrate der Lösungen auf die Membran zu kontrollieren.
8. Qualitative Tests, die durchgeführt werden, um das Binden von Anti-Lysozym-Antikörpern an Lysozym, das auf einer Membran immobilisiert ist, zu bestätigen
Eine positive Bindung der Antikörper an das Protein und somit an die Membran wurde durch Färben der Mikrofasern der Membran mit einem sekundären fluoreszierenden Antikörper bei einem separaten Versuch bestätigt. Im Anschluss an die Immobilisierung von Lysozym auf der Membran wurde die Membran in einen Behälter platziert, der 200 µl von 313,6-µl/ml-Anti-Lysozym-Antikörper-Lösung enthielt, und eine Stunde lang bei 4 °C inkubiert. Die Membran wurde dann gründlich mit 1X PBS gewaschen, um überschüssige Anti-Lysozym-Antikörper zu entfernen, die sich nicht an das Lysozym gebunden haben. Die folgenden Schritte wurden dann wegen der Lichtempfindlichkeit der Fluorochrome in den Reagenzien in einem dunklen Raum durchgeführt. 200 µl des sekundären Antikörpers Alexa Fluor 488 (Invitrogen) wurde der Membran zugeführt, und die Membran wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie wieder mit 1X PBS gewaschen wurde und trocknen konnte. Behandelte Proben wurden dann in einem lichtempfindlichen Behälter aufbewahrt. Eine Bestätigung einer positiven Bindung des Proteins an die Faser und des primären Antikörpers an das Protein wurde unter Verwendung eines konfokalen Fluoreszenzmikroskops (konfokales Mikroskop Zeiss LSM780) bestimmt. Positiv- und Kontrollbilder wurden mit dem 40 X-Objektiv erfasst, und die Fluoreszenz- und Phasenkontrastüberlagerungen wurden schnell qualitativ bewertet. Die fluoreszierenden sekundären Antikörper, die auf Mikrofasern der Membran immobilisiert waren, sind auf den aufgenommenen Bildern eindeutig zu sehen.
Versuchsergebnisse
(a) Widerstand der Membran mit der leitenden Beschichtung
Bei dem ersten Versuch wurde der Widerstand, der aus dem Spannungsabfall über drei Membranen berechnet wurde, die mit der leitenden Beschichtung beschichtet waren, 20 Minuten lang gemessen. Die drei Membranen wurden mittels des gleichen Prozesses vorbereitet, wie oben bei 1 beschrieben worden ist. Der Widerstand als Funktion der Zeit der drei Membranen ist in 11 grafisch dargestellt. Lineare Trendlinien wurden in jeden Satz von Daten eingesetzt (Membran 1 (1001): y = 3,7511x+238,98 R² = 0,9231, Membran 2 (1002): y = 2,4567x+ 135,48 R² = 0,9712, Membran 3 (1003): y = 2,5994x + 217,12 R² = 0,9336)). Ein Anstieg des Widerstands oder eine Verringerung der Leitfähigkeit über die Zeit wird für jede Membran beobachtet. Der anfängliche Widerstand und die Anstiegsrate des Widerstands in den grafischen Darstellungen sind für die unterschiedlichen Membranen mehr oder weniger gleich.
Im Anschluss an das Beschichten der Platten mit leitenden Reagenzien wurden Membranwiderstandswerte von so niedrigen Werten wie 140 Ω pro 17 mm erreicht. 17 mm ist der standardisierte Abstand, über den die Messungen durchgeführt wurden. Obwohl niedrige Widerstände erreicht wurden, variierte der Widerstand der drei vorbereiteten Membranen zwischen 140 Ω und 300 Ω pro Abstand von 17 mm. Es ist absehbar, dass diese Abweichung durch Automatisieren des Membranvorbereitungsprozesses verringert werden kann.
Der in 11 gezeigte stetige Anstieg des Widerstands über die Zeit erfolgte, obwohl während der Messungen keine zusätzlichen Lösungen oder Reagenzien auf die Membran aufgebracht wurden. Der Anmelder ist der Meinung, dass der Anstieg des Widerstands durch Wechselwirkungen der Kupferelektroden und der Salze, die auf der Membran vorhanden sind, wie z. B. Eisen(III)-chlorid, Natriumchlorid (NaCl), Kaliumchlorid (KCl), Natriumphosphat (Na₂HPO₄) und Kaliumphosphat (KH₂PO₄), abgeleitet von der PBS-Lösung, die vor sämtlichen Messungen auf die Membran aufgebracht wurde, hervorgerufen worden ist.
Es wird erwartet, dass der beobachtete lineare Anstieg des Widerstands bei sämtlichen Widerstandsmessungen, die an den Membranen durchzuführen sind, vorhanden ist. Dies kann als „Basiswirkung“ oder Hintergrundwirkung beschrieben werden, mit der sämtliche weitere Messungen verglichen werden können. Die Anstiegsrate des Widerstands ergab auf der Basis der Daten in 11 im Durchschnitt ungefähr 2,935 Ω pro Minute.
(b) Widerstand von leitenden Membranen mit darauf aufgebrachtem Glutaraldehyd
Bei dem zweiten Versuch wurde der Widerstand, der aus dem Spannungsabfall über drei leitende Membranen berechnet wurde, auf die das Vernetzungsreagens Glutaraldehyd aufgebracht worden ist, 20 Minuten lang gemessen, und eine grafische Darstellung der Ergebnisse ist in 12 gezeigt. Lineare Trendlinien wurden in die grafischen Darstellungen eingesetzt (Membran 1 (1101): y = 4,9836x + 399,43 R² = 0,9355, Membran 2 (1102): y = 6,8606x + 441,49 R²= 0,9752, Membran 3 (1103): y = 5,0314x + 495,38 R² = 0,9231). Der anfängliche Widerstand der drei Membranen ist unterschiedlich, die Anstiegsrate des Widerstands über die Zeit ist jedoch im Wesentlichen gleich.
Durch die Schichtbildung der Membran mit Glutaraldehyd wurde die Leitfähigkeit der Membran verringert. Der Widerstand einer leitenden Membran nach dem Aufbringen von Glutaraldehyd erhöhte sich auf zwischen 200 Ω und 350 Ω. Ein Mittelwert des gemessenen Widerstands für die drei Membranen erzeugte eine Trendlinie, y = 5,6252x + 445,43, wobei der Gradient den Anstieg des Widerstands pro Minute anzeigte. Die Anstiegsrate des Widerstands ist größer im Vergleich zu den Anstiegsraten, die für die Membranen ohne Glutaraldehyd beobachtet wurden, wahrscheinlich aufgrund der Tatsache, dass leitende Wege mit dem Glutaraldehyd-Vernetzungsmittel abgedeckt waren.
Weitere Versuche zeigten, dass längere Inkubationszeiten und höhere Konzentrationen von Glutaraldehyd den Widerstand der Membran aufgrund der Mehrfachschichtbildung weiter erhöhten. Es hat sich somit herausgestellt, dass die optimale Inkubationszeit und die Konzentration von Glutaraldehyd, bei der maximales Glutaraldehyd aufgebracht wird, ohne dass Mehrfachschichten gebildet werden, zwischen 1 und 2 Stunden, vorzugsweise 1,5 Stunden, und bei einer Konzentration von 2,5v mM Glutaraldehyd liegt.
(c) Widerstand von leitenden Membranen sowohl bei aufgebrachtem Glutaraldehyd als auch Lysozym
Drittens wurde der Widerstand, der aus dem Spannungsabfall über drei leitende Membranen berechnet wurde, auf die das Vernetzungsreagens Glutaraldehyd und das Lysozym-Protein aufgebracht worden sind, 20 Minuten lang gemessen, und eine grafische Darstellung der Ergebnisse ist in 13 gezeigt. Lineare Trendlinien wurden in die grafischen Darstellungen eingesetzt (Membran 1 (1201): y = 7,6702x + 598,54 R² = 0,9661, Membran 2 (1202): y = 5,1633x + 632,5 R² = 0,9903, Membran 3 (1203): y = 11,826x + 638,53 R² = 0,9889).
Durch die Immobilisierung von Lysozym auf der Membran stieg der Widerstand der Membran um zwischen 100 Ω und 300 Ω weiter an. Ein Mittelwert des gemessenen Widerstands für die drei Membranen produziert eine Trendlinie mit der Gleichung: y = 8,2199x + 623,19.
(d) Widerstand von leitenden Membranen mit Glutaraldehyd, Lysozym und 200 µl von unterschiedlichen Konzentrationen von Antikörper, die zu der Membran hinzugefügt wurden

Widerstandsmessungen wurden in den ersten 5 Minuten des Versuchs alle 2 Sekunden durchgeführt, und danach erfolgte eine Ablesung eine Stunde lang jede Minute. Eine grafische Darstellung des Widerstands von vier unterschiedlichen Membranen, die mittels des gleichen Prozesses vorbereitet worden sind und auf die 200 µl von 313,6-µl/ml- (100x verdünnter Antikörper) Antikörper aufgebracht worden ist, ist in 14 gezeigt. Die linearen Trendlinien, die in die vier Diagramme eingesetzt worden sind, sind in Tabelle 1 zusammengefasst: Tabelle 1. Lineare Trendlinien der grafischen Darstellungen in Fig. 14

Membran	Bezeichnung in Fig.	Trendlinien-Gleichung
1	(1301)	y = 15,887x + 613,97, R ² = 0,9971
2	(1302)	y = 21, 273x + 837,13, R ² = 0,9878
3	(1303)	y = 17,259x + 472,15, R ² = 0,9955
4	(1304)	y = 22,358x + 631,32, R ² = 0,9803

14 zeigt einen beträchtlichen Anstieg des Widerstands jeder Membran in den ersten 5 Minuten, nachdem die Antikörperlösung zu der Membran hinzugefügt worden ist. Nach 5 Minuten sinkt die Veränderungsrate des Widerstands. Der anfängliche Widerstand, der für jede Membran gemessen wird, unterscheidet sich um ungefähr 200 Ω. Die Anstiegsrate des Widerstands über 60 Minuten variiert zwischen ungefähr 16 und 22 Ω pro Minute.

Eine grafische Darstellung des Widerstands von vier unterschiedlichen Membranen, die mittels des gleichen Prozesses vorbereitet worden sind und auf die 200 µl von 15,8 µl/ml (10.000x verdünnter Antikörper) aufgebracht worden ist, ist in 15 gezeigt. Die linearen Trendlinien der vier grafischen Darstellungen, die in den letzten 55 Minuten eingesetzt worden sind (somit ausschließlich der ersten 5 Minuten, die einen schnellen Anstieg des Widerstands anzeigen), sind in Tabelle 2 zusammengefasst: Tabelle 2. Lineare Trendlinien der grafischen Darstellungen in Fig. 15

Membran	Bezeichnung in Fig.	Trendlinien-Gleichung
1	(1401)	y = 10,179x + 542,12, R ² = 0,9628,
2	(1402)	y = 11,719x+ 1074,9, R ² = 0,902
3	(1403)	y = 15,066x + 447,11, R ² = 0,9976
4	(1405)	y = 14,134x + 405,47, R ² = 0,9974

Wie in 15 zu sehen ist, gibt es selbst bei dieser wesentlich niedrigeren Konzentration der Antikörperlösung von 15,8 µl/ml einen unverzüglichen messbaren Anstieg des Widerstands der Membran, nachdem die Antikörperlösung der Membran zugeführt worden ist. Die Anstiegsrate des Widerstands nach 5 Minuten ist für die vier unterschiedlichen Membranen ähnlich.

Als Nächstes ist eine grafische Darstellung des Widerstands von vier unterschiedlichen Membranen, die mittels des gleichen Prozesses vorbereitet worden sind und auf die 200 µl von 0,8 µl/ml (100.000x verdünnter Antikörper) aufgebracht worden ist, in 16 gezeigt. Die linearen Trendlinien, die in die vier Diagramme eingesetzt worden sind, sind in Tabelle 3 zusammengefasst: Tabelle 3. Lineare Trendlinien der grafischen Darstellungen in Fig. 16

Membran	Bezeichnung in Fig.	Trendlinien-Gleichung
1	(1501)	y = 10,767x + 622,87, R ² = 0,9976
2	(1502)	y = 10, 32x + 1486, R ² = 0,8745
3	(1503)	y = 6,4755x + 438,37, R ² = 0,9702
4	(1504)	y = 9,4595x + 379,73, R ² = 0,9922

Wie aus 16 ersichtlich ist, wird selbst bei der extrem niedrigen Konzentration der Antikörperlösung von 0,8 µl/ml ein schneller Anstieg des Widerstands der Membran in den ersten 5 Minuten des Versuchs beobachtet. Danach wird mehr oder weniger die gleiche Anstiegsrate des Widerstands in den vier unterschiedlichen Membranen beobachtet.
Zum Verifizieren der Ergebnisse wurde ein positiver Kontrolltest durchgeführt. 200 µl einer 15,8-µl/ml-Antikörperlösung, die einen Antikörper enthält, der für Lysozym nichtspezifisch ist, wurden auf die leitende Membran aufgebracht, auf der Lysozym immobilisiert war, und der Widerstand der Membran wurde im Verlauf einer Stunde gemessen. Die Ergebnisse des positiven Kontrolltests sind in 17 gezeigt. Die lineare Trendlinie (1601), die in die grafische Darstellung eingesetzt ist, hat die Form von y = 7,9448x + 495,41, R² = 0,9939. Der Gradient der linearen Trendlinie ist ähnlich demjenigen der leitenden Membran, auf die Glutaraldehyd und Lysozym aufgebracht worden ist. Die grafische Darstellung bestätigt somit, dass das Hinzufügen von nichtspezifischen Antikörpern zu der Membran nicht zu einem schnellen Anstieg der Widerstandsfähigkeit der Membran führt, wie es bei der spezifischen Bindung von Anti-Lysozym-Antikörpern an Lysozym, das auf der Membran immobilisiert ist, beobachtet worden ist.
Die Ergebnisse, die für die Versuche erhalten worden sind, welche das Zuführen der drei unterschiedlichen Konzentrationen von Anti-Lysozym-Antikörper zu den vier unterschiedlichen Membranen umfassen, welche mittels des gleichen Prozesses vorbereitet worden sind, wurden kombiniert. Die kombinierten grafischen Darstellungen für jede Konzentration und die Ergebnisse des positiven Kontrolltests sowie die Ergebnisse eines negativen Kontrolltests, bei dem nur eine PBS-Lösung, die keine Biomoleküle enthielt, der Membran zugeführt worden ist, sind in 18 gezeigt.

Die linearen Trendlinien für die jeweiligen Konzentrationen und die Kontrolltests sind in Tabelle 4 aufgeführt: Tabelle 4. Lineare Trendlinien der grafischen Darstellung in Fig. 18

Konzentration von Anti-Lysozym-Antikörper-Lösung (µl/ml)	Konzentration von nichtspezifischer Antikörperlösung (µl/ml)	Bezeichnung in Fig.	Trendlinien-Gleichung
313,6	-	(1701)	y = 19,203x + 638,25, R ² = 0,9941
15,8	-	(1702)	y = 12,775x + 617,39, R ² = 0,9875
0,8	-	(1703)	y = 10,046x + 698,71, R ² = 0,8946
-	15,8	(1704)	y = 7,9448x + 495,41, R ² = 0,9939
0	-	(1705)	y = 8,2199x + 623,19, R ² = 0,9978

Wie aus 18 ersichtlich ist, wird eine ausgeprägte anfängliche Wirkung in Form eines wesentlichen Anstiegs des Widerstands der Membran in den ersten wenigen Minuten nach dem Aufbringen der Anti-Lysozym-Antikörper auf die Membran bei allen verschiedenen Konzentrationen der Antikörperlösung erhalten. In diesen Fällen fällt die Anstiegsrate des Widerstands, sie bleibt jedoch nach den ersten 5 Minuten über den Verlauf der nächsten 55 Minuten konstant. Es ist aus 18 eindeutig ersichtlich, dass es im Wesentlichen keine solche Wirkung bei dem positiven (nichtspezifische Antikörperlösung) und dem negativen Kontrolltest (Null-Konzentrationen der Antikörperlösung) gibt.
Die Gradienten der linearen Trendlinien von 18 zeigen, dass die Anstiegsrate des Widerstands der Membran am höchsten ist, wenn die 313,6-µl/ml-Konzentration der Anti-Lysozym-Antikörper auf die Membran aufgebracht ist. Die Anstiegsrate des Widerstands der Membran, wenn Anti-Lysozym-Antikörper mit einer Konzentration von 15,8 µl/ml und 0,8 µl/ml auf die Membran aufgebracht sind, ist niedriger als diejenige bei der 313,6-µl/ml-Konzentration. Der Gradient des gemessenen Widerstands bei der Konzentration von 0,8 µl/ml ist demjenigen der Konzentration von 15,8 µl/ml sehr ähnlich, was ein Zeichen für die Empfindlichkeit der Vorrichtung ist.
Die Anstiegsrate des Widerstands der Membran, wenn diese mit einem nichtspezifischen Antikörper (positive Kontrolle) oder ohne jeden Typ von Antikörper (negative Kontrolle) behandelt wird, ist ähnlich bei ungefähr 8 Ω pro Minute.

19 ist eine grafische Darstellung der ersten 5 Minuten der Ergebnisse, die in 18 gezeigt sind. Die linearen Trendlinien-Gleichungen und die Anstiegsrate des Widerstands der Membran während der ersten 5 Minuten nach dem Hinzufügen der Lösung zu der Membran, an die eine Spannung angelegt ist, ist in Tabelle 5 zusammengefasst. Tabelle 5. Lineare Trendlinien der grafischen Darstellungen in Fig. 19 und der Veränderungsrate des Widerstands

Konzentration von Anti-Lysozym-Antikörper-Lösung (µl/ml)	Konzentration von nichtspezifischer Antikörperlösung (µl/ml)	Bezeichnung in Fig.	Trendlinien-Gleichung	Veränderungsrate des Widerstands (Ω/min)
313,6	-	(1801)	y = 26,821x + 596,64, R2 = 0,9818	26,8
15,8	-	(1802)	y = 42,852x + 513,48, R2 = 0,9973	42,9
0,8	-	(1803)	y = 61 ,584x + 524,0, R2 = 0,4905	61,6
-	15,8	(1804)	y = 14,992x + 472,46, R2 = 0,9935	15,0
0	-	(1805)	y = 9,4016x + 620,93, R2 = 1	9,4

Die Anstiegsrate des Widerstands der Membran über die Periode von 5 Minuten ab dem Aufbringen der Anti-Lysozym-Antikörper-Lösung auf die Membran ist viel höher als die Anstiegsrate des Widerstands der Membran, auf die eine Null-Konzentration von Antikörper (negative Kontrolle) oder eine nichtspezifische Antikörperlösung (positive Kontrolle) aufgebracht worden ist.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Antikörper in der Lösung unter Verwendung einer Ausführungsform der Vorrichtung zur Detektion von Biomolekülen detektiert werden können. Die Tatsache, dass eine messbare Widerstandswirkung bei einer Antikörperkonzentration von 0,8 µl/ml im Vergleich zu der negativen Kontrolle erhalten worden ist, zeigt dass die Membran bemerkenswert empfindlich gegenüber sehr niedrigen Konzentrationen von Antiköper ist.
Die positive Kontrolle dient zum Aufzeigen, dass der Anstieg der Veränderungsrate des Widerstands ein Ergebnis der spezifischen Bindung ist, die zwischen dem Anti-Lysozym-Antikörper und dem Lysozym auftritt, und nicht aufgrund der Bindung von nichtspezifischen Antikörpern oder der Adsorption des Antiköpers an der Membran auftritt.
Das Aufbringen des Antikörpers auf die Membran führte dazu, dass sich der Antikörper an das Lysozym gebunden hat, um einen Antigen-Antikörper-Komplex zu bilden. Während der ersten wenigen Minuten des Überwachens des Widerstands im Anschluss an das Aufbringen der Antikörperlösung wurde ein ausgeprägter Anstieg des Widerstands bei einer erhöhten Rate relativ zu der übrigen Zeit, in der der Widerstand überwacht worden ist, beobachtet. Der positive und der negative Kontrolltest, die durchgeführt worden sind, führten zu einer Anstiegsrate des Widerstands von 14,992 Ω pro Minute bzw. 9,4016 Ω pro Minute während der ersten fünf Minuten. Die Versuche, die mit variierenden Konzentrationen von Antikörper durchgeführt worden sind, zeigten jeweils einen mittleren Anstieg des Widerstands von 26,821, 42,852 bzw. 61,584 Ω pro Minute während der ersten fünf Minuten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine Bindung zwischen dem Antikörper und dem Lysozym unmittelbar nach dem Hinzufügen des Antikörpers mit einer relativ schnellen Rate auftritt.
Die Ergebnisse zeigen ferner an, dass die Vorrichtung beim Detektieren des Vorhandenseins des Antikörpers innerhalb der ersten fünf Minuten oder weniger des Hinzufügens der Probe am effektivsten zu sein scheint, statt beim Durchführen des Versuchs über eine ganze Stunde. Die Anstiegsrate des Widerstands war etwas weniger wahrnehmbar, obwohl immer noch in vernünftigem Maß höher im Vergleich zu den Kontrollmessungen über die übrige Zeitperiode von 6 bis 60 Minuten. Durch Verlängern der Dauer der Messungen ist es möglich, die ungefähre Konzentration von Antikörpern in der Probenlösung genauer zu ermitteln.
Es wird erwartet, dass je größer der Antigen-Antikörper-Komplex (oder die Biologische-Erkennungskomponenten- und Biomolekül-Kombination) ist, der sich im Anschluss an das Hinzufügen der Probenlösung zu der Membran an die Membran bindet, desto höher der Widerstand der Membran ist und desto ausgeprägter die Differenz zwischen dem Widerstand der Membran mit dem Komplex und dem Widerstand der Membran ohne den Komplex ist.
Bei den Versuchen, die durchgeführt wurden, wiesen die Platten aus dem aufgeschmolzenen Spinnvlies aus Polypropylen-Mikrofasern eine Dicke oder Flächendichte von 50 g/m² auf, was einen ausreichend großen Flächenbereich für die Immobilisierung der biologischen Erkennungskomponente auf der Membran bot. Die Platten wiesen ferner die gewünschte Haltbarkeit auf. Es ist absehbar, dass Platten mit unterschiedlichen Dicken oder Flächendichten bei der Vorbereitung einer Membran verwendet werden können, die Verwendung eines dickeren Materials ermöglichte es jedoch, dass die Lösung, die während der Verwendung der Membran zugeführt wurde, langsamer durch die Mikrofasern eindrang, wodurch mehr Zeit für die spezifische Bindung der Biomoleküle an die biologische Erkennungskomponente ermöglicht wurde. Als dünnere Platten verwendet wurden, konnte die Lösung einfach durch die Hohlräume in der Membran fließen, ohne dass Zeit zur Verfügung stand, in der eine Bindung erfolgen konnte.
Beispiel 2
Die Fähigkeit der Vorrichtung, Escherichia coli- (E.coli-) Bakterien zu detektieren, wurde getestet. Die leitfähige Membran wurde entsprechend den Schritten des vorstehenden Beispiels 1 vorbereitet. Statt Lysozym wurde jedoch Anti-E.coli-Antikörper ab25823 auf der Membran immobilisiert.
Verfahren
Die Immobilisierung des Anti-E.coli-Antikörpers ab25823 auf der Membran wurde dadurch erreicht, dass zuerst die leitende Membran mit 0,1M PBS gewaschen und dann 10 Minuten lang getrocknet wurde. Die Membran wurde dann 1 Stunde lang bei 4 °C in 2,5mM Glutaraldehyd inkubiert. Danach wurde die Membran wieder mit 0,01M PBS gewaschen und 10 Minuten lang getrocknet. Die Membran wurde eine Stunde lang bei 37 °C in 600 ml Anti-E.coli-Antikörper (6,67 µg/ml) inkubiert und danach mit 0,01M PBS gewaschen und 10 Minuten lang getrocknet. Danach wurden 5% BSA Blocker™ zu der Membran hinzugefügt, und es konnte 1 Stunde lang bei Raumtemperatur eine Reaktion stattfinden. Schließlich wurde die Membran dreimal unter Verwendung von 0,01M PBS gewaschen.
Unterschiedliche Konzentrationen von E.coli-Lösungen von 3,4 ×10⁸, 3,4 ×10⁵ und 3,4 ×10² CFU/ml wurden aufbereitet, und 100 µl von jeder Lösung wurden einer Membran zugeführt. Die Versuche wurden unter Verwendung von drei ähnlich zubereiteten leitenden Membranen mit Anti-E.coli-Antikörper, der darauf immobilisiert war, wiederholt. Weitere Kontrollversuche wurden durchgeführt, bei denen 100 µl von 9,67 ×10⁷, 9,67 ×10⁴ und 9,67 ×10 CFU/ml Lösungen von Lacto Bacillus Plantarum-Bakterien der Membran, auf der Anti-E.coli-Antikörper immobilisiert waren, zugeführt wurden.
Ergebnisse
Die Ergebnisse der Versuche sind in 20 gezeigt, die eine grafische Darstellung der Veränderung des Widerstands der Membranen während der ersten fünf Minuten jedes Versuchs im Anschluss an das Hinzufügen der bakteriellen Lösungen ist. Das Diagramm zeigt, dass bei der höchsten Konzentration von E.coli ein ausgeprägtes Ansteigen der Veränderungsrate des Widerstands der Membran erfolgt, wenn die E.coli-Lösung zu der Membran hinzugefügt wird. im Gegensatz dazu konnte kein wesentliches Ansteigen bemerkt werden, wenn Lacto Baccillus Plantarum der Membran zugefügt wird. Entsprechend führt die spezifische Bindung von E.coli an den Anti-E.coli-Antikörper, der auf der Membran immobilisiert ist, zu einem ausgeprägten Anstieg der Veränderungsrate des Widerstands der Membran, wodurch die Detektion von E.coli ermöglicht wird.
Die E.coli-Bindung wurde ferner durch Färben von lebenden Bakterienzellen und Beobachten der gefärbten Bakterien unter einem konfokalen Mikroskop bestätigt.
Beispiel 3
Bei diesem Beispiel wurde eine papierbasierte leitende Membran als Teil der Vorrichtung zum Demonstrieren ihrer Fähigkeit zum Detektieren von Anti-Lysozym-Antikörpern verwendet. Ein Lysozym-Protein wurde auf der papierbasierten leitenden Membran immobilisiert, und der Widerstand der Membran wurde überwacht und aufgezeichnet. Die Widerstandsmesswerte wurden verarbeitet und demonstrieren, dass die papierbasierte leitende Membran in der Lage ist, Biomoleküle resistiv zu erfassen.
Verfahren
Filterpapiere Whatmann Grade 50 (97 g/m²) und Whatmann Grade 1 (87 g/m²) wurden aufgrund ihrer Nassfestigkeit gewählt und von Sigma Aldrich erhalten. Whatmann-Filterpapiere (Grades 1, 50) wurden zur Verwendung zu Testzwecken in eine Standardgröße von 180 x 280 mm geschnitten.
1. Leitende Beschichtung
Die Zellulosefasern des Filterpapiers wurden durch Beschichtung mit einer dotierten Polypyrrollösung leitend gemacht. Die 180 x 280 mm großen Platten wurden zunächst in das Pyrrol-Monomer eingetaucht und konnten sich 5 Minuten lang vollsaugen, wodurch sichergestellt wurde, dass das Papier vollständig mit dem Pyrrol gesättigt war. Die mit Pyrrol gesättigten Platten wurden dann in eine Lösung getaucht, die 0,3M HCl und 5 g/100 ml FeCl₃ in destilliertem Wasser enthielt, und konnten 90 Minuten lang polymerisieren. Die Papierplatten wurden sanft hin- und herbewegt, damit eine oxidative Polymerisation erfolgen konnte. Die Fasern wurden aus dem Reaktionsgefäß entfernt und mit 0,3M HCl und entionisiertem (DI-) Wasser gewaschen, um überschüssiges Pyrrol zu entfernen. Die Papierplatten wurden dann in einer Abzugshaube platziert und konnten 1 Stunde lang trocknen. Die behandelten Papierplatten zeigten Oberflächenablagerungen von überschüssigem Pyrrol und Eisen, daher wurden die leitenden Platten mit mechanischen Mitteln weiter gereinigt. Die mechanisch gereinigten Platten wurden dann mit DI-Wasser gewaschen und konnten in der Abzugshaube trocknen. Papier, das mittels dieses Verfahrens beschichtet wurde, um eine leitende Membran zu bilden, zeigte eine hohe elektrische Leitfähigkeit (15 S cm^-1) und eine gute mechanische Stabilität. Die leitenden Papiere (180 x 280 mm) zeigten Widerstände im Bereich von 2-5 Ω, gemessen über die Breite der Platte und nicht deren Länge.
2. Glutaraldehyd-Vernetzung
Die Membranen wurden in eine Lösung aus Di-Wasser, das 2,5 mM Glutaraldehyd enthielt, getaucht. Die Inkubation konnte eine Stunde lang bei 4 °C fortgesetzt werden, wonach die Membranen herausgenommen wurden, mit Di-Wasser gewaschen wurden und trocknen konnten. Der Widerstand der Membranen stieg um 1-3 Ω, nachdem sich das Glutaraldehyd mit der Membran vernetzt hatte.
3. Lysozym-Aufbringung
Lysozym-Protein aus Hühnereiweißen (Roche, Mannheim, Deutschland), wurde in einer Lösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml in 1X PBS hergestellt, diese Lösung wurde in einem sterilisierten Glas aufbereitet. Die Glutaraldehyd-PPy-Papierplatten wurden ungefähr 5 Sekunden lang mit 1X PBS gespült und in den Lysozymlösungsbehälter verbracht. Die Platten konnten 2 Stunden lang bei 4 °C in der Lysozymlösung inkubiert werden. Nach der Inkubation wurden die gekennzeichneten Papierplatten mit 1X PBS gewaschen und konnten trocknen.
4. Versuchsaufbau
Die resistive Erfassung wurde durch Verwendung eines Arduino Uno-Mikroprozessors und einer zweckbestimmten Schaltungsanordnung implementiert. Die zweckbestimmte Schaltungsanordnung ist in 10 gezeigt und funktioniert als Ohmmeter, wobei der unbekannte Widerstand, die leitende Membran mit dem darauf immobilisierten Lysozym, durch Spannungsteilung durch Messen des Spannungsabfalls über ein bekanntes Widerstandselement gemessen wird. Das Versuchsverfahren ermöglichte die Verwendung des Arduino-Mikroprozessors zum Weiterleiten von Informationen über dessen Analog Pin (A0) zu einem seriellen Monitor eines Laptops. Die Eingangsspannung betrug 0,5 V.
Sobald die Membranen mit dem darauf immobilisierten Lysozym getrocknet waren, wurde jede Membran auf den Elektroden platziert und wurde ein Basiswiderstand für diese einzelne Membran 1 Minute lang gemessen und aufgezeichnet. Die Ausgestaltung der Elektroden wurde so gewählt, dass die Membran sandwichartig zwischen den Kupferplatten, die als Elektroden dienten, angeordnet war. Diese Elektrodenausgestaltung misst einen Widerstand über die Breite der Elektrotextilie.
5. Aufbereitung von zu testenden Antikörperlösungen
Konzentrationen von Anti-Lysozym-Antikörpern wurden in 1X PBS: 1110,14, 111,01, 11,01, 1,10, 0,11, 0,01 µg/ml hergestellt. Der Bereich von Verdünnungen ermöglichte das Identifizieren einer Detektionsgrenze (limit-of-detection - LOD).
Ein Volumen von 100 µl Anti-Lysozym-Antikörper wurde dann zu den Fasern hinzugefügt, und diese konnten eine Stunde lang bei 4 °C inkubiert werden. Dadurch wurde sichergestellt, dass viele der zur Verfügung stehenden Bindungsorte auf dem Papier ausgenutzt wurden. Nach der Inkubation wurden die Papierplatten kurz mit 1X PBS gespült, um sicherzustellen, dass keine nicht gebundenen Anti-Lysozym-Antikörper oder ein anderes biologisches Material auf der Oberfläche verblieben und die Widerstandsablesewerte beeinträchtigten. Nach dem Waschen der Fasern konnten diese an der Luft trocknen. Die trockenen Papierplatten, die durch Antikörper immobilisiert waren, wurden dann auf der Halterung platziert, und einzelne Widerstandsmessungen wurden 10 Minuten lang aufgezeichnet. Messungen, die innerhalb der ersten Minute erfolgten, wurden ignoriert.
Die Tests wurden an mindestens 3 und bis zu 7 Papieren für jede Konzentration von Antikörpern wiederholt, um die Reproduzierbarkeit nachzuweisen und einen größeren Datensatz bereitzustellen. Die Verhältnisse des gemessenen Widerstands nach der Inkubation zu den Basislinien-Widerständen wurden erstellt, um zu versuchen zu erkennen, ob es einen rationalen Widerstandsanstieg für jede Konzentration von Antikörpern gibt.
Ergebnisse
Lysozym und primäre Antikörper wurden unter Verwendung eines sekundären fluoreszierenden Antikörpers (Alexa Fluor 488) gekennzeichnet, und fluoreszierende Bilder wurden unter Verwendung von Zeiss™ LSM780 (konfokales Mikroskop) aufgenommen. Primäre Anti-Lysozym-Antikörper wurden den Membranen, die mit Lysozym immobilisiert waren, hinzugefügt. Alexa Fluor 488 wurde zu den Papieren, die mit primären Antikörpern behandelt worden waren, Membranen nur mit immobilisiertem Lysozym und Membranen ohne Glutaraldehyd hinzugefügt.
Die Bindung des sekundären fluoreszierenden Antikörpers an die primären Anti-Lysozym-Antikörper wurde durch die konfokale Mikroskopie bestätigt. Eine Fluoreszenz in dem Bild zeigt das Vorhandensein der sekundären, primären Antikörper und somit des Lysozym-Proteins an. Eine gleichmäßige Beschichtung der einzelnen Fasern wurde beobachtet, singuläre Fasern konnten aufgrund von fluoreszierenden Antikörpern, die um die Fasern herum gebunden waren, ausgemacht werden. Kontrolltests wurden an den Membranen und den Papieren, die nicht mit einem primären Antikörper behandelt worden waren, durchgeführt, eine spezifische Bindung wurde aufgrund des Fehlens von Fluoreszenz in den Kontrollbildern bestätigt.
Aus den Widerstandsmesswerten wurde ein rationaler Widerstandsanstieg für jede Membran berechnet, und diese berechneten Werte wurden mit Antikörperkonzentrationen, positiven und negativen Kontrollen verglichen. Die Ergebnisse sind in 21 gezeigt. Die höchste Konzentration einer Antikörperlösung zeigte den höchsten rationalen Widerstandsanstieg. Es wurde festgestellt, dass der Widerstand bei höheren Konzentrationen von Antikörpern dramatisch anstieg und danach bei jeder jeweiligen Verdünnung exponentiell abnahm. Eine positive (nichtspezifischer Antikörper) und eine negative Kontrolle (1X PBS) wurden aufgenommen, um festzustellen, wo die Konzentration von Antikörpern keinen festgestellten Anstieg über die Kontrollen produzierte. Eine Detektionsgrenze (LOD) von 100 ng/ml wurde berechnet.
Mit dieser Elektrodenausgestaltung wurde in diesem Beispiel der Widerstand über die Dicke der Membran gemessen. Das Aufzeigen, dass die Größe der Membran wesentlich verringert werden kann, ermöglicht eine Miniaturisierung der gesamten Vorrichtung. Solche Erfassungspapiere könnten in Mikrocontroller integriert sein und eine auf dem Chip erfolgende Analyse von Pathogenen bieten.
Die Ergebnisse demonstrieren, dass ein spezifischer Antikörper für ein Target-Pathogen auf der Oberfläche der Zellulosefasern immobilisiert sein kann und die gleiche Methodologie des Testens angewendet werden kann, was zu einem Widerstandsanstieg über die Membran führt. Pathogene können eine wesentlich größere Größe aufweisen als das verwendete Proof-of-Concept-Protein (Lysozym) und können somit potenziell einen größeren Anstieg des Widerstands hervorrufen, als während des Lysozym-Testens gemessen wird.
Die hier beschriebene Vorrichtung dient zum Bereitstellen eines kosteneffektiven, effizienten und tragbaren impedanzbasierten Biosensors zum schnellen Detektieren von Pathogenen oder Antikörpern, die mit pathogenen Infektionen verbunden sind, aus einer Mikrofluidprobe. Pathogene, wie z. B. E.coli oder Mycobacterium tuberculosis, können zum Beispiel detektiert werden. Die Vorrichtung kann ohne zusätzliche Ausrüstung oder tiefergehendes technisches Wissen betrieben werden. Der kleine Umfang, in dem die Proben analysiert werden, bietet Vorteile, wie z. B. kleinere Mengen an benötigten Reagenzien und Proben sowie ein Screening mit schnellem Durchsatz der Proben.
Im Wesentlichen weist die Vorrichtung einen Wandler und biologische Erkennungskomponenten auf, die in der Lage sind, das Vorhandensein von und die Menge an Biomolekülen, welche in einer Probe vorhanden sind, zu detektieren. Der Wandler wandelt die biologische Antwort, die erhalten wird, wenn die biologische Erkennungskomponente mit den Biomolekülen in einer Probe interagiert, in ein elektrisches Signal um, das quantifiziert werden kann.
Die hier beschriebene Vorrichtung zum Detektieren von Target-Biomolekülen ist eine kleinere und leichtere Alternative zu derzeit zur Verfügung stehenden Vorrichtungen und ist robust, schnellwirkend und hochempfindlich gegenüber einem Target-Biomolekül. Das beschriebene Detektionsverfahren kann ebenfalls eine kostengünstige Alternative zu derzeit zur Verfügung stehenden Verfahren und daher besonders relevant beim Unterstützen des Abmilderns der diagnostischen Belastung angesichts spezieller Pathogene, wie derjenigen von Tuberkulose und E.coli, sein. Die Vorrichtung dient zum Bieten einer hochspezifischen schnellen Detektion des Target-Biomoleküls, wie z. B. eines Antigens oder Antikörpers.
Die Tatsache, dass die Membran und die Elektroden nicht in eine Pufferlösung eingetaucht werden, führt zu einer gesteigerten Empfindlichkeit der Membran, und es gibt keinen zu berücksichtigenden Parallelwiderstand der Lösung.
Es sei darauf hingewiesen, dass zahlreiche Veränderungen an der Vorrichtung zum Detektieren von Target-Biomolekülen durchgeführt werden können, ohne dass dadurch vom Umfang der Erfindung abgewichen wird. Die Membran und die Halterung können von jeder geeigneten Größe und Gestalt sein und entsprechend dem Volumen der Probe, die der Membran zugeführt wird, skaliert sein. Die Membran kann aus jeder geeigneten Mikro- oder Nanofaser gefertigt sein, die einen großen Flächenbereich für die Immobilisierung von biologischen Erkennungskomponenten auf ihrer Oberfläche bietet und die so modifiziert werden kann, dass sie leitend wird. Die Membran kann jede geeignete Dicke oder Flächendichte aufweisen, und die Dicke kann zum Beispiel in einem Bereich zwischen 5 und 100 g/m² liegen.
Es sei darauf hingewiesen, dass mehr als ein Typ von biologischer Erkennungskomponente auf der Oberfläche immobilisiert werden kann, um ein duales Testen von unterschiedlichen Pathogenen, Verschmutzungsstoffen oder Infektionen zu ermöglichen.
Jeder Typ von Mikro- oder Nanofasern in Form einer Textilie kann als Membran verwendet werden, vorausgesetzt, dass sie inhärent leitend ist oder so modifiziert werden kann, dass sie leitend wird. Die Membran kann mit den geeigneten Reagenzien leitend gemacht werden, um als Widerstandselement zu dienen, das einen großen Flächenbereich für das Binden von biologischen Erkennungskomponenten und das potenzielle Binden von Biomolekülen bereitstellt. In Abhängigkeit von den Materialien, die zum Ausbilden der Membran verwendet werden, kann sie unterschiedliche Flächeneigenschaften aufweisen. Zum Beispiel führt die Membran, die aus Polypropylen-Mikrofasern gebildet ist, welche mit dotiertem Polypyrrol beschichtet sind, wie vorstehend in Bespiel 1 und 2 beschrieben worden ist, zu einer hydrophoben Oberfläche. Eine Membran, die aus Zellulosefasern gebildet ist, wie in Beispiel 3 beschrieben worden ist, ist eher hydrophil, was zu einer anderen Wechselwirkung einer wässrigen Probe, die Biomoleküle enthält, mit der Membran führt. Es hat sich herausgestellt, dass Papier als Substrat in der leitenden Membran stärker absorbierend ist, wodurch die Dispersion der Fluidprobe, die Biomoleküle enthält, über die Membran beeinträchtigt wird. Die Verwendung von Papier als Membran ist aufgrund der guten Verfügbarkeit und Erschwinglichkeit vorteilhaft. Die Zellulosefasern weisen einen großen Flächenbereich auf, und es ist ein großer Bereich von Faserdurchmessern in Papier zu finden.
Die Halterung kann jede geeignete Gestalt und Form aufweisen, vorausgesetzt, dass sie so ausgestaltet ist, dass sie eine leitende Membran derart lösbar aufnimmt und hält, dass diese sich zumindest teilweise über die Elektroden erstreckt, um mit den Elektroden in Kontakt zu kommen. Die Halterung kann mit Fixierformationen, wie z. B. (nicht gezeigten) Klemmen oder Haltebändern versehen sein, die aus einem nichtleitenden Material gefertigt sind und sich von entgegengesetzten Seiten der Halterung quer zumindest teilweise über die Oberfläche der Elektroden erstrecken, um die leitende Membran festzuhalten und einen Kontakt zwischen der Membran und den Elektroden sicherzustellen.
Bei weiteren Ausführungsformen der Erfindung kann die Halterung dadurch modifiziert werden, dass sie mit einem Membranrahmen oder -deckel, der mittels einer Schnappverbindung mit der Halterung zusammenwirkt, oder mit dem Gleitelement, das mit der Halterung zusammenwirkt, um einen schnellen und einfachen Austausch der Membran zu ermöglichen, versehen ist.
Die Elektroden können aus jedem geeigneten leitenden Material gefertigt sein. Bei der beschriebenen Ausführungsform wurden Gold- und Kupferelektroden verwendet. Platinelektroden sind jedoch weniger reaktionsfreudig und können in der Lage sein, genauere Ablesewerte des Widerstands und der Veränderungsrate des Widerstands bei einer molekularen Bindung zwischen der biologischen Erkennungskomponente und den Biomolekülen der Probe zu liefern. Kupfer ist jedoch das kosteneffektivere Material zum Herstellen der Elektroden oder Anschlussverbindungen mit der Membran.
Eine Batterie kann als Energiequelle zum Liefern eines Stroms zu der Schaltung und einer Spannung zu der Schaltung vorgesehen sein. Die Batterie kann ferner einen Controller mit Energie versorgen, der idealerweise ein Mikrocontroller ist, wie z. B. ein Arduino-Mikrocontroller, der aus einem Computer mit darauf installierter geeigneter Hardware und Software besteht, welcher mit der Steuerschaltungsanordnung verbunden ist und so ausgeführt ist, dass er die Spannungsmessvorrichtung steuert und die Ablesewerte aus der Vorrichtung entnimmt, um den Widerstand der Membran zu berechnen. Die Vorrichtung kann ferner eine drahtlose Übertragungseinrichtung, wie z. B. Bluetooth, zum Übertragen der Messwerte oder der Detektionssignale zu einer mobilen oder einer anderen Vorrichtung aufweisen. Diese Komponenten können zum Herstellen einer kompakten und tragbaren Vorrichtung zur schnellen und einfachen Verwendung im Freien verwendet werden.
Es versteht sich, dass in der Spezifikation und den Patentansprüchen durchgängig der Ausdruck ‚umfassen‘ oder Varianten, wie z. B. ‚umfasst‘ oder ‚umfassend‘, das Einschließen einer genannten ganzen Zahl oder einer Gruppe von ganzen Zahlen, jedoch nicht das Ausschließen jeder anderen ganzen Zahl oder Gruppe von ganzen Zahlen impliziert, sofern der Inhalt nichts anderes fordert.

Claims

Vorrichtung (1, 31, 100) zum Detektieren von Target-Biomolekülen umfassend eine elektrisch leitende Membran (3, 103, 207) mit einer biologischen Erkennungskomponente, die so ausgeführt ist, dass sie ein darauf immobilisiertes Target-Biomolekül bindet, wobei die Membran mittels Elektroden (7, 107) mit einer elektrischen Schaltung (200) verbunden ist; eine Spannungsquelle (203) zum Liefern einer Spannung innerhalb der elektrischen Schaltung; und eine Widerstandsüberwachungsvorrichtung (205), die so ausgeführt ist, dass sie den Widerstand der Membran überwacht, wenn ein ausgewähltes Volumen einer Fluidprobe der Membran zugeführt wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran (3, 103, 207) an einer nichtleitenden Halterung (9, 109) montiert ist, die so ausgeführt ist, dass sie die Membran derart lösbar aufnimmt und hält, dass diese mit den Elektroden (7, 107) in Kontakt kommt.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Halterung (9, 109) eine Kammer (11) begrenzt, die die Membran (3, 103, 207) aufnimmt, und wobei sich die Elektroden (7, 107) in die Kammer (11) erstrecken, um mit der darin aufgenommenen Membran in Kontakt zu kommen.
Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Halterung (9, 109) einen Einlass (23, 115) für die Zuführung des ausgewählten Volumens der Fluidprobe zu der Membran (3, 103, 207) aufweist, wobei das ausgewählte Volumen der Fluidprobe zwischen 10 und 1000 µl liegt.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Membran (3, 103, 207) aus inhärent elektrisch leitendenden Fasern oder Polymerfasern, die mit einer elektrisch leitenden Beschichtung beschichtet sind, gebildet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 4, wobei die Membran (3, 103, 207) aus Polymerfasern, die mit einer elektrisch leitenden Beschichtung beschichtet sind, gebildet ist und die elektrisch leitende Beschichtung eine Polymerbeschichtung ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Polypyrrol, Polythiophen, Polyanilin und Polyacetylen, wahlweise mit einem Dotiermittel.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die biologische Erkennungskomponente durch ein Vernetzungsmittel auf die Membran (3, 103, 207) aufgebracht ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die biologische Erkennungskomponente ein Antigen zum wirkungsmäßigen Binden eines Target-Antikörpers oder ein Antikörper zum wirkungsmäßigen Binden eines Target-Antigens ist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die ferner einen Controller aufweist, der so ausgeführt ist, dass er maschinenlesbare Anweisungen an die Spannungsquelle (203) zum Anlegen einer Spannung ausgibt, und ferner so ausgeführt ist, dass er maschinenlesbare Anweisungen an die Widerstandsüberwachungsvorrichtung (205) zum Überwachen und zum Aufnehmen von Ablesewerten des Widerstands über die Membran (3, 103, 207) ausgibt.
Vorrichtung nach Anspruch 8, wobei der Controller so ausgeführt ist, dass er maschinenlesbare Anweisungen an eine Signalisierungskomponente ausgibt, die die Detektion eines Target-Biomoleküls signalisiert, wenn von der Widerstandsüberwachungsvorrichtung (205) ein Widerstand gemessen wird, der über einem Schwellwiderstand liegt, welcher ein Widerstand der Membran (3, 103, 207) ist, wenn keine Fluidprobe der Membran zugeführt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, wobei der Controller so ausgeführt ist, dass er die Ablesewerte des Widerstands über die Membran (3, 103, 207) verarbeitet, um die Menge an Biomolekülen in der Probe zu quantifizieren und einen Grad an Kontamination oder Infektion der Fluidprobe zuzuordnen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei der Controller eine Nutzerschnittstelle (43) und eine Anzeige (45) zum Anzeigen eines Signals, einer quantifizierten Menge an Biomolekülen und/oder eines Grads an Kontamination oder Infektion aufweist.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Widerstandsüberwachungsvorrichtung (205) eine Spannungsmessvorrichtung ist, die über die Membran (3, 103, 207) geschaltet ist, und der Widerstand der Membran aus einem Spannungsabfall ermittelt wird, der über die Membran gemessen wird.
Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vorrichtung tragbar und batteriebetrieben ist.
Verfahren zum Detektieren von Target-Biomolekülen unter Verwendung der Vorrichtung (1, 31, 100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das die folgenden Schritte umfasst: Zuführen eines ausgewählten Volumens einer Fluidprobe zu einer elektrisch leitenden Membran (3, 103, 207), auf der eine biologische Erkennungskomponente, die so ausgeführt ist, dass sie ein Target-Biomolekül bindet, immobilisiert ist; Überwachen des Widerstands der Membran; und wenn der Widerstand über einem Schwellwiderstand liegt, Signalisieren der Detektion des Target-Biomoleküls.