DE3617710C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung einer immunologischen Komponente gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Aufgrund der jüngsten Fortschritte auf medizinischem Gebiet ist es möglich geworden, sehr kleine Menge biologischer Substanzen zu bestimmen und dies trägt zu einer frühen Diagnose verschie­ dener Krankheiten bei. Zum Beispiel können bösartige Tumore et­ wa durch Alpha-Fetoprotein (AFP)und carcinoembryonales Antigen (EA), eine abnorme Hormonsekretion wie von Insulin und Thyroxin und immunologische Erkrankungen, z.B. durch Immunoglobulin, in einem frühen Stadium diagnostiziert werden. Darüber hinaus ist es möglich geworden, den Verlauf bzw. Erfolg einer medizini­ schen Behandlung zu überwachen. Ferner trägt die Bestimmung von niedermolekularen Haptenen (wie Arzneimitteln) dazu bei, ein Verabreichungsschema für Arzneimittel zu entwickeln.

Die meisten dieser biologischen Substanzen wurden mit Hilfe eines immunologischen Verfahrens bestimmt, bei dem die Antigen­ Antikörper-Reaktion ausgenutzt wird. Es sind viele unterschied­ liche immunologische Bestimmungsverfahren bekannt. Z. B. wird Antigen oder Antikörper an feine Teilchen aus Glas oder synthe­ tischem Harz fixiert und mit einer Probe von Antikörper oder Antigen zusammengebracht, während markierende Antikörper oder Antigene, die mit sehr empfindlichen Markierungssubstanzen, wie Radioisotopen, fluoreszierenden Substanzen, lumineszierenden Substanzen bzw. Enzymen markiert sind, angewandt werden, um einen Antigen-Antikörper-Komplex zu bilden. Dann wird der Antigen- Antikörper-Komplex nachgewiesen, umd das in der Probe ent­ haltene Antigen bzw. den Antikörper quantitativ zu bestimmen.

Fig. 1 zeigt z. B. einen Reaktionsverlauf einer aus der DE-OS 34 12 886 bekannten enzymimmu­ nologischen Analyse unter Anwendung eines Enzyms als Markier­ rungssubstanz. Auf der Außenseite eines unlöslichen Trägers 1 ist ein Antikörper 1 A fixiert, der spezifisch mit dem in der zu untersuchenden Probe enthaltenen Antigen reagiert. Wenn in der Probe Antikörper anstelle von Antigenen bestimmt werden sollen, muß das Antigen, das mit der Probe spezifisch reagiert, auf dem unlöslichen Träger 1 fixiert werden. Zunächst reagiert der Antikörper 1 A auf dem Träger 1 mit dem in der Probe enthaltenen Antigen 2. Dann wird freies Antigen, das nicht mit dem Antikör­ per 1 A auf dem Träger 1 reagiert hat, von dem auf dem Träger 1 gebundenen Antigen 1 A durch Waschen abgetrennt. Diese Trennstu­ fe wird allgemein als B-F-Trennung bezeichnet. Anschließend wird der Träger 1 mit einem Markierungsreagens 3 umgesetzt, bestehend aus Antikörper 3 A markiert mit Enzym 3 A, wobei der Antikörper 3 A spezifisch mit dem Antigen 2 der Probe reagiert. Anschließend wird erneut eine B-F-Trennung durchgeführt, um freies Markierungsreagens von dem Markierungsreagens abzutren­ nen, das an das Antigen 2 der Probe gebunden ist, das seiner­ seits mit dem Antikörper 1 A, der auf dem Träger 1 fixiert ist, reagiert hat. Ferner wird ein Farbreagens zugesetzt, um eine Farbreaktion durchzuführen mit dem Enzym 3 B des Markierungs­ reagens 3. Schließlich wird die Reaktionsflüssigkeit kolori­ metrisch untersucht, um die Enzymaktivität nachzuweisen. Auf diese Weise wird die Substanz 2 in der Probe mit hoher Emp­ findlichkeit quantitativ bestimmt. Das oben erwähnte immuno­ logische Bestimmungsverfahren wird weitgehend angewandt.

Bei dem bekannten immunologischen Bestimmungsverfahren, bei dem ein Markierungsreagens, enthaltend Antikörper oder Antigen, an­ gewandt wird, wird, nachdem der auf dem Träger fixierte Anti­ körper bzw. das Antigen mit dem Antigen bzw. Antikörper der Probe reagiert hat, die erste B-F-Trennung durchgeführt, und nachdem das Antigen bzw. der Antikörper der Probe mit dem Mar­ kierungsreagens reagiert hat, wird die zweiten B-F-Trennung durchgeführt. Daher erfordert die Analyse zahlreiche Stufen und das Bestimmungsverfahren wird kompliziert. Außerdem ist es er­ forderlich, verschiedene Arten von Reagentien zu verwenden, wo­ durch die laufenden Kosten hoch werden. Es ist zu bemerken, daß eine Analysiervorrichtung zur Durchführung der bekannten Be­ stimmung ebenfalls kompliziert und teuer wird.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein immunologisches Bestim­ mungsverfahren zu entwickeln, mit dessen Hilfe Proben mit weni­ ger Stufen genau analysiert werden können, ohne daß teure Rea­ gentien angewandt werden müssen. Bei diesem Verfahren soll die B-F-Trennung nicht erforderlich sein. Die Lösung dieser Aufgabe ist im Patentanspruch 1 beschrieben.

Bei Entwicklung der vorliegenden Erfindung wurde die folgende Tatsache ausgenutzt: Flüssigkristalle werden verbreitet als passive Elemente unter Ausnutzung elektrooptischer und thermo­ optischer Effekte angewandt. Feine Flüssigkristall-Moleküle werden in einer Flüssigkeit suspendiert und die dreidimensiona­ le molekulare Anordnung durch elektrische Spannung und mechani­ schen Druck verändert, so daß auf die Flüssigkristalle auffal­ lendes Licht polarisiert oder selektiv reflektiert wird. Daher ist es, wenn die Orientierung von Flüssigkristallen verändert wird durch immunologische Bindung von Antigenen oder Antikörper aus der Probe möglich, die Menge an Antigenen oder Antikörper in der Probe zu messen.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Flüssigkristalle an­ stelle eines unlöslichen Trägers angewandt und Antikörper bzw. Antigen, der (das) spezifisch mit dem Antigen bzw. Antikörper in der Probe reagiert, wird an die Flüssigkristall-Moleküle fi­ xiert. Dann wird Antigen oder Antikörper aus der Probe in die Lösung der Flüssigkristalle gegeben, um die Antigen-Antikörper­ Reaktion durchzuführen. Die Orientierung der Flüssigkristall- Moleküle wird verändert je nach der Menge an Antigen oder Anti­ körper in der Probe, das (der) mit dem auf den Flüssigkristall- Molekülen fixierten Antikörper bzw. Antigen reagiert hat, und die Flüssigkristall-Lösung dienst als Analysator oder Rotator für auffallendes polarisiertes Licht. Daher kann durch Messung der durch die Flüssigkeitskristallösung hindurchgehenden Menge an polarisiertem Licht die Menge an Antigen oder Antikörper in der Probe, die an die Flüssigkristall-Moleküle gebunden ist, direkt gemessen werden, ohne daß eine B-F-Trennung durchgeführt werden muß. Auf diese Weise kann gemäß der Erfindung das Be­ stimmungsverfahren einfach gemacht werden und in einer einfa­ chen kleinen und billigen Analysiervorrichtung durchgeführt werden. Darüber hinaus können die laufenden Kosten wesentlich verringert werden, da keine teuren Markierungssubstanzen und Farbreagentien erforderlich sind. In den beiliegenden Zeichnungen sind

Fig. 1 eine schematische Ansicht, die die aufeinanderfolgen­ den Stufen eines bekannten immunologischen Bestim­ mungsverfahrens zeigt;

Fig. 2 bis 5 schematische Ansichten, die die aufeinanderfolgen­ den Stufen einer Ausführungsform eines erfindungsge­ mäßen Bestimmungsverfahrens zeigen;

Fig. 6 Kurven, die die Beziehung zwischen der Konzentration der zu bestimmenden Substanz in der Probe und dem photoelektrisch umgewandelten Ausgangssignal zeigen;

Fig. 7 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Konzentra­ tion der Substanz in der Probe und der Zeit nach dem Anlegen der Spannung angibt;

Fig. 8 eine schematische Ansicht, die eine andere Ausfüh­ rungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt; und

Fig. 9 und 10 schematische Ansichten, die eine weitere Ausfüh­ rungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens darstellen.

Die Fig. 2 bis 5 sind, wie oben erwähnt, schematische Ansicht­ ten, die die aufeinanderfolgenden Stufen bei einer Ausführungs­ form des erfindungsgemäßen immunologischen Bestimmungsverfah­ rens zeigen. Bei dieser Ausführungsform werden starre stäbchen­ förmige Flüssigkristall-Moleküle 10 anstelle des unlöslichen Trägers verwendet und Antikörper 11, der spezifisch mit dem in der Probe enthaltenen Antigen reagiert, ist auf diesen Flüssig­ kristall-Molekülen 10 fixiert. Der Antikörper 11 kann auf den Flüssigkristall-Molekülen 10 in ähnlicher Weise fixiert sein wie auf einem unlöslichen Träger, wie Glas oder Kunststoff­ perlen, wie er nach dem Stand der Technik verwendet wird. Die Flüssigkristall-Moleküle 10, an die der Antikörper 11 fixiert ist, werden in ein die Probe 12 enthaltendes Reaktionsgefäß 13 eingebracht. Das Reaktionsgefäß 13 besteht aus transparentem bzw. durchsichtigem Kunststoff und ein Paar transparenter Elek­ troden 14 a und 14 b wird an den Seitenwänden 13 a und 13 b einan­ der gegenüber angeordnet. Die transparenten Elektroden 14 a und 14 b sind über einen Schalter15 und eine Gleichstromquelle16 verbunden. Gegenüber (auf der dem Reaktionsgefäß abgewandten Seite) der Elektrode 14 a ist eine Polarisierungsplatte 17 und eine Lichtquelle 18 angeordnet und gegenüber der transparenten Elektrode 14 b ist ein lichtaufnehmendes Element 19 angeordnet.

Fig. 2 zeigt einen Zustand, in dem Antigen aus der Probe nicht an die Flüssigkristall-Moleküle gebunden ist und kein elektri­ sches Feld angelegt ist. In diesem Falle sind die Flüssigkri­ stall-Moleküle 10 in der Probe 12 suspendiert und willkürlich in unterschiedlichen Richtungen orientiert. Daher wirkt die Kombination aus Flüssigkristall-Molekülen 10, Probe 12, Reak­ tionsgefäß 13 und transparenten Elektroden 14 a und 14 b nicht als Analysator. Von der Lichtquelle 18 ausgesandtes Licht wird durch die Polarisierungsplatte 17 in linear polarisiertes Licht umgewandelt und trifft dann auf das Reaktionsgefäß 13 auf. Wie oben gesagt sind die Flüssigkristall-Moleküle 10 nicht in einer Richtung orientiert, sondern in unterschiedlichen Richtungen. Daher wird nahezu das gesamte auftreffende Licht von den Flüs­ sigkristall-Molekülen 10 nicht unterbrochen, sondern geht durch das Reaktionsgefäß 13 durch. Das aus dem Reaktionsgefäß 13 aus­ tretende Licht wird von dem Licht empfangenden Element 19 auf­ genommen.

Wie in Fig. 3 gezeigt, sind jedoch, wenn der Schalter 15 ge­ schlossen ist, und das elektrische Feld zwischen den Elektroden 14 a und 14 b in Richtung der optischen Achse aufgebaut ist, alle Flüssigkristall-Moleküle 10 in dem Reaktionsgefäß 13 in einer Richtung senkrecht zu dem elektrischen Feld orientiert. Dann dient das Reaktionsgefäß 13 als Analysator und nahezu das ge­ samte einfallende polarisierte Licht wird von dem Analysator unterbrochen und gelangt nicht auf das Licht empfangende Element (Licht-Detektor) 19.

Fig. 4 zeigt einen Zustand, in dem Antigen 20 aus der Probe 12 an den auf den Flüssigkristall-Molekülen 10 fixierten Antikör­ per 11 gebunden ist, aber kein elektrisches Feld angelegt ist. Wenn die Probe das nachzuweisende Antigen 20 enthält, reagiert dieses mit dem auf den Flüssigkristall-Molekülen 10 fixierten Antikörper 11. Daher sind in dem Reaktionsgefäß 13 Flüssigkri­ stall-Moleküle 10 a vorhanden, an die Antigen 20 gebunden ist und Flüssigkristall-Moleküle 10 b, an die kein Antigen gebunden ist. Die Menge an Flüssigkristall-Molekülen 10 a ist proportio­ nal der Menge Antigen 20 in der Probe.

Wenn anschließend der Schalter 15 geschlossen wird, wie in Fig. 5 angegeben, um ein elektrisches Feld über die transparen­ ten Elektroden 14 a und 14 b zu erzeugen, werden die Flüssigkri­ stall-Moleküle 10 b, an die kein Antigen 20 der Probe gebunden ist, innerhalb kurzer Zeit parallel zu der Elektrodenoberfläche orientiert, während Flüssigkristall-Moleküle 10 a, an die Anti­ gen 20 der Probe gebunden ist, kaum in der gleichen Richtung orientiert werden, da das Antigen 20 dem einen (Viskositäts)- Widerstand entgegensetzt. Daher sind in dem Reaktionsgefäß 13 nebeneinander orientierte Flüssigkristall-Moleküle 10 b und nichtorientierte Flüssigkristall-Moleküle 10 a vorhanden und dadurch geht ein Teil des einfallenden linear polarisierten Lichtes durch das Reaktionsgefäß 13 hindurch und wird von dem Licht empfangenden Element 19 aufgenommen. Die von dem Licht empfangenden Element 19 aufgenommene Lichtmenge ist proportio­ nal der Menge der Flüssigkristall-Moleküle 10 a, an die das An­ tigen 20 der Probe gebunden ist, so daß es durch geeignete Ver­ arbeitung des Ausgangssignals des Licht empfangenden Elements 19 möglich ist, das in der Probe 12 enthaltene Antigen 20 quan­ titativ zu bestimmen.

Fig. 6 zeigt die Beziehung zwischen der Konzentration an Anti­ gen in der Probe und dem Ausgangssignal des Licht empfangenden Elements. Die Abszisse gibt die Zeit an, die nach Anlegen des elektrischen Feldes verstrichen ist, und die Ordinate die Amplitude des photoelektrischen Ausgangssignals. Die Kurve A zeigt die Veränderung des photoelektrischen Ausgangssignals, das erhalten wird, wenn die Probe 12 kein nachzuweisendes Anti­ gen 20 enthält. In diesem Falle nimmt die Amplitude des photo­ elektrischen Ausgangssignals plötzlich bis auf einen Sätti­ gungswert zu, wenn der Schalter 15 geschlossen wird. Die Kurven B, C und D zeigen Veränderungen des photoelektrischen Ausgangs­ signals für Proben, die Antigen 20 in unterschiedlichen Konzen­ trationen enthalten. Das heißt, die Konzentration an Antigen 20 nimmt für die Kurven B, C und D in dieser Reihenfolge zu. Wenn Die Probe Antigen 20 enthält, nimmt das photoelektrische Aus­ gangssignal nach und nach zu und die Anstiegszeit wird länger, wenn die Probe das Antigen 20 in höherer Konzentration enthält. Außerdem nimmt das Sättigungsniveau mit zunehmender Antigenkon­ zentration ab. Es ist zu bemerken, daß nach einer ausreichend langen Zeit das photoelektrische Ausgangssignal einen konstan­ ten Sättigungswert erreicht unabhängig von der Konzentration an Antigen 20, aber innerhalb eines definierten Zeitraums erreicht das photoelektrische Ausgangssignal unterschiedliche Sätti­ gungswerte je nach der Konzentration des Antigens 20. Daher kann durch Nachweis des photoelektrischen Ausgangssignals zu einem bestimmten Zeitpunkt nach Anlegen des elektrischen Feldes und Vergleich des erhaltenen Wertes mit dem photoelektrischen Ausgangssignal für eine Standardprobe ohne das nachzuweisende Antigen die Gesamtmenge an Antigen 20 bestimmt werden.

Fig. 7 ist eine Kurve, die die Beziehung zwischen Antigenkon­ zentration der Probe und Zeit, während der das photoelektrische Ausgangssignal ein bestimmtes Niveau erreicht, angibt. Wie oben erläutert, variiert die Geschwindigkeit, mit der das photoelek­ trische Ausgangssignal den Sättigungswert erreicht, in Überein­ stimmung mit der Konzentration an Antigen in der Probe. Das heißt, wenn die Antigenkonzentration in der Probe klein ist, wird auch die Menge an Antigen, das an die Flüssigkristall- Moleküle 10 gebunden ist, gering, so daß die Flüssigkristall- Moleküle sich mit höherer Geschwindigkeit orientieren und da­ durch das photoelektrische Ausgangsssignal schnell erreicht wird. Die Anstiegsgeschwindigkeit nimmt ab mit Zunahme der An­ tigenkonzentration in der Probe. Daher ist es durch Nachweis der Zeitspanne, innerhalb der das photoelektrische Ausgangs­ signal auf einen vorgegebenen Wert steigt, möglich, die Gesamt­ menge an Antigen in der Probe zu bestimmen.

Fig. 8 ist eine schematische Ansicht einer anderen Ausführungs­ form des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens. Bei dieser Ausführungsform sind entsprechende Teile wie in den Fig. 2 bis 5 mit den gleichen Bezugsziffern wie in diesen Figuren bezeich­ net. Bei dieser Ausführungsform bestehen die Flüssigkristalle aus einem solchen Material, daß eine Polarisationsebene, d. h. Polarisationsrichtung des einfallenden linear polarisierten Lich­ tes gedreht wird, und auf beiden Seiten des Reaktionsgefäßes 13 sind eine erste und eine zweite Polarisationsplatte 30 und 31 angeordnet, die ein paralles Nicol'sches Prisma bilden.

Das von der Lichtquelle 18 ausgesandte Licht wird durch die er­ ste Polarisierungsplatte 30 linear polarisiert und trifft dann auf das Reaktionsgefäß 13 auf dessen Seitenwand 13 a auf, an der die transparente Elektrode 14 a angelegt ist. Die Orientierung der Flüssigkristall-Moleküle 10, an die Antikörper 11 fixiert ist, wird verändert in Übereinstimmung mit der Menge Antigen 20 in der Probe 12, das an Antikörper 11 durch die immunologische Reaktion gebunden ist. Die Rotation bzw. Drehung der Polarisa­ tionsebene des einfallenden linear polarisierten Lichtstrahls wird beeinflußt von der Änderung der Orientierung der Flüssig­ kristalle. Daher verändert sich der Drehwinkel der Polarisa­ tionsebene von linear polarisiertem Licht, das durch das Reak­ tionsgefäß 13 hindurchgeht. Dieses hindurchgehende Licht trifft auf die zweite Polarisierungsplatte 31 auf, die als Analysator dient. Die durch die zweite Polarisierungsplatte 31 hindurchge­ hende Lichtmenge wird von einem Lichtdetektor 19 nachgewiesen. Dadurch ist es möglich, die Gesamtmenge Antigen 20 in der Probe 12 zu bestimmen.

Die in Fig. 9 und 10 zeigen schematische Ansichten einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens. Bei dieser Ausführungsform werden cholesterische Flüssigkri­ stalle verwendet, bei denen die Farbe des durchgehenden Lichtes sich entsprechend der Orientierung der Flüssigkristall-Moleküle verändert. Die Fig. 9 zeigt einen Fall, in dem eine kleinere Menge zu bestimmendes Antigen in einer Probe 12 in dem Reak­ tionsgefäß 13 an Antikörper gebunden ist, die auf den Flüssig­ kristall-Molekülen 10 fixiert sind, und Fig. 10 zeigt einen Fall, in dem eine größere Mengen Antigen 20 in der Probe 12 an die Flüssigkristall-Moleküle 10 gebunden ist. Die Orientierung der Flüssigkristall-Moleküle 10 verändert sich mit der Menge an Antigen 20, das an die Flüssigkristall-Moleküle 10 gebunden ist, und die Farbe, d. h. die Wellenlänge des durch die Flüssig­ kristalle hindurchgehenden Lichtes verändert sich entsprechend der Änderung der Orientierung. Bei dieser Ausführungsform trifft das aus einer Lichtquelle 18 austretende Licht auf das Reaktionsgefäß 13 über eine Polarisierungsplatte 30 und ein elektrisches Feld wird über die transparenten Elektroden 14 a und 14 b auf den Seitenwänden 13 a und 13 b durch Schließen des Schalters 15 angelegt, der in Reihe mit einer Gleichstromsquelle 16 verbunden ist. Dann ändert sich die Farbe des Lichts L, das durch das Reaktionsgefäß 13 hindurchgeht, entsprechend der Men­ ge Antigen 20 in der Probe 12. Daher ist es durch Nachweis der Farbe des hindurchgegangenen Lichtes L, die durch einen ent­ sprechenden Farbdetektor gemessen wird, möglich, das Antigen 20 in der Probe 12 quantitativ zu bestimmen.

Wie oben erläutert, werden erfindungsgemäß Flüssigkristalle anstelle des unlöslichen Trägers verwendet und Antikörper oder Antigen, der bzw. das spezifisch mit Antigen oder Antikörper in einer Probe reagiert, wird auf den Flüssigkristall-Molekülen fixiert. Dadurch ist es möglich, die Konzentration an Antigen oder Antikörper direkt in der Probe zu messen, ohne daß die B-F-Trennung durchgeführt werden muß und ohne daß eine Reaktion mit Markierungsreagens und Farbreagens erforderlich ist. Daher wird das Bestimmungsverfahren sehr einfach und die Bestimmungs­ zeit kann wesentlich verkürzt werden.

Claims (9)

1. Verfahren zum Nachweis oder zur Bestimmung einer immunologischen Komponente in einer Probe mit Hilfe einer Antigen-Antikörper-Reaktion durch Vermischen einer die zu bestimmende Substanz enthaltenden Probe in einem Reaktionsgefäß mit einem spezifischen Bindungs­ partner für die zu bestimmende Substanz und Messung der immuno­ logischen Reaktion, dadurch gekennzeichnet, daß der spezifische Bindungspartner an Flüssigkristalle gebun­ den bzw. auf diesen fixiert ist und die Orientierung der Flüs­ sigkristalle in dem Reaktionsgemisch gemessen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung so erfolgt, daß ein elektrisches Feld über Elektroden angelegt wird, die sich an gegenüberliegenden Sei­ tenwänden des Reaktionsgefäßes befinden, linear polarisiertes Licht auf das Reaktionsgefäß gerichtet wird und das durch das Reaktionsgefäß hindurchgehende Licht gemessen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das linear polarisierte Licht durch die Elektroden hindurchgeht, die aus einem transparenten Material bestehen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das linear polarisierte Licht, das durch das Reaktionsgefäß hindurchgeht, direkt von einem Licht empfangenden Element (Licht-Detektor) aufgenommen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das linear polarisierte Licht, das durch das Reaktionsgefäß hindurchgeht, von einem Licht empfangenden Element über einen Analysator aufgenommen wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Polarisationsrichtung des auftreffenden linear polari­ sierten Lichtes parallel gemacht wird zu der Polarisationsrich­ tung des Analysators.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Flüssigkristalle aus einem solchen Material bestehen, daß die Polarisationsebene des einfallenden linear polarisier­ ten Lichtes dreht.

8. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Farbe des linear polarisierten Lichtes, das durch das Reaktionsgefäß hindurchgeht, bestimmt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der in der Probe enthaltenden Substanz gemessen wird, durch Bestimmung der Zeit, innerhalb der die Menge an durch das Reaktionsgefäß hindurchgehendem Licht einen bestimmten Wert erreicht.