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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Detektionseinheit, insbesondere
einen Biosensor, zur Detektion von Ziel- bzw. Markermolekülen nach
Anspruch 1; die erfindungsgemäße Detektionseinheit eignet
sich insbesondere zu Zwecken der Verwendung für eine Vielzahl von Anwendungen
im Bereich der Krankheitsdiagnose, der Vorhersage von Krankheitsentwicklungen
bzw. -verläufen
und dergleichen.
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Eine
Erkrankung geht häufig
mit der Veränderung
physiologischer Parameter einher: So liegt beispielsweise bei entzündlichen
Krankheiten oftmals eine signifikante Veränderung des Blutbildes, beispielsweise
eine deutliche Erhöhung
der Anzahl weißer
Blutkörperchen
sowie ein Auftreten bzw. eine Freisetzung bestimmter Entzündungsmediatoren und/oder
Antigene und/oder Antikörper,
vor. Eine gezielte qualitative und quantitative Analyse derartiger Veränderungen
kann – beispielsweise
in Verbindung mit weiteren diagnostischen Maßnahmen – zu einer spezifischen Bestimmung
bzw. Diagnose der vorliegenden Erkrankung herangezogen werden, so
daß auf
dieser Basis eine gezielte kurative und/oder therapeutische Behandlung
unter Auswahl spezifischer Arzneimittel eingeleitet werden kann.
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Neben
entzündlichen
Erkrankungen, welche beispielsweise auf virale oder bakterielle
Infektionen zurückgehen,
sind insbesondere Tumor- und Krebserkrankungen mit der Freisetzung
spezifischer Moleküle
bzw. Marker verbunden, wobei es sich hierbei insbesondere um spezifische
Proteine handelt, welche in bezug auf die Tumorentstehung und -entwicklung
sowie dessen Metastasierung eine Rolle spielen und für das Auftreten
von Tumorerkrankungen charakteristisch sind. In diesem Zusammenhang können beispielhaft
sogenannte, insbesondere durch Tumorzellen im hohen Maße synthetisierte
Wachstumsfaktoren genannt werden, wie beispielsweise VEGF ("Vasular Endothelial
Growth Factor"),
dem eine entscheidende Rolle zur Bildung neuer Blutgefäße zur Versorgung
eines Tumors zukommt. Weitere, durch den Tumor gebildete bzw. tumorinduzierte
Proteine – synonym
auch als Marker, Markerproteine bzw. Markersubstanzen bezeichnet – sind beispielsweise
spezifische Zellzyklusregulatoren, Chemokinrezeptoren sowie Signaltransduktionsfakto ren
sowie eine große
Breite weiterer Verbindungen, welche insgesamt ein sogenanntes tumor-
bzw. krebsspezifisches Markerprofil ergeben, anhand dessen eine
Tumorerkrankung identifiziert bzw. im Hinblick auf die weitere Tumorentwicklung
charakterisiert werden kann. Zu diesen Markersubstanzen zählt auch
das sogenannte Prostataspezifische Antigen (PSA), welches einen
spezifischen Indikator für
ein Prostatakarzinom darstellt und anhand dessen Bestimmung beispielsweise
eine Vorhersage in bezug auf die Tumor- bzw. Krebsentwicklung, beispielsweise
in bezug auf das Risiko einer Lymphknotenmetastasierung, getroffen
werden kann.
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Im
allgemeinen kann somit aufgrund der Spezifität eines Markerprofils dieses
beispielsweise zur Identifizierung und Charakterisierung von Tumor- bzw.
Krebserkrankungen herangezogen werden.
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Im
Stand der Technik sind zur Ermittlung von Markern bzw. Markerprofilen
zahlreiche biochemische Identifizierungs- bzw. Detektionsverfahren
beschrieben, wie das sogenannte Festphasenimmunoassay-Verfahren
sowie das ELISA-Verfahren ("Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay"),
bei welchen die Detektion spezifischer Proteine bzw. Antigene immunologisch
und letztlich über
radioaktive Markierungen oder Fluoreszenzmarkierung erfolgt. Eine
weitere immunbiologische Technik stellt das sogenannte Western-Blotting
dar.
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Derartige
Nachweissysteme weisen jedoch den gravierenden Nachteil auf, daß sie verfahrenstechnisch
aufwendig sind, da beispielsweise eine arbeitsintensive Präparation
bzw. Aufarbeitung der zu analysierenden Probe notwendig ist. Darüber hinaus sind
die vorgenannten Verfahren des Standes der Technik zeit- und kostenintensiv
und führen
oftmals nur zu einer quantitativen Bestimmung der zu detektierenden
Substanz. Auch sind diese Verfahren nicht oder nicht ohne weiteres
automatisierbar.
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Zudem
ist im Stand der Technik beispielsweise die Bestimmung spezifischer
harnblasenkarzinomassoziierter Antigene durch die Entwicklung monoklonaler
Antikörper
möglich,
welche aus der Fusion antikörperproduzierender
Zellen mit immortalisierten Zellen in vitro produziert werden können. Dabei
werden die von sogenannten Hybridomzellen produzierten Antikörper mit
ei nem zweiten Antikörper
gekoppelt, um die sogenannte Antigen/Antikörper-Reaktion an der Zielzelle optisch sichtbar
oder zytometrisch-photometrisch meßbar zu machen.
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Eine
weitere biochemische, insbesondere molekulargenetische Technik zur
Detektion bestimmter DNA-Stränge
bzw. -Abschnitte ist die sogenannte Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
(FISH) sowie die hieraus hervorgehende Weiterentwicklung, die sogenannte
vergleichende genomische Hybridisierung (CGH). Derartige Verfahren
sind jedoch auf genetisches Material, wie DNA, beschränkt. Die
Detektion erfolgt gleichermaßen
photometrisch. Zudem ist eine zeitnahe, beispielsweise intraoperativ
durchführbare Markeranalyse
mit diesen Techniken nicht realisierbar. Eine zeitnahe Analyse kann
jedoch im Rahmen einer individuellen Prognoseabschätzung bereits
zu einer intraoperativen Therapieoptimierung führen.
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Eine
weitere Entwicklung in bezug auf die spezifische Bestimmung von
Proteinen bzw. Marker stellen sogenannte "Lab-on-a-chip"-Lösungen
dar, bei denen auf einem Träger
ein entsprechender Proteinnachweis erfolgen kann. Jedoch weisen
derartige Detektionsvorrichtungen keine integrierte Sensorik auf,
und die Auslesung erfolgt nach Probenauftrag deutlich zeitversetzt
bzw. "offline" (extern) mittels
optischer Detektion unter Verwendung externer und aufwendiger optischer
Lese- und Auswertevorrichtungen, ohne daß diese Vorrichtungen auf der
Detektionsvorrichtung integriert sind.
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Demnach
sind derartige Systeme apparativ aufwendig, und eine zeitnahe Ermittlung
eines Markerprofils ist mit derartigen Systemen ebenfalls nur begrenzt
möglich.
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Insgesamt
ist somit im Stand der Technik bisher kein System bekannt, welches
portabel ist und mit welchem automatisch und zumindest semikontinuierlich
eine biosensorische Gewebstypisierung, insbesondere zur Ermittlung
eines Markerprofils, durchgeführt
werden kann.
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Vor
diesem technischen Hintergrund besteht nunmehr die Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, eine Detektionseinheit, insbesondere einen Biosensor,
bereitzustellen, welche die zuvor geschilderten Nachteile des Standes
der Tech nik zumindest teilweise vermeidet oder aber zumindest abschwächt. Insbesondere
soll eine Detektionseinheit bereitgestellt werden, mit welcher spezifische
Ziel- bzw. Markermoleküle
in qualitativer und/oder quantitativer Weise erfaßt werden
können,
so daß auf
dieser Basis ein Markerprofil einer biologischen Probe, beispielsweise
eines Tumorgewebes oder einer Körperflüssigkeit (z.
B. Blut oder Urin), erstellt werden kann. Dabei soll die Detektionseinheit
vorteilhafterweise sowohl spezifische Erfassungskomponenten als
auch zur Detektion erforderliche Sensorkomponenten umfassen, wobei
die Detektion insbesondere unter Ausgabe eines elektrischen Meßsignals
erfolgen soll. Insbesondere soll sich die Detektionseinheit zur
Detektion von Zielmolekülen
eignen, welche für
das Auftreten bzw. Vorliegen von Tumor- bzw. Krebserkrankungen oder aber
von entzündlichen
Erkrankungen des Urogenitaltraktes charakteristisch sind.
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Zur
Lösung
der zuvor geschilderten Aufgabenstellung schlägt die vorliegende Erfindung
eine Detektionseinheit zur Erzeugung eines insbesondere elektrischen
Meßsignals
infolge einer Wechselwirkung zwischen einem Fängermolekül einerseits und einem Zielmolekül andererseits
gemäß Anspruch
1 vor. Weitere, vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der
jeweiligen Unteransprüche.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist somit eine Detektionseinheit, welche
insbesondere als Biosensor ausgebildet ist und mit spezifischen Fängermolekülen ausgestattet
ist. Die Fängermoleküle sind
derart ausgestaltet, daß sie
mit Ziel- bzw. Markermolekülen
in spezifischer Art und Weise interagieren können.
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Eine
Besonderheit der erfindungsgemäßen Detektionseinheit
ist darin zu sehen, daß ein
insbesondere elektrisches Meßsignal
infolge der Wechselwirkung zwischen dem Fängermolekül einerseits und dem Ziel-
bzw. Markermolekül
andererseits erzeugt wird. Zu diesem Zweck weist die erfindungsgemäße Detektionseinheit
einen Träger
auf, wobei auf dem Träger
eine Meßeinrichtung,
welche zur Erfassung der Wechselwirkung zwischen Fängermolekül einerseits
und Ziel- bzw. Markermolekül
andererseits sowie zur Erzeugung eines insbesondere elektrischen Meßsignals
infolge der Wechselwirkung dient, angeordnet ist. Die erfindungsgemäße Detektionseinheit zeichnet
sich weiterhin da durch aus, daß auf
dem Träger
bzw. auf der Meßeinrichtung
mindestens ein Fängermolekül immobilisiert
ist. Das Fängermolekül ist vorzugsweise
auf der Meßeinrichtung
angeordnet. Das Zielmolekül
ist für
das Auftreten bzw. Vorliegen von Tumorerkrankungen, insbesondere
Krebserkrankungen, insbesondere des Urogenitaltraktes, oder aber
von entzündlichen
Erkrankungen des Urogenitaltraktes charakteristisch.
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Mit
Hilfe der erfindungsgemäßen Detektionseinheit
ist es möglich,
eine rasche Identifizierung von gewebstypischen Markern zu realisieren,
was weiterführende
Aussagen in bezug auf die zuvor genannten Erkrankungen, beispielsweise
bereits vor oder während
einer Tumoroperation, ermöglicht.
Darüber
hinaus zeichnet sich die erfindungsgemäße Detektionseinheit dadurch
aus, daß sie
in ein portables Ansteuerungs- und Auswertesystem integriert werden
kann und darüber
hinaus eine automatisierte bzw. selbstständige Messung mehrerer paralleler
Proben möglich
ist.
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Eine
zentrale Idee der vorliegenden Erfindung ist darin zu sehen, daß eine Detektionseinheit bereitgestellt
wird, mit welcher in einer Messung eine Vielzahl spezifischer Ziel-
bzw. Markermoleküle
ermittelt werden kann, so daß es
in einfacher Weise möglich
ist, ein komplexes Markerprofil einer Probe, beispielsweise einer
Gewebeprobe eines Tumors, zu erstellen. Gleichermaßen ist
es aber auch möglich, daß mehrere
verschiedene Proben – beispielsweise Gewebeproben
von Tumoren verschiedener Patienten – auf einer einzigen Detektionseinheit
untersucht werden können,
wobei diese dann – wie
nachfolgend geschildert – vorzugsweise
kompartimentiert ist. Dabei vereint die erfindungsgemäße Detektionseinheit gewissermaßen in einer
Vorrichtung sowohl erkennungsspezifische als auch sensorspezifische
Komponenten. Infolge der Erkennung von Zielmolekülen werden Sensorsignale vorzugsweise
in elektrischer Form ausgegeben, so daß die Wechselwirkung zwischen
Fängermolekül und Zielmolekül quantitativ und
qualitativ analysiert werden kann und auf dieser Basis Rückschlüsse auf
das Zielmolekül
bzw. den Marker möglich
sind.
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Die
Detektionseinheit nach der vorliegenden Erfindung ist somit speziell
auf die Erfassung solcher Zielmoleküle, welche für das Auftreten
bzw. Vorliegen von Tumor- bzw. Krebserkrankungen, insbesondere des
Urogenitaltraktes, oder aber von entzündlichen Erkrankungen des Urogenitaltraktes
charakteri stisch sind, ausgelegt bzw. sozusagen maßgeschneidert.
Hierin ist eine maßgebliche,
zentrale Idee der vorliegenden Erfindung zu sehen.
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Weitere
Vorteile, Merkmale, Eigenschaften und Aspekte der vorliegenden Erfindung
ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von bevorzugten
Ausführungsformen
auf Basis der angefügten Figur.
Die einzige Figur zeigt einen schematischen Querschnitt der erfindungsgemäßen Detektionseinheit 1 gemäß einer
erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform,
welche im vorliegenden Fall mit einer Probe beaufschlagt ist und
Ziel- bzw. Markermoleküle 3 enthält.
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In
der einzigen Figur werden für
gleiche oder ähnliche
Teile die gleichen oder dieselben Bezugszeichen verwendet, wobei
entsprechende Eigenschaften und Vorteile erreicht werden, auch wenn eine
wiederholte Beschreibung aus Vereinfachungsgründen weggelassen ist.
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Die
Figur zeigt eine erfindungsgemäße Detektionseinheit 1,
insbesondere einen Biosensor, bei welchem ein insbesondere elektrisches
Meßsignal infolge
einer Wechselwirkung zwischen einem Fängermolekül 2 einerseits und
einem Zielmolekül 3 andererseits
erzeugt wird. Die Figur zeigt, daß die Detektionseinheit 1 nach
der Erfindung einen Träger 4 aufweist,
wobei auf dem Träger 4 eine
Meßeinrichtung 5 angeordnet
ist. Die Meßeinrichtung 5 dient
der Erfassung der Wechselwirkung zwischen Fängermolekül 2 einerseits und
Zielmolekül 3 andererseits
sowie zur Erzeugung eines infolge dieser Wechselwirkung generierten,
insbesondere elektrischen Meßsignals.
Das Fängermolekül 2 ist – wie der
Figur weiterhin zu entnehmen ist – auf dem Träger 4 bzw.
auf der Meßeinrichtung 5,
vorzugsweise auf der Meßeinrichtung 5,
immobilisiert. Dabei ist das Fängermolekül 2 geeignet,
in spezifischer Weise mit einem Zielmolekül 3, welches für das Auftreten
bzw. Vorliegen von Krankheiten aus der Gruppe von Tumorerkrankungen,
insbesondere Krebserkrankungen, insbesondere Tumorerkrankungen des
Urogenitaltraktes, oder von entzündlichen
Erkrankungen des Urogenitaltraktes charakteristisch ist, in Wechselwirkung
zu treten. Die erfindungsgemäße Detektionseinheit 1 ist
hierdurch speziell auf die Erfassung solcher Zielmoleküle, welche
für das
Auftreten bzw. Vorliegen von Tumor- bzw. Krebserkrankungen, insbesondere
des Urogenitaltraktes, oder aber von entzündlichen Erkrankungen des Urogenitaltraktes
charakteristisch sind, ausgerichtet.
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Was
die erfindungsgemäße Detektionseinheit 1 als
solche anbelangt, so wird diese synonym auch als Biochip, Biosensor
bzw. elektrochemischer Sensor bezeichnet, insbesondere da es sich
bei der erfindungsgemäßen Detektionseinheit 1 um
einen hochsensitiven und selektiven Sensor beispielsweise für Affinitätsbindungen
von auf dem Sensor immobilisierten bzw. fixierten Molekülen (Fängermolekül 2) einerseits
und in einer Probe befindlichen Ziel- bzw. Markermolekülen 3 andererseits
handelt, wobei infolge der zuvor beschriebenen Interaktion ein insbesondere
elektrisches Meßsignal
ausgegeben wird.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Begriff "Biosensor" somit insbesondere eine
Kopplung biologischer Komponenten (z. B. Fängermolekül 2) zur spezifischen
Erkennung eines Analyten (z. B. Zielmolekül 3) mit einem insbesondere
physikalischen Transduktor bzw. Signalwandler. Dabei vereinigt der
Biosensor in sich die hohe Spezifität biologischer Systeme mit
großer
Nachweisempfindlichkeit physikalischer Systeme. Der Biosensor wandelt
die biochemische Information eines Substrates (z. B. Zielmolekül 3)
in ein physikalisch quantifizierbares Signal um, vorzugsweise in
ein elektrisches Signal, das einer elektronischen Verstärkung zugänglich ist.
Für weitere
Einzelheiten in bezug auf Biosensoren kann verwiesen werden auf
Römpp Lexikon
Biotechnolgie und Gentechnik, 2. Auflage, 1999, Georg Thieme Verlag
Stuttgart/New York, Seite 120, Stichwort: "Biosensoren", dessen gesamter Offenbarungsgehalt
einschließlich
der dort genannten Literaturstellen hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen
ist. Der vorstehende Begriff "Analyt" wird erfindungsgemäß als synonyme
Bezeichnung für
das Zielmolekül 3 verwendet.
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Gemäß einer
besonders bevorzugten Ausführungsform
weist die erfindungsgemäße Detektionseinheit 1 – wie nachfolgend
noch ausführlich
erörtert – Meßelektroden 6a, 6b auf,
welche insbesondere als ein Bestandteil der Meßeinrichtung 5 auf
den Träger 4 aufgebracht
sind und in Kontakt mit einer zu analysierenden Probe stehen können. Vorzugsweise ist
das Fängermolekül 2 auf
den Meßelektroden 6a, 6b immobilisiert.
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Was
das erfindungsgemäß verwendete
Fängermolekül 2 anbelangt,
so handelt es sich hierbei gewissermaßen um eine Biokomponente (synonym auch
als Biomolekül
bezeichnet), welche imstande ist, mit dem Ziel- bzw. Markermolekül 3 zu
interagieren bzw. hiermit in Wechselwirkung zu treten. Dabei kann
der Begriff "Fängermolekül" einerseits eine
Vielzahl von identischen Fängermolekülen sowie
andererseits ein Ensemble unterschiedlicher Spezies von Biokomponenten
umfassen. Der Begriff "Fängermolekül" betriff somit mit
anderen Worten sowohl eine Sorte von Biokomponenten (z. B. einen
speziellen Antikörper)
als auch eine Mischung verschiedener Biokomponenten (z. B. eine
Mischung verschiedener Antikörper).
Demnach liegt es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, wenn der
Träger 4 bzw.
die Meßeinrichtung 5 und
besonders bevorzugt die Meßelektroden 6a, 6b – je nach
Anwendungsfall – mit
einer Vielzahl identischer oder mit einer Mischung unterschiedlicher
Fängermolekülen beaufschlagt
ist bzw. sind. Da die erfindungsgemäße Detektionseinheit 1 nicht
auf eine einzige Meßeinrichtung 5 beschränkt ist,
sondern gleichermaßen
eine Vielzahl von vorzugsweise unabhängigen Meßeinrichtungen 5 aufweisen
kann, ist es erfindungsgemäß möglich, daß die erfindungsgemäße Detektionseinheit 1 verschiedene
Meßeinrichtungen 5 mit
jeweils voneinander verschiedenen Fängermolekülen 2 je Meßeinrichtung 5 aufweist.
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Die
erfindungsgemäße Detektionseinheit 1 eignet
sich aufgrund ihrer speziellen Konzeption für eine vorzugsweise elektrische
Multianalytmessung, wobei die Detektionseinheit 1 in diesem
Fall mehrere unterschiedliche Meßeinrichtungen 5 umfaßt, auf welchen
jeweils unterschiedliche Fängermoleküle 2 gemäß der vorgenannten
Begriffsdefinition immobilisiert sind. Sofern eine Untersuchung
verschiedener Proben, beispielsweise von verschiedenen Patienten bzw.
von verschiedenen Geweben, vorgesehen ist, können die einzelnen Meßeinrichtungen 5 durch Trennwände bzw.
Kompartimentierungen voneinander getrennt sein, so daß eine kompartimentierte
Detektionseinheit 1 nach der Erfindung resultiert. Die Kompartimente
weisen dann vorzugsweise Volumina im Bereich von wenigen Nanolitern
auf. Sofern die Detektionseinheit 1 mehrere Meßeinrichtungen 5 aufweist,
sind diese vorzugsweise einzeln bzw. getrennt voneinander steuerbar,
d. h. die jeweiligen Meßeinrichtungen 5 sind
getrennt voneinander z. B. mit elektrischen Potentialen beaufschlagbar
bzw. Meßsignale
sind unabhängig
voneinander aus den jeweiligen Meßeinrichtungen 5,
beispielsweise über Meßelektroden 6a, 6b,
auslesbar.
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Die
erfindungsgemäß vorgesehene
Meßeinrichtung 5 umfaßt somit
gemäß einer
erfindungsgemäß bevorzugten
Ausführungsform
elektrische Meßelektroden
(6a, 6b) sowie einen Teil des Trägers 4 und
kann gegebenenfalls beispielsweise durch Wandungen der Trägerstruktur
ein abgetrenntes Areal der erfindungsgemäßen Detektionseinheit 1 ausbilden. Wie
nachfolgend noch beschrieben, kann die Meßeinrichtung 5 als
ein sogenanntes Elektrodenarray ausgebildet sein.
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Was
das Fängermolekül 2 als
solches betrifft, so handelt es sich hierbei vorzugsweise um einen
Antikörper,
ein Antigen oder eine Nukleinsäuresequenz.
Als Nukleinsäuresequenzen
kommen dabei Desoxyribonukleinsäure-
oder Ribonukleinsäuresequenzen
in Betracht. Die Auswahl des Fängermoleküls 2 ist
erfindungsgemäß in Abhängigkeit
von dem zu detektierenden Zielmolekül 3 durchzuführen. Dabei
sollte das Fängermolekül 2 derart
ausgebildet sein, daß es
mit dem Zielmolekül 3 in
Wechselwirkung treten kann, so daß eine spezifische Anlagerung
bzw. Bindung des Zielmoleküls 3 an
das Fängermolekül 2 erfolgen
kann. Diesbezüglich
sollte das Fängermolekül 2 derart
ausgebildet sein, daß es durch
seine hohe Spezifität
ausschließlich
mit dem entsprechenden Zielmolekül 3 interagiert,
sofern es in der Probe vorhanden ist.
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Die
Bindung zwischen Fängermolekül 2 und Zielmolekül 3 kann
physikalisch und/oder chemisch, beispielsweise durch elektrostatische
und/oder interionische Wechselwirkung oder durch Ausbildung kovalenter
Bindungen erfolgen, so daß gewissermaßen ein
Fängermolekül/Zielmolekül-Komplex
("Schlüssel/Schloß-Prinzip") resultiert, was
zu einem insbesondere elektrochemischen Detektionsprozeß, beispielsweise
zur Ausgabe eines elektronischen Meßsignals, führt. Mit anderen Worten ist
das Fängermolekül 2 sozusagen
komplementär
zu der Zielstruktur, d. h. komplementär zu dem Zielmolekül 3,
auszuwählen.
Das Fängermolekül 2 und
das Zielmolekül 3 stellen
somit gewissermaßen
aufeinander abgestimmte, interaktionsfähige Biokomponenten dar. Sofern
das Zielmolekül 3 beispielsweise
ein Protein mit Antigenfunktion ist, sollte das Fängermolekül 2 entsprechend ein
für diese
Antigenstruktur spezifischer Antikörper sein.
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Gemäß einer
ersten Variante der vorliegenden Erfindung ist das Fängermolekül 2 derart
ausgelegt, daß es
geeignet ist, mit einem Zielmolekül 3 in Wech selwirkung
zu treten, welches für
das Auftreten bzw. Vorliegen einer Tumorerkrankung, insbesondere
einer Krebserkrankung, vorzugsweise des Urogenitaltraktes, charakteristisch
ist. In diesem Zusammenhang handelt es sich bei der Tumorerkrankung, insbesondere
Krebserkrankung, beispielsweise und in nichtbeschränkender
Weise um ein Urethelkarzinom, Prostatakarzinom bzw. Nierenkarzinom,
wobei jedoch auch weitere Krebsarten in Betracht kommen, wie beispielsweise
Kolonkarzinom, Bronchialkarzinom sowie Mammakarzinom. Was die Tumor-
bzw. Krebserkrankung betrifft, so umfaßt diese Primärtumore,
Metastasen, Präkanzerosen
(Krebsvorstufen), benigne und maligne Tumore und dergleichen. Gemäß dieser
erfindungsgemäßen Variante
ist das Fängermolekül 2 ein
vorzugsweise spezifischer Antikörper,
und das Zielmolekül 3 ist
vorzugsweise ein Antigen. Das Zielmolekül 3 ist vorzugsweise
eine für
die jeweilige Tumor- bzw. Krebserkrankung spezifische Proteinstruktur
bzw. ein sogenanntes Markerprotein, d. h. ein aufgrund oder im Zusammenhang
mit der spezifischen Tumor- bzw. Krebserkrankung auftretendes Protein,
welches beispielsweise durch den Tumor selbst synthetisiert und/oder
freigesetzt wird oder aber beispielsweise durch tumorfremde Gewebe
bzw. Organe gewissermaßen
als Reaktion auf die Tumorentstehung bzw. -entwicklung synthetisiert und/oder
freigesetzt wird. So kann das Zielmolekül 3 beispielsweise
das zuvor genannte Prostataspezifische Antigen (PSA) sein, welches
ein spezifisches Markerprotein für
ein Prostatakarzinom darstellt. Darüber hinaus kann es sich bei
dem Zielmolekül 3 beispielsweise
und in nichtbeschränkender
Weise auch um ein E-Cadherin oder Catenin, wie B-Catenin, handeln. Darüber hinaus
kann das Zielmolekül 3 ein Wachstumsfaktor,
wie HER-2/neu, oder aber ein Proto-Onkogen, wie Cyclin-D, sein.
Darüber
hinaus kommen für
das Zielmolekül 3 spezifische
Wachstumsfaktoren, wie EGF-R, sowie Tumorsupressorgene bzw. -genprodukte,
wie p53 und PTEN, sowie Zellzyklusregulatoren, wie p27Kip und Ki67,
in Betracht. Weiterhin kann das Zielmolekül 3 ein Chemokinrezeptor,
wie CXCR4 oder CCR7, oder ein Signaltransduktionsfaktor, wie Rho-Kinase,
Rho A, Rho B, Rho C, Epac 1, Epac 2, H-Ras, Raf-Kinase, Rap 1 bzw. Rap
2, sein. Auch Motilitätsfaktoren,
wie Zellmotilitätsfaktoren,
beispielsweise Pecam bzw. Vimentin, und Angiogenesefaktoren, wie
UPA (PLAU), kommen als Zielmolekül 3 in
Betracht.
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In
diesem Zusammenhang wird den vorgenannten Ziel- bzw. Markermolekülen 3 eine
hohe Relevanz in bezug auf eine Tumor- bzw. Krebserkrankung zugesprochen.
So stellt die von den Zellen eines Primärtumors gebildete Molekülgruppe
der zuvor beschriebenen vaskulären
endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF) Schlüsselmoleküle in bezug auf eine lymphogene
Tumorzellausbreitung dar. Zudem gibt es Hinweise, daß die Familie
der zuvor genannten Chemokinrezeptoren eine zentrale Rolle in bezug
auf eine lymphogene Metastasierung, wie Migration, Invasion und
Proliferation, spielen. In Kenntnis dieser spezifischen Marker ist
somit ein gezielter Rückschluß auf die
jeweilige Tumorart bzw. eine spezifische Charakterisierung des Tumors
möglich,
so daß vor
diesem Hintergrund spezifische therapeutische Ansätze der
Tumorbehandlung abgestimmt bzw. eingesetzt werden können, wie
beispielsweise eine gezielte Hemmung der lymphogenen Tumorzellausbreitung
durch selektive Inhibition von Wachstumsfaktor- und/oder Chemokinrezeptoren.
Insgesamt kann somit mittels der erfindungsgemäßen Detektionseinheit 1 ein
spezifisches Markerprofil bzw. ein spezifisches Antigenprofil einer
Probe, insbesondere eines Tumors und dergleichen, erstellt werden, so
daß gewissermaßen eine
biosensorische Krebsschnellerkennung bzw. eine Schnellidentifizierung von
Tumor- bzw. Tumorgewebseigenschaften möglich ist, auf deren Basis
beispielsweise gezielte therapeutische Schritte eingeleitet werden
können.
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Die
erfindungsgemäße Detektionseinheit 1 ist
jedoch nicht auf die Detektion von tumor- bzw. krebsspezifischen
Zielmolekülen 3 beschränkt. Vielmehr
ist es gemäß einer
zweiten erfindungsgemäßen Variante
gleichermaßen
möglich,
das Fängermolekül 2 derart
auszuwählen,
daß es
geeignet ist, mit einem Zielmolekül 3, welches für das Auftreten
bzw. Vorliegen von entzündlichen
Erkrankungen des Urogenitaltraktes, insbesondere Nieren-, Harnleiter-
oder Blasenentzündungen
(z. B. bakteriellen Ursprungs), charakteristisch ist, in Wechselwirkung
zu treten. In diesem Fall ist das Fängermolekül 2 vorzugsweise eine
Nukleinsäuresequenz,
welche vorzugsweise eine zu dem Zielmolekül 3 komplementäre Desoxyribonukleinsäure- oder
Ribonukleinsäuresequenz – z. B.
eine cDNA oder cRNA – ist.
Gemäß dieser
zweiten Variante ist das Zielmolekül 3 ein charakteristisches Molekül, welches
von einem die entzündliche
Erkrankung hervorrufenden Erreger stammt. Hierbei handelt es sich
insbesondere um Erreger der Gattung bzw. Spezies Escherichia, wie
Escheri chia coli; Klebsiella; Proteus; Pseudomonas, wie Pseudomonas aeruginosa;
Enterococcus; Staphylococcus, wie Staphylococcus saprophyticus;
Streptococcus bzw. Candida, wie Candida albicans. Das Zielmolekül 3 stellt
in diesem Fall somit eine Nukleinsäuresequenz, vorzugsweise eine
Desoxyribonukleinsäure-
oder Ribonukleinsäuresequenz,
dar. Insbesondere handelt es sich bei dem Zielmolekül 3 um
einen Sequenzabschnitt einer 16S-rRNA, wobei das Fängermolekül 2 vorzugsweise
ein hierzu komplementärer
Basenstrang ist. Das Fängermolekül 2 bzw.
das Zielmolekül 3 ist
gemäß dieser
Variante nicht auf eine Nukleinsäuresequenz
beschränkt.
Vielmehr kann es sich hierbei auch um ein Protein, beispielsweise
einen Antikörper
bzw. ein Antigen, handeln, wobei in diesem Fall gleichermaßen zu beachten
ist, daß beide
Komponenten – also
Fängermolekül 2 einerseits
und Zielmolekül 3 andererseits – komplementär sind.
Dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt somit gewissermaßen eine
Erregeridentifizierung bzw. -klassifizierung auf elektrochemischer
Ebene dar, welche vorzugsweise als Einmaltest konzipiert ist. Hierbei handelt
es sich um ein schnelles Testsystem, da die komplette Mikrobiologie,
d. h. Anzüchten
der Bakterienkulturen und nachfolgende Bestimmung, komplett entfällt und
anhand der ermittelten Zielmoleküle 3 eine
Bestimmung der die Erkrankung induzierenden Erreger vorgenommen
werden kann.
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Wie
zuvor angesprochen, ist das Fängermolekül 2 auf
dem Träger 4 und/oder
der Meßeinrichtung 5,
insbesondere auf der Meßeinrichtung 5,
immobilisiert. Gemäß einer
erfindungsgemäß besonders
bevorzugten Ausführungsform
ist das Fängermolekül 2 auf
den Meßelektroden 6a, 6b der
Meßeinrichtung 5 immobilisiert,
wobei es gleichermaßen möglich ist,
daß das
Fängermolekül 2 auch
auf den Teilen des Trägers 4 immobilisiert
ist, welche die Meßeinrichtung 5 ausbilden.
Hierdurch ist eine hohe Fängermolekülbeladung
realisierbar, was die Sensoreigenschaften zusätzlich verbessert.
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Gemäß einer
erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform
erfolgt die Immobilisierung des Fängermoleküls 2 auf die zuvor
genannten Strukturen physikalisch und/oder chemisch, wobei eine
chemische Fixierung erfindungsgemäß bevorzugt ist. Die Immobilisierung
kann in diesem Zusammenhang beispielsweise mittels Selbstanordnung
(self-assembling), Elektropolymerisation oder über Gold/Thiol-Bindungen erfolgen.
Weitere Fixierungsmöglichkeiten des
Fängermoleküls 2 können Adhäsion, Adsorption
sowie spezifische Kondensationsreaktionen, wie beispielsweise Silanisierung
in bezug auf den Träger 4,
sein. Mit anderen Worten wird eine Modifizierung bzw. Belegung der
Oberflächen
des Trägers 4 bzw.
der Meßeinrichtung 5 bzw.
der Meßelektroden 6a, 6b durch
kovalente Bindung oder Adhäsion
an die metallischen oder nichtmetallischen Oberflächen oder
an die Wandungen der entsprechenden Komponenten erreicht, wobei
das Fängermolekül 2 z.
B. als Monolayer oder Multilayer aufgebracht ist.
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Wie
die Figur weiterhin zeigt, weist die Detektionseinheit 1 nach
der vorliegenden Erfindung mindestens zwei Meßelektroden 6a, 6b auf.
Das Material der Meßelektroden 6a, 6b kann
ein Edelmetall sein, wobei Gold, Platin bzw. Iridium erfindungsgemäß bevorzugt
sind. Darüber
hinaus kommen auch elektrisch leitende Kohlenstoffmaterialien als
Material für
die Meßelektroden 6a, 6b in
Betracht. Gleichermaßen
kommen für
die Meßelektroden 6a, 6b auch andere
elektrisch leitende Materialien oder deren Kombinationen in Betracht.
Vorzugsweise weist die Meßeinrichtung 5 mindestens
zwei Meßelektroden 6a, 6b auf,
die vorzugsweise ein Elektrodenpaar 7 (synonym auch als
Paar von Meßelektroden
bezeichnet), beispielsweise eine Anode und eine Kathode, bilden.
Weiterhin kann es erfindungsgemäß vorgesehen
sein, daß die
Meßeinrichtung 5 eine
Vielzahl Meßelektroden 6a, 6b bzw.
Elektrodenpaare 7 aufweist. Die Meßelektroden 6a, 6b können auf
den Träger 4 aufgebracht
bzw. teilweise in den Träger 4 eingelassen
sein, wobei es erfindungsgemäß gewährleistet sein
sollte, daß zumindest
ein Teil der Meßelektroden 6a, 6b an
der Oberfläche
des Trägers 4 zu
liegen kommt.
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Um
die Meßelektroden 6a, 6b beispielsweise mit
einem elektrischen Potential zu beaufschlagen bzw. um elektrische
Meßsignale
ableiten zu können, weisen
die Meßelektroden 6a, 6b vorzugsweise
Anschlußleitungen
auf, welche gleichermaßen
auf den Träger 4 aufgebracht
oder in diesen eingelassen sein können. Dabei können die
Anschlußleitungen
beispielsweise an den Randbereichen der Detektionseinheit 1 bzw.
des Trägers 4 flächenförmig vergrößert sein,
um beispielsweise mit weiteren elektrischen Geräten, z. B. über Steckverbindungen, verbunden zu
werden.
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Zudem
ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich, daß die erfindungsgemäße Detektionseinheit 1 bzw.
die Meßeinrichtung 5 über weitere
Arbeits-, Gegen- und/oder Referenzelektroden verfügt, wobei
die Meßelektroden 6a, 6b beispielsweise
gegenüber
diesen Elektroden polarisiert werden können. Beispielsweise kann eine
Silber/Silberchlorid-Elektrode als Referenzelektrode eingesetzt werden.
Durch die Ergänzung
der Meßelektroden 6a, 6b um
weitere Hilfselektroden können
beispielsweise gleichzeitig sowohl Elemente zur Ausführung elektrophoretischer
Transportvorgänge
der zu analysierenden Zielmoleküle 3 zu
den Orten des affinitätsbindenden
Fängermoleküls 2 als
auch zur Beseitigung unerwünschter
Bindungsereignisse eingesetzt werden.
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Die
Meßelektroden 6a, 6b sind über deren Anschlüsse mit
Meß- und
Auswertevorrichtungen verbindbar. So sind die Meßelektroden 6a, 6b – beispielsweise
zu Zwecken der Beaufschlagung mit elektrischen Potentialen bzw.
zur Ableitung von elektrischen Potentialen bzw. zur Polarisierung – z. B.
mit einem Multipotentiostaten verbunden, wobei eine Polarisation
der Meßelektroden 6a, 6b in
Bereichen von –1.000
mV bis +1.000 mV, insbesondere –500
mV bis +500 mV, vorzugsweise –300
mV bis +300 mV, ganz besonders bevorzugt –200 mV bis +200 mV, möglich ist.
Dabei kann sowohl eine Gleichspannung als auch eine Wechselspannung – je nach
Meßverfahren – an die
Meßelektroden 6a, 6b angelegt
sein. Von diesen Werten kann jedoch deutlich abgewichen werden, sofern
anwendungsbezogen erforderlich, wobei die Frequenz der Wechselspannung
breit variiert werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung
ist es bevorzugt, daß die
Detektionseinheit 1 mit einer Vielzahl von – beispielsweise
mit zwei, drei, vier, fünf, zehn,
sechzehn oder mehr – Meßeinrichtungen 5 bzw.
Elektrodenarrays ausgestattet ist, wobei dann die jeweiligen Meßelektroden 6a, 6b bzw.
die Elektrodenpaare 7 unabhängig voneinander ansteuerbar und
auslesbar sind, beispielsweise mittels des zuvor genannten Multipotentiostaten.
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In
erfindungsgemäß bevorzugter
Weise sind die Meßelektroden 6a, 6b derart
angeordnet, daß sie im
sogenannten sub-Mikrometer-Bereich (sub-μm-Bereich) voneinander beabstandet
sind. Mit anderen Worten sind die Meßelektroden 6a, 6b vorzugsweise
weniger als 10 μm,
insbesondere weniger als 7 μm,
vorzugsweise weniger 5 μm,
bevorzugt weniger als 3 μm,
besonders be vorzugt weniger als 1 μm, voneinander beabstandet.
Im allgemeinen sollten die Meßelektroden 6a, 6b so
eng zueinander angeordnet werden, daß sie zumindest im wesentlichen der
Größe großer Molekülkomplexe,
z. B. Immunoproteinen oder DNA-Molekülen, nahekommen. Dies führt zu dem
Vorteil, daß sich
zwischen nahe benachbarten Meßelektroden 6a, 6b beispielsweise
elektrische Wechselfelder erzeugen lassen und der resultierende
Strom hauptsächlich
von den zu detektierenden Molekülen
bzw. Molekülkomplexen
im elektrodennahen Raum beeinflußt wird. Die Form bzw. Feinstruktur
der Meßelektroden 6a, 6b kann
erfindungsgemäß in weiten
Bereichen variieren, wobei beispielsweise eine interdigitale Ausbildung
bzw. Anordnung erfindungsgemäß bevorzugt
ist. Gleichermaßen
können
die Meßelektroden 6a, 6b als
parallele Streifen oder mäanderförmige oder
runde oder schneckenartige Strukturen bzw. Formen ausgebildet sein.
Die Meßelektroden 6a, 6b sind
vorzugsweise zum Meßraum
hin nicht abgedeckt, während
die Zuleitungen zu den Meßelektroden 6a, 6b vorzugsweise
elektrisch isoliert sind. Die Breite der Meßelektroden 6a, 6b kann
in weiten Bereichen variieren, so kann die Breite der Meßelektroden 6a, 6b beispielsweise
50 bis 1.000 nm, vorzugsweise 100 bis 800 nm, vorzugsweise 150 bis
500 nm, besonders bevorzugt 200 bis 300 nm betragen. Prinzipiell
sind aber sowohl größere als
auch kleinere Elektrodenbreiten erfindungsgemäß geeignet.
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Wie
die Figur weiterhin zeigt, kann die Meßeinrichtung 5 als
ein Elektrodenarray ausgebildet sein, wobei das Elektrodenarray
mindestens zwei Meßelektroden 6a, 6b und
gegebenenfalls als weiteren Bestandteil einen Abschnitt des Trägers 4 umfaßt. Gemäß einer
weiteren erfindungsgemäß bevorzugten
Ausführungsform
weist die Meßeinrichtung 5 eine
Vielzahl derartiger Elektrodenarrays auf. Durch die Strukturierung
der Meßeinrichtung 5 in
Elektrodenarrays resultiert eine Kompartimentierung, wobei die Randbereiche
des Elektrodenarrays, welche beispielsweise durch den Träger 4 gebildet
werden können,
erhöht
sein können.
Darüber
hinaus ist es aber auch möglich,
daß eine
Kompartimentierung durch das Aufbringen beispielsweise weiterer
Polymerschichten oder von Distanzringen realisiert ist. Sofern anwendungsbezogen
erforderlich, kann die Meßeinrichtung 5 bzw.
das Elektrodenarray auch eine Vielzahl von Meßelektroden 6a, 6b,
d. h. beispielsweise zwei, drei, vier, fünf, sechs oder mehr, aufweisen,
wodurch eine gewisse Signalverstärkung
bei der Detektion von Zielmolekülen 3 erreicht
werden kann. Gemäß einer
erfin dungsgemäßen Ausführungsform kann
die Detektionseinheit 1 beispielsweise 15 Elektrodenarrays
aufweisen, von denen jeweils sieben Elektrodenarrays mit identischen
Fängermolekül 2 beaufschlagt
sind und ein Elektrodenarray als Referenz fungiert, so daß mit einer
derartigen Detektionseinheit 1 insgesamt sieben Doppelbestimmungen
sowie eine Referenzbestimmung durchführbar ist.
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Gemäß einer
alternativen erfindungsgemäßen Ausführungsform
umfaßt
die Meßeinrichtung 5 der
erfindungsgemäßen Detektionseinheit 1 mindestens
zwei Paare 7 von Meßelektroden 6a, 6b (nicht dargestellt).
Bei einer solchen Konfiguration ist es möglich, daß die jeweiligen Paare 7 von
Meßelektroden 6a, 6b jeweils
mit unterschiedlichen Fängermolekülen 2 beaufschlagt
sind, so daß innerhalb
einer Meßeinrichtung 5 mehrere
Fängermoleküle 2 auf
die unterschiedlichen Paaren 7 von Meßelektroden 6a, 6b aufgebracht
werden können,
so daß eine
zu analysierende Probe auf das Vorliegen mehrerer voneinander verschiedener
Zielmoleküle 3 bzw.
Markermoleküle
in einer Meßeinrichtung 5 untersucht
werden kann. Dabei sind die Paare 7 von Meßelektroden 6a, 6b jeweils
unabhängig
voneinander ansteuerbar. Auf diese Weise ist es beispielsweise möglich, daß die Meßeinrichtung 5 zwei,
drei, vier oder mehr Paare 7 von Meßelektroden 6a, 6b aufweist,
die jeweils mit unterschiedlichen Fängermolekülen 2 beaufschlagt sind,
so daß die
Meßeinrichtung 5 zwei,
drei, vier oder mehr Arten bzw. Spezies von Fängermolekülen 2 umfaßt, so daß eine zu
analysierende Probe in bezug auf das Vorhandensein von zwei, drei,
vier oder mehr Arten bzw. Spezies von Zielmolekülen 3 untersuchbar
ist. Weiterhin ist es erfindungsgemäß möglich, daß die Meßeinrichtung 5 mindestens
zwei, jeweils ein aus zwei Meßelektroden 6a, 6b gebildetes Elektrodenpaar 7 aufweisende
Elektrodenarrays umfaßt.
Bei dieser Ausführungsform
sind die Elektrodenarrays vorzugsweise mit jeweils einem Fängermolekül 2 beaufschlagt.
Gemäß dieser
Anordnung ist es auch möglich,
die Elektrodenarrays mit jeweils einem Fängermolekül 2 gemäß der vorgenannten
Definition (d. h. als Mischung verschiedener Biokomponenten) auszustatten.
Diese Anordnung eignet sich insbesondere zur Analyse mehrerer Proben,
da die Detektionseinheit 1 aufgrund des Vorhandenseins
der Elektrodenarrays kompartimentiert ist.
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Gemäß einer
weiteren alternativen Ausführungsform
kann die Meßeinrichtung 5 mindestens
ein Elektrodenarray, welches mindestens zwei aus jeweils zwei Meßelektroden 6a, 6b gebildete
Elektrodenpaare 7 aufweist, umfassen. In diesem Fall können die
jeweiligen Elektrodenpaare 7 – wie zuvor geschildert – mit jeweils
einem Fängermolekül 2 (d.
h. mit einer Art bzw. Spezies von Fängermolekül bzw. Biokomponente) beaufschlagt
sein. Auf diese Weise können
auf einer erfindungsgemäßen Detektionseinheit 1 mehrere
unterschiedliche Proben auf das Vorliegen von mehreren, voneinander
verschiedenen Zielmolekülen 3 untersucht
werden.
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Für die zuvor
beschriebenen Fälle
bzw. Ausgestaltungen sollten die einzelnen Elektrodenpaare 7 unabhängig voneinander
mit elektrischen Potentialen beaufschlagbar sein, so daß Meßeffekte
an den einzelnen Meßelektroden 6a, 6b der
Paare 7 bzw. an den einzelnen Elektrodenpaaren 7 unabhängig voneinander
ableitbar sind.
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Die
Erfassung des vorzugsweise elektrischen Meßsignals bzw. der Meßeffekte,
welche insbesondere bei oder durch Interaktion bzw. Wechselwirkung
des Fängermoleküls 2 mit
dem Zielmoleküls 3 erzeugt
wird, erfolgt vorzugsweise potentiometrisch und/oder voltametrisch
und/oder konduktometrisch. Darüber
hinaus ist auch eine amperometrische und/oder impedimetrische Erfassung
des Meßeffektes
möglich,
beispielsweise mittels Impedanzspektrometrie.
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Die
ermittelten Meßsignale
werden über
die Meßeinrichtung 5 abgeleitet,
gegebenenfalls verstärkt
bzw. gemittelt und vorzugsweise einer mikroprozessorgestützten Auswertung – vorzugsweise
unter Verwendung entsprechender Kontroll- bzw. Auswertungssteuerungsprogramme – unterzogen.
Die diesbezüglich
einsetzbaren Vorrichtungen sind dem Fachmann hinlänglich bekannt,
und der Fachmann ist jederzeit in der Lage, die entsprechenden Komponenten
in bezug auf die erfindungsgemäße Detektionseinheit 1 abzustimmen.
Zur Messung der Meßeffekte
können
Gleichströme
und vorzugsweise Wechselströme
mit vorgegebener Frequenz auf die Meßelektroden 6a, 6b bzw.
an die Elektrodenpaare 7 appliziert sein, wobei die Frequenz
des Wechselstroms 0,1 Hz bis 1 MHz oder mehr betragen kann. In diesem
Zusammenhang werden die mit den Fängermolekülen 2 bzw. gegebenenfalls
den Fängermolekül/Zielmolekül-Komplexen
beaufschlagten Elektrodenpaare 7 bzw. Meß elektroden 6a, 6b beispielsweise
mittels Impedanzspektrometrie vermessen, wobei Kapazität, Leitfähigkeit
und Dielektrizitätskonstante sowie
der Phasenwinkel durch die Messung und die nachfolgende Auswertung
ermittelbar sind.
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Die
erfindungsgemäße Detektionseinheit 1 zeichnet
sich dadurch aus, daß die
Wechselwirkung von Fängermolekül 2 einerseits
und Zielmolekül 3 andererseits
zur Erzeugung eines insbesondere über die Meßelektroden 6a, 6b ableitbaren
elektrischen Meßsignals
führt,
welches über
eine entsprechende Auswerteelektronik erfaßbar und analysierbar ist. Weiterhin
ist es möglich,
daß ein
insbesondere auf die Meßelektroden 6a, 6b beaufschlagtes
Potential und/oder ein beaufschlagter Strom durch die Wechselwirkung
von Fängermolekül 2 einerseits
und Zielmolekül 3 andererseits
veränderbar
ist, beispielsweise durch eine Kapazitäts- und/oder Widerstands- und/oder
Impendanzänderung
des Systems, wobei diese Änderung
meßtechnisch
ebenfalls erfaßbar und
analysierbar ist.
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Gemäß einer
erfindungsgemäß bevorzugten Ausführungsform
kann es vorgesehen sein, daß das insbesondere
elektrische Meßsignal
mittels einer infolge der Wechselwirkung von Fängermolekül 2 einerseits und
Zielmolekül 3 andererseits
induzierten chemischen Reaktion, insbesondere Redoxreaktion bzw.
elektrochemischen Reaktion, generierbar ist. Bei der chemischen
Reaktion kann es sich insbesondere um eine enzymkatalysierte Reaktion
handeln, wobei das Zielmolekül 3 vor
oder nach der Wechselwirkung mit dem Fängermolekül 2 beispielsweise
mit einem Enzym gekoppelt ist, welches anschließend ein gegebenenfalls zuzugebenes
Substrat derart umsetzt, daß auf
diese Weise oder aufgrund nachfolgender Reaktionen ein Stromfluß erfolgt.
Mit anderen Worten kann das Zielmolekül 3 mit einem Enzym
beispielsweise verbunden bzw. "gelabelt" sein, wobei bei
Einsatz von Enzymsubstraten die Freisetzung eines elektrochemisch
reversiblen Produktes durch das Enzym katalysiert wird. Bei einer
solchen Meßanordnung
kann z. B. eine Meßelektrode
(z. B. Meßelektrode 6a)
eines Elektrodenpaars 7 derart polarisiert werden, daß ein reduziertes
Reaktionsprodukt oxidiert wird, und die andere Meßelektrode
(z. B. Meßelektrode 6b)
desselben Elektrodenpaars 7 kann derart polarisiert werden,
daß ein
oxidiertes Reaktionsprodukt reduziert wird, so daß ein zykli scher
Prozeß vorliegt,
der gewissermaßen
zu einer Verstärkung
des Meßsignals
führt.
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Im
Rahmen der Redox-Rezyklierung ("Redox-Recycling") werden vorzugsweise
sogenannte Enzymmarker eingesetzt, die – wie zuvor angesprochen – entweder
mit dem Zielmolekül 3 an
das auf der Meßelektrode 6a, 6b beaufschlagte
Fängermolekül 2 in
das Meßsystem
eingeführt
werden oder nach der erfolgten spezifischen Bindung zwischen Fängermolekül 2 einerseits
und Zielmolekül 3 andererseits durch
sekundäre
Bindungsprozesse, wie Antikörperbindung,
Interkalation, kovalente Anheftung und andere gebräuchliche
Markierungsreaktionen, vorzugsweise an das Zielmolekül 3 gebunden
werden. Das entsprechende Enzym, welches sich somit vorzugsweise
nur an solchen Meßeinrichtungen 5 befindet, an
denen die molekulare Erkennungsreaktion zwischen Fängermolekül 2 einerseits
und Zielmoleküle 3 andererseits
stattgefunden hat, werden anschließend mit einem elektrochemisch
inaktiven Substrat, z. B. p-Aminophenylphosphat versetzt, welches
dann durch die Enzymreaktion, beispielsweise unter Verwendung einer
alkalischen Phosphatase, in ein elektrodenaktives, der Redox-Rezyklierung
zugängliches Produkt,
beispielsweise p-Aminophenol, umgewandelt wird.
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Im
Rahmen des zyklischen Redoxprozesses mit einer als Anode polarisierten
Meßelektrode
(z. B. Meßelektrode 6a)
und einer als Kathode polarisierten Meßelektrode (z. B. Meßelektrode 6b)
des Elektrodenpaars 7 und induzierter Oxidation bzw. Reduktion des
elektrodenaktiven Produkts wird insgesamt ein Summenstrom erhalten,
der mit der Menge der an der entsprechenden Elektrodenposition gebundenen Zielmoleküle 3 korreliert.
Bezogen auf die gebundenen Zielmoleküle 3, sollte die Menge
an eingeführtem Markerenzym
vorzugsweise quantitativ und/oder stöchiometrisch sein. Sofern man
die zur Immobilisierung hergestellten Mikrokompartimente auch zur
Volumentrennung bei dieser Art von Detektion nutzt, ist die in jedem
Mikrokompartiment bzw. Elektrodenarray entstehende Konzentration
an elektrodenaktiven Substanzen ein quantitatives Maß für die Zahl
der an dieser Position individuell stattgefundenen Erkennungsreaktionen.
Auf diese Weise bedeutet somit das Fehlen einer elektrochemischen
Reaktion auch das Ausbleiben eines Erkennungsereignisses und damit
die Abwesenheit bzw. Nichtbindung des Zielmoleküls 3 in bezug auf
das entsprechende Fängermolekül 2.
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Mit
Hilfe der sogenannten Redox-Rezyklierung ist gleichermaßen eine
gewisse Verstärkung des
Meßsignals
realisierbar, da einerseits das gebundene Enzym, insbesondere die
alkalische Phosphatase, eine große Menge des Substrats in das elektrodensensitive
Produkt überführt und
dieses Produkt dann in einer Vielzahl von zyklischen Prozessen oxidiert
bzw. reduziert wird.
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Was
die zu analysierende Probe betrifft, mit welcher die erfindungsgemäße Detektionseinheit 1 beaufschlagbar
ist, so handelt es sich hierbei um eine Probe aus biologischem bzw.
körpereigenem
Material, wobei diesbezüglich
Körperflüssigkeiten,
wie Blut oder Urin, oder Körpergewebe,
wie Tumorgewebe, in Betracht kommen. Beispielsweise kann für die Bestimmung
des zuvor beschriebenen PSA-Moleküls eine Blutprobe zugrundegelegt
werden, während
für die
Bestimmung tumorspezifischer Markerproteine, wie Angiogenesefaktoren
und dergleichen, vorzugsweise eine Probe des Tumors an sich verwendet wird.
Zur Beaufschlagung auf die erfindungsgemäße Detektionseinheit 1 kann
es erfindungsgemäß vorgesehen
sein, daß die
Probe aufgearbeitet wird. Im allgemeinen ist es möglich, daß die Probe
als Gewebe oder aber in Form von isolierten Zellen, lysierten Zellen,
Membranfragmenten, isolierten Proteinen, isolierten Nukleinsäuren und
dergleichen eingesetzt wird. Erfindungsgemäß kann die Beaufschlagung der erfindungsgemäßen Detektionseinheit 1 mit
der Probe beispielsweise mittels Mikrofluidiksystemen, insbesondere
einem Nanoliterdispensierautomaten, vorzugsweise rechnergesteuert,
beaufschlagt werden. Bei der Untersuchung bzw. Detektion von DNA bzw.
RNA kann eine Amplifikation, insbesondere eine primergestützte lineare
Amplifikation, durchgeführt
werden. Diese ist aber rein fakultativ; so ist bei einer spezifischen
Untersuchung auf 16S-RNA eine derartige Amplifikation in der Regel
nicht erforderlich, da 16S-RNA in den zu untersuchenden Medien bzw. Bakterien
in hohen Kopiezahlen vorliegt. Die Aufarbeitung der Probe ist dem
Fachmann an sich bekannt, so daß es
diesbezüglich
keiner weiteren Ausführungen
bedarf.
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Was
das Material des Trägers 4 der
erfindungsgemäßen Detektionseinheit 1 betrifft,
so handelt es sich hierbei vorzugsweise um ein elektrisch isolierendes
und gegenüber
den zu untersuchenden Zielmolekülen 3 vorzugsweise
inertes Material. Insbesondere handelt es sich bei dem Material
des Trägers 4 um
eine Siliziumverbindung, Glas, Keramik bzw. organische Polymere.
Wie zuvor ausgeführt, kann
der Träger 4 hinsichtlich
seiner Formgebung kompartimentiert sein, wobei einzelne Kompartimente,
welche mit Meßelektroden 6a, 6b bzw.
Elektrodenpaaren 7 ausrüstbar
sind, als Mikroarrays ausgebildet sind. Demgegenüber ist aber auch eine flache, planare
Ausbildung des Trägers 4 möglich. Vorzugsweise
dient der Träger 4 zur
mechanischen Unterstützung
der Meßelektroden 6a, 6b.
Die Verwendung einer Siliziumverbindung ist zudem bevorzugt, wenn beispielsweise
zur individuellen Kontrolle der Elektrodenpositionen, beispielsweise
in bezug auf das Elektrodenarray, Steuerung und Schaltung sowie
Auslesung der einzelnen Meßelektroden 6a, 6b,
zusätzliche
elektronische Elemente, wie Transistoren, Dioden, Widerstände und
andere übliche
elektronische Komponenten, positionsbezogen im Träger 4 integriert
sind.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung kann als Ausgangsvorrichtung für die erfindungsgemäße Detektionseinheit
1 ein
Biosensor verwendet werden, wie er in der WO 94/29708 A1 sowie der
zugehörigen
US 5 670 031 A und
der
DE 43 18 519 C2 ,
in der WO 97/34140 A1 sowie der zugehörigen US 2002/28441 A1 und
der
DE 196 10 115
C2 , in der WO 2000/67026 A1 sowie der zugehörigen
US 6 881 379 B1 und
der
DE 199 16 867
A1 , in der WO 00/62048 A2 sowie der zugehörigen
DE 199 16 921 A1 und
schließlich
in der
DE 196 28 052
C1 beschrieben ist, wobei alle vorgenannten Dokumente hiermit
durch Bezugnahme vollumfänglich
eingeschlossen sind, wobei die in den vorgenannten Druckschriften
genannten Biosensoren in der erfindungsgemäßen Art und Weise ausgestattet
werden müssen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können die aus dem Stand der
Technik bekannten Biosensoren in erfindungsgemäßer Weise mit den zuvor definierten
speziellen Fängermolekülen ausgerüstet bzw.
beaufschlagt werden, um für
die erfindungsgemäßen Zwecke
nutzbar zu sein. Die Ausrüstung
der Biosensoren mit den erfindungsgemäß ausgewählten Fängermolekülen bzw. Biokomponenten ist
dem Fachmann als solche bekannt, so daß bezüglich herstellungstechnischer
Eigenschaften hierauf nicht näher
eingegangen zu werden braucht.
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Die
erfindungsgemäße Detektionseinheit, insbesondere
der erfindungsgemäße Biosensor, kann
für eine
Vielzahl von verschiedenen Anwendungen verwendet werden. So kann
die erfindungsgemäße Detektionseinheit
zur Diagnose von Krankheiten bzw. zur Ermittlung des Risikos, an
einer Krankheit zu er kranken, verwendet werden. In diesem Zusammenhang
kann z. B. die Analyse eines für
eine bestimmte Krankheit, insbesondere für eine bestimmte Krebsart bzw.
einen bestimmten Tumor, charakteristischen Markerprofils mittels
der erfindungsgemäßen Detektionseinheit
durchgeführt
werden und auf diese Weise die Erkrankung diagnostiziert werden,
wobei es gleichermaßen
vorgesehen sein kann, daß im
Rahmen der Diagnose weitere, wohlbekannte diagnostische Verfahren
gewissermaßen
zur Unterstützung
bzw. zur Absicherung der auf Basis des Markerprofils erstellten
Diagnose eingesetzt werden.
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Was
die Ermittlung des Risikos, an einer Krankheit zu erkranken, betrifft,
so kann eine Analyse des Markerprofils herangezogen werden, um beispielsweise
einen Tumor hinsichtlich seiner weiteren Entwicklung bzw. hinsichtlich
seiner Eigenschaft, Metastasen zu bilden, zu charakterisieren. Des
weiteren kann die erfindungsgemäße Detektionseinheit
eingesetzt werden, um einen Krankheitsverlauf zu prognostizieren,
wobei wiederum das aus einer Probe ermittelte Markerprofil für diese
Beurteilung herangezogen werden kann.
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Schließlich kann
die erfindungsgemäße Detektionseinheit
gleichermaßen
zur Prognose von individuellen Arzneimittelwirkungen bei der Behandlung einer
Krankheit eingesetzt werden. Dabei wird vorzugsweise derart vorgegangen,
daß zunächst die
Erkrankung über
das ermittelte Markerprofil diagnostiziert bzw. charakterisiert
wird und auf Basis dieser Grundlagen dem Patienten ein diesbezüglich optimal wirkendes
Arzneimittel verabreicht wird. Gleichermaßen kann die Arzneimittelwirkung
auch dahingehend optimiert werden, daß beispielsweise spezifische Blocker
für durch
die erfindungsgemäße Detektionseinheit
aufgefundene Ziel- bzw. Markermoleküle eingesetzt werden, beispielsweise
spezifische Rezeptorblocker.
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Zudem
kann im Rahmen der Prognose von individuellen Arzneimittelerkrankungen
bei einer Tumorerkrankung aufgrund der spezifischen Charakterisierung
des Tumors gezielt abgestimmt werden, ob z. B. eine Chemotherapie,
Strahlentherapie oder eine Kombination aus beiden Therapieformen
durchgeführt
wird.
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Wie
zuvor in bezug auf die erfindungsgemäße Detektionseinheit als solche
ausgeführt,
handelt es sich bei der Krankheit, bei der die erfindungsgemäße Detektionseinheit,
eingesetzt wird um eine Tumorerkrankung, insbesondere um eine Krebserkrankung,
insbesondere Urogenitaltraktes, oder aber um eine entzündliche
Erkrankung des Urogenitaltraktes. Dabei handelt es sich bei den
entzündlichen
Erkrankungen des Urogenitaltraktes, insbesondere um bakterielle
Nieren-, Harnleiter- oder Blasenentzündungen. Was die Tumorerkrankungen,
insbesondere Krebserkrankungen, anbelangt, so kommen hier insbesondere
Krebserkrankungen des Urogenitaltraktes, insbesondere Urethelkarzinome,
Prostatakarzinome bzw. Nierenkarzinome, in Betracht.
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Die
Verwendung der Detektionseinheit nach der Erfindung zeichnet sich
somit dadurch aus, daß zunächst eine
Probe aus biologischem bzw. körpereigenem
Material, wie Körperflüssigkeiten,
insbesondere Blut bzw. Urin, oder Körpergewebe, wie Tumorgewebe,
auf das Vorhandensein spezifischer Zielmoleküle, wie zuvor definiert, untersucht
wird. Hierbei wird insbesondere ein spezifisches Profil von Zielmolekülen (Markerprofil)
der Probe erstellt. Dabei kann das Vorhandensein von Zielmolekülen qualitativ
bzw. quantitativ erstellt werden. In einem nachfolgenden Schritt
kann dann das spezifische Profil von Zielmolekülen (Markerprofil) ausgewertet
bzw. abgeglichen werden, wobei in bezug auf den Datenabgleich insbesondere
eine wie nachfolgend beschriebene Referenzdatenbank verwendet wird.
Auf Grundlage der Auswertung bzw. Abgleichung kann nachfolgend eine
Diagnose der Krankheit bzw. ein Risiko, an einer Krankheit zu erkranken,
bzw. eine Prognose eines Krankheitsverlaufs bzw. eine Prognose von
individuellen Arzneimittelwirkungen bei Behandlung einer Krankheit
ermittelt werden.
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Genauer
gesagt, kann die Detektionseinheit nach der Erfindung rein beispielhaft
und in nichtbeschränkender
Weise zur individuellen Prognose eines Rezidivrisikos einer Tumorerkrankung,
insbesondere Krebserkrankung, verwendet werden. Darüber hinaus
ist auch eine Verwendung der erfindungsgemäßen Detektionseinheit zur individuellen
Prognose eines Progressionsrisikos einer Tumorerkrankung, insbesondere
Krebserkrankung, bzw. zur individuellen Prognose des Verlaufs einer
Tumorerkrankung insbesondere Krebserkrankung, insbesondere nach Resektion
eines Tumors, möglich.
Schließlich
kann die erfindungsgemäße Detektionseinheit
auch zur individuellen Prognose einer insbesondere systemischen
Chemotherapie bei einer Tumorerkrankung, insbesondere Krebserkrankung,
verwendet werden. Hinsichtlich der Abschät zung des Progressionsrisikos
kann beispielsweise eine frühzeitige
Indikation zur radikalen Zystektomie bzw. transurethalen Elektroresektion
vorliegen. Gleichermaßen
ist aber auch eine Abschätzung
der Heilung durch Lokalmaßnahmen
möglich.
In bezug auf weitere Ausführungsformen
betreffend die erfindungsgemäße Verwendung kann
auf obige Ausführungsformen
betreffend die erfindungsgemäße Detektionseinheit
verwiesen werden, die hier entsprechend gelten.
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Die
erfindungsgemäße Detektionseinheit, insbesondere
der erfindungsgemäße Biosensor, kann
gleichermaßen
in einem Verfahren zur Bestimmung von Zielmolekülen, insbesondere zur Ermittlung
eines Profils von Zielmolekülen
(Markerprofil), an einer Probe aus biologischem bzw. körpereigenem
Material, eingesetzt werden. Dabei umfaßt die Probe insbesondere Körperflüssigkeiten,
wie Blut bzw. Urin, oder Körpergewebe,
wie Tumorgewebe, eines Patienten. Das Verfahren zur Bestimmung von Zielmolekülen zeichnet
sich durch die folgenden Verfahrensschritte aus:
- a)
Bereitstellung der Probe aus biologischem bzw. körpereigenem Material, gegebenenfalls
unter Aufarbeitung, dann
- b) Untersuchung der Probe auf das Vorhandensein spezifischer
Zielmoleküle,
insbesondere wie zuvor definiert, insbesondere zur Erstellung eines
spezifischen Profils von Zielmolekülen (Markerprofil), unter Verwendung
einer wie zuvor definierten Detektionseinheit nach der Erfindung.
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Mit
anderen Worten basiert das Verfahren zur Bestimmung von Zielmolekülen bzw.
zur Ermittlung eines Profils von Zielmolekülen (Markerprofil) darauf,
daß eine
wie zuvor beschriebene Probe mit der erfindungsgemäßen Detektionseinheit
in Kontakt gebracht wird, und zwar insbesondere mit den zuvor beschriebenen
Meßeinrichtungen
bzw. Elektrodenarrays, insbesondere mit den jeweiligen Meßelektroden,
die mit einem entsprechenden Fängermolekül beaufschlagt
sind, so daß das
Fängermolekül mit dem
gegebenenfalls vorhandenen Zielmolekül interagieren kann. Diese
Interaktion bzw. Wechselwirkung kann dann beispielsweise durch Anlegen
eines elektrischen Potentials bzw. eines elektrischen Wechselfeldes
detektiert bzw. erfaßt
werden, wobei die durch die Interaktion induzierten Strom- bzw.
Potentialveränderungen
gemes sen werden können
und einer entsprechenden, vorzugsweise elektronischen Auswertung
unterzogen werden können.
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Für weitere
Ausführungen
betreffend das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auf obige Ausführungen
betreffend die erfindungsgemäße Detektionseinheit
sowie auf die Verwendung der erfindungsgemäßen Detektionseinheit verwiesen
werden, welche für
das zuvor beschriebene Verfahren entsprechend gelten.
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Die
erfindungsgemäße Detektionseinheit, insbesondere
der erfindungsgemäße Biosensor, kann
gleichermaßen
in einem Verfahren zur Ermittlung des Risikos, an einer Krankheit
zu erkranken, bzw. zur Prognose eines Krankheitsverlaufs bzw. zur Prognose
von individuellen Arzneimittelwirkungen bei Behandlung einer Krankheit
eingesetzt werden. Bei der Krankheit handelt es sich – wie zuvor
beschrieben – um
Tumorerkrankungen, insbesondere Krebserkrankungen, insbesondere
des Urogenitaltraktes oder entzündliche
Erkrankungen des Urogenitaltraktes. Das Verfahren ist dabei durch
die folgenden Verfahrensschritte gekennzeichnet:
- a)
Zunächst
Bereitstellung einer gegebenenfalls aufgearbeiteten Probe aus biologischem
bzw. körpereigenem
Material eines Patienten, wobei die Probe eine Körperflüssigkeit, insbesondere Blut bzw.
Urin, oder Körpergewebe,
insbesondere Tumorgewebe, darstellt; dann
- b) Untersuchung der Probe auf Vorhandensein spezifischer Zielmoleküle, insbesondere
wie zuvor definiert, insbesondere Erstellung eines spezifischen
Profils von Zielmolekülen
(Markerprofil) unter Verwendung einer zuvor definierten Detektionseinheit
nach der vorliegenden Erfindung; anschließend
- c) Auswertung, insbesondere Abgleich der spezifischen Zielmoleküle bzw.
des Profils von Zielmolekülen
(Markerprofil) mit einer Referenzdatenbank (wobei die Referenzdatenbank
entsprechende Markerprofile einer Vielzahl von Patienten und das
hiermit korrelierende Krankheitsbild, insbesondere den dem Markerprofil
zuzuordnenden pathologischen und/oder klinischen symptomatischen
und/oder histologischen Befund, erfaßt bzw. enthält); schließlich
- d) Erstellung einer Diagnose der Krankheit bzw. Ermittlung eines
Risikos, an einer Krankheit zu erkranken, bzw. Prognose eines Krankheitsverlaufs bzw.
Prognose von individuellen Arzneimittelwirkungen bei Behandlung
einer Krankheit auf Grundlage der Auswertung bzw. Abgleich der spezifischen
Zielmoleküle
bzw, des Profils von Zielmolekülen
(Markerprofil) mit der Referenzdatenbank.
-
Für weitere
Ausführungen
betreffend das zuvor beschriebene Verfahren kann auf obige Ausführungen
betreffend die erfindungsgemäße Detektionseinheit,
die Verwendung der Detektionseinheit nach der Erfindung sowie das
Verfahren zur Bestimmung von Zielmolekülen verwiesen werden, welche
hier entsprechend gelten.
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Schließlich kann
die erfindungsgemäße Detektionseinheit,
insbesondere der erfindungsgemäße Biosensor,
gleichermaßen
in einem Verfahren zur Herstellung einer Referenzdatenbank für Krankheiten
aus der Gruppe von Tumorerkrankungen, insbesondere Krebserkrankungen,
und entzündlichen
Erkrankungen des Urogenitaltraktes mit einer Vielzahl von krankheitsspezifischen
Profilen einer Vielzahl von Patienten, wobei das Verfahren durch
die folgenden Verfahrensschritte gekennzeichnet ist:
- a) Bereitstellung einer gegebenenfalls aufgearbeiteten Probe
aus biologischem bzw. körpereigenem
Material eines Patienten, insbesondere ausgewählt aus Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut
bzw. Urin, oder Körpergewebe,
insbesondere Tumorgewebe; dann
- b) Untersuchung der Probe auf Vorhandensein spezifischer Zielmoleküle, insbesondere
wie zuvor definiert, insbesondere zur Erstellung eines spezifischen
Profils von Zielmolekülen
(Markerprofil), vorzugsweise unter Verwendung einer zuvor definierten
erfindungsgemäßen Detektionseinheit;
dann
- c) Korrelation der in Verfahrensschritt b) ermittelten Zielmoleküle, insbesondere
des in Verfahrensschritt b) erstellten Profils von Zielmolekülen (Markerprofil),
mit dem der Probe zuzuordnenden pathologischen bzw. klinischen bzw.
symptomatischen bzw. histologischen Befund des betreffenden Patienten;
dann
- d) Einstellung der in den Verfahrensschritten b) und/oder c)
ermittelten bzw. herangezogenen Daten in die Referenzdatenbank;
anschließend
- e) Wiederholung der Verfahrensschritte a) bis d) an einer Vielzahl
von Patienten; und schließlich
- f) gegebenenfalls Einstellung der ermittelten Zielmoleküle, insbesondere
des in Verfahrensschritt b) erstellten Profils von Zielmolekülen (Markerprofil),
in verschiedene Gruppen, insbesondere verschiedene Gruppen jeweils
gleicher oder zumindest ähnlicher
Korrelation.
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Der
Begriff "Korrelation" ist in diesem Zusammenhang
so zu verstehen, daß die
mittels der erfindungsgemäßen Detektionseinheit
bzw. mittels des zuvor beschriebenen Verfahrens ermittelten Zielmoleküle bzw.
das Profil der Zielmoleküle
(Markerprofil) einer Probe (beispielsweise einer Tumorprobe) eines Patienten
dem krankheitsspezifischen Profil des entsprechenden Patienten zugeordnet
wird. Dies kann beispielsweise und in nichtbeschränkender
Weise dergestalt sein, daß beispielsweise
anhand statistischer Auswertungen an einer Vielzahl von Patienten einem
bestimmten Zielmolekül
bzw. Markermolekül ein
erhöhtes
Rezidivrisiko in bezug auf die Tumorerkrankung zugeordnet wird.
Diese aufgrund einer Vielzahl statistischer Daten angenommene Korrelation kann
dann als Grundlage für
eine Aussage hinsichtlich einer Rezidivabschätzung in bezug auf einen Patienten
herangezogen werden, in dessen Probe das entsprechenden Zielmolekül bzw. Markermolekül nachgewiesen
wird.
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Mit
anderen Worten besteht das Prinzip der Referenzdatenbank darin,
daß zunächst eine
möglichst
große
Anzahl von beispielsweise Tumorgewebsproben auf das Vorhandensein
der oben angeführten
Zielmoleküle
bzw. Markermoleküle
bzw. Tumormarker (d. h, das Markerprofil) überprüft wird, um auf diese Weise
einen Einfluß der
Zielmoleküle
auf den Krankheitsverlauf des Patienten zu ermitteln. Die so gewonnenen
Zusammenhänge
bzw. der entsprechende Nachweis des Einflusses des Zielmoleküls auf den
Krankheitsverlauf können
dann als Referenz in bezug auf weitere Proben anderer Patienten übertragen
bzw. herangezogen werden.
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Diesbezüglich kann
beispielsweise und in nichtbeschränkender Weise derart verfahren
werden, daß beispielsweise
Paraffinmaterial von histopathologisch sowie klinisch im Rahmen
einer operativen Diagnostik/Therapie und Nachsorge dokumentierten
Patienten – beispielsweise
mit nachgewiesenem Harnblasenkarzinom – in Form eines sogenannten
Tissue Microarrays (TMA), welches eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Detektionseinheit darstellt,
untersucht wird. Dabei werden nahezu sämtliche derzeit bekannten Tumormarker
mit Einfluß auf
den individuellen Krankheitsverlauf an einer Vielzahl von Tumorproben
getestet. Die darauf basierenden Tumorproben und als Referenz herangezogene
Proben normalen Gewebes präsentieren
die Harnblasenkarzinomerkrankung in bezug auf die gesamte klinische
Breite, z. B. in bezug auf die Rezidiv- und Progressionswahrscheinlichkeit.
In diesem Zusammenhang kann die erfindungsgemäße Detektionseinheit bzw. der
Tissue Microarray (TMA) aus zwei unterschiedlichen Arrays (beispielsweise
Meßeinrichtungen
oder Elektrodenarrays) bestehen. Ein Array (Rezidiv-TMA) repräsentiert
oberflächliche Harnblasenkarzinome
mit dokumentiert aufgetretenem Rezidiv. Der zweite Array (Progressions-TMA) entspricht
aggressiven Tumoren mit dokumentierter Tumorprogression oder Tod
infolge des Tumors. Nach Analyse der Ergebnisse können die
so definierten Antikörper
(Fängermoleküle) auf
die erfindungsgemäße Detektionseinheit
aufgebracht werden, um so die Analyse von Gewebeproben oder Körperflüssigkeiten
zu ermöglichen
und um auf diese Weise eine individuelle Prognoseabschätzung in
bezug auf das Rezidivrisiko, Progressionsrisiko und dergleichen
zu ermöglichen.
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Insbesondere
in Zusammenhang mit der Erstellung der Referenzdatenbank kann die
Probeentnahme bei einem Patienten in bezug auf Tumorgewebe wie folgt
durchgeführt
werden:
- A) Einverständniserklärung über die wissenschaftliche Nutzung
von entnommenem Gewebe und der Krankheitsgeschichte durch den Patienten;
- B) Probenasservierung im Operationssaal durch Personal der Referenzdatenbank:
– Präparation
eines repräsentativen
Tumorgewebestücks
und Präparation
von Normalgewebe durch geschultes Personal nach Anweisungen des
Operateurs
- C) Unterleitung des Tumor- und Normalgewebes in drei gleiche
Stücke
mit Asservierung wie folgt:
1. Vorbehandlung des Gewebes, beispielsweise mit
Histo-Frees-Spray, Einbringen des ersten Gewebepräparates
in Flüssigstickstoff
(Warmischämiezeit < 3 Minuten); es
resultiert eine erste Gewebetube,
2. Einbringen des zweiten
Gewebestücks
in Formalin und Weitergabe an die Pathologie für eine Referenzhistologie und
Aufbewahrung bei Raumtemperatur; es resultiert eine zweite Gewebetube,
3.
Einbringen des dritten Gewebepräparates
in RNAlater und Aufbewahrung bei Kühlschranktemperatur für 24 Stunden
und anschließend
bei –25°C; es resultiert
eine dritte Gewebetube;
4. Zusätzlich werden von dem jeweiligen
Patienten eine Monovette-EDTA
Blut und eine Serummonovette abgenommen (je nach Tumorentität wird zusätzlich eine
Urinprobe genommen) und Aufbewahrung unter Tiefkühlung bei –20°C;
5. Erstellung eines
Einfrierprotokolls
- D) Probenasservierung und Verwaltung in der Referenzdatenbank:
1.
Aufbewahrung des Gewebes in der zentralen Referenzdatenbank bzw.
Tumordatenbank;
2. Erstellung eines Markerprofils in zuvor
beschriebener Weise;
3. Verwaltung des Gewebes und der Patientendaten
gemäß einem
definierten, insbesondere EDV-gestützten Muster;
4. Bereitstellung
des Gewebes zur Aufbereitung.
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Auf
diese Weise wird eine standardisierte Asservierung des operativ
entfernten Gewebes gewährleistet,
und die intraoperativ gewonnenen Erkenntnisse bezüglich des
bestimmten Marker- bzw. Antigenprofils bleiben für Referenzuntersuchungen durch
herkömmliche
Verfahren, wie immunohistochemische Färbungen, reproduzierbar.
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Die
erfindungsgemäße Detektionseinheit weist
zahlreiche Vorteile auf, von denen rein beispielhaft die folgenden
genannt werden sollen.
- • Bei der erfindungsgemäßen Detektionseinheit handelt
es sich um einen insbesondere elektrischen Biochip, der individuell
mit spezifischen Fän germolekülen zur
Detektion spezifischer Zielmoleküle
eingesetzt werden kann. Durch die variable und anwendungsbezogene
Ausstattung mit Fängermolekülen kann
der Biochip für
unterschiedlichste Anwendungen individuell abgestimmt werden.
- • Aufgrund
des vorzugsweise elektrischen Meßprinzips entfallen weitere
Erfassung- bzw. Detektionsvorrichtungen, wie optische Sensoren.
Denn die erfindungsgemäße Detektionseinheit
vereint in einer Vorrichtung sowohl Erfassungskomponenten für die Zielmoleküle als auch
Ausgabekomponenten für
das Meßsignals,
so daß weitere diesbezügliche Vorrichtungen,
wie optische Auswertevorrichtung, entfallen. Hierdurch vereinfacht sich
der Aufbau der gesamten Vorrichtung deutlich.
- • Aufgrund
der kompakten Struktur der erfindungsgemäßen Detektionseinheit und der
geringen Anzahl an zusätzlichen
Vorrichtungen ist der Gesamtaufbau gleichermaßen kompakt, so daß insgesamt
ein portables System resultiert, welches vor Ort – beispielsweise
in einem Operationssaal – eingesetzt
werden kann.
- • Mit
Hilfe der erfindungsgemäßen Detektionseinheit
ist eine rasche Identifizierung (Testdauer ca. 20 Minuten) beispielsweise
gewebetypischer Marker bei einer Krebsoperation möglich, so
daß bereits
vor Ort während
einer Operation sicher und schnell diese Marker quantifiziert werden können.
- • Mit
Hilfe des Meßverfahrens
zur Bestimmung eines Antigenprofils können bereits beispielsweise intraoperativ
Informationen zum Antigenprofil des vorliegenden Gewebes z. B. in
Ergänzung
zum Ergebnis der herkömmlichen,
routinemäßigen Schnellschnittuntersuchung
erhalten werden, so daß therapeutische
Entscheidungen schon während
der Operation getroffen bzw. optimiert werden können. Dies führt zu erheblichen
Vorteilen für
den zu behandelnden Patienten.
- • Insgesamt
resultiert somit ein System zur Bestimmung von Markerprofilen, welches
eine einfache Bedienung aufweist, gut zu desinfizieren ist und selbstständige Messungen
mehrerer paralleler Proben ermöglicht.
Zudem ist eine Anbindung eines separaten Miniautomatens zur parallelen Probenvorbehandlung
(z. B. käufliches
Portalrobotersystem der Fa. Gilson) möglich.
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Weitere
Ausgestaltungen, Abwandlungen und Variationen der vorliegenden Erfindung
sind für den
Fachmann beim Lesen der Beschreibung ohne weiteres erkennbar und
realisierbar, ohne daß er
dabei den Rahmen der vorliegenden Erfindung verläßt.
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Die
vorliegende Erfindung wird anhand des nachfolgenden Ausführungsbeispiels
veranschaulicht, welches die vorliegende Erfindung jedoch keinesfalls
beschränken
soll.
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AUSFÜHRUNGSBEISPIEL:
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Ausführunsgbeispiel der Bespottung
der Siliziumchips am Beispiel VEGF:
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Geräte:
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- 1. Stereo-/Auflichtmikroskop (z. B. Nikon SMZ 1000)
- 2. Bespottungseinrichtung bestehend aus Mikromanipulator mit
Injektionseinheit (z. B. Eppendorf FemtoJet + Eppendorf InjectMan
NI2)
- 3. eBiochip Analysegerät
Fraunhofer Institut
- 4. Computersoftware Origin und MCDDE32 zum Betrieb des Analysegerätes
- 5. Gewebehomogenisator zur Tumorgewebeaufarbeitung (z. B. Quiagen
TissueLyser)
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Lösungen:
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- 1. Antikörperlösung (z.
B. VEGF)
- 2. Sulfo-NHS-LC-Biotin zur Biotinylierung der Antikörperlösung
- 3. TBS Puffer (pH 7 und pH 8)
- 4. TTBS Puffer (pH 7)
- 5. TTBS-BSA Puffer (1%ig) (pH 7)
- 6. Glycin/HCl (pH 2)
- 7. pAPP Substrat
- 8. Anti-SEB-Biotin 1:250
- 9. Extravidin-AP-Konjugat 1:500
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Ablauf der Bespottung:
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Die
Kapillarnadel der Injektionseinheit wird mit der Antikörperlösung (pAK
1:1 in PBS ca. 1 mg/ml) befüllt
und in den InjectMan eingespannt. Die vorgefertigten Siliziumchips
werden unter dem Auflichtmikroskop fixiert und eingestellt. Anschließend erfolgt
die Applikation der Antikörperlösung unter
manueller Einstellung mittels des Mikromanipulators mit einer Konzentration
von ca. 1 mg/ml druck- und zeitgesteuert, so daß sich eine Menge von 30 nl
Antikörperlösung pro
Meßposition
ergibt. Die Positivkontrollposition wird mit a-fd bacteriophage-Biotin
1:250 in PBS bespottet. Die Negativkontrollposition werden mit 1
% BSA in PBS bespottet. Nach Bespottung der 16 Meßpositionen
wird der Chip mit PBS abgedeckt, so daß eine Lagerung über einige
Stunden möglich ist.
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Ablauf der Gewebeaufarbeitung:
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Zur
Gewebeaufarbeitung wird ein etwa 5 × 5 mm große Tumorgewebsstück zusammen
mit drei 3 mm-Edelstahlbeats in ein Rundboden-Eppendorf-Cup gegeben
und mit einer Frequenz von 30/Min über 600 Sekunden durch Schwingungen
zerkleinert (Quiagen TissueLyser). Der Überstand wird abpippetiert
und dient als Probe für
die Proteinmessung.
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Ablauf der Messung:
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Die
Messung erfolgt vollautomatisch innerhalb des eBiochip Analysegerätes mithilfe
der oben genannten Analysesoftware. Hierzu wird der bespottete Siliziumchip
in das Anlaysegerät
eingelegt und die einzelnen Lösungen, ähnlich dem
Verfahren bei einem Sandwich-ELISA, in definierter Folge und Menge über die
Meßpunkte
des Siliziumchips gegeben. Die Ergebnisse werden durch die Analysesoftware
graphisch in Form von Balkendiagrammen dargestellt, die die Antigen/Antikörperreaktion
und -bindung auf jeder der 16 Meßpositionen sichtbar machen.