KR100463979B1 - 액정 분석을 위한 생화학적 블로킹층 - Google Patents

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Abstract

액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조는: 생화학적 블로킹층을 형성하는 지지체의 일면에 화학적으로 고정된 생화학적 블로킹 화합물 및 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면에 침착된 생체분자 인식 물질을 포함한다. 생체분자 인식 물질은 액정 분석 장치에 의해 검출될 표적 종을 선택적으로 인식할 수 있는 인식 부위를 포함한다. 아울러, 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면은 액정이 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면과 접촉하였을 때 액정의 균일 정착을 유도하는 특징을 지니도록 마찰된다. 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조의 제조방법, 액정 분석에 사용하기 위한 광학셀, 액정 분석에 사용하기 위한 키트 및 액정 분석 장치를 사용하는 표적 종 존재의 검출방법 또한 기술되어 있다.

Description

액정 분석을 위한 생화학적 블로킹층{BIOCHEMICAL BLOCKING LAYER FOR LIQUID CRYSTAL ASSAY}
샘플내 생물학적 물질 및 화학적 화합물의 존재 검출방법은 분석화학 및 생화학 분야에서 계속 발전해온 영역이다. 환경 또는 생(living) 유기체와 같은 기원으로부터 취한 샘플에서 각종 표적 종의 검출을 가능하게 하는 다양한 방법이 개발되었다. 표적 종의 검출은 처방된 치료방법에 착수할 수 있고 병을 진단하기 전 임상적 상황에서 종종 필요하다.
표적 종의 존재를 검출하기 위해 다수의 통상의 분석방법이 매우 잘 적용되지만, 다수의 통상의 분석방법은 값비싸고 종종 기구 사용과 고도로 훈련된 전문가를 요하여 그 분야에서 일상적으로 사용하기가 어렵다. 이에 따라, 사용하기가 더욱 용이하고 먼 위치에서도 샘플의 평가가 가능한 분석장치 및 시스템이 필요하다.
최근에, 액정을 이용하는 분석장치가 발표되었다. 예를 들면, 유리 상에 경사 침착된 이방성 금막 상에 지지된 옥탄티올 및 비오틴을 함유하는 혼합된 자기조립 단층(SAM)을 사용하는 액정 분석장치가 최근에 보고되었다. Gupta, V. K.;Skaife, J. J.; Dubrovsky, T. B., Abbott N. L. Science, 279, (1998), pp. 2077-2079. 또한, 1999년 12월 9일자로 공개된 PCT 공보 WO 99/63329가 기질에 부착된 SAM과 SAM에 의해 정착되는 액정층을 사용하는 분석장치를 기술하고 있다.
이방성 금막을 사용하는 기술되어 있는 액정-기본 분석장치가 표적 종이 샘플에 존재하는지를 판단하는 데 사용하기에 적당하지만, 경사 침착에 의한 이방성 금막의 제조가 어렵다. 예를 들면, 경사 침착된 금막의 제조는 복잡한 세척 단계 및 고 진공의 침착을 요한다. 따라서, 제조하기가 용이하고 의양성 시험 결과를 초래할 수 있는 단백질에 의한 비-특이적 흡착을 저지하는 기질 구조가 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 액정 분석장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조, 마찰 기질 구조를 사용하여 제조된 광학셀, 마찰 기질 구조의 제조방법, 액정 분석에 사용하기 위한 키트 및 액정 분석장치를 사용하는 표적 종의 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 액정 분석장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조는 생화학적 블로킹층을 형성하는 지지체의 일면에 화학적으로 고정된 생화학적 블로킹 화합물 및 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체 일면에 침착된 생분자 인식 물질을 포함한다. 생체분자 인식 물질은 액정 분석장치에 의해 검출될 표적 종을 선택적으로 인식할 수 있는 인식 부위를 포함한다. 생화학적 블로킹층 및 침착된 생체분자 인식 물질을 함유하는 지지체의 일면은 액정이 생화학적 블로킹층 및 침착된 생체분자 인식 물질을 함유하는 지지체의 일면과 접촉하였을 때 액정의 균일 정착을 유도하는 특징을 지니도록 마찰된다. 또다른 바람직한 마찰 기질 구조에서는, 액정이생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면과 접촉하고, 생체분자 인식 물질이 생화학적 블로킹층을 함유하는 마찰 표면에 침착되었을 때 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면이 액정의 균일 정착을 유도하는 특징을 지니도록 마찰된다.
본 발명에 따른 액정 분석장치에 사용하기 위한 또다른 마찰 기질 구조는: 생화학 물질을 갖는 생화학적 블로킹층; 제 1 말단과 제 2 말단을 갖는 이기능성 스페이서(spacer) 화합물; 제 1 말단과 제 2 말단을 갖는 표면 변형 화합물; 및 생화학적 블로킹층을 함유하는 적어도 일면을 갖는 지지체를 포함한다. 생화학 물질중 적어도 하나는 제 1 화학반응 전의 생화학 물질에 대한 반응기와 제 1 화학반응 전의 이기능성 스페이서 화합물의 제 1 말단에 대한 반응기 간의 제 1 화학반응을 통해 이기능성 스페이서 화합물의 제 1 말단과 공유결합한다. 표면 변형 화합물은 제 2 화학반응 전의 표면 변형 화합물의 제 1 말단에 대한 반응기와 제 2 화학반응 전의 이기능성 스페이서 화합물의 제 2 말단에 대한 반응기 간의 제 2 화학반응을 통해 이기능성 스페이서 화합물의 제 2 말단과 공유결합한다. 아울러, 표면 변형 화합물은 제 3 화학반응 전의 표면에 대한 반응기와 제 3 화학반응 전의 표면 변형 화합물의 제 2 말단에 대한 반응기 간의 제 3 화학반응을 통해 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면과 공유결합한다. 추가로, 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면은 액정이 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면과 접촉하였을 때 액정의 균일 정착을 유도하는 특징을 지니도록 마찰된다.
전술한 바와 같은 바람직한 마찰 기질 구조는 또한 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면에 침착된 생체분자 인식 물질을 포함한다. 생체분자 인식 물질은 액정 분석장치에 의해 검출될 표적 종을 선택적으로 인식할 수 있는 인식 부위를 가진다.
바람직한 마찰 기질 구조에서, 이기능성 스페이서 화합물은 제 1 및 제 2 화학반응 전에 하기 화학식을 가지는 유기 화합물이다:
화학식
상기식에서,
n은 1 내지 20, 더욱 바람직하게는 2 내지 10, 훨씬 더 바람직하게는 5 내지 8 범위의 값을 가지는 정수이다.
가장 바람직하게는, 이기능성 활성화 화합물은 디석신이미딜 수버레이트이다.
다른 바람직한 마찰 기질 구조에서, 제 3 화학반응 전의 표면 변형 화합물의 제 2 말단의 반응기는 할로겐-실리콘 결합 또는 알콕시-실리콘 결합이고 반면 다른 바람직한 마찰 기질 구조에서, 제 2 및 제 3 화학반응 전의 표면 변형 화합물은 실리콘 원자; 산소-실리콘 결합을 통해 실리콘 원자와 결합하는 알콕시 그룹; 및 탄소-실리콘 결합을 통해 실리콘 원자와 결합하는 아미노알킬 그룹을 포함하는 실리콘 화합물이다. 더욱 바람직한 마찰 기질 구조에서, 제 2 및 제 3 화학반응 전의 표면 변형 화합물은 아미노알킬트리알콕시실란이고, 더욱 바람직하게는 아미노프로필트리에톡시실란이다.
다른 바람직한 마찰 기질 구조에서, 생화학적 블로킹층의 생화학 물질은 혈청 알부민, 더욱 바람직하게는 소 혈청 알부민이다.
다른 바람직한 마찰 기질 구조에서 생체분자 인식 물질은 면역글로불린 또는 면역글로불린의 일부이고 반면 다른 바람직한 마찰 기질 구조에서, 생체분자 인식 물질은 펩타이드 또는 탄수화물이거나 펩타이드 또는 탄수화물의 서열, 혹은 DNA 또는 RNA의 서열이다. 다른 바람직한 마찰 기질 구조에서, 생체분자 인식 물질은 펩타이드, 탄수화물, DNA, RNA 또는 이들의 단편이나 단백질, 바이러스, 박테리아 또는 미세 병원체와 결합하는 결합 도메인을 인식할 수 있다.
생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체 일면의 적어도 두 영역은 상이한 압력하에서 상이한 기간 동안 마찰되어 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체 일면의 적어도 두 영역이 표적 종에 대해 상이한 감수성을 가지는 다른 바람직한 마찰 기질이 제공된다.
액정 분석장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 제조방법은 적어도 하나의 반응기를 가지는 생화학적 블로킹 화합물을 지지체의 활성화되고 변형된 표면과 반응시키는 단계를 포함한다. 지지체의 활성화되고 변형된 표면은 생화학적 블로킹 화합물의 반응기와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용기를 가져 생화학 물질과 지지체 간에 공유결합을 형성하므로써 생화학적-블로킹 화합물을 함유하는 표면을 가지는 지지체를 생산한다. 본 방법은 또한 생화학적-블로킹 화합물을 함유하는 지지체의 표면을 마찰시켜 액정이 마찰 표면과 접촉하였을 때 액정의 균일 정착을 유도하는 특징을 지니는 마찰면을 생산하는 단계를 포함한다.
액정 분석장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 바람직한 제조방법은 또한 제 1 말단과 제 2 말단을 가지는 표면 변형 화합물을 지지체와 반응시켜 지지체와 표면 변형 화합물 제 1 말단 간에 공유결합을 형성하므로써 표면 변형된 지지체를 생산하는 단계를 포함한다. 바람직한 방법은 또한 제 1 말단과 제 2 말단을 가지는 이기능성 활성제를 표면 변형된 지지체와 반응시켜 표면 변형제의 제 2 말단과 이기능성 활성제 제 1 말단을 반응시켜 공유결합을 형성하므로써 활성화되고 변형된 지지체의 표면을 생산하는 단계를 포함한다.
액정 분석장치에 사용하기 위한 광학셀은 두 개의 마찰 기질 구조 및 두 개의 마찰 기질 구조의 생화학적 블로킹층 사이에 위치하는 스페이싱(spacing) 물질을 포함하여 마찰 기질 구조의 생화학적 블로킹층이 서로 마주보지만, 액정으로 충진될 수 있는 공동에 의해 분리되도록 한다.
본 발명에 따른 액정 분석장치는 마찰 기질 구조; 액정을 균일하게 정착시키는 표면; 및 마찰 기질 구조의 생화학적 블로킹층 일면과 액정을 균일하게 정착시키는 표면 사이에 위치하는 스페이싱 물질을 포함한다. 마찰 기질 구조의 표면은 생화학적 블로킹층과 생체분자 인식 물질을 모두 포함한다. 바람직한 액정 분석장치에서, 액정을 균일하게 정착시키는 표면은 생화학적 블로킹층과 생체분자 인식 물질을 가지는 또다른 마찰 기질 구조; 생체분자 인식 물질을 함유하지 않는 마찰 기질 구조; 옥타데실트리클로로실란으로 처리된 유리 슬라이드; 마찰 비코팅 유리 슬라이드; 전단-침착된 테플론을 가지는 유리 슬라이드; 또는 경사 침착된 금막을 가지는 유리 슬라이드일 수 있다.
액정 분석에 사용하기 위한 키트는 마찰 기질 구조; 액정을 균일하게 정착시키는 표면; 마찰 기질 구조와 액정을 균일하게 정착시키는 표면 사이에 위치하는 스페이싱 물질, 바람직하게는 필름; 및 액정 화합물을 포함한다. 액정 분석에 사용하기 위한 바람직한 키트에서, 액정을 균일하게 정착시키는 표면은 또다른 마찰 기질 구조이다. 다른 바람직한 키트에서, 마찰 기질 구조, 액정을 균일하게 정착시키는 표면 및 스페이싱 물질은 그들 사이에 위치하는 스페이싱 물질을 갖는 셀로 예비조립된다. 이러한 키트에서, 표적 종을 함유할 수도 있는 샘플은 예정된 시간 동안 셀을 통해 플러싱될 것이다. 이어서, 액정이 셀에 위치할 것이고 셀을 통해 플러싱될 수 있으며, 이에 따라 키트가 표적 종이 샘플에 존재하는 지를 판단하는 데 사용될 수 있다.
액정 분석장치를 사용하는 표적 종 존재의 검출방법은 표적 종의 존재를 시험할 샘플과 함께 마찰 기질 구조를 인큐베이팅하고; 인큐베이팅된 마찰 기질 구조와 액정을 균일하게 정착시키는 표면 사이에 스페이싱 물질, 바람직하게는 필름을 두어 마찰 기질 구조의 생화학적 블로킹층 일면이 액정을 균일하게 정착시키는 표면과 마주보도록 하며; 액정을 인큐베이팅된 마찰 기질 구조와 액정을 균일하게 정착시키는 표면 사이의 영역으로 드로잉한 다음; 액정이 마찰 기질 구조 상에 균일하게 정착되었는 지를 판단하는 단계를 포함한다.
샘플내 하나 이상의 표적 종의 존재를 검출하기 위한 장치가 제공된다. 본 장치는 생화학적 블로킹층을 가지는 마찰면을 갖는 지지체를 포함한다. 본 장치는 또한 생화학적 블로킹층을 가지는 지지체의 첫번째 부분에 제 1 표적 종 검출 영역을 포함하고, 제 1 표적 종 검출 영역은 제 1 표적 종과 결합할 수 있는 제 1 생체분자 인식 물질을 가진다. 본 장치는 생화학적 블로킹층을 가지는 지지체의 적어도 하나의 다른 부분에 적어도 하나의 다른 표적 종 검출 영역을 추가로 포함하고, 적어도 하나의 다른 표적 종 검출 영역은 적어도 하나의 다른 표적 종과 결합할 수 있는 적어도 하나의 다른 생체분자 인식 물질을 가진다. 제 1 표적 종 검출 영역은 표적 종의 부재하에 액정을 균일하게 정착시키고, 적어도 하나의 다른 표적 종 검출 영역은 적어도 하나의 다른 표적 종의 부재하에 액정을 균일하게 정착시킨다. 제 1 표적 종 검출 영역에서 액정의 균일 정착은 제 1 표적 종 검출 영역이 제 1 표적 종에 노출되었을 때 붕괴되고, 적어도 하나의 다른 표적 종 검출 영역에서도 액정의 균일 정착은 적어도 하나의 다른 표적 종 검출 영역이 적어도 하나의 다른 표적 종에 노출되었을 때 붕괴된다.
샘플내 표적 종의 존재를 검출하는 데 특히 바람직한 장치에는 표면이 마찰되었고 제 1 생체분자 인식 물질 및 적어도 하나의 다른 생체분자 인식 물질이 각각 제 1 표적 종 검출 영역과 적어도 하나의 다른 표적 종 검출 영역에 존재하는 것이 포함된다.
본 발명은 샘플내 표적 종의 존재를 검출하는 데 사용하기 위한 키트를 추가로 제공하고, 상기 키트는 적어도 하나의 마찰 기질 구조와 액정 화합물을 포함한다. 이러한 유형의 키트를 사용하는 샘플내 표적 종의 존재를 검출하기 위한 방법 또한 제공된다. 본 방법은 키트의 마찰 기질 일부를 일정량의 샘플과 접촉시키고; 키트의 액정을 샘플과 접촉한 마찰 기질 구조의 일부에 둔 다음; 액정의 균일 정착이 붕괴되었는 지를 판단하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가의 목적, 특징 및 장점이 첨부된 도면과 함께 하기의 상세한 설명으로 자명해질 것이다.
본 발명은 일반적으로 생물학적 물질 및 화학 물질의 분석분야, 좀더 구체적으로 말하면 액정 분석에 사용하기 위한 블로킹층에 관한 것이다.
도면에서:
도 1은 유리판에 소 혈청 알부민(BSA)을 화학결합시키는 데 사용되는 여러 단계를 도시하는 개략도이다. 첫째, 깨끗하고 건조한 유리 슬라이드를 3-아미노프로필트리에톡시실란으로 실릴화시킨다. 둘째, 디석신이미딜 수버레이트(DSS)와 같은 이기능성 가교결합제의 일측을 실릴화된 유리 슬라이드와 반응시켜 소 혈청 알부민의 아미노 그룹과의 반응을 위한 활성화된 표면을 제공한다. 최종적으로, BSA를 부착된 DSS의 유리(free) 측 및 반응성 측과 반응시켜 도면에 도시되어 있는 바와 같이 BSA를 유리에 고정시키는 안정한 아마이드 결합을 제공한다.
도 2는 도 1에 도시되어 있는 절차를 사용하여 제조된 유리 슬라이드 및 실리콘 웨이퍼를 마찰시키는 데 사용되는 장치를 도시하는 도면이다. 장치의 여러가지 부품으로는 유리 슬라이드(1); 전동식 마찰기(2)[변형된 스트립 차트 리코더(strip chart recorder)]; 벨벳형 폴리에스테르 포 마찰 재료(3); 알루미늄 블록 웨이트(4); 고정된 스톱퍼(stopper)(5); 양면 테입(6); 및 이동 가이드(7)로서의 차트 페이퍼(chart paper)가 포함된다.
도 3은 도 2에 도시되어 있는 장치를 사용하는 마찰 전(백색)후(흑색)에 유리 슬라이드 상의 BSA층의 타원편광측정(ellipsometric) 두께를 보여주는 막대 그래프이다. BSA층은 깨끗한 무처리 유리 슬라이드 및 OTS-처리된 유리 슬라이드 상에 물리적으로 흡착된다. BSA는 도 1에 도시되어 있는 바와 같이 APES와의 반응에 이어 DSS와의 반응에 의해 변형된 유리 슬라이드에 화학적으로 고정된다. BSA의 마찰 필름은 5 mm/초의 속도로 1분간 103Pa의 압력을 적용하여 제조된다. 막대 그래프는 화학적으로 고정된 BSA를 가지는 유리 슬라이드가 마찰되었을 때 BSA가 다른 슬라이드 상의 BSA층과 비교하여 상당히 적은 BSA층이 손실된다는 것을 보여준다.
도 4는 간섭 편광과 도 1에 따라 제조된 화학적으로 고정된 BSA를 함유하는 마찰() 및 비마찰() 유리 슬라이드에 정착된 5CB 사이의 빛의 부분 투과율을 보여주는 그래프이다. 부분 투과율은 샘플과 편광판 사이각의 함수로서 나타나 있다. 부분 투과율은 액정을 함유하는 광학셀을 통해 투과한 빛의 강도와 간섭 편광 사이의 빛의 강도 대 병렬-편광하에서 속빈 셀을 통해 투과한 빛의 최고 강도의 비이다.
도 5는 각종 용액에 침지시킨 후에 표면에 BSA가 화학적으로 고정된 마찰(흑색) 및 비마찰(백색) 실리콘 웨이퍼의 타원편광측정 두께 증가를 보여주는 막대 그래프이다. BSA-고정된 기질의 타원편광측정 두께의 증가는 10 mg/㎖의 BSA; 0.2 mg/㎖의 피브리노겐; 100 nM의 항-BSA; 및 100 nM의 항-FITC의 PBS-완충 용액에 2시간 침지시킨 후에 측정된다. 도면은 BSA-고정된 기질이 항-BSA PBS-완충 용액에 침지되었을 때 두께의 상당한 증가를 초래한다는 것을 보여준다.
도 6은 셀의 마찰 방향과 편광판 사이각의 함수로서 간섭 편광과 단백질 용액에 침지시킨 후에 BSA의 마찰 필름에 정착된 5CB 사이의 빛의 부분 투과율을 보여주는 그래프이다. 참조로, 고정된 BSA의 마찰 필름의 부분 투과율은 임의의 추가 용액에의 침지 없이 측정된다(). 단백질에 의한 비-특이적 흡착을 위해, 고정된 BSA의 마찰 필름을 2시간 동안 10 mg/㎖의 BSA() 및 0.2 mg/㎖의 피브리노겐()의 PBS-완충 용액에 인큐베이팅한다. 항체에 의한 특이적 결합을 위해, 고정된 BSA의 마찰 필름을 2시간 동안 100 nM의 항-BSA() 및 100 nM의 항-FITC(△)의 PBS-완충 용액에 인큐베이팅한다.
도 7은 간섭 편광과 BSA보다는 비오틴-BSA를 사용하여 도 1에 따라 제조된 화학적으로 고정된 비오틴-BSA를 함유하는 비마찰() 및 마찰() 유리 슬라이드에 정착된 5CB 사이의 빛의 부분 투과율을 보여주는 그래프이다. 부분 투과율은 샘플과 편광판 사이각의 함수로서 나타나 있다. 부분 투과율은 액정을 함유하는 광학셀을 통해 투과한 빛의 강도와 간섭 편광 사이의 빛의 강도 대 병렬-편광하에서 속빈 셀을 통해 투과한 빛의 최고 강도의 비이다.
도 8은 항-비오틴 IgG 농도의 함수로서 비오틴-BSA의 마찰 필름에 정착된 5CB의 표준화된 광출력을 보여주는 그래프이다. 마찰 속도, 길이 및 압력은 대략 2.1 mm/초, 127 mm, 및 1,000 Pa(); 2.1 mm/초, 127 mm 및 250 Pa(); 및 2.1 mm/초, 51 mm, 및 250 Pa(△)이다.
도 9는 용액중 항-비오틴 IgG 농도의 함수로서 실리콘 웨이퍼(네이티브 옥사이드를 가짐)의 표면에 공유적으로 고정된 비오틴-BSA 필름의 타원편광측정 두께를보여주는 그래프이다. 마찰 속도, 길이 및 압력은 대략 2.1 mm/초, 127 mm 및 1,000 Pa(); 2.1 mm/초, 127 mm 및 250 Pa(); 및 2.1 mm/초, 51 mm 및 250 Pa(△)이다.
도 10은 비오틴-BSA 필름에 결합된 항-비오틴 IgG 양의 함수로서 비오틴-BSA의 마찰 필름에 정착된 5 CB의 표준화된 광출력을 보여주는 그래프이다. 마찰 속도, 길이 및 압력은 대략 2.1 mm/초, 127 mm 및 1,000 Pa(); 2.1 mm/초, 127 mm 및 250 Pa(); 및 2.1 mm/초, 51 mm 및 250 Pa(△)이다.
도 11은 마찰 압력의 함수로서 비오틴-BSA의 마찰 필름 상의 5CB 필름의 표준화된 광출력() 및 이에 상응하는 두께의 증가()를 보여주는 그래프이다. 마찰 속도 및 길이는 각각 대략 2.1 mm/초 및 127 mm이다. 마찰 필름을 20 nM의 항-비오틴 IgG의 PBS 용액에 90분간 교반하면서 침지시킨다.
도 12는 마찰 길이의 함수로서 비오틴-BSA의 마찰 필름 상의 5CB 필름의 표준화된 광출력() 및 이에 상응하는 두께의 증가()를 보여주는 그래프이다. 마찰 속도 및 압력은 대략 2.1 mm/초 및 1,000 Pa이다. 마찰 필름을 20 nM의 항-비오틴 IgG의 PBS 용액에 90분간 교반하면서 침지시킨다.
하기 약어가 본 출원 전반에 걸쳐서 사용된다:
APES: 3-아미노프로필트리에톡시실란
BSA: 소 혈청 알부민
DMSO: 디메틸 설폭사이드
DSS: 디석신이미딜 수버레이트
OTS: 옥타데실트리클로로실란
PBS: 포스페이트-완충 식염수
5CB: 4-시아노-4'-펜틸비페닐
본원에서 열거되는 모든 범위는 그 범위의 한도 내에 포함되는 모든 조합 및 하위조합을 포함한다. 따라서, "5-92%"의 범위는 "5-84%", "16-75%" 등의 범위를 포함한다. "1000 Pa 미만"의 범위는 "400 Pa 미만", "250 Pa 미만" 등을 포함할 것이다.
일반적으로, 본 발명은 액정 분석장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조; 마찰 기질 구조의 제조방법; 마찰 기질 구조로부터 제조되는 광학셀; 마찰 기질 구조를 함유하는 키트; 및 액정 분석장치를 사용하는 표적 종 존재의 검출방법을 제공한다.
마찰 기질이 생물학적 표적 분자를 특이적으로 결합시키는 데 유용하고 액정의 재배향을 유도하려면 이것은 특별한 특징을 지녀야 한다. 액정의 재배향은 이것이 마찰 기질 구조로부터 조립된 분석 장치가 표적 종이 주어진 샘플에 존재하는지를 판단하기 위해 사용되도록 하는 것이기 때문에 필요하다. 적당한 마찰 기질이 지녀야 하는 특징 중의 일부는: 비-특이적 흡착의 저지능; 액정을 균일하게 배향하는 능력; 및 표적 종의 특이적 결합이 부분적으로 또는 완전히 제거할 수 있는 이방성 구조의 소유를 포함한다. 후자의 특징은 표적 종이 샘플에 존재한다는 것을나타내는 액정의 불균일 정착을 유도한다.
마찰 BSA과 같은 마찰 생화학적 블로킹층은 단백질과 같은 다른 종의 비-특이적 흡착을 저지한다. 아울러, 이러한 마찰 블로킹층을 함유하는 마찰 기질은 표적 종이 표면상의 생체분자 인식 물질과 결합하였을 때 붕괴될 수 있는 액정의 균일한 정렬을 제공한다.
액정 분석장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조는 일반적으로 지지체의 적어도 일면에 고정된 생화학적 블로킹 화합물을 포함한다. 생화학적 블로킹 화합물의 지지체에의 고정이 지지체 상에 생화학적 블로킹층을 형성한다.
당업자에게 자명한 것처럼 매우 다양한 물질이 본 발명에 따른 마찰 기질 구조에서 지지체로서 사용될 수 있다. 바람직한 지지체로는 표면 변형 화합물 또는 물질과 반응하기 위한 하이드록실 그룹을 함유하는 중합체 및 실리카-함유 물질이 포함된다. 중합체 지지체의 예로는 바람직하게는 하이드록실 또는 카복실산 작용기가 존재하도록 플라스마 처리된 폴리스티렌, 폴리카보네이트 및 폴리메틸 메타크릴레이트가 포함되고, 이로 한정되지는 않는다. 지지체로 사용하기에 적당한 기타 물질로는 바람직하게는 하이드록실 또는 카복실산 그룹과 같은 반응성 작용기를 함유하는 황-함유 화합물과 반응하는 인듐 옥사이드, 주석 옥사이드 및 마그네슘 옥사이드와 같은 금속 옥사이드(이로 한정되지 않음)와 금, 은 및 백금과 같은 금속(이로 한정되지 않음)이 포함된다. 지지체로 사용될 수 있는 기타 물질로는 니트로셀룰로스, 목재, 페이퍼 및 판지와 같은 셀룰로스 물질과 졸-겔 물질이 포함된다. 특히 바람직한 지지체로는 유리, 석영 및 실리카가 포함되고, 가장 바람직한 지지체로는 유리 슬라이드 및 실리카 웨이퍼가 포함된다. 바람직하게는, 이러한 지지체를 사용하기 전에 세척한다. 예를 들면, 유리 슬라이드는 바람직하게는 "피라냐(piranha) 용액"(70% H2SO4/30% H2O2)으로 1시간 동안 처리한 다음 질소 스트림하에서 건조시키기 전에 탈이온수로 세정함으로써 깨끗해진다. "피라냐 용액"은 유기 화합물과 격렬히 반응하기 때문에 취급에 주의를 요하고 밀폐 용기에 저장해서도 안된다.
혈청 알부민, 양극성 중합체, 흡착된 지질층, 덱스트란 및 기타 당류, 가교결합 지질, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리옥사졸린 및 하이드로겔과 같은 다양한 물질(이로 한정되지 않음)이 생화학적 블로킹층에 사용하기 위한 생화학적 화합물로 사용하기에 적당할 수 있다. 생화학적 블로킹 화합물로 사용하기에 바람직한 물질로는 소 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민, 설치류 혈청 알부민, 개 혈청 알부민, 고양이 혈청 알부민, 돼지 혈청 알부민, 말 혈청 알부민 및 토끼 혈청 알부민과 같은 혈청 알부민이 포함되고, 이로 한정되지는 않는다. 소 혈청 알부민이 본 발명에 따른 마찰 기질 구조에서 생화학적 블로킹층을 형성하는 데 사용하기에 특히 바람직한 생화학적 블로킹 화합물이다.
액정 분석장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조는 바람직하게는 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면에 침착된 생체분자 인식 물질을 포함한다. 생체분자 인식 물질은 표적 종이 샘플에 존재하면 액정 분석장치에 의해 검출될 표적 종을 인식하고 바람직하게는 결합할 수 있는 인식 부위를 포함한다.
생화학적 블로킹 화합물을 지지체 상에 생화학적 블로킹 화합물을 화학적으로 고정시키지 않고 물리적 흡착을 사용하여 지지체 상에 위치시킬 수 있다. 예를 들면, 유리 슬라이드 또는 실리콘 웨이퍼 지지체를 밤새 PBS-완충 BSA 용액에 침지시킨 다음 건조시킬 수 있다. 이러한 BSA-코팅 지지체는 깨끗한 무처리 유리 슬라이드 및 OTS-처리된 유리 슬라이드를 포함하지만, 이로 한정되지는 않는 각종 지지체를 사용하여 제조될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 생화학적 블로킹층을 지지체의 표면에 화학적으로 고정시킨다. 이것은 지지체 상에 물리적으로 흡착된 생화학적 블로킹층을 글루타르알데하이드(이로 한정되지 않음)와 같은 가교결합제로 처리함으로써 달성될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 표면 변형제가 이기능성 스페이서 화합물 또는 활성제와 함께 사용되어 지지체 표면에 생화학적 블로킹 화합물을 고정시킨다.
도 1은 바람직하게는 액정 분석장치에 사용하기 위한 지지체의 표면에 생화학적 블로킹층을 화학적으로 고정시키는 방법에 사용되는 단계를 도시하는 반응 개략도이다. 도 1에 도시되어 있는 바와 같이, 지지체를 일반적으로 지지체 표면 상의 작용기와 반응할 수 있는 반응기를 가지는 일 말단과 이기능성 스페이서 화합물 일 말단의 반응기와 반응할 수 있는 반응기를 가지는 또다른 말단을 가지는 표면 변형제로 1차 처리한다. 바람직한 표면 변형 화합물에서, 지지체의 작용기와 반응할 수 있는 반응기로는 할로겐-실리콘 결합 또는 알콕시-실리콘 결합과 같은 작용기가 포함되고, 이로 한정되지는 않는다. 이러한 작용기는 실리카 웨이퍼 또는 유리와 같은 지지체 상의 하이드록실 그룹과 반응하여 실리콘 화합물을 지지체 표면에 속박시키는 공유결합을 형성한다. 바람직한 표면 변형 화합물은 이기능성 스페이서 화합물 일 말단의 반응기와 반응할 수 있는 반응기를 가지는 말단도 포함한다. 표면 변형 화합물 상의 이러한 바람직한 반응기로는 알킬아민이 포함되고, 이로 한정되지는 않는다. 따라서, 바람직한 표면 변형제는 실리콘 원자; 산소-실리콘 결합을 통해 실리콘 원자와 결합하는 적어도 하나의 알콕시 그룹; 및 탄소-실리콘 결합을 통해 실리콘 원자와 결합하는 아미노알킬 그룹을 포함하는 실리콘 화합물이다. 더욱 바람직한 표면 변형 화합물로는 탄소수 2 내지 8의 아미노알킬 그룹을 가지는 것들과 같은 아미노알킬트리알콕시실란이 포함된다. 특히 바람직한 이러한 화합물은 아미노프로필트리에톡시실란(APES)이다.
당업자는 메톡시, 프로폭시, 부톡시 및 페녹시와 같은 알콕시 그룹이 에톡시 그룹 대신 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 아울러, 당업자는 아미노알킬디알킬클로로실란, 3-머캅토프로필트리메톡시실란과 같은 설피드릴-말단 실란, 및 알릴트리클로로실란 및 알릴트리알콕시실란과 같은 이중결합을 가지는 실란과 같은 기타 실란(이로 한정되지 않음) 또한 표면 변형 화합물로 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 당업자는 3-머캅토프로필트리메톡시실란과 같이 설피드릴 그룹을 가지는 실란이 지지체 표면의 하이드록실 그룹 및 생화학적 블로킹 화합물 모두와 실란의 설피드릴 그룹과 단백질의 설피드릴 그룹 간의 디설파이드 결합의 형성을 통해 반응할 것이라고 인지할 것이다. 따라서, 이기능성 스페이서 화합물은 이러한 표면 변형 화합물이 이용되면 필요하지 않을 수도 있다. 그러나, 필요시 n-석신이미딜 3-(2-피리딜리티오)프로피오네이트(SPDP) 또는 석신이미딜옥시카보닐-메틸-(2-피리딜리티오)톨루엔(SMPT), 또는 석신이미딜-4-(N-말레이미도-메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트(SMCC) 또는 말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르(MBS)와 같은 헤테로이기능성 가교결합제가 이러한 설피드릴 함유 표면 변형 실리콘 화합물과 함께 사용될 수 있다.
표면 변형 화합물과 지지체 간의 반응이 이기능성 스페이서 화합물과의 반응에 의해 활성화될 수 있는 변형된 표면을 가지는 지지체를 생산한다. 반응 혼합물 중의 물이 표면 변형 화합물과의 원치않는 반응을 초래할 수도 있기 때문에, 표면 변형 화합물과 지지체 간의 반응은 바람직하게는 무수 용매 및 조건을 사용하여 수행되는데, 하지만 당업자는 물 약간의 존재는 허용가능할 것이라고 인지할 것이다.
지지체의 표면에 생화학적 블로킹층을 화학적으로 고정시키는 방법에서, 이기능성 스페이서 화합물 또는 이기능성 활성제 일 말단의 반응기는 통상적으로 표면을 활성화시키기 위해 변형된 표면과 반응하여 지지체의 활성화되고 변형된 표면을 형성한다. 바람직한 이기능성 스페이서 화합물은 유사하거나 상이한 작용기를 가질 수 있는 두 말단을 가진다. 바람직한 이러한 이기능성 스페이서 화합물은 두 말단 각각에 이탈기를 가져 일 말단은 생화학적 블로킹 화합물의 아민과 같은 그룹과 반응할 것이고 나머지 말단은 속박된 표면 변형 화합물의 아민 그룹과 같은 그룹과 반응할 것이다. 바람직한 이기능성 스페이서 화합물 또는 활성제로는 하기 화학식을 가지는 구조가 포함된다:
화학식
상기식에서,
n은 1 내지 20, 더욱 바람직하게는 2 내지 10, 훨씬 더 바람직하게는 5 내지 8 범위의 값을 가지는 정수이다. 가장 바람직하게는, 이기능성 스페이서 화합물 또는 활성제는 n이 6의 값을 가지는 디석신이미딜 수버레이트이다.
당업자는 매우 다양한 이기능성 스페이서 화합물이 상기의 디석신이미딜 종 대신 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이고 지지체의 표면에 생화학적 블로킹 화합물을 고정시키는 데 효과적이라고 입증할 것이다. 표면 변형 화합물의 아민 및 생화학적 블로킹층의 생화학적 화합물의 아민과 반응할 호모이기능성 스페이서 화합물의 예로는: 디석신이미딜 수버레이트; 비스(설포석신이미딜) 수버레이트; 디석신이미딜 글루타레이트; 디메틸 아디프이미데이트; 디메틸 수버이미데이트; 디메틸 피멜이미데이트; 디메틸 3,3-디티오비스프로피온이미데이트; 메틸 N-석신이미딜 아디페이트; 및 1,5-디플루오로-2,4-니트로벤젠이 포함되고, 이로 한정되지는 않는다. 표면 변형 화합물의 설피드릴 그룹 및 생화학적 블로킹층의 생화학적 화합물의 설피드릴 그룹과 반응할 호모이기능성 스페이서 화합물의 예로는: 1,11-비스-말레이미도테트라에틸렌글리콜; 비스말레이미도헥산; 1,6-헥산-비스-비닐설폰; 1,8-비스-말레이미도트리에틸렌글리콜; 1,4-비스-말레이미도부탄; 및 비스말레이미도에탄이 포함되고, 이로 한정되지는 않는다.
상기에 나타나 있는 호모이기능성 스페이서 화합물과 아울러, 본 발명에 헤테로이기능성 스페이서 화합물을 사용하는 것도 가능하다. 아민과 반응할 수 있는 일 말단과 설피드릴과 반응할 수 있는 일 말단을 가지는 이기능성 스페이서 화합물의 예로는: N-(κ-말레이미도운데카노일옥시) 설포석신이미드 에스테르; 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복시-(6-아미도-카프로에이트); N-(κ-말레이미도운데카노산); 석신이미딜 4-[p-말레이미도페닐]부티레이트; 석신이미딜-6[(β-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트]; 석신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트; N-석신이미딜(4-아이오도아세틸)아미노벤조에이트; N-[γ-말레이미도부티릴옥시]석신이미드 에스테르; m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르; N-ε-말레이미도카프로산; N-[ε-말레이미도카프로일옥시]석신이미드 에스테르; N-석신이미딜-[4-비닐설포닐]벤조에이트; N-[β-말레이미도프로필옥시]-석신이미드 에스테르; 석신이미딜 3-[브로모아세트아미도]프로피오네이트; N-β-말레이미도프로피온산; N-[α-말레이미도아세톡시]석신이미드 에스테르; N-석신이미딜 S-아세틸티오프로피오네이트; 및 N-석신이미딜 아이오도아세테이트가 포함되고, 이로 한정되지는 않는다. 아민과 반응할 수 있는 일 말단 및 카복실 그룹과 반응할 수 있는 일 말단을 가지는 이기능성 스페이서 화합물로는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드가 포함된다. 설피드릴 그룹과 반응할 수 있는 일 말단 및 하이드록실 그룹과 반응할 수 있는 일말단을 가지는 헤테로이기능성 스페이서 화합물의 예로는 N-[p-말레이미도페닐]이소시아네이트가 포함된다.
생화학적 블로킹 화합물이 바람직하게는 이기능성 스페이서 화합물과의 반응에 의해 생산된 지지체의 활성화되고 변형된 표면과 반응한다. 예를 들면, 아민 그룹, 바람직하게는 라이신 잔기의 ε-아미노 그룹과 같은 아민 중 하나가 이기능성 스페이서 화합물의 미반응 말단과 반응하여 지지체의 표면에 생화학적 블로킹 화합물을 고정시키는 공유 아마이드 결합을 형성할 것이다.
상기에 지적하였듯이, 생체분자 인식 물질은 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면에 침착된다. 생체분자 인식 물질은 생화학적 블로킹층이 지지체의 표면에 고정되기 전에, 고정되는 중에 또는 고정된 후에 침착될 수 있다. 생체분자 인식 물질은 지지체의 표면에 흡착될 수 있지만, 바람직하게는 이것은 또한 지지체의 표면에 화학적으로 고정되거나, 그렇지 않으면 생화학적 블로킹층과의 결합에 의해 부착될 것이다. 바람직한 생체분자 인식 물질로는 더욱 바람직하게는 단백질, 바이러스, 박테리아 및 기타 미세 병원체와 결합하는 결합 에피토프 및 결합 도메인을 인식할 수 있는 IgG와 같은 면역글로불린 또는 면역글로불린의 일부가 포함된다. 다른 바람직한 생체분자 인식 물질로는 펩타이드 또는 펩타이드의 서열, 단백질, 탄수화물 또는 탄수화물의 서열, RNA 및 DNA가 포함된다. 다른 바람직한 생체분자 인식 물질은 펩타이드 서열, 단백질, 탄수화물 및 탄수화물의 서열, DNA, RNA 또는 DNA나 RNA의 단편을 인식하여 결합할 수 있다. 바람직하게는, 생체분자 인식 물질의 아민 그룹은 지지체의 활성화되고 변형된 표면과 반응할 것이고 이어서 생화학적 블로킹 화합물이 첨가되어 지지체의 표면에 고정될 것이다. 작은 분자가 생체분자 인식 물질로 소용될 수 있다. 예를 들면, 비오틴과 같은 작은 분자가 BSA와 같은 생화학적 블로킹층의 마찰면에 속박되어 단백질을 특이적으로 결합시킬 수 있다. 따라서, 이러한 생체분자 인식 물질을 가지는 마찰 기질이 약제 개발 과정에서 유용할 작은 분자-단백질 상호반응을 스크리닝하는 데 사용될 수 있다.
상기에 지적하였듯이, 생체분자 인식 물질은 여러 방법을 사용하여 마찰 기질 구조의 표면에 위치할 수 있다. 예를 들면, DSS를 함유하는 활성 표면을 면역글로불린으로 1차 처리한 다음 블로킹층을 구성하는 생화학적 화합물과 반응시킬 수 있다. 또다른 절차에서, DSS를 함유하는 활성 표면을 BSA와 같은 생화학적 블로킹 화합물과 반응시킨 다음 마찰시킬 수 있다. 이어서 이러한 마찰면을 DSS 및 비오틴, 펩타이드, 폴리펩타이드 및 DNA 또는 RNA와 이들의 단편 서열과 같은 아민 그룹으로 종결된 리간드로 처리할 수 있다. 이어서 이것을 마찰 BSA 표면에 고정시킬 수 있다. 또다른 절차에서, 결합된 DSS를 함유하는 활성 표면을 BSA와 부분 반응시킨 다음 마찰시킬 수 있다. 이어서 생성된 구조를 면역글로불린을 함유하는 용액에 침지시킬 수 있다. 또다른 절차에서, DSS-활성화된 표면을 단백질과 반응시킨다. 이어서 단백질을 가지는 표면을 면역글로불린-함유 용액에 침지시킨 다음 BSA와 같은 생화학적 블로킹 화합물을 함유하는 용액에 침지시킨다. 특히 바람직한 절차에서, DSS(이로 한정되지 않음)와 같은 활성제를 함유하는 활성 표면을 비오틴 처리된 BSA(이로 한정되지 않음)와 같은 생체분자 인식 물질과 결합하는 생화학적 블로킹 화합물과 반응시킨다. 이것은 5CB(이로 한정되지 않음)와 같은 액정의 균일 정착을 유도하도록 마찰될 수 있는 생화학적 블로킹 화합물 및 생체분자 인식 물질을 모두 함유하는 기질을 생산한다. 비오틴-BSA로부터 제조되는 것과 같이 마찰 기질은 항-비오틴 IgG의 존재를 검출하기 위한 광학셀 및 키트를 제조하는 데 사용될 수 있다. 다양한 생체분자 인식 물질 및 생화학적 블로킹 화합물이 전술한 바와 같은 방식으로 지지체에 부착되어 마찰될 수 있고 이어서 생체분자 인식 물질과 결합하는 특정 표적 종에 노출시 액정의 불균일 정착을 보일 기질을 생산할 수 있다는 것이 당업자에게 자명할 것이다.
일 바람직한 절차에 따라서, 생체분자 인식 물질이 부착된 생화학적 블로킹 화합물을 액체 소적으로서 활성 표면의 특정 부분에 전달한다. 이러한 방식으로, 특정 생체분자 인식 물질을 가지는 생화학적 블로킹 화합물이 표면의 국한된 특정 영역으로만 한정된다. 첫번째와는 상이한 인식 물질을 작용기로 갖는 생화학적 블로킹제를 함유하는 액체의 두번째 소적을 표적의 두번째 위치에 위치시킨다. 이 절차를 표면이 영역의 배열을 지탱할 때까지 반복하는데, 상기 각각의 영역은 블로킹제 및 상이한 인식 물질에 의해 커버링된다. 이어서 전체 표면을 마찰시킬 수 있다. 이 절차는 생화학적 마이크로어레이로 사용하기에 적당한 표면을 제공하고 샘플 내에 종의 다양성을 검출하게 한다. 당업자는 상기 절차의 변경이 또한 멀티어레이를 생산하는 데도 사용될 수 있을 것이라고 인지할 것이다. 이러한 일 바람직한 절차에서, 표면 상에 액체 소적을 "스폿팅(spotting)"하는 것보다는 유체 채널(예: 마이크로몰딩(micromolded) 폴리디메틸실록산으로 제조)이 액체를 표면의 국한된 지역에 전달하는 데 사용된다. 일반적으로, 액체를 표면의 국한된 지역에 전달하기 위한 당업자에게 알려져 있는 방법이 다수의 표적 종의 검출을 위한 바람직한 마이크로어레이 장치를 생산하는 데 사용될 수 있다.
상기에 나타나 있는 마이크로어레이는 샘플에서 하나 이상의 표적 종의 존재를 검출하기 위한 장치를 제공한다. 본 장치는 생화학적 블로킹층을 가지는 마찰 표면을 갖는 지지체를 포함한다. 본 장치는 또한 생화학적 블로킹층을 가지는 지지체의 첫번째 부분에 제 1 표적 종 검출 영역을 포함하고, 제 1 표적 종 검출 영역은 제 1 표적 종과 결합할 수 있는 제 1 생체분자 인식 물질을 가진다. 본 장치는 추가로 생화학적 블로킹층을 가지는 지지체의 적어도 하나의 다른 부분에 적어도 하나의 다른 표적 종 검출 영역을 포함하고, 적어도 하나의 다른 표적 종 검출 영역은 적어도 하나의 다른 표적 종과 결합할 수 있는 적어도 하나의 다른 생체분자 인식 물질을 가진다. 제 1 표적 종 검출 영역은 표적 종의 부재하에서 액정을 균일하게 정착시키고, 적어도 하나의 다른 표적 종 검출 영역도 적어도 하나의 다른 표적 종의 부재하에서 액정을 균일하게 정착시킨다. 제 1 표적 종 검출 영역에서 액정의 균일 정착은 제 1 표적 종 검출 영역이 제 1 표적 종에 노출되었을 때 붕괴되고, 적어도 하나의 다른 표적 종 검출 영역에서 액정의 균일 정착도 적어도 하나의 다른 표적 종 검출 영역이 적어도 하나의 다른 표적 종에 노출되었을 때 붕괴된다.
샘플에서 표적 종의 존재를 판단하기에 특히 바람직한 장치로는 표면이 마찰되었고 제 1 생체분자 인식 물질 및 적어도 하나의 다른 생체분자 인식 물질이 각각 제 1 표적 종 검출 영역 및 적어도 하나의 다른 표적 종 검출 영역에 존재하는 것이 포함된다.
생화학적 블로킹층을 함유하는 기질의 표면을 바람직하게는 일 방향(이로 한정되지 않음)으로 마찰시킨다. 일부 절차에서는, 생화학적 블로킹층의 상이한 영역을 상이한 방향으로 마찰시키는 것이 바람직하다. 이것은 생화학 물질이 인식 잔기와 결합시 액정이 일정 패턴을 창조하도록 한다. 이 패턴이 사용자에게 정보를 제공하는 데 사용될 수 있다. 일부 절차에서는 또한 작은 구역으로 각 영역에 상이한 마찰 조건을 사용하여 생화학적 블로킹층을 마찰시키는 것이 바람직하다. 이것은 결합된 표적 생화학 물질에 대한 감수성이 다양한 표면을 제조하게 한다. 일반적으로는, 표면이 표면에 결합하는 물질의 부재하에서는 액정의 균일 정착을 유도하고 액정이 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면과 접촉하였을 때는 액정의 균일 정착이 붕괴되는 특징을 지니도록 기질의 표면을 마찰시킨다. 당업자는 기질 구조의 마찰이 다양한 도구 및 장치와 벨벳형 폴리에스테르 포, 실크, 벨벳, 면, 울, 박엽지, 범포, 나일론 및 폴리에스테르(이로 한정되지 않음)를 포함하는 다양한 마찰 재료를 사용하여 수행될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 바람직한 마찰 재료는 벨벳형 폴리에스테르 포이다. 마찰방법으로는: 손바닥 크기의 포를 기질 표면에 교차하여 밀기; 목재를 사포로 미는 데 사용하기 위한 기계적 사포와 유사한 도구에 포를 붙인 다음 이것을 기질 표면에 대해 홀딩(holding); 및 원통형 롤러에 부착된 포를 기질 위에서 회전시킨 다음 회전하는 실린더를 기질 쪽으로 하강시키는 것이 포함되고, 이로 한정되지는 않는다. 당업자는 표면이 액정을 균일하게 정착시키도록 표면을 마찰시키는 데 사용될 수 있는, 액정-기본 컴퓨터 디스플레이에 사용하기 위해 개발된 표면의 마찰방법을 포함하는 다수의 방법이 있다는 것을 인지할 것이다. 일반적으로, 기질의 마찰은 포를 표면과 접촉시키면서 포 또는 기타 재료를 기질 표면에 교차하여 미는 단계를 포함한다.
생화학적 블로킹층을 함유하는 기질의 표면 마찰방법은 도 2에 도시되어 있는 바와 같은 변형된 스트립 차트 리코더를 사용한다. 도 2에 도시되어 있는 바와 같이, 슬라이드(1)를 통상적으로 변형된 스트립 차트 리코더(2)에 두어 생화학적 블로킹층을 함유하는 슬라이드(1)의 일면이 마찰 재료(3)와 마주보도록 한다. 이어서 고정된 스톱핑기(5)로 적당하게 유지되는 슬라이드(1) 상에 압력을 가하기 위해 알루미늄 웨이트(4)를 슬라이드에 둔다. 양면 테입(6)이 마찰 재료를 이동 가이드로서 사용되는 차트 페이퍼(7)의 상단에 고정시키는 데 통상 사용된다. 마찰은 바람직하게는 약 250 내지 약 1,000 Pa의 적용 압력을 사용하여 달성된다. 마찰 재료의 이동은 통상적으로 약 5 mm/초 내지 약 2.1 mm/초이고, 마찰은 약 1분 내지 약 30초의 시간 동안 통상 수행된다. 당업자는 다양한 압력, 시간 및 속도가 기질 구조를 마찰시키는 데 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 그러나, 후술되어 있는 것처럼, 놀랍고도 예상밖으로 마찰 기질로부터 제조되는 생화학 물질 검출용 광학셀의 감수성이 마찰 속도, 마찰 길이 및 마찰 압력을 변동시킴으로써 상당히 변화할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 특히 마찰 압력 및 마찰 길이가 감수성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 기질을 마찰시키는 데 사용되는 압력의 강하가 검출될 종의 주어진 농도에서 액정의 정착에 대한 마찰 기질의 감수성을 현저히 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 마찰 길이에 대해서도 마찬가지이다.
생화학적 블로킹층은 비-표적 종의 비-특이적 흡착을 저지한다. 발생하는비-표적 종의 비-특이적 흡착은 표면 상에서 액정의 배향을 변화시키지 않아 표적 종의 결합을 암시하는 액정 배향의 해석을 방해한다. 예를 들면, 소 혈청 알부민으로부터 형성된 생화학적 블로킹층을 함유하는 실리콘 웨이퍼 또는 유리 슬라이드의 마찰 기질 구조는 피브리노겐, 리소자임, 항-FITC 및 항-스트렙타비딘의 비-특이적 흡착을 저지한다. 생화학적 블로킹층의 이러한 중요한 특징은 액정 분석장치에 이용하기 위한 마찰 기질 구조에서 중요한데, 그 이유는 비-표적 종의 비-표적 흡착이 표면과 접촉하게 되는 액정의 균일 정착을 붕괴하여 의양성 실험 결과를 초래할 것이기 때문이다. 비-특이적 흡착을 저지하는 BSA를 함유하는 특히 바람직한 생화학적 블로킹층은 생체분자 인식 물질을 위한 다수의 결합 부위를 가지고, 지지체의 활성 표면과 쉽게 반응하며, 5CB와 같은 액정의 균일 정착을 초래하도록 마찰된다.
여러가지 유형의 액정이 마찰 기질 구조와 함께 사용될 수 있다. 그 예로는 네마틱(nematic) 및 스멕틱(smectic) 액정 모두가 포함된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 기타 부류의 액정으로는: 고분자 액정, 유방성 액정, 열방성 액정, 원주형 액정, 네마틱 원반상형 액정, 칼래미틱(calamitic) 네마틱 액정, 강유전성 액정, 원판형 액정 및 콜레스테릭 액정이 포함되고, 이로 한정되지는 않는다. 사용될 수 있는 일부 액정의 예가 상기 표 1에 나타나 있다. 본 발명에 사용하기에 특히 바람직한 액정으로는 4-시아노-4'펜틸비페닐이 포함된다.
액정 분석장치에 사용하기 위한 광학셀은 바람직하게는 전술한 바와 같은 두 개의 마찰 기질 및 두 개의 마찰 기질 사이에 위치하여 액정으로 충진될 수 있는 공동을 초래하는 스페이싱 물질, 바람직하게는 필름을 포함한다. 본 발명에 따른 다른 바람직한 광학셀은 전술한 바와 같은 마찰 기질 구조; 액정을 균일하게 정착시키는 표면; 및 마찰 기질 구조의 생화학적 블로킹층과 액정을 균일하게 정착시키는 표면 사이에 위치하는 스페이싱 물질을 포함한다. 따라서, 광학셀의 양면이 모두 마찰 기질일 필요는 없다. 스페이싱 물질은 바람직하게는 한정된 두께의 필름이고 더욱 바람직하게는 액정 물질의 존재하에 안정하며, 다루기가 용이하며, 액정을 오염시키지 않는 필름이다. 당업자에게 자명한 것처럼 다양한 필름이 본 발명에 따른 광학셀에서 스페이싱 물질로 사용하기에 적당할 수 있다. 그러나, 바람직한 필름 스페이싱 물질은 바람직하게는 MylarR필름 또는 SaranR랩과 같은 중합체 물질로 제조된다. 필름 스페이싱 물질은 통상적으로 마찰 기질 사이에 위치하여 생화학적 블로킹층을 함유하는 마찰 기질 각 표면이 다른 마찰 기질의 또다른 이러한 표면과 마주보도록 한다. 스페이싱 물질은 또한 광학셀을 형성하는 양면을 분리하기 위해 액정으로 분산되는 한정된 직경의 마이크로스피어(microsphere) 또는 로드(rod)로 이루어질 수 있다.
본 발명에 따른 액정 분석장치는 전술한 바와 같은 마찰 기질 구조; 액정을 균일하게 정착시키는 표면; 및 마찰 기질 구조의 생화학적 블로킹층과 액정을 균일하게 정착시키는 표면 사이에 위치하는 스페이싱 물질을 포함한다. 마찰 기질 구조의 표면은 생화학적 블로킹층과 생체분자 인식 물질을 모두 포함한다. 생화학적 블로킹층을 함유하는 마찰 기질 구조의 일면과 액정을 균일하게 정착시키는 표면은 서로 마주보고 이들 사이에 위치하는 스페이싱 물질에 의해 분리된다. 액정은 마찰 기질 구조와 액정을 균일하게 정착시키는 표면 사이의 영역으로 드로잉된다. 바람직한 분석장치에서, 그럴 필요가 없을 수도 있지만, 액정을 균일하게 정착시키는 표면 또한 생체분자 인식 물질을 함유할 수 있는 마찰 기질 구조이다. 액정을 균일하게 정착시키는 표면으로 사용하기에 적당한 기타 물질로는 옥타데실트리클로로실란과의 반응에 의해 변형된 유리 표면 및 경사 침착된 금막을 가지는 유리 표면이 포함된다. 액정을 균일하게 정착시키는 다른 적당한 표면으로는 전단-침착된 테플론을 가지는 마찰 유리 슬라이드 및 유리 슬라이드가 포함된다. 표면이 액정을 균일하게 정착시키는 한, 샘플에서 표적 종의 존재는 생체분자 인식 물질을 갖는 마찰 기질 구조에서 액정의 배향을 붕괴시킬 것이고 이에 따라 검출될 것이다.
액정 분석에 사용하기 위한 키트는 본 발명에 따른 마찰 기질 구조; 액정을 균일하게 정착시키는 표면; 전술한 바와 같은 분석장치가 제조될 수 있도록 마찰 기질 구조와 액정을 균일하게 정착시키는 표면 사이에 있는 필름과 같은 스페이싱 물질; 및 액정을 함유한다. 액정을 균일하게 정착시키는 표면은 마찰 기질 또는 전술한 바와 같이 액정을 균일하게 정착시키는 또다른 표면일 수 있다. 이러한 키트는 표적 종의 검출을 위한 지시를 포함할 수 있다. 이러한 지시는 마찰 기질을 검출할 표적 종을 함유할 수도 있는 샘플과 함께 인큐베이팅하기 위한 방법을 통상 포함할 것이다. 이것은 또한 바람직하게는 표적 종의 존재가 어떻게 확인되는지를설명하는 지시를 포함할 것이고 또한 샘플중 표적 종의 농도를 측정하는 데 사용될 수 있는 단계를 포함할 수 있다. 추가로, 바람직한 키트는 다양한 농도의 표적 종의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있는 다양한 마찰 조건을 사용하여 제조되는 마찰 기질을 포함할 수 있다. 일부 바람직한 키트에서는, 마찰 기질 구조, 또다른 마찰 기질 구조일 수 있는 액정을 균일하게 정착시키는 표면 및 스페이싱 물질이 광학셀로 예비조립된다. 이러한 키트에서, 표적 종에 대해 시험할 샘플, 이어서 액정이 예비조립된 셀을 통해 드로잉되거나 흐를 수 있다. 따라서 이러한 키트는 또한 표적 종의 검출에 사용하기 위한 하나 이상의 시린지를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 다른 키트는 적어도 하나의 마찰 기질 및 액정을 포함한다. 이러한 키트는 또한 샘플내 표적 종의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다. 본 방법은 키트의 마찰 기질의 부분을 일정량의 샘플과 접촉시키고; 키트의 액정을 샘플과 접촉한 마찰 기질 구조 부분에 둔 다음; 액정의 균일 정착이 붕괴되었는지를 판단하는 단계를 포함한다. 액정의 균일 정착이 붕괴되었으면, 표적 종이 샘플에 존재한다. 액정의 균일 정착이 붕괴되었는지의 판단은 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 이러한 일 방법은 마찰 기질을 교차 편광판을 통해 관찰하는 단계를 포함한다.
전술한 바와 같은 액정 분석장치를 사용하는 표적 종 존재의 검출방법은 여러 단계를 포함한다. 첫째, 마찰 기질 구조를 표적 종의 존재에 대해 시험할 샘플과 함께 인큐베이팅한다. 통상적으로, 인큐베이팅 시간은 약 2시간일 것이지만, 이것은 특정 표적 종 및 표적 종을 특이적으로 인식하여 결합할 수 있는 생체분자 인식 물질에 따라 다양해질 수 있다. 둘째, 필름과 같은 스페이싱 물질을 인큐베이팅된 마찰 기질 구조와 액정을 균일하게 정착시키는 표면 사이에 두어 마찰 기질 구조의 생화학적 블로킹층이 액정을 균일하게 정착시키는 표면과 마주보도록 한다. 셋째, 5CB와 같은 액정을 인큐베이팅된 마찰 기질 구조와 액정을 균일하게 정착시키는 표면 사이의 영역으로 드로잉한다. 통상적으로, 액정은 이 단계 중에 등방성 상태이다. 액정을 인큐베이팅된 마찰 기질 구조와 액정을 균일하게 정착시키는 표면 사이의 영역으로 드로잉하기 전에 가열할 필요가 있을 수 있다. 액정은 또한 네마틱 상태로 셀에 드로잉될 수 있다. 최종적으로, 분석을 수행하는 사람이 액정이 마찰 기질 구조에 균일하게 정착되었는 지를 판단한다. 액정이 마찰 기질 구조에 균일하게 정착되었으면, 샘플은 표적 종을 함유하지 않는 것으로 밝혀질 것이다. 한편, 액정이 마찰 기질 구조에 균일하게 정착되지 않으면, 샘플은 표적 종을 함유하는 것으로 밝혀질 것이다.
전술한 방법과 아울러, 본 발명에 따라 사용되는 키트 및 분석장치는 또한 시험될 샘플이 마찰 기질 구조, 스페이싱 물질 및 액정을 균일하게 정착시키는 표면을 포함하는 예비조립된 셀을 통해 직접 통과하거나 이에 유지되도록 설계될 수 있다. 일단 상당한 시간이 경과하면, 샘플을 제거한 다음 액정을 첨가하여 표적 종이 샘플에 존재하는지 그렇지 않는지를 판단한다.
전술한 방법과 아울러, 본 발명에 따라 사용되는 키트 및 분석장치는 액정이 인큐베이팅된 마찰 기질 구조의 표면에 직접적으로 위치하고 마찰 기질 표면 상의 액정의 일면에서의 액정의 배향을 공기로 관찰하도록 설계될 수 있다. 즉, 액정이 간단히 표면에 위치한다. 예를 들면, 5CB의 배향이 액정 공기 경계면에서 호메오트로픽(homeotropic)이라는 것이 잘 알려져 있다. 따라서, 액정의 유리(free) 표면이 액정을 균일하게 정착시키는 제 2 표면 대신 치환될 수 있다. 이러한 유형의 키트는 패턴 인식 그룹의 마이크로어레이를 위해 특히 유용하다.
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재료
실험에 사용되는 현미경 유리 슬라이드는 매우 고급이며 Fisher Scientific(미국 펜실베니아 피츠버그 소재)로부터 입수되고 연마한 실리콘(100) 웨이퍼는 Silicon Sense(미국 뉴햄프셔 나슈아 소재)로부터 입수된다. 유리 슬라이드와 실리콘 웨이퍼를 사용하기 전에 "피라냐 용액"(70% H2SO4/30% H2O2)으로 처리함으로써 소제한다. "피라냐 용액"은 유리 물질과 격렬히 반응하기 때문에 매우 주의하여 다루어야 하고 밀폐 용기에 저장해서도 안된다. 1시간 동안 80℃에서 "피라냐 용액"으로 소제한 후에, 슬라이드와 실리콘 웨이퍼를 탈이온수로 풍부하게 세정하고, 질소 스트림하에서 건조시킨다. 사용하기 전에, 깨끗한 기질을 120℃에서 적어도 3시간 동안 가열된 오븐에 저장한다.
다양한 화학물질이 본 실험에서 사용되었다. 옥타데실트리클로로실란(OTS) 및 3-아미노프로필트리에톡시실란(APES)은 모두 Gelest(미국 펜실베니아 툴리타운 소재)로부터 구매된다. OTS를 사용하는 현미경 유리 슬라이드의 실릴화 용액은 용매로서 무수 톨루엔(미국 위스콘신 밀워키에 소재하는 Aldrich)을 사용하여 제조되고 반면 APES를 사용하는 현미경 유리 슬라이드의 실릴화 용액은 10 mM의 나트륨 아세테이트-아세트산 완충(pH 5.0) 용액을 사용하여 제조된다. 디석신이미딜 수버레이트(DSS)는 Pierce(미국 일리노이 록포드 소재)로부터 입수된다. DSS 용액은 Aldrich(미국 위스콘신 밀워키 소재)로부터 입수되는 무수 메탄올 및 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 사용하여 제조된다. 소 혈청 알부민(BSA, IgG 무, 동결건조된 분말), 항-BSA(토끼에서 발달), 항-스트렙타비딘(토끼에서 발달), 항-FITC(단일클론, 클론 FL-D6, 마우스 복수액), 피브리노겐(인간 혈장으로부터의 분획 I, III형), 리소자임(EC 3.2.1.17, III 등급: 달걀 흰자로부터), 및 항-비오틴 IgG(다클론, 염소에서 발달)는 Sigma(미국 미주리 세인트 루이스 소재)로부터 입수되고 입수한 대로 사용된다. 비오틴 처리된 소 혈청 알부민(비오틴-BSA, 비오틴 몰/BSA 몰 = 8)은 Pierce(미국 일리노이 록포드 소재)로부터 입수된다. 본 연구에 사용되는 모든 단백질은 pH 7.2의 포스페이트-완충 식염수(PBS) 완충액에 용해된다. 모든 수용액은 Millipore(미국 매사추세츠 베드포드 소재)로부터 입수되는 Milli-Qplus브랜드의 탈이온수(18.2 ㏁ㆍcm)를 사용하여 제조된다. 완충 용액은 분석용 시약을 사용하여 제조된다. BDH에 의해 제조되는 네마틱 액정인 4-시아노-4'-펜틸비페닐(5CB)을 EM industries(미국 뉴욕 호손 소재)로부터 구매한다.
물리적으로 흡착된 BSA층을 갖는 기질의 제조
소수성 및 친수성 기질이 이들 표면에의 BSA의 물리적 흡착 연구를 위해 제조되었다. 깨끗한 유리 슬라이드와 실리콘 웨이퍼가 친수성 기질로 사용되었다. 소수성 기질은 유리 슬라이드 및 실리콘 웨이퍼를 OTS 용액(무수 톨루엔중 3%의 OTS)으로 밤새 처리함으로써 제조된다. 가수분해의 잠재력을 제거하기 위해, OTS로의 실릴화가 질소하 글러브 박스(미국 캘리포니아 호손에 소재하는 Vacuum Atmospheres Co.의 모델 CC-40)에서 수행된다. OTS로 실릴화된 기질을 추가로 사용하기 전에 톨루엔으로 세정하고 120℃에서 적어도 3시간 동안 건조시킨다. BSA는 이것을 PBS 완충액(pH 7.2)중 1 mg/㎖의 BSA 용액에 밤새 침지시킴으로써 친수성 및 소수성 기질에 물리적으로 흡착된다.
화학적으로 고정된 BSA층을 갖는 기질의 제조
화학적으로 고정된 BSA층을 갖는 기질이 도 1에 개략적으로 도시되어 있는 실험 절차를 사용하여 제조된다. 깨끗한 유리 슬라이드를 나트륨 아세테이트-아세트산 완충액(10 mM, pH 5.0)중 10%의 APES와 3시간 동안 80℃에서 반응시킴으로써 아미노프로필화시킨다. 아미노프로필화된 기질을 탈이온수로 세정한 다음 120℃에서 적어도 3시간 동안 건조시키고, 이어서 석신이미드 에스테르 가교결합제(DSS)로 활성화시켜 아마이드 결합 형성에 의한 BSA의 표면에의 커플링을 촉진한다. 아미노프로필화된 기질을 무수 메탄올에 침지시킨 다음 무수 DMSO중 50 mM의 DSS 스톡 용액을 1 mM의 DSS 용액을 생성하는 충분량으로 첨가한다. 혼합물을 1시간 동안 교반하고, 메탄올로 세척한 다음 BSA의 아민 그룹과 즉시 커플링시킨다. BSA 커플링은 DSS-활성화된 유리 슬라이드를 PBS 완충액(pH 7.2)중 1 mg/㎖의 BSA 용액에 밤새 침지시킴으로써 달성된다.
BSA 마찰 필름을 갖는 기질의 제조
마찰 BSA 필름이 도 2에 도시되어 있는 바와 같은 마찰용 변형 스트립 차트 리코더(Heath Company의 모델 No. SR-255 A/B)를 사용하여 BSA-고정된 유리 슬라이드에 교차하여 마찰 재료를 슬라이딩시킴으로써 제조된다. Logantex Inc.(미국 뉴욕 뉴욕시 소재)로부터 입수되는 벨벳형 폴리에스테르 포(90% 폴리에스테르/10% 스판덱스)이 본 연구에서 마찰 재료로 사용되었다. 마찰 재료를 양면 테입을 사용하여 이동 가이드(차트 페이퍼)의 상단에 부착하여, BSA-고정된 유리 슬라이드를 마찰 재료 위에 둔다. 유리 슬라이드가 제자리에서 고정될 수 있기 때문에, 마찰은 차트 페이퍼에 의해 가이딩되는 마찰 재료의 이동에 의해 달성된다. 마찰 시간은 차트 리코더로 5 mm/초의 속도로 1분간이다. 적용되는 압력은 약 103Pa이고, 이것은 유리 슬라이드에 웨이트(약 1 인치 ×3 인치의 치수를 갖는 약 200 g의 알루미늄 블록)를 로딩함으로써 달성된다.
화학적으로 고정된 비오틴-BSA층을 갖는 기질의 제조
화학적으로 고정된 비오틴-BSA층을 갖는 기질이 도 1에 개략적으로 도시되어 있는 실험 절차를 사용하고 BSA 대신 비오틴 처리된 BSA를 사용하여 제조된다. 깨끗한 유리 슬라이드를 3시간 동안 80℃에서 나트륨 아세테이트-아세트산 완충액(10 mM, pH 5.0)중 5%의 APES와 반응시킴으로써 아미노프로필화시킨다. 아미노프로필화된 기질을 초음파처리조에서 10분간 80℃에서 나트륨 아세테이트-아세트산 완충액으로 3회 소제하고, 탈이온수로 세정한 다음, 적어도 3시간 동안 120℃에서 건조시키고, 이어서 석신이미드 에스테르 가교결합제(DSS)로 활성화시켜 아마이드 결합 형성에 의한 비오틴-BSA의 표면에의 커플링을 촉진한다. 아미노프로필화된 기질을 무수 메탄올에 침지시킨 다음 무수 DMSA중 50 mM의 DSS 스톡 용액을 1 mM의 DSS 용액을 생성하는 충분량으로 첨가한다. 기질을 교반 혼합물에 1시간 동안 침지시키고, 메탄올 및 탈이온수로 세척한 다음 비오틴-BSA의 아민 그룹과 즉시 커플링시킨다. 비오틴-BSA 커플링은 PBS 완충액(pH 7.2)중 1 mg/㎖의 비오틴-BSA 용액에 DSS-활성화된 유리 슬라이드를 침지시킴으로써 달성된다.
비오틴-BSA 마찰 필름을 갖는 기질의 제조
비오틴-BSA의 마찰 필름이 전술한 바와 같이 제조된 비오틴-BSA 코팅 기질에 교차하여 Logantex Inc.(미국 뉴욕 뉴욕시 소재)로부터 입수되는 벨벳형 포(90% 폴리에스테르/10% 스판덱스)를 슬라이딩시킴으로써 제조된다. 마찰은 도 2에 도시되어 있는 바와 같은 마찰용 변형 스트립 차트 리코더(모델 SR-255 A/B Heath Company)를 사용하여 달성된다. 포를 양면 테입을 사용하여 이동 가이드(차트 페이퍼)의 상단에 부착하여, (비오틴-BSA)-고정된 유리 슬라이드를 포와 마주보도록 둔다. 유리 슬라이드가 제자리에서 고정될 수도 있기 때문에, 마찰은 차트 페이퍼에 의해 가이딩되는 마찰 재료를 이동시킴으로써 달성된다. 마찰 속도 및 길이는 차트 리코더의 공급 속도 및 마찰 시간을 각각 변경시킴으로써 조절된다. 마찰 압력은 마찰 전에 기질에 상이한 질량의 알루미늄 블록을 둠으로써 조절된다. 표준 조건으로서, 대략 2.1 mm/초(5 인치/분)의 마찰 속도, 대략 127 mm의 마찰 길이(1분의 마찰 시간) 및 대략 1,000 Pa의 마찰 압력(대략 200 그램의 질량 및 2.54 cm × 7.62cm의 치수를 갖는 알루미늄 블록)이 사용된다.
생체분자 인식 물질을 갖는 마찰 BSA 필름의 일반적인 제조
화학적으로 고정된 BSA층 및 화학적으로 고정된 생체분자 인식 물질을 갖는 기질이 생체분자 인식 물질인 면역글로불린 또는 이의 단편이 변형되고 활성화된 표면을 BSA로 처리하기 전에 DSS와 반응한다는 것을 제외하고는 도 1에 개략적으로 도시되어 있는 실험 절차를 사용하여 제조된다. 깨끗한 유리 슬라이드를 나트륨 아세테이트-아세트산 완충액(10 mM, pH 5.0)중 10%의 APES와 3시간 동안 80℃에서 반응시킴으로써 아미노프로필화시킨다. 이어서 아미노프로필화된 기질을 탈이온수로 세정하고 120℃에서 적어도 3시간 동안 건조시키며, 이어서 석신이미드 에스테르 가교결합제(DSS)로 활성화시켜 아마이드 결합 형성에 의한 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편 및 BSA의 표면에의 커플링을 촉진한다. 아미노프로필화된 기질을 무수 메탄올에 침지시킨 다음 무수 DMSO중 50 mM의 DSS 스톡 용액을 1 mM의 DSS 용액을 생성하는 충분량으로 첨가한다. 혼합물을 1시간 동안 교반하고, 메탄올로 세척한 다음, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 아민 그룹과 즉시 커플링시킨다. 면역글로불린 또는 이 단편의 커플링은 DSS-활성화된 유리 슬라이드를 100 ng/㎖의 면역글로불린 또는 이 단편의 PBS 완충액에 밤새 침지시킴으로써 달성된다. 이어서 슬라이드를 탈이온수로 세정하고 BSA로 처리하여 마찰을 위한 최종 기질 표면을 생산한다. BSA 커플링은 유리 슬라이드를 PBS 완충액(pH 7.2)중 1 mg/㎖의 BSA 용액에 밤새 침지시킴으로써 달성된다. 이어서 고정된 BSA 및 면역글로불린 또는 이의 단편을 함유하는 기질의 표면을 상기에 약술되어 있는 절차에 따라 마찰시킨다.
BSA층 없는 마찰 기질
BSA층 없는 마찰 유리 슬라이드 및 전단-침착된 테플론 필름을 갖는 유리 슬라이드가 마찰 필름에의 단백질 흡착 예비 연구를 위해 제조된다. BSA층 없는 마찰 유리 슬라이드는 BSA를 함유하는 슬라이드에 대해 전술한 바와 같은 조건하에서 비-BSA를 함유하는 유리 슬라이드를 기계적으로 마찰시킴으로써 제조된다. 전단-침착된 테플론 필름을 갖는 유리 슬라이드는 전동기에서 융합된 유리 슬라이드에 교차하여 편평한 테플론 블록을 슬라이딩시킴으로써 수득된다. 대략 100℃의 온도가 유리 슬라이드에 테플론을 전단-침착시키는 데 사용되는데, 그 이유는 이것이 더 저온이 사용되었을 때 달성되는 것보다 더 완전하고 재현 가능한 표면 피복면적을 제공하기 때문이다. 적용되는 압력 및 속도 또한 조절되는데, 각각 약 103Pa 및 15초간 0.5 mm/s이다.
단백질 흡착
다양한 생화학 물질에 의한 단백질 흡착을 연구하기 위해, 화학적으로 고정된 BSA의 마찰 필름을 PBS 완충액(pH 7.2)중 다양한 단백질 용액과 함께 2시간 동안 인큐베이팅한다. 이러한 용액은 특이적 결합을 위한 100 nM의 다클론 항-BSA IgG 용액; BSA의 추가 흡착을 연구하기 위한 10 mg/㎖의 BSA 용액; 100 nM의 항-FITC IgG 용액; 0.2 mg/㎖의 피브리노겐 용액; 및 0.2 mg/㎖의 리소자임 용액을 포함한다. 항-FITC, 피브리노겐 및 리소자임 용액이 화학적으로 고정된 BSA 기질에 의한 비-특이적 흡착을 조사하기 위해 제조되었다.
비오틴-BSA의 마찰 필름에 의한 항-비오틴 IgG의 결합
전술한 바와 같이 제조된 비오틴-BSA의 마찰 필름을 상이한 농도로 항-비오틴 IgG의 PBS 용액(pH 7.2)에 90분간 인큐베이팅한다. 인큐베이팅 중에, IgG 용액을 자기 교반바를 사용하여 교반한다. 단백질 용액으로부터 제거한 후에, 기질을 탈이온수로 세정하고 건조한 질소 스트림하에서 건조시킨다.
광학셀
광학셀이 두 개의 유리 슬라이드를 페어링(pairing)하고, Dupont Films(미국 델라웨어 윌밍턴 소재)로부터 입수되는 약 10 ㎛ 두께의 MylarR브랜드의 필름을 사용하여 이것의 일면의 간격을 띄워 제조된다. 마찰 필름을 서로 마주보도록 정렬하여 필름의 마찰 방향은 셀 내에서 평행이다. 셀을 현미경 유리 슬라이드의 에지를 따라 위치하는 "불독(bulldog)" 클립을 사용하여 함께 유지한다. 셀을 40℃에서 고온의 플레이트에 두고 고온의 공기로 대략 10초간 가열한다. 네마틱 액정인 5CB를 등방성 상태(약 35℃)로 유리 시린지에서 가열한다. 이어서 5CB의 소적을 고온의 플레이트에서 각 셀의 에지에 위치시킨다. 이어서 5CB를 광학셀로 모세관 현상에 의해 드로잉한다. 일단 광학셀이 5CB로 충진되면, 셀을 고온의 플레이트로부터 제거한 다음 실온으로 공기 중에서 냉각시킨다. 냉각시, 5CB의 등방성 상태는 네마틱 상태로 전환된다.
편광 현미경
편광 현미경(일본 도쿄에 소재하는 Olympus의 BX60)이 5CB로 충진된 광학셀을 통해 투과되는 빛에 의해 형성된 광학적 텍스처(texture)를 관찰하는 데 사용되었다. 마찰 비오틴-BSA 기질을 사용한 것을 제외하고는 모든 영상이 간섭-편광 사이에서 550 ㎛의 가시 영역을 갖는 20× 대물 렌즈를 사용하여 입수되었다. 간섭 편광 사이에서 1.0 mm의 가시 영역을 갖는 10× 대물 렌즈가 마찰 비오틴-BSA 기질로부터 구성된 셀의 영상을 입수하는 데 사용되었다. 마찰 비오틴-BSA 기질로부터 제조된 액정 광학셀의 광학적 양상의 영상을 편광 현미경에 연결된 디지털 카메라(미국 뉴욕 멜빌에 소재하는 Olympus America Inc.로부터 입수한 C-2020 Z)로 찍는다. 마찰 비오틴-BSA 기질을 사용하여 제조된 광학셀의 사진은 f11의 구경 및 1/160초의 셔터 속도로 고급 모드(1600 ×1200 화소의 해상도)를 사용하여 입수된다. 마찰 비오틴-BSA 기질로부터 제조된 셀의 광학적 텍스처의 분석이 천연색의 회색으로의 영상 변환 후에 영상의 평균 휘도(0-255 범위의 평균 화소값)를 계산하기 위한 포토샵 소프트웨어(미국 캘리포니아 새너제이에 소재하는 Adobe Systems Incorporated)를 사용하여 수행된다. 모든 광학셀을 위한 액정의 방위각상 배향이 1/4 파길이판(quarter-wave plate, Normarski 프리즘, 147.3 nm)의 광 경로로의 삽입시 간섭색의 변화에 의해 측정된다. 모든 광학셀을 편광판의 축에 대해 광학셀의 45°회전에 상응하는 1/4 파길이판의 감광도가 낮은 축에 평행한 마찰 방향으로 현미경에 둔다. 감광도가 낮은 축은 간섭 이동의 방향을 관찰함으로써 결정된다. 즉, 간섭색은 액정의 감광도가 낮은 축과 1/4 파길이판이 일치할 때 Michel-Levy chart에서 더 큰 지연쪽으로 이동한다.
광학셀의 투과율
각 광학셀을 통해 투과한 빛의 강도가 간섭 편광 사이에서 샘플의 회전 중에 기록된다. 간섭-편광을 통해 투과한 빛의 백그라운드 강도(IBackground) 및 병렬 편광을 통해 투과한 빛의 최고 강도(IParallel)가 속빈 광학셀(5CB를 충진하지 않음)에 대해 기록된다. 기록된 강도 값은 간섭-편광을 통해 투과한 빛의 백그라운드 강도에 대해 보정되고 병렬 편광 사이를 투과한 측정된 빛의 강도에 의해 표준화된다(둘 다 속빈 셀). 즉, 보정되고 표준화된 부분 투과율이 하기 수학식으로 주어진다:
투과한 빛의 모든 강도는 실리콘 포토다이오드(미국 뉴저지 뉴톤에 소재하는 Thorlabs, Inc.의 실리콘 포토다이오드 FDS100)에 의해 측정된다.
타원편광측정 두께
타원편광측정을 위해서, 실리콘 웨이퍼가 유리 슬라이드 대신 기질로 사용된다. 측정용 샘플 기질이 광학적 측정을 위해 유리 슬라이드를 준비하는 데 사용된 것과 동일한 절차를 사용하여 준비된다. 타원편광측정 두께는 6320 Å의 파장 및 70°의 입사각으로 Rudolph Auto EL 타원편광측정기(미국 뉴저지 플란더스)를 사용하여 각 샘플의 3 지점에서 측정된다. 결합 단백질의 타원편광측정 두께를 해석하기 위해, 간단한 2층 모델(유기층/SiO2/Si의 효과적인 기질)이 사용된다. 계산을 수행하기 위해, 실리콘 웨이퍼에 형성된 유기 필름에 대해 1.46의 굴절율이 사용된다.
5CB의 아웃-오브-플레인(out-of-plane) 배향
홈-빌트(home-built) 광학 장치가 광학셀내 5CB의 아웃-오브-플레인 배향(경사각)을 측정하는 데 사용된다. 본 장치는 10 mW의 He-Ne 레이저, 편광판, 샘플의 회전을 허용하는 컴퓨터 제어 단계, 분석기 및 포토다이오드를 포함한다. 광학셀은 간섭-편광판 사이에 위치하고 편광 He-Ne 레이저를 사용하여 정상 입사각으로 조명한 다음, 정상 입사각에 대해 -20°내지 +20°로 회전한 입사각으로 조명한다. 입사각에 대한 셀을 통해 투과된 빛의 강도의 플롯이 셀의 표면으로부터의 액정의 광축의 경사를 측정하는 데 사용된다.
실험 결과의 토론
생화학적 블로킹층의 마찰에 대한 안정성
전술한 바와 같이, 그럴 필요가 없지만 BSA와 같은 생화학적 블로킹 화합물은 바람직하게는 지지체에 공유적으로 고정된다. 고정되지 않은 생화학적 블로킹층을 갖는 기질 구조의 안정성을 조사하기 위해, 기질 구조를 깨끗한 유리 슬라이드 및 OTS와의 반응에 의해 변형된 소수성 슬라이드를 사용하여 제조한다. 이어서 BSA를 슬라이드의 표면에 물리적으로 흡착시킨 다음 도 2에 도시되어 있는 장치를 사용하여 마찰시킨다. 도 3에 나타나 있는 바와 같이, 타원편광측정 두께의 측정이 지지체가 깨끗한 유리 슬라이드든지 OTS로 처리된 슬라이드든지에 상관없이 물리적으로 흡착된 BSA의 50% 이상이 마찰시 손실된다는 것을 나타낸다. 또다른 한편, 도 3에 나타나 있는 바와 같이, 도 1에 도시되어 있는 개략도에 따라 제조된 기질 구조가 마찰되면 타원편광측정 두께의 약간의 변화가 관찰된다. 따라서, 도 1에 도시되어 있는 방법을 사용하는 생화학적 블로킹층의 고정이 생화학적 블로킹층의 마찰로 인한 두께의 감소를 극복하는 것으로 보여진다.
고정된 BSA의 마찰 필름에서 액정의 배향
다양한 광학셀의 광학적 텍스처를 조사하여 마찰이 광학셀로 드로잉되는 액정의 정착에 미치는 영향을 평가한다. 구체적으로 말하면, 도 1에 도시되어 있는 바와 같이 제조되는 고정된 BSA를 함유하는 유리 슬라이드 지지체 사이에 샌드위칭된 5CB의 간섭 편광판 사이에서의 광학적 텍스처를 관찰하여 사진으로 기록한다. 마찰 전에, BSA-고정된 층과 접촉하는 5CB의 광학적 텍스처는 균일하지 않다. 마찰 기질 구조를 사용하여 제조된 광학셀로 드로잉될 때 BSA-고정된 층의 마찰이 5CB의 균일 정착을 유도한다. 마찰 BSA층에서 액정의 방위각상 배향은 광 경로에 1/4 파길이판의 삽입시 간섭색의 변화에 의해 쉽게 측정된다(실험 단락의 상세한 설명 참조). 1/4 파길이판을 삽입한 후에 간섭색은 색을 더 큰 지연쪽으로 이동시키고, 이것은 액정의 정렬이 마찰 방향에 대해 평행하다는 것을 나타낸다.
표면에 지지된 5CB의 아웃-오브-플레인 배향(경사각) 또한 상기 분석에 이용한 것과 동일한 셀을 사용하여 측정한다. 셀을 결정체 회전 장치에 고정시킴으로써(실험 단락의 상세한 설명 참조), 마찰 BSA층을 함유하는 평면으로부터의 5CB의 광축의 경사각이 1.5 ±0.5°인 것으로 측정된다. 따라서, 이러한 측정치는 고정된 BSA의 마찰 필름이 마찰 방향에 대해 '평면'이고 '평행'한 5CB의 배향을 유도한다는 것을 보여준다.
빛 투과율을 사용하는 액정의 균일성 분석
광학셀이 회전할 때 발생하는 어두운 영상과 밝은 영상 사이의 빛 소멸은 감섭-편광판 사이에서 광학셀을 통해 투과한 빛에 의해 일어난다. 마찰 방향이 편광판 또는 분석기에 대해 평행일 때 관찰되는 어두운 영상은 액정이 균일하게 정착되었다는 것을 나타낸다. 각 광학셀을 통해 투과한 빛의 강도가 샘플이 간섭-편광판 사이에서 회전할 때 기록된다. 이 기술이 고정된 BSA의 마찰 필름에서 액정 정착의 균일성을 특징규명하는 데 사용된다(도 4에서). 부분 투과율 측정(실험 단락의 상세한 설명 참조)에서 나타난 것처럼 편광판에 대해 셀을 회전시키는 중에 간섭-편광판을 통해 투과하는 빛의 강도의 큰 변화가 마찰 고정된 BSA 기질 구조에서 액정의 균일 정착을 나타낸다. 또다른 한편, 액정의 불균일 정착을 보이는 비마찰 고정 BSA 기질(도 4에서)의 경우, 투과한 빛의 강도는 샘플의 회전각에 대해 독립적이다. 이것은 빛의 간섭-편광판 사이에서 마찰 고정 BSA 기질 구조로 제조된 광학셀의 회전 중에 측정되는 빛의 투과율의 큰 변화가 고정 BSA의 마찰 필름에서 5CB의 균일 정착으로부터 초래된다는 것을 다시 확인해준다.
마찰 필름의 이방성 및 단백질 흡착의 영향
전술한 바와 같이, 고정된 BSA의 마찰 필름은 액정이 마찰 기질 구조와 접촉하였을 때 5CB를 균일하게 정착시킨다. 단백질의 결합이 정렬층에서 이방성을 제거시키는 지를 평가하기 위한 실험이 수행되었다. 이 목적을 위해, BSA층을 갖지 않는 마찰 필름을 제조한다. 이것은 임의의 생화학적 블로킹 화합물을 가지지 않는 유리 슬라이드를 마찰시킴으로써, 그리고 전단-침착된 테플론 필름을 가지는 유리슬라이드를 사용함으로써 달성된다. 전단-침착된 필름을 가지는 유리 슬라이드는 액정의 균일 정착을 유도하는 것으로 알려져 있다. Dennis, J. R.; Vogel, V. J. J. App. Phys. 83 (1998) p. 5195. BSA는 대부분의 표면에 쉽게 흡착되기 때문에, BSA가 물리적 흡착에 의해 마찰 필름을 완전히 커버링할 것이라고 예견된다. 마찰 유리 슬라이드 및 전단-침착된 테플론 필름에서 액정이 BSA 용액에 침지되기 전에는 표면에 균일하게 정렬된 것이 관찰되었다. 그러나, 0.1 mg/㎖의 BSA 용액에 침지시킨 후에는 마찰 유리 슬라이드 및 전단-침착된 테플론층에 지지된 5CB의 네마틱 상태가 편광판에 대한 샘플의 일정 각에서 셀을 통해 투과한 빛을 소멸시키지 않는다. 달리 말하면, 텍스처가 완전히 불균일하고, 방위각상 배열의 바람직한 방향이 없다. 따라서, 마찰 유리 슬라이드 및 전단-침착된 테플론 필름 상에 BSA의 흡착에 의해 일어나는 형태의 변화가 표면의 이방성을 붕괴하고 액정의 불균일 정착을 초래한다. 따라서, 마찰 유리 슬라이드 및 전단-침착된 테플론 필름 상에 BSA의 흡착은 표면의 이방성을 붕괴하고 액정의 불균일 정착을 초래한다. 이에 따라, 단백질 흡착에서 선택성을 가지는 정렬 또는 생화학적 블로킹층이 액정 분석 장치에 사용하기 위한 기질 구조로서 적당할 것이라고 결론내릴 수 있다. 이러한 결과는 또한 깨끗한 유리 또는 테플론 필름이 비특이적 단백질 흡착을 저지하지 않기 때문에, 비특이적 단백질 흡착을 저지하는 생화학적 블로킹층이 액정 분석 장치에 필요하다는 것을 보여준다.
BSA층에서 단백질의 비특이적 흡착
전술한 바와 같이, 생화학적 블로킹층은 이것이 효과적이라면 단백질의 비특이적 흡착을 효과적으로 저지해야 한다. 마찰 필름을 BSA 10 mg/㎖를 함유하는 수용액에 침지시킨 후에 고정된 BSA의 마찰 필름에 지지된 액정의 광학적 텍스처를 관찰하고 사진으로 기록한다. 침지시키지 않은 BSA의 마찰 필름에서의 액정 양상과 비교하면, 액정의 광학적 양상은 BSA 용액에의 BSA의 마찰 필름의 침지에 의해 거의 변하지 않는다. 이 결과는 BSA의 수용액에 침지시킨 후 테플론의 마찰 필름 및 마찰 유리에서의 액정의 광학적 양상과 대조된다. 마찰 및 비마찰 BSA 필름의 타원편광측정 두께를 BSA 용액에 침지시킨 후에 측정한다(도 5). 도 5의 검토가 BSA의 공유적으로 고정된 필름(비마찰)이 BSA를 함유하는 수용액에 침지되어 이로부터 취해지면 측정 가능한 양의 BSA를 흡착하지 않는다는 것을 나타낸다. 반대로, 마찰시, BSA의 공유적으로 고정된 층은 대략 15 Å의 BSA를 흡착한다. 따라서, BSA의 비특이적 흡착 수준이 마찰되지 않은 BSA 필름과 비교하여 BSA의 마찰 필름에서 더 높은 것으로 결론내려진다. 그러나, 마찰 필름에서 BSA의 비특이적 흡착 수준은 액정의 균일 정착을 붕괴하기에는 불충분하다. 하기에 나타나 있는 것처럼, 이 결과는 BSA의 마찰 필름에서 항-BSA IgG의 특이적 결합의 영향과 대조된다. 이 경우에, 항-BSA IgG의 특이적 결합은 BSA의 마찰 필름에서 액정의 불균일 정착을 유도하는 것으로 관찰된다.
피브리노겐 및 리소자임을 함유하는 수용액에 침지시켜 취한 BSA의 마찰 필름에 정착된 5CB의 광학적 양상 또한 조사되었다. BSA 마찰 필름의 리소자임에의 침지가 관찰하여 사진으로 기록한 것처럼 액정의 균일 정착을 초래하지만, 다수의 결점(루프 회위)이 피브리노겐에 침지된 마찰 BSA의 필름에 지지된 액정의 광학적텍스처에 나타난다. 결점이 피브리노겐에 침지된 마찰 BSA의 필름에 지지된 액정의 광학적 양상에서 분명히 나타나지만, 대부분의 액정이 균일하게 배향된 상태라는 것을 주목해야 한다. 하기에 나타나 있는 것처럼, 균일성의 수준(부분 투과율의 측정)이 정량화되고 항-BSA IgG의 마찰 필름에의 특이적 결합이 일어나는 경우의 액정 양상과 구분된다는 것을 보여준다. 피브리노겐에 침지시킨 후에 마찰 필름에 지지된 액정의 광학적 텍스처의 작은 결점 때문에 BSA 및 피브리노겐의 수용액에 마찰 필름을 침지시킨 후에 액정의 광학적 양상이 서로 상이하지만, 비특이적으로 흡착된 BSA와 피브리노겐의 타원편광측정 두께 측정이 매우 유사한 수준의 흡착을 보여준다(도 5). 이 결과는 액정이 타원편광측정 방법에 의해 특징규명될 때 구분할 수 없는 흡착된 단백질층 간에 구분될 수 있다는 것을 보여준다. 피브리노겐의 비특이적 흡착(대략 15 Å)이 추가로 고정된 BSA의 필름에서 측정되고, 필름이 마찰되었는지 그렇지 않은지에 상관없는 것으로 밝혀졌다.
액정의 경사각 또한 BSA의 마찰 필름에의 BSA 및 피브리노겐의 비특이적 흡착 후에 측정된다. 측정된 경사각은 BSA 및 피브리노겐의 경우 각각 3.8 ±0.8°및 3.5 ±0.5°이었다. 전술한 바와 같이, 액정의 경사는 BSA 또는 피브리노겐 수용액에 BSA의 마찰 필름을 침지시키기 전에 1.5°±0.5이었다. 이 결과는 비특이적 흡착이 액정 경사의 변화(2도 이하)를 약간 일으킨다는 것을 설명한다. 따라서, 고정된 BSA의 마찰 필름이 BSA의 마찰 방향과 평행한 방향으로 5CB의 균일한 평면 배향을 거의 유지하는 수준으로 단백질의 비특이적 흡착을 저지한다고 결론내릴 수 있다.
마찰 BSA층에서 단백질의 특이적 결합
액정 분석 장치에 사용하기에 적당하기 위해서, 블로킹층은 샘플에서 검출될 표적 종과의 특이적 결합에 의해 제거되는 이방성 구조를 지녀야 한다. 고정된 BSA의 마찰 필름을 2시간 동안 PBS-완충된 100 nM의 각종 항체에 침지시킨다. 항-BSA 용액에 침지시킨 후에, 마찰 고정된 BSA를 함유하는 광학셀의 텍스처는 거의 불균일한 텍스처를 가진다. 따라서, 마찰 기질 구조에서 BSA 블로킹층에 의한 항-BSA의 결합은 마찰면의 이방성을 제거한다. 이와 달리, 마찰 고정 BSA 기질 구조의 항-FITC 및 항-스트렙타비딘과 같은 항체 용액에의 침지는 마찰 기질이 BSA 수용액에 있을 때 얻어지는 결과와 유사한 균일한 텍스처를 전혀 변화시키지 않는다. 도 5에 나타나 있는 것처럼, 타원편광측정 두께의 측정은 항-BSA에 의한 특이적 결합과 특이적 결합에 의한 불균일 텍스처의 변화를 분명히 나타낸다. BSA, 피브리노겐 및 항-FITC 용액에의 침지와 비교하여, 항-BSA 용액에의 침지로부터 초래되는 특이적 결합은 두께의 현저한 증가(40 Å 이상)를 초래한다. 이것은 BSA 및 피브리노겐에의 침지로부터의 광학셀이 실질적으로 고농도의 단백질을 사용할 때도 마찬가지이다. 아울러, 두께 증가가 마찰과 상관없기 때문에, 항원-항체 반응의 경우 BSA의 결합 부위는 마찰에 의해 손상되지 않는다는 것이 추론된다. 따라서, BSA의 마찰 필름이 비특이적 흡착을 저지하고 이방성이 특이적 결합에 의해 제거되는 표면을 제공한다는 것이 밝혀졌다.
특이적 및 비특이적 흡착의 투과율 분석
전술한 다양한 용액에 침지시킨 후에 마찰 고정 BSA 기질 구조의 투과율 분석이 마찰 기질 구조에 의한 특이적 및 비특이적 결합 간의 정량적 비교를 위해 수행된다. 도 6은 항-BSA와의 특이적 결합이 셀의 회전에 의한 소멸과 마찰 BSA층의 주기적 투과율 성질을 제거한다는 것을 보여준다. 표 2는 침지 실험을 통해 각 단백질 흡착의 최고(IMax) 및 최소(IMin) 값의 부분 강도를 요약하고 특이적 및 비특이적 흡착 간의 비교를 위해 더욱 유용한 최고 및 최소 투과율 사이의 소멸차([IMax-IMin]/IMax)를 표준화한다. 항-BSA와의 특이적 결합의 [IMax-IMin]/IMax가 약 0.33으로 측정되었다. 따라서, 특이적 결합시 현저한 감소가 일어난다. 이것은 고정 BSA의 마찰 필름의 [IMax-IMin]/IMax값이 약 0.94라는 것을 고려하면 특히 사실이다. 비특이적 흡착의 경우에도, 표준화된 부분 투과율 값은 피브리노겐과의 흡착일 경우를 제외하고는 0.90 이상이다. 피브리노겐 흡착의 [IMax-IMin]/IMax가 다른 비특이적 흡착과 비교하여 비교적 작지만(약 0.84), 이 값은 항-BSA와의 특이적 흡착과 같은 특이적 흡착보다는 비특이적 흡착에 더 근접한다. 또한, 도 6에 나타나 있는 바와 같이, 피브리노겐에 침지된 마찰 고정 BSA 기질 표면의 빛 투과율의 주기적인 성질이 분명히 계속되고 항-BSA 용액에의 침지로부터 초래되는 특이적 결합의 빛 투과율과 분명히 상이하다. 따라서, 광학적 텍스처 및 타원편광측정 두께에 의한 관찰과 함께, 투과율 측정으로부터 수집되는 결과가 마찰 고정 BSA 기질 구조가 액정을 균일하게 정착시키고, 비특이적 흡착을 저지하며, 특이적 결합에 의해 제거될 수 있는 이방성 구조를 지닌다는 것을 나타낸다.
단백질 흡착에 의한 액정셀의 부분 투과율a
단백질(농도) 부분 투과율 I Max -I Min d IMax
IMax bIMin c
참조e 0.63 ±0.02 0.03 ±0.01 0.94 ±0.01
BSA(10 mg/㎖) 0.61 ±0.02 0.05 ±0.01 0.91 ±0.02
피브리노겐(0.2 mg/㎖) 0.58 ±0.05 0.09 ±0.02 0.84 ±0.02
리소자임(0.2 mg/㎖) 0.49 ±0.02 0.02 ±0.01 0.94 ±0.01
항-BSA(100 nM) 0.34 ±0.04 0.23 ±0.02 0.33 ±0.04
항-FITC(100 nM) 0.58 ±0.06 0.01 ±0.01 0.96 ±0.01
항-스트렙타비딘(100 nM) 0.57 ±0.01 0.03 ±0.01 0.94 ±0.01
a부분 투과율은 간섭-편광과 2시간 동안 단백질 용액에 침지시킨 후의 BSA 마찰 필름에 정착된 5CB 사이에서 측정된다.b부분 투과율의 최고값(IMax)은 편광판과 광학셀의 마찰 방향의 사이각이 45°, 135°, 225° 및 315°일 때 측정된다.c최소값(IMin)은 이 각이 0°, 90°, 180° 및 270°일 때 측정된다.d[IMax-IMin]/IMax값은 (0°, 45°), (90°, 135°), (180°, 225°) 및 (270°, 315°)에서의 페어링 부분 투과율로부터 계산된다.e참조는 단백질 흡착 전에 고정된 BSA의 마찰 필름을 나타낸다.
비오틴-BSA의 마찰 필름
마찰 및 비마찰 비오틴-BSA 기질로부터 제조된 광학셀에서 5CB의 광학적 텍스처의 변화를 전술한 바와 같이 관찰하고 사진을 찍는다. 간섭 편광판 사이에서 회전시키면, 5CB의 불균일 정착을 나타내는 광학적 텍스처의 약간의 변화(변화가 일어난다면)가 마찰되지 않은 비오틴-BSA의 필름에서 관찰된다. 반대로, 마찰 필름 사이에 정착된 5CB의 광학적 양상은 간섭 편광판 사이에서 셀을 회전시킴으로써 어두움과 밝음 사이에서 변화하는 것으로 관찰되었다. 이러한 차이점은 도 7에 그래프로 도해되어 있다. 도 4와 도 7의 비교가 액정을 균일하게 정착시키는 능력면에서 마찰 및 비마찰 비오틴-BSA 기질로부터 제조된 광학셀이 마찰 및 비마찰 BSA 기질로부터 제조된 것들과 유사하게 행동한다는 것을 보여준다. BSA 기질로부터 제조된 광학셀의 경우와 마찬가지로, 액정은 네마틱 상태의 광축이 비오틴 처리된 BSA로부터 제조된 광학셀의 편광판 또는 분석장치와 함께 정렬되면 어둡게 보인다. 마찰 방향(즉, 5CB의 네마틱 상태의 광축)이 편광판 또는 분석장치에 대해 평행하게 정렬되면, 입사광의 편광은 셀을 통한 투과에 의해 변하지 않는다. 따라서, 액정의 광학적 양상은 간섭 편광판을 통해 봤을 때 균일하게 어둡다. 그러나, 셀의 회전이 광의 편광을 변화시킴으로써 입사광을 간섭 편광판을 통해 투과시키고, 투과된 빛의 강도는 편광판에 대해 마찰 방향의 45°회전에서 최고에 도달한다. 도 7은 셀의 회전각의 함수로서 비오틴-BSA 필름의 평균 휘도 경향을 요약하였다. 도 7에 나타나 있는 바와 같이, 마찰 전에 샘플은 셀이 회전할 때 어떤 변화도 보이지 않았지만, 마찰 샘플에서는 뚜렷한 주기적이고 큰 변화가 관찰되었다. 최고 휘도는 45°, 135°, 225° 및 315°에서 관찰되고 최소 휘도는 0°, 90°, 180° 및 270°에서 관찰된다.
비오틴-BSA의 마찰 필름에 결합한 항-비오틴 IgG에 의한 액정의 광학적 텍스처
초기에, 표준 마찰 조건(약 2.1 mm/초의 마찰 속도 및 약 1,000 Pa의 적용 압력으로 1분간 마찰)이 화학적으로 고정된 비오틴-BSA 기질을 평가하는 데 사용된다. 이러한 조건하에서 마찰 비오틴-BSA 기질로부터 제조된 광학셀의 광학적 텍스처는 기질이 침지된 용액중 항-비오틴 IgG의 농도에 좌우된다는 것이 밝혀졌다. 액정의 광학적 양상은 분석 용액중 항-비오틴 IgG의 농도가 증가할수록 더욱 복잡해지고 불균일이 된다. 저농도에서, 균일한 정렬이 빛의 산란을 일으키는 회위 라인의 출현에 의해 처음 관찰된다. 회위 루프 수가 농도와 함께 증가하지만, 샘플의 회전은 여전히 광학셀을 통해 투과된 빛의 강도의 꽤 큰 변화를 초래한다. 항-비오틴 IgG의 농도가 추가로 증가하면, 매우 불균일한 텍스처의 지지된 액정의 양상이 최종적으로 이러한 샘플의 회전이 셀을 통해 투과된 빛의 강도의 측정 가능한 변화를 거의 일으키지 않을 때까지 관찰된다. 매우 불균일한 액정의 양상이 5CB의 네마틱 상태가 이러한 필름에서 바람직한 방위각상 배향 없이 정착된다는 것을 나타낸다.
용액중 항-비오틴 IgG의 결합에 대한 광학적 텍스처의 감수성이 조사된다. 자세히 설명하면, 비오틴-BSA의 필름을 상이한 조건하에서 마찰시켜 마찰 조건이 감수성에 미치는 어떤 규칙(있다면)을 발견한다. IgG의 검출에서 감수성의 조절이 중요하다. 검출 감수성이 변화될 수 있으면, 생물학적 정량 적용에서 검출 범위의 유동성이 제공될 수 있다. 첫째, 적용되는 압력은 다른 마찰 파라미터의 변화 없이 1,000에서 250 Pa로 감소한다. 비오틴-BSA 기질을 가벼운 질량으로 마찰시킨 결과는 5CB의 균일 정착이 저농도의 항-비오틴 IgG에서 제거된다는 것이다. 예를 들면, 저압(약 250 Pa)에서 마찰된 비오틴-BSA 기질은 20 nM의 농도에서 항-비오틴 IgG 용액에 노출될 때 매우 불균일한 텍스처를 보인다. 이와 달리, 5CB의 균일 정렬은약 1,000 Pa의 압력을 제외하고 동일한 조건하에서 마찰된 유사한 기질이 28 nM의 농도에서 항-비오틴 IgG 용액에 인큐베이팅되었을 때 유지된다. 따라서, 검출 시스템과 마찰 기질로부터 제조된 광학셀의 감수성은 마찰 압력을 감소시킴으로써 증가할 수 있다. 다른 마찰 조건의 변화도 마찬가지로 감수성을 변화시키는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 250 Pa의 적용되는 마찰 압력을 사용하여 마찰 시간을 60초에서 24초로 단축하는 것은 감수성을 훨씬 더 증가시킨다. 이러한 결과는 마찰 필름의 감수성이 마찰 조건을 간단히 변화시킴으로써 조절될 수 있다는 것을 설명한다. 대조 실험으로서, 비오틴-BSA의 마찰 필름을 3 가지 마찰 조건을 사용하여 제조한다. 이들 실험에서 마찰 속도, 길이 및 압력은 대략 2.1 mm/초, 127 mm 및 1,000 Pa; 2.1 mm/초, 127 mm 및 250 Pa; 및 2.1 mm/초, 51 mm 및 250 Pa이다. 이러한 조건을 사용하여 제조된 마찰 비오틴-BSA 기질을 임의의 항-비오틴 IgG를 함유하지 않는 PBS 완충 용액에 인큐베이팅한다. 마찰은 5CB의 광학적 텍스처를 균일하게 하고(특색없음), 마찰 기질로부터 제조된 광학셀을 분별하기가 어렵게 한다. 일부 회위 루프의 출현이 마찰 압력 및 길이가 감소한 마찰 기질로부터 제조된 광학셀에서 관찰되지만, 광학적 텍스처는 이들이 항-비오틴 IgG의 특이적 결합으로부터 초래되는 불균일성을 갖는 광학셀로부터 구분될 수 있도록 하기에 충분한 균일 정착을 유지한다. 이것은 감수성이 의양성 시험 결과를 제공하지 않으면서 증가할 수 있다는 것을 나타낸다.
항-비오틴 IgG의 결합에 의해 유도되는 5CB의 광학적 양상의 정량적 분석
일정 농도의 항-BSA 면역글로불린에 노출시 비오틴-BSA의 마찰 기질로부터형성된 광학셀의 광학적 양상의 변화가 전술한 방법을 사용하여 광학적 텍스처의 평균 휘도를 측정함으로써 정량화된다. 보정되고 표준화된 광출력이 하기 수학식으로 표시될 수 있다:
수학식 1
상기 식에서,
S는 셀을 회전시킴으로써 얻어지는 어두운 영상과 밝은 영상 사이의 최고 휘도 비이고(LMin/LMax),
LMin은 마찰 방향이 간섭 편광판 사이에서 편광판에 대해 평행일 때 텍스처의 평균 휘도이며,
LMax는 마찰 방향이 편광판에 대해 45°회전하였을 때 수집되며,
SMax및 SMin은 마찰 전후에 비오틴-BSA의 필름을 사용하여 수집된다.
휘도비(S) 및 참조 셀을 사용하여 표준화된 광출력이 다양한 양의 항-비오틴 IgG를 갖는 용액에 인큐베이팅시 초래되는 불균일 정도에 대한 정량적 정도를 제공한다. 점 대 점 또는 샘플 대 샘플로부터 발견되는 편차 정도 또한 최소화될 수 있다. 도 8은 면역글로불린 농도의 함수로서 항-비오틴 IgG의 특이적 결합 후에 비오틴-BSA의 마찰 필름에 지지된 액정의 영상으로부터 수집되는 표준화된 광출력을 보여준다. 도 8은 마찰 강도와 길이의 감소가 액정의 균일 및 불균일 정착 사이의 한계를 더 낮은 농도의 면역글로불린으로 이동시킨다는 것을 보여준다. 광출력을 사용하는 불균일한 특징의 더욱 자세한 관찰이 후술되는 것처럼 마찰 필름에 결합된 항-비오틴 IgG의 양을 측정함으로써 수행될 수 있다.
비오틴-BSA의 마찰 필름에 결합된 항-비오틴 IgG
마찰 비오틴-BSA층에 특이적으로 결합된 항-비오틴 IgG의 양을 측정하기 위해, 실리콘 웨이퍼에 고정된 비오틴-BSA의 마찰 필름에 결합된 IgG로 인한 두께의 증가를 전술한 바와 같은 타원편광측정 두께 측정 기술을 사용하여 측정한다(도 9). 도 9는 항-비오틴 IgG의 결합으로 인한 두께의 증가가 상이한 마찰 조건에도 불구하고 각 기질의 경우 거의 동일하다는 것을 보여준다. 이것은 앞서 언급하였고 도 8에 도해되어 있는 것처럼 표준화된 광출력이 마찰 조건의 변화에 의해 상당한 영향을 받아도 마찬가지이다. 도 9에 나타나 있는 것처럼, 결합된 항-비오틴 IgG의 두께는 서서히 증가하고 약 10 nm에서 포화에 도달한다. 일반적으로 4 nm ×10 nm ×14 nm로 측정되는 IgG의 크기를 고려하면, 약 10 nm의 포화 두께 증가는 표면이 포화 상태로 항-비오틴 IgG에 의해 거의 완전히 커버링된다는 것을 나타낸다.
전술하였고 도 8에 나타나 있는 것처럼, 광학적 텍스처 및 표준화된 광출력 측정이 액정의 균일 정착을 제거하는 양으로 항-비오틴 IgG의 농도를 제공한다. 또한 앞서 언급하였고 도 9에 나타나 있는 것처럼, 결합된 항-비오틴 IgG의 두께 측정은 결합 IgG에 의해 5CB의 균일 정착을 유지하거나 제거하는 수준으로 한계량을 제공한다. 이에 따라 도 8 및 9의 검토가 마찰 필름에 정착된 액정의 배향 성질을 변화시키기 위해 필요한 결합 항-비오틴 IgG의 양을 보여준다. 도 10은 비오틴-BSA마찰 기질 표면에서 비오틴과의 특이적 결합으로 인한 결합 항-비오틴 IgG의 양이 마찰 기질에서 액정의 불균일 정착 증가를 유도한다는 것을 설명한다. 표준 마찰 조건(2.1 mm/초, 127 mm(1분의 마찰 시간) 및 대략 1,000 Pa의 마찰 압력(대략 200 그램의 질량 및 2.54 cm ×7.62 cm의 치수를 갖는 알루미늄 블록))에서, 광출력의 뜻밖의 변화가 결합 항-비오틴 IgG 약 5 nm에서 관찰된다. 마찰 강도의 감소는 한계점을 더 낮은 수준의 결합 항-비오틴 IgG로 이동시킨다. 마찰 압력이 250 Pa로 감소하면, 한계 두께는 결합 항-비오틴 IgG 약 4 nm로 이동한다. 마찰 압력의 1,000 Pa에서 약 250 Pa로의 감소 및 마찰 시간의 60초에서 24초로의 감소는 모두 결합 항-비오틴 IgG의 한계량을 약 5 nm에서 2 nm 미만으로 이동시킨다. 따라서, 결합 단백질에 의한 액정의 광출력에서 감수성 조절은 간단히 마찰 조건을 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 따라서, 마찰 기질은 표적 종의 다양한 농도에서 정량적 및 정성적 용도를 위해 제조될 수 있다.
마찰 조건 변화에 의한 광 반응의 감수성
마찰 조건 측면에서 액정 정렬의 특성이 체계적인 접근법을 사용하여 시험된다. 이를 수행하기 위해, 마찰 속도, 마찰 압력 및 마찰 길이(즉, 마찰 시간)를 다시 변화시킨다. 전술한 표준 마찰 조건이 참조로 사용된다. 일정 시점에서 일 마찰 파라미터를 감수성 및 두께에 미치는 영향이 독립적으로 관찰될 수 있도록 변화시킨다. 마찰 조건이 도 11 및 12에 나타나 있는 범위에 걸쳐서 변화되면, 마찰은 5CB에 노출시(표적 분석물질과 함께 인큐베이팅 전) 매우 균일한 텍스처를 제공하는 기질을 생산한다. 아울러, 도 4 및 7에 나타나 있는 것과 유사하게 셀을 회전시키면 큰 변화가 관찰된다. 마찰 조건의 함수로서 항-비오틴 IgG의 특이적 결합에 의한 표준화된 광출력을 관찰하기 위해, 마찰 기질을 표준 조건하에서 마찰된 기질 광출력의 중간 상태를 보여주는 20 nM의 농도에서 항-비오틴 IgG의 용액에 인큐베이팅한다. 이것은 특이적으로 시험될 마찰 조건을 변화시킴으로써 광 영상의 변화를 가능하게 한다.
도 11은 두께 증가 및 표준화된 광출력에 의해 나타나는 것처럼 결합 항-비오틴 IgG의 양이 마찰 중에 적용되는 압력의 함수로서 20 nM의 농도에서 항-비오틴 IgG의 용액에 인큐베이팅된 후에 어떻게 변하는지를 보여준다. 도 12는 마찰 길이가 동일한 파라미터에 어떻게 영향을 미치는 지를 보여준다. 표준 마찰 조건이 사용되면, 20 nM의 항-비오틴 IgG 용액에의 비오틴-BSA의 마찰 필름의 인큐베이팅이 약 4 nm의 결합 IgG(도 9), 약간의 회위 루프 출현 및 약 0.2의 표준화된 광출력(도 8)을 초래한다. 도 11 및 12에 나타나 있는 것처럼, 항-비오틴 IgG 용액에 인큐베이팅한 후에 검출 불가능한 두께의 변화가 마찰 중에 사용되는 압력 또는 마찰 길이를 변화시킨 결과로 일어난다. 그러나, 광출력은 마찰 기질을 제조하는 데 사용되는 마찰 조건에 의해 상당한 영향을 받는다. 따라서, 마찰 공정 중에 적용되는 압력은 마찰 기질로부터 제조되는 광학셀의 감수성을 변화시키는 데 사용될 수 있다. 도 12는 마찰 길이가 두께에는 영향을 미치지 않으면서 마찰 길이의 좁은 범위에 걸쳐서 광학적 양상에 상당한 영향을 미친다는 것을 보여준다. 마찰 길이의 감소는 광학적 텍스처의 불균일성을 증가시키고, 완전히 불균일한 특징은 2.54 mm의 마찰 길이에서 달성된다. 마찰 길이의 증가는 마찰 필름이 5CB의 불균일 정착을 저지하게 한다. 따라서, 마찰 길이가 약 508 mm까지 증가하면, 항-비오틴 IgG와 함께 인큐베이팅된 마찰 필름의 광학적 양상은 완전히 균일한 텍스처를 보이고 이의 표준화된 광출력은 거의 0이다. 이것은 20 nM의 항-비오틴 IgG 용액에서의 인큐베이팅이 마찰 기질의 광학적 텍스처에 거의 변화를 일으키지 않는다는 것을 의미한다. 두께 증가 및 표준화된 출력에 미치는 마찰 속도의 영향 또한 시험되었다. 그러나, 마찰 속도의 함수로서 광출력의 변화는 거의 관찰되지 않았다. 이들 결과는 마찰 압력 및 마찰 길이가 마찰 기질을 사용하여 제조된 광학셀의 감수성을 조절하고 변형시키는 데 사용될 수 있는 매우 효과적인 파라미터임을 설명한다.
상기의 결과를 근거로, 비오틴-BSA의 마찰 필름에서 액정 광출력의 영상 분석이 마찰 비오틴-BSA 기질의 표면에 결합된 항-비오틴 IgG의 양을 정량적으로 측정하는 데 사용될 수 있다. 아울러, 이러한 기질은 항-비오틴 IgG로 설명되는 것처럼 샘플에서 이러한 기질의 존재 및 양을 측정하는 데 사용될 수 있다. 추가로, 광출력의 감수성은 마찰 기질을 제조하는 데 사용되는 마찰 조건을 변화시킴으로써 쉽게 조절될 수 있다. 따라서, 마찰 기질은 액정과 함꼐 사용될 때 특이적 생체분자 상호반응을 영상화하는 데 유용하다.
항체를 갖는 마찰 기질의 제조
앞서 언급하였듯이, 다양한 절차가 생체분자 인식 물질로서 항체를 함유하는 마찰 기질을 제조하는 데 사용될 수 있다. 6 가지의 이러한 절차의 요약이 하기와 같다:
절차 1
1. 활성화된 유리를 항체 수용액에 침지시킴으로써 DSS 활성화된 유리 슬라이드를 사용하여 현미경 유리 슬라이드의 표면에 항체를 공유적으로 고정시키고,
2. 변형된 차트 리코더를 사용하여 고정된 항체를 함유하는 슬라이드의 표면을 기계적으로 마찰시킨 다음,
3. 이것을 10 mg/㎖의 BSA 수용액에 1시간 동안 침지시킴으로써 마찰 단백질 필름을 블로킹한다.
절차 2
1. 활성화된 유리를 항체 수용액에 침지시킴으로써 DSS 활성화된 유리 슬라이드를 사용하여 현미경 유리 슬라이드의 표면에 항체를 공유적으로 고정시키고,
2. 이것을 10 mg/㎖의 BSA 수용액에 1시간 동안 침지시킴으로써 기질을 블로킹하며,
3. 변형된 차트 리코더를 사용하여 고정된 항체/BSA 표면을 기계적으로 마찰시킨 다음,
4. 이것을 10 mg/㎖의 BSA 수용액에 1시간 동안 침지시킴으로써 마찰 단백질 필름을 블로킹한다.
절차 3
1. 활성화된 유리 슬라이드를 단백질 수용액에 침지시킴으로써 DSS 활성화된 현미경 유리에 단백질을 공유적으로 고정시키고,
2. 기질을 항체 수용액에 침지시킴으로써 고정된 단백질에 대해 특이적인 항체를 고정된 단백질에 결합시키며,
3. 변형된 차트 리코더를 사용하여 고정된 항체 및 단백질을 함유하는 기질의 표면을 기계적으로 마찰시킨 다음,
4. 이것을 10 mg/㎖의 BSA 수용액에 1시간 동안 침지시킴으로써 기질 상의 마찰 단백질 표면을 블로킹한다.
절차 4
1. 활성화된 현미경 유리 슬라이드를 단백질 수용액에 침지시킴으로써 DSS 활성화된 현미경 유리에 단백질을 공유적으로 고정시키고,
2. 변형된 차트 리코더를 사용하여 고정된 단백질을 함유하는 표면을 기계적으로 마찰시키며,
3. 슬라이드를 항체 수용액에 침지시킴으로써 고정된 단백질에 대해 특이적인 항체를 고정된 단백질에 결합시킨 다음,
4. 이것을 10 mg/㎖의 BSA 수용액에 1시간 동안 침지시킴으로써 마찰 단백질 필름을 블로킹한다.
절차 5
1. 슬라이드를 BSA 수용액에 침지시킴으로써 DSS 활성화된 현미경 유리 슬라이드에 BSA를 공유적으로 고정시키고,
2. 변형된 차트 리코더를 사용하여 고정된 BSA의 표면을 기계적으로 마찰시키며,
3. 표면을 재활성화시키기 위해 DSS를 사용하여 고정된 BSA에 항체를 공유적으로 고정시킨 다음,
4. 이것을 10 mg/㎖의 BSA 수용액에 1시간 동안 침지시킴으로써 마찰 기질의 표면을 블로킹한다.
절차 6
1. 슬라이드를 BSA를 함유하는 수용액에 침지시킴으로써 DSS 활성화된 현미경 유리 슬라이드에 BSA를 공유적으로 고정시키고,
2. 표면을 재활성화시키기 위해 DSS를 사용하여 고정된 BSA 표면에 항체를 공유적으로 고정시키며,
3. 변형된 차트 리코더를 사용하여 고정된 항체 및 BSA를 함유하는 표면을 기계적으로 마찰시킨 다음,
4. 이것을 10 mg/㎖의 BSA 수용액에 1시간 동안 침지시킴으로써 마찰 기질 표면을 블로킹한다.
니트릴로트리아세테이트/Ni +2 를 갖는 마찰 단백질 기질의 제조
니트릴로트리아세테이트(NTA)/Ni+2를 갖는 마찰 기질을 제조하기 위해 여러가지 절차가 사용될 수 있다. 이러한 마찰 기질은 히스티딘 융합 단백질을 검출하는 데 유용하다.
첫번째 절차에서, 슬라이드를 10 mg/㎖의 NTS-작용기 처리된 BSA를 함유하는 용액에 1시간 동안 침지시킴으로써 DSS를 사용하여 NTA-작용기 처리된 BSA를 현미경 유리 슬라이드에 공유적으로 고정시킨다. 이어서 슬라이드를 건조시키고 전술한 바와 같은 변형된 차트 리코더를 사용하여 기계적으로 마찰시킨다. 이어서 NTS-BSA 필름을 Ni+2를 포함하는 수용액에 침지시켜 착체를 형성한다.
두번째 절차에서, 슬라이드를 10 mg/㎖의 BSA 용액에 1시간 동안 침지시킴으로써 BSA를 현미경 유리 슬라이드의 표면에 공유적으로 1차 고정시킨다. 이어서 슬라이드의 표면을 변형된 스트립 차트 리코더를 사용하여 마찰시킨다. 이어서 마찰면을 DSS로 활성화시키고, 활성화된 표면을 Qiagen으로부터 입수 가능한 아미노-말단 NTA와 같은 NTA-리간드와 함께 약 1 mM의 농도로 NTA-리간드 용액을 사용하여 약 6시간 동안 인큐베이팅한다. 이어서 생성된 기질을 10 mg/㎖의 BSA 용액에 1시간 동안 침지시켜 표면을 블로킹한다. 이어서 생성된 기질을 약 10 mM의 농도로 Ni+2를 함유하는 수용액에 3시간 동안 침지시킨다.
세번째 절차에서, 슬라이드를 약 10 mg/㎖의 BSA를 함유하는 수용액에 1시간 동안 침지시킴으로써 BSA를 유리 슬라이드의 표면에 공유적으로 1차 고정시킨다. 이어서, BSA-코팅된 기질의 표면을 전술한 바와 같이 DSS를 사용하여 활성화시킨다. 이어서 활성화된 BSA-코팅 기질을 1 mM의 NTA-리간드 용액에 약 6시간 동안 인큐베이팅한다. 이어서, 기질을 10 mg/㎖의 BSA 수용액에 침지시켜 표면을 블로킹한다. 표면을 블로킹한 후에, 기질을 약 10 mM 농도의 Ni+2를 갖는 수용액에 약 3시간 동안 침지시킨다. 최종적으로, 생성된 기질의 표면을 전술한 절차를 사용하여 기계적으로 마찰시킨다.
당업자는 본 발명의 마찰 기질이 다양한 표적 종을 검출하는 데 사용될 수 있고 다양한 생체분자 인식 물질이 마찰 기질에 사용될 수 있다는 것을 곧 감지할 것이다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 생체분자 인식 물질 및 표적 종의 일부 비-제한 리스트는 하기와 같다:
생체분자 인식 물질 표적 종
항-Ras IgG Ras
RAF1의 히스티딘 융합 활성화된 Ras
RAF1 활성화된 Ras
RAF1의 GST 융합 활성화된 Ras
시알산 인플루엔자 바이러스
항-활성 p38, pAb, 토끼(pTGpY) p38
항-pT183 MAPK pAb, 토끼 MAPK
항-활성 MAPK, pAb, 토끼, (pTEpY) 활성화된 MAPK
항-ERK 1/2 pAb, 토끼 ERK
항-활성 JNK pAb, 토끼, (pTPpY) 활성화된 JNK
항-활성 CaM KII pAb, 토끼, (pT286) 활성화된 CaM KII
항-pS473 Akt, pAb Akt
항-포스포티로신 pAb 포스포티로신
당나귀 항-토끼 IgG 토끼 IgG
만노스 콘카발린 A
항-C형 간염 IgG C형 간염 바이러스
항-B형 간염 IgG B형 간염 바이러스
항-활성 p38 pAb 활성화된 p38
항-CNP mAb CNP
항-GBP pAb GBP
항-인간 BDNF pAb BDNF
항-인간 GDNF pAb GDNF
항-인간 NT-3 pAb NT-3
항-인간 NT-4 pAb NT-4
항-인간 p75 pAb p75
항-인간 트립타제 mAb 트립타제
항-NGF mAb NGF
항-Pan Trk pAb Trk
항-토끼 CNTF pAb CNTF
항-TrkB In pAb TrkB
항-TGF-b1 pAb TGF-b1
항-VACht pAb VACht
항-GFP 녹색 형광 단백질
NTA-Ni 히스티틴 융합 단백질
글루타티온 GST 융합 단백질본 발명의 예시적인 구체예가 하기에 명기된다.(0001)(a) 생화학 물질을 포함하는 생화학적 블로킹층;(b) 제 1 말단과 제 2 말단을 포함하는 이기능성 스페이서 화합물;(c) 제 1 말단과 제 2 말단을 포함하는 표면 변형 화합물; 및(d) 생화학적 블로킹층을 함유하는 적어도 일면을 포함하는 지지체를 포함하는 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조에 있어서, 생화학 물질 중 적어도 하나가 제 1 화학반응 전의 생화학 물질에 대한 반응기와 제 1 화학반응 전의 이기능성 스페이서 화합물의 제 1 말단에 대한 반응기 간의 제 1 화학반응을 통해 이기능성 스페이서 화합물의 제 1 말단과 공유결합하고; 표면 변형 화합물이 제 2 화학반응 전의 표면 변형 화합물의 제 1 말단에 대한 반응기와 제 2 화학반응 전의 이기능성 스페이서 화합물의 제 2 말단에 대한 반응기 간의 제 2 화학반응을 통해 이기능성 스페이서 화합물의 제 2 말단과 공유결합하며; 표면 변형 화합물이 제 3 화학반응 전의 표면에 대한 반응기와 제 3 화학반응 전의 표면 변형 화합물의 제 2 말단에 대한 반응기 간의 제 3 화학반응을 통해 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면과 공유결합하며; 추가로 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면이 액정이 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면과 접촉하였을 때 액정의 균일 정착을 유도하는 특징을 지니도록 마찰되는 마찰 기질 구조.(0002)제 (0001) 단락에 있어서, 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면에 침착되고, 액정 분석 장치에 의해 검출될 표적 종을 선택적으로 인식할 수 있는 인식 부위를 포함하는 생체분자 인식 물질을 추가로 포함하는, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0003)제 (0002) 단락에 있어서, 생체분자 인식 물질이 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면에 화학적으로 고정되는, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0004)제 (0003) 단락에 있어서, 생체분자 인식 물질이 생화학적 블로킹층의 생화학 물질중 적어도 일부와 공유결합하는, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0005)제 (0003) 단락에 있어서, 생체분자 인식 물질이 이기능성 스페이서 화합물중 적어도 일부와 공유결합하는, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0006)제 (0003) 단락에 있어서, 생화학적 블로킹층의 생화학 물질이 혈청 알부민을 포함하고 생체분자 인식 물질이 면역글로불린, 면역글로불린의 일부, 펩타이드, 폴리펩타이드, 탄수화물, RNA의 단편 또는 DNA의 단편인, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0007)제 (0003) 단락에 있어서, 생화학적 블로킹층이 소 혈청 알부민을 포함하고 생체분자 인식 물질이 펩타이드, 폴리펩타이드, DNA, RNA, DNA 단편, RNA 단편 또는 단백질, 바이러스, 박테리아 또는 미세 병원체와 결합하는 결합 도메인을 인식하여 결합할 수 있는, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0008)제 (0003) 단락에 있어서, 생화학 물질의 반응기가 아민인 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0009)제 (0001) 단락에 있어서, 제 1 및 제 2 화학반응 전에 이기능성 활성제가 화학식(상기 식에서, n은 1 내지 20 범위의 값을 가지는 정수이다)의 유기 화합물을 포함하는, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0010)제 (0009) 단락에 있어서, n이 5 내지 8 범위의 값을 가지는 정수인, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0011)제 (0001) 단락에 있어서, 제 1 및 제 2 화학반응 전에 이기능성 스페이서 화합물이 디석신이미딜 수버레이트인, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0012)제 (0001) 단락에 있어서, 표면 변형 화합물의 제 2 말단의 반응기가 할로겐-실리콘 결합 및 알콕시-실리콘 결합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0013)제 (0001) 단락에 있어서, 제 2 및 제 3 화학반응 전에 표면 변형 화합물이 실리콘 원자; 산소-실리콘 결합을 통해 실리콘 원자와 결합하는 알콕시 그룹; 및 탄소-실리콘 결합을 통해 실리콘 원자와 결합하는 아미노알킬 그룹을 포함하는 실리콘 화합물인, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0014)제 (0001) 단락에 있어서, 제 2 및 제 3 화학반응 전에 표면 변형 화합물이 아미노알킬트리알콕시실란인, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0015)제 (0001) 단락에 있어서, 제 2 및 제 3 화학반응 전에 표면 변형제가 아미노프로필트리에톡시실란인, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0016)(a) 생화학적 블로킹층을 형성하는 지지체의 일면에 화학적으로 고정된 생화학적 블로킹 화합물; 및(b) 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면에 침착되고, 액정 분석 장치에 의해 검출될 표적 종을 선택적으로 인식할 수 있는 인식 부위를 포함하는 생체분자 인식물질을 포함하는 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조에 있어서, 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면이 액정이 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면과 접촉하였을 때 액정의 균일 정착을 유도하는 특징을 지니도록 마찰되는 마찰 기질 구조.(0017)제 (0016) 단락에 있어서, 생체분자 인식 물질이 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 마찰면에 침착되는, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0018)제 (0016) 단락에 있어서, 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면이 마찰되기 전에 생체분자 인식 물질이 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면에 침착되는, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0019)제 (0016) 단락에 있어서, 생화학적 블로킹 화합물이 가교결합제로의 가교결합에 의해 지지체에 고정되는, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0020)제 (0019) 단락에 있어서, 가교결합제가 글루타르알데하이드인 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0021)제 (0016) 단락에 있어서, 생화학적 블로킹 화합물이 이기능성 스페이서 화합물과 결합함으로써 지지체에 고정되어, 이기능성 스페이서 화합물이 표면 변형 화합물과 결합하며 표면 변형 화합물이 지지체 표면에 대한 작용기와 결합하는 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0022)제 (0016) 단락에 있어서, 생체분자 인식 물질이 이기능성 스페이서 화합물과 결합함으로써 지지체에 고정되어, 이기능성 스페이서 화합물이 표면 변형 화합물과 결합하며 표면 변형 화합물이 지지체 표면에 대한 작용기와 결합하는, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0023)제 (0016) 단락에 있어서, 생체분자 인식 물질이 생화학적 블로킹 화합물과 결합함으로써 지지체에 고정되는, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0024)제 (0016) 단락에 있어서, 생화학적 블로킹 화합물이 혈청 알부민을 포함하고 생체분자 인식 물질이 면역글로불린, 면역글로불린의 일부, 펩타이드, 폴리펩타이드, 탄수화물, RNA의 단편 또는 DNA의 단편인, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0025)제 (0016) 단락에 있어서, 생화학적 블로킹 화합물이 소 혈청 알부민을 포함하고 생체분자 인식 물질이 펩타이드, 폴리펩타이드, DNA, RNA, DNA 단편, RNA 단편 또는 단백질, 바이러스, 박테리아 또는 미세 병원체와 결합하는 결합 도메인을 인식하여 결합할 수 있는, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0026)제 (0016) 단락에 있어서, 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체 일면의 적어도 두 영역이 상이한 압력하에서 상이한 시간 동안 마찰되어 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체 일면의 적어도 두 영역이 표적 종에 대해 상이한 감수성을 가지는, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조.(0027)액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 제조방법에 있어서,(a) 생화학적 블로킹 화합물의 반응기와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용기를 포함하는 활성화되고 변형된 지지체 표면을 적어도 하나의 반응기를 포함하는 생화학적 블로킹 화합물과 반응시켜, 생화학 물질과 지지체 간에 공유결합을 형성하므로써 생화학적 블로킹 화합물을 포함하는 표면을 갖는 지지체를 생산하는 단계,(b) 생화학적 블로킹 화합물을 포함하는 표면을 마찰시켜 액정이 마찰면과 접촉하였을 때 액정의 균일 정착을 유도하는 특징을 지니는 마찰면을 생산하는 단계를 포함하는 제조방법.(0028)제 (0027) 단락에 있어서, 생화학적 블로킹 화합물이 혈청 알부민인, 액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 제조방법.(0029)제 (0027) 단락에 있어서, 생화학적 블로킹 화합물이 소 혈청 알부민인 액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질의 제조방법.(0030)제 (0027) 단락에 있어서,(c) 제 1 말단과 제 2 말단을 포함하는 표면 변형 화합물을 지지체와 반응시켜, 지지체와 표면 변형 화합물의 제 1 말단 간에 공유결합을 형성하므로써 표면 변형된 지지체를 생산하는 단계;(d) 제 1 말단과 제 2 말단을 가지는 이기능성 활성제를 표면 변형된 지지체와 반응시켜, 표면 변형제의 제 2 말단과 이기능성 활성제의 제 1 말단과의 반응에 의해 공유결합을 형성하므로써 활성화되고 변형된 지지체 표면을 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질의 제조방법.(0031)제 (0030) 단락에 있어서, 표면 변형 화합물이 지지체 표면의 하이드록실 그룹과 반응할 수 있는, 액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 제조방법.(0032)제 (0030) 단락에 있어서, 이기능성 활성제가 생화학 물질의 아민과 반응할 수 있는, 액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 제조방법.(0033)제 (0030) 단락에 있어서, 표면 변형제의 제 1 말단이 할로겐-실리콘 결합 및 알콕시-실리콘 결합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 제조방법.(0034)제 (0030) 단락에 있어서, 표면 변형제가: 실리콘 원자; 산소-실리콘 결합을 통해 실리콘 원자와 결합한 알콕시 그룹; 및 탄소-실리콘 결합을 통해 실리콘 원자와 결합한 아미노알킬 그룹을 포함하는 실리콘 화합물인, 액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 제조방법.(0035)제 (0030) 단락에 있어서, 표면 변형제가 아미노알킬트리알콕시실란인 액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 제조방법.(0036)제 (0035) 단락에 있어서, 표면 변형제가 아미노프로필트리에톡시실란인 액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 제조방법.(0037)제 (0030) 단락에 있어서, 이기능성 활성제가 화학식(상기 식에서, n은 1 내지 20 범위의 값을 가지는 정수이다)의 유기 화합물을 포함하는, 액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 제조방법.(0038)제 (0037) 단락에 있어서, n이 5 내지 8 범위의 값을 가지는 정수로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 제조방법.(0039)제 (0030) 단락에 있어서, 이기능성 활성제가 디석신이미딜 수버레이트를 포함하는, 액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 제조방법.(0040)제 (0027) 단락에 있어서, 분석 장치에 의해 검출될 표적 종을 선택적으로 인식하여 결합할 수 있는 반응성 부위 및 인식 부위를 포함하는 생체분자 인식 물질을 지지체의 활성화되고 변형된 표면과 반응시켜, 생체분자 인식 물질과 활성화되고 변형된 지지체 간에 공유결합을 형성하므로써 분석 장치에 의해 검출될 표적 종을 선택적으로 인식하여 결합할 수 있는 인식 부위를 가지는 생체분자 인식 물질을 포함하는 지지체를 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 제조방법.(0041)제 (0040) 단락에 있어서, 생화학적 블로킹 화합물을 포함하는 표면이 마찰되기 전에 생체분자 인식 물질이 지지체의 활성화되고 변형된 표면과 반응하는, 액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 제조방법.(0042)제 (0040) 단락에 있어서, 생화학적 블로킹 화합물을 포함하는 표면이 마찰된 후에 생체분자 인식 물질이 지지체의 활성화되고 변형된 표면과 반응하는, 액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 제조방법.(0043)제 (0040) 단락에 있어서, 생화학적 블로킹 화합물을 포함하는 표면의 적어도 두 영역이 상이한 압력을 사용하여 상이한 시간 동안 마찰되는, 액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 제조방법.(0044)제 (0027) 단락에 있어서, 분석 장치에 의해 검출될 표적 종을 선택적으로 인식하여 결합할 수 있는 반응성 부위 및 인식 부위를 포함하는 생체분자 인식 물질을 지지체의 활성화되고 변형된 표면과 반응시켜, 생체분자 인식 물질과 생화학적 블로킹 화합물 간에 공유결합을 형성시킴으로써 분석 장치에 의해 검출될 표적 종을 선택적으로 인식하여 결합할 수 있는 인식 부위를 가지는 생체분자 인식 물질을 포함하는 지지체를 생산하는 단계를 추가로 포함하는, 액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 제조방법.(0045)제 (0027) 단락에 있어서,(c) 제 1 반응성 부위 및 제 1 인식 부위를 포함하는 제 1 생체분자 인식 물질을 지지체의 활성화되고 변형된 표면의 제 1 영역과 반응시켜, 제 1 생체분자 인식 물질과 활성화되고 변형된 지지체의 제 1 영역 간에 공유 결합을 형성시키는 단계와,(d) 제 2 반응성 부위 및 제 2 인식 부위를 포함하는 제 2 생체분자 인식 물질을 지지체의 활성화되고 변형된 표면의 제 2 영역과 반응시켜, 제 2 생체분자 인식 물질과 활성화되고 변형된 지지체의 제 2 영역 간에 공유결합을 형성시키는 단계를 추가로 포함하는, 액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 제조방법.(0046)제 (0045) 단락에 있어서, 생화학적 블로킹 화합물을 포함하는 표면이 마찰되기 전에 제 1 및 제 2 생체분자 인식 물질이 지지체의 활성화되고 변형된 표면의 제 1 및 제 2 영역과 반응하는, 액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 제조방법.(0047)(a) 제 (0002) 단락 또는 제 (0016) 단락에 따른 두 개의 마찰 기질 구조; 및(b) 서로 마주 보지만 액정으로 충진될 수 있는 공동으로 분리되어 있는 두 개의 마찰 기질 구조의 생화학적 블로킹층 사이에 위치하는 스페이싱 물질을 포함하는, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 광학셀.(0048)(a) 제 (0002) 단락 또는 제 (0016) 단락에 따른 마찰 기질 구조;(b) 액정을 균일하게 정착시키는 표면; 및(c) 마찰 기질 구조의 생화학적 블로킹층과 액정을 균일하게 정착시키는 표면 사이에 위치하는 스페이싱 물질을 포함하는 액정 분석 장치.(0049)(a) 제 (0002) 단락 또는 제 (0016) 단락에 따른 적어도 하나의 마찰 기질 구조;(b) 액정을 균일하게 정착시키는 표면;(c) 마찰 기질과 액정을 균일하게 정착시키는 표면 사이에 위치하는 스페이싱 물질; 및(d) 액정 화합물을 포함하는, 액정 분석 장치에 사용하기 위한 키트.(0050)제 (0049) 단락에 있어서, 액정이 4-시아노-4'-펜틸비페닐인 액정 분석 장치에 사용하기 위한 키트.(0051)제 (0049) 단락에 있어서, 적어도 하나의 마찰 기질 구조, 액정을 균일하게 정착시키는 표면 및 스페이싱 물질이 광학셀로 예비조립되는 액정 분석에 사용하기 위한 키트.(0052)(a) 제 (0002) 단락 또는 제 (0016) 단락에 따른 마찰 기질 구조를 표적 종의 존재에 대해 시험할 샘플과 함께 인큐베이팅하고;(b) 마찰 기질 구조의 생화학적 블로킹층이 액정을 균일하게 정착시키는 표면과 마주보도록 인큐베이팅된 마찰 기질 구조의 생화학적 블로킹층과 액정을 균일하게 정착시키는 표면 사이에 스페이싱 물질을 두며;(c) 액정을 인큐베이팅된 마찰 기질 구조와 액정을 균일하게 정착시키는 표면 사이의 영역으로 드로잉한 다음;(d) 액정이 마찰 기질 구조에 균일하게 정착되었는 지를 판단하는 단계를 포함하는, 액정 분석 장치를 사용하는 표적 종 존재의 검출방법.(0053)(a) 생화학적 블로킹층을 포함하는 마찰면을 갖는 지지체;(b) 생화학적 블로킹층을 포함하는 지지체의 제 1 부분에 제 1 표적 종 검출 영역(제 1 표적 종 검출 영역은 제 1 표적 종과 결합할 수 있는 제 1 생체분자 인식 물질을 포함한다); 및(c) 생화학적 블로킹층을 포함하는 지지체의 적어도 하나의 다른 부분에 적어도 하나의 다른 표적 종 검출 영역(적어도 하나의 다른 표적 종 검출 영역은 적어도 하나의 다른 표적 종과 결합할 수 있는 적어도 하나의 다른 생체분자 인식 물질을 포함한다)을 포함하는 샘플내 하나 이상의 표적 종의 존재를 검출하기 위한 장치에 있어서,제 1 표적 종 검출 영역이 표적 종의 부재하에서 액정을 균일하게 정착시키고 적어도 하나의 다른 표적 종 검출 영역이 적어도 하나의 다른 표적 종의 부재하에서 액정을 균일하게 정착시키며, 추가로 제 1 표적 종 검출 영역에서 액정의 균일 정착이 제 1 표적 종 검출 영역이 제 1 표적 종에 노출되었을 때 붕괴되고 적어도 하나의 다른 표적 종 검출 영역에서 액정의 균일 정착이 적어도 하나의 다른 표적 종 검출 영역이 적어도 하나의 다른 표적 종에 노출되었을 때 붕괴되는 장치.(0054)제 (0053) 단락에 있어서, 제 1 생체분자 인식 물질과 적어도 하나의 다른 생체분자 인식 물질이 각각 제 1 표적 종 검출 영역 및 적어도 하나의 다른 표적 종 검출 영역에 존재하면서 표면이 마찰되는 장치.(0055)샘플에서 표적 종의 존재를 검출하는 데 사용하기 위한 키트에 있어서, 제 (0002) 단락 또는 제 (0016) 단락에 따른 적어도 하나의 마찰 기질 구조와 액정 화합물을 포함하는 키트.(0056)제 (0055) 단락의 키트를 사용하여 샘플내 표적 종의 존재를 검출하는 방법에 있어서,(a) 제 (0055) 단락의 마찰 기질 구조 부분을 일정량의 샘플과 접촉시키고;(b) 제 (0055) 단락의 키트의 액정을 샘플과 접촉한 마찰 기질 구조 부분에 둔 다음;(c) 액정의 균일 정착이 붕괴되었는 지를 판단하는 단계를 포함하는 방법.
본 발명이 설명을 위해 본원에 상술되어 있는 양태로 제한되지 않지만, 하기의 청구범위 범위 내에 있는 한 이의 이러한 모든 양태를 포함하는 것으로 이해된다.

Claims (56)

  1. (a) 생화학 물질을 포함하는 생화학적 블로킹층;
    (b) 제 1 말단과 제 2 말단을 포함하는 이기능성 스페이서 화합물;
    (c) 제 1 말단과 제 2 말단을 포함하는 표면 변형 화합물; 및
    (d) 생화학적 블로킹층을 함유하는 적어도 일면을 포함하는 지지체를 포함하는 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조에 있어서, 생화학 물질 중 적어도 하나가 제 1 화학반응 전의 생화학 물질에 대한 반응기와 제 1 화학반응 전의 이기능성 스페이서 화합물의 제 1 말단에 대한 반응기 간의 제 1 화학반응을 통해 이기능성 스페이서 화합물의 제 1 말단과 공유결합하고; 표면 변형 화합물이 제 2 화학반응 전의 표면 변형 화합물의 제 1 말단에 대한 반응기와 제 2 화학반응 전의 이기능성 스페이서 화합물의 제 2 말단에 대한 반응기 간의 제 2 화학반응을 통해 이기능성 스페이서 화합물의 제 2 말단과 공유결합하며; 표면 변형 화합물이 제 3 화학반응 전의 표면에 대한 반응기와 제 3 화학반응 전의 표면 변형 화합물의 제 2 말단에 대한 반응기 간의 제 3 화학반응을 통해 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면과 공유결합하며; 추가로 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면이 액정이 생화학적 블로킹층을 함유하는 지지체의 일면과 접촉하였을 때 액정의 균일 정착을 유도하는 특징을 지니도록 마찰되는 마찰 기질 구조.
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  16. (a) 생화학적 블로킹층을 형성하는 지지체의 일면의 표면에 화학적으로 고정되고, 비-표적 종의 비-특이적 흡착을 저지하는 생화학적 블로킹 화합물; 및
    (b) 생화학적 블로킹층으로서 지지체의 동일 면에 침착되며 액정 분석 장치에 의해 검출될 표적 종을 선택적으로 인식할 수 있는 인식 부위를 포함하는 생체 분자 인식 물질을 포함하는 액정 분석 장치에 사용하기 위한 마찰 기질 구조에 있어서, 생화학적 블로킹층의 표면이 마찰되어 액정이 마찰면과 접촉하였을 때 액정의 균일 정착을 유도하는 특징을 지니는 마찰면을 생성하는 마찰 기질 구조.
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  27. 액정 분석 장치에 사용하기에 적당한 마찰 기질 구조의 제조방법에 있어서,
    (a) 생화학적 블로킹 화합물의 반응기와 반응할 수 있는 적어도 하나의 작용기를 포함하는 활성화되고 변형된 지지체 표면을 적어도 하나의 반응기를 포함하는 생화학적 블로킹 화합물과 반응시켜, 생화학 물질과 지지체 간에 공유결합을 형성하므로써 생화학적 블로킹 화합물을 포함하는 표면을 갖는 지지체를 생산하는 단계,
    (b) 생화학적 블로킹 화합물을 포함하는 표면을 마찰시켜 액정이 마찰면과 접촉하였을 때 액정의 균일 정착을 유도하는 특징을 지니는 마찰면을 생산하는 단계를 포함하는 제조방법.
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  52. (a) 제 16 항에 따른 마찰 기질 구조를 표적 종의 존재에 대해 시험할 샘플과 함께 인큐베이팅하고;
    (b) 마찰 기질 구조의 생화학적 블로킹층이 액정을 균일하게 정착시키는 표면과 마주보도록 인큐베이팅된 마찰 기질 구조의 생화학적 블로킹층을 액정을 균일하게 정착시키는 표면 사이에 스페이싱 물질을 두며;
    (c) 액정을 인큐베이팅된 마찰 기질 구조와 액정을 균일하게 정착시키는 표면 사이의 영역으로 드로잉한 다음;
    (d) 액정이 마찰 기질 구조에 균일하게 정착되었는 지를 판단하는 단계를 포함하는, 액정 분석 장치를 사용하는 표적 종 존재의 검출방법.
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