CH625625A5

CH625625A5 -

Info

Publication number: CH625625A5
Application number: CH391575A
Authority: CH
Inventors: Ivar Giaever
Original assignee: Gen Electric
Priority date: 1974-04-01
Filing date: 1975-03-26
Publication date: 1981-09-30
Also published as: US3960490A; FR2274919B1; GB1514192A; US3960491A; DE2512730A1; US3960489A; FR2274919A1; DE2512730C2

Description

55 Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel zur Prüfung auf An- bzw. Abwesenheit von bestimmten immunologisch reaktiven biologischen Teilchen in Untersuchungsmustern.

Immunologische Reaktionen sind hoch spezifische biologische Reaktionen, in denen ein erstes immunologisch reaktives 60 biochemisches Teilchen (im allgemeinen ein Protein), das als Antigen bekannt ist, sich mit einem zweiten Protein verbindet, das spezifisch für das Antigen ist und als Antikörper bekannt ist, wobei ein immunologisch komplexiertes Protein gebildet wird. Immunologische Reaktionen finden innerhalb eines biologi-65 sehen Systems, wie einem Tier oder einem Menschen, statt und solche Reaktionen sind lebenswichtig zur Bekämpfung von Krankheit. In einem biologischen System veranlasst der Eintritt eines Fremdproteins, d.h. eines Antigens, das biologische System

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zur Bildung spezifischer Antikörperproteine gegenüber dem Antigen in einem Verfahren, das bisher noch nicht voll verstanden ist. Die Antikörperprotein-Moleküle weisen verfügbare chemische Bindestellen auf, die komplementär zu denen der Antigen-Moleküle sind, so dass sich Antigen und Antikörper unter Bildung eines immunologisch komplexierten Proteins miteinander verbinden.

Die meisten Antigene sind Proteine oder enthalten Proteine als einen wesentlichen Teil, während alle Antikörper Proteine sind. Proteine sind grosse Moleküle von hohem Molekulargewicht, d.h. Polymere, die aus Ketten einer unterschiedlichen Zahl von Aminosäuren bestehen. In den DT-OS 23 30 702 und 24 33 246 ist offenbart, dass ein willkürlich ausgewähltes Protein an einer Substratoberfläche nur in einer monomolekularen Schicht haftet und dass kein anderes willkürlich ausgewähltes Protein an dieser ersten Proteinschicht haften wird. Ein spezifisch mit dem adsorbierten ersten Protein reagierendes Protein wird sich jedoch immunologisch mit dieser ersten Proteinschicht verbinden. Diese Feststellung ist gemäss den oben genannten Druckschriften dazu benutzt medizinisch diagnostische Vorrichtungen zu schaffen, in denen eine Substratoberfläche, wie ein Objektträger, mit einer monomolekuralen Schicht adsorbierten Proteins dazu benutzt wird, Lösungen zu untersuchen, in denen man die Anwesenheit des spezifisch reagierenden Proteins dafür vermutet. Ist das spezifisch reagierende Protein in der Lösung vorhanden, dann weist die Substratoberfläche, nachdem man sie der Lösung ausgesetzt hat, eine bimolekulare Proteinschicht auf. Ist das spezifisch reagierende Protein in der Lösung nicht vorhanden, dann hat die Substratoberfläche auch nachdem man sie der Lösung ausgesetzt hat,nur die ursprüngliche monomolekulare Schicht. In den obigen Druckschriften sind ausserdem optische, elektrische und chemische Mittel angegeben, um zwischen monomolekularen und bimolekularen biologischen Teilchenschichten zu unterscheiden.

Da in biologischen Systemen Antikörper als Antwort auf das Eindringen von Fremdproteinen produziert werden, ist der Nachweis von Antikörpern in einem biologischen System von medizinisch diagnostischem Wert für die Bestimmung der Antigene, denen das System ausgesetzt worden ist. Ein typisches Beispiel für den diagnostischen Nachweis von Antikörpern ist der Nachweis von Antikörpern zur Syphilis oder Gonorrhoe in menschlichem Serum. Umgekehrt hat aber auch der Nachweis gewisser Antigene in einem biologischen System medizinisch diagnostischen Wert. Beispiele des diagnostischen Nachweises von Antigenen schliessen den Nachweis von HCG-Proteinmole-külen in Urin als Nachweis für die Schwangerschaft und den Nachweis der mit der Hepatitis verbundenen Antigenmoleküle (HAA) im Blut in Aussicht genommener Blutspender ein.

Um solche diagnostischen Tests auszuführen, muss das geeignete Protein des immunologisch reagierenden Paares erhalten werden. Die einzige bekannte Quelle eines Antikörperproteins ist ein lebendes biologisches System. Im einzelnen sind derzeit sogar nur Wirbeltiere bekannt, die die Einführung eines Fremdproteins mit immunologischen Reaktionen beantworten. So werden z.B. im Blutserum von Tieren und Menschen, die den entsprechenden Antigenen ausgesetzt worden sind, viele Antikörper gefunden. Es können jedoch viele Antigene kontrollierbar in Laboratoriumskulturen hergestellt werden. Einige Antigene jedoch, wie die mit der Hepatitis verbundenen Antigene, sind derzeit, wie Antikörper, nur aus höheren lebenden biologischen Systemen erhältlich.

Es ist in der Immunologie bekannt, dass Antikörpermoleküle als Antigene wirken, wenn sie in das System eines Wirbeltieres eingeführt werden, für das sie Fremdproteine sind. Auf diese Weise können spezifisch reagierende Antikörper zu einem gegebenen Antikörper leicht in einem solchen Wirbeltier erzeugt werden.

Derzeit beruht die Sammlung und Reinigung und die diagnostische Nutzung immunologisch reaktiver biologischer Teilchen auf der ausfällenden oder agglutinierenden Eigenschaft der Proteine, die aus der immunologischen Komplexierungsre-5 aktion erhalten werden. Das klassische Beispiel dieser diagnostischen Anwendungen ist die Blutgruppenbestimmung, bei der Blutproben mit Serumantikörpern vermischt werden und bei der die Blutgruppe durch Beobachtung der in den Blutproben auftretenden Agglutinierungen bestimmt wird.

io Eine andere diagnostische Anwendung der immunologisch reaktiven biologischen Teilchen ist der Schwangerschaftstest mit HCG-Protein, der derzeit als Verhinderungstest ausgeführt wird. Dieser Test wird in der Weise ausgeführt, dass man eine Menge von Anti-HCG-Serum mit einer Urinprobe vermischt. 15 Dann wird eine Vielzahl von Polystyrolkügelchen, die mit HCG-Protein beschichtet worden sind, in die vorher zubereitete Urinprobe eingeführt. Die Polystyrolkügelchen werden aggluti-nieren, wenn und nur wenn in der Urinprobe kein HCG-Protein vorhanden ist. In diesem Falle komplexiert das HCG-Protein 20 auf den Polystyrolkügelchen mit dem Anti-HCG-Serum, das man vorher zu der Urinprobe hinzugegeben hat und dadurch agglutinieren die Kügelchen. Ist dagegen in der Urinprobe HCG-Protein vorhanden, dann komplexiert dieses mit dem zuerst hinzugegebenen Anti-HCG-Serum, so dass für das HCG-25 Protein auf den Kügelchen kein Antiserum mehr verfügbar ist, um das HCG-Protein auf den Kügelchen zu komplexieren und somit zu agglutinieren. Im Falle anderer diagnostischer Proteintests, wie dem Nachweis des mit der Hepatitis verbundenen Antigens, wäre es sehr erwünscht, einen empfindlicheren Test 30 zu haben, sowie einen, mit dem man die Konzentration der Antikörper oder Antigene messen könnte. Der Nachteil der Agglutinierungstests besteht darin, dass die beteiligten Teilchen aus irgendeinem einer Vielzahl von Gründen, die nichts mit einer immunologischen Agglutinierung zu tun haben, agglome-35 rieren können und auf diese Weise die Zuverlässigkeit des Tests verringern. Üblicherweise werden die Agglutinierungstests mit grosser Sorgfalt durch gut ausgebildetes Personal durchgeführt, doch gelegentlich treten diagnostische Fehler auf.

Immunologische Experimente sind in der Vergangenheit auf 40 Celluloseacetat-Membranen und in Gelen ausgeführt worden, bei denen Proben, die Antigene und Antikörper enthielten, auf unterschiedliche Bereiche der feuchten Membran (oder in Schächten in dem Gel) aufgebracht wurden und aufeinander zu diffundierten und dabei eine komplexierte Proteinniederschlag-45 linie bildeten. Bei diesen Experimenten nach dem Stand der Technik war die Empfindlichkeit jedoch nicht so hoch wie sie oft erwünscht war und die Nierderschlagslinie, die von der immunologischen Reaktion herrührte, war mit dem blossen Auge nicht sichtbar, solange die Celluloseacetat-Membran oder das 50 Gel nicht in geeigneter Weise mit einem Proteinmaterial gefärbt war, wie Amido-Schwarz, wie in dem Buch «Methods in Immu-nology and Immunochemistry», Band III, herausgegeben durch C.A. Williams und M.W. Chase, Academic Press, Seiten 153 und 169 beschrieben. Dieses Anfärben bedeutet eine zusätzli-55 che Stufe in dem Verfahren zum Nachweisen solcher biologischer Teilchen. Ausserdem hat die Bildung der Niederschlagslinie in dem Gel den Nachteil, dass sich während der Lagerung des Gels ein unerwünschtes Bakteriumswachstum ergibt.

Obwohl die Substrate (Objektträger), die in den oben ge-60 nannten Druckschriften beschrieben sind, hinsichtlich ihrer Leistungsfähigkeit zum Nachweis einer bimolekularen Schicht aus immunologisch reaktiven biologischen Teilchen als zufriedenstellend erwiesen haben, sind diese Substrate für die Doppeldiffusionstechnik nicht geeignet.

65 Weiter zeigen die in den oben genannten Druckschriften beschriebenen Substrate nicht die Konzentration der biologischen Teilchen, die die zweite monomolekulare Schicht auf dem Substrat bilden, in einer Lösung an, wenn nicht ein Einstellver

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fahren verwendet wird. Es ist daher festzustellen, dass durch den Gebrauch der metallisierten Objektträger allein kein Mittel zur Bestimmung der Konzentration der zweiten Teilchen in einer Probe, wie einer Blutprobe gegeben ist. Ähnliche Nachteile ergeben sich auch mit dem anodisierten Tantalobjektträger, der in folgenden Artikeln beschrieben ist:

«Interactions Among Human Blood Proteins at Interfaces» von L. Vroman et al, Fédération Proceedings, Band 30, Nr. 5 (September-Oktober 1971), Seiten 1494 bis 1502 und «Three Simple Ways to Detect Antibody-Antigen Complex on Fiat Surfaces» von A.L. Adams et al, Journal of Immunological Me-thods 3 (1973, Seiten 227 bis 232, der weniger empfindlich ist als der in der US-Patentanmeldung Serial No. 445 204 beschriebene Indiumgoldlegierung-Indiumoxyd-Objektträger, insbesondere für den Nachweis der Hepatitis. Ein anderer Artikel, der sich auf metallisierte Objektträger nach dem Stand der Technik bezieht, ist der von Alexandre Rothen «Immunologie and Enzymatic Reactions Carried out at a Solid-Liquid Interface» in Physiological Chemistry and Physics 5 (1973), Seiten 243 bis 258.

Das erfindungsgemässe Mittel zur Prüfung auf An- bzw. Abwesenheit von bestimmten immunologisch reaktiven biologischen Teilchen in Untersuchungsmustern ist im Patentanspruch 1 definiert.

Während des Diffusionsprozesses wird die Vorrichtung in einer Feuchtigkeitskammer belassen. Es ist zu bemerken, dass die zweiten biologischen Teilchen mit einer Empfindlichkeit nachgewiesen werden, die wesentlich höher ist als die, die mit der üblichen Doppeldiffuionstechnik erhalten werden konnte. Typische Beispiele für die feste Oberfläche sind Mikroskop-Objektträger, Glasplatten oder Schalen, Kunststoffplatten oder -schalen usw.

Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen, die spezielle Ausführungsformen der Erfindung darstellen, näher beschrieben. Im einzelnen zeigen:

Figur la eine Draufsicht auf eine Vorrichtung gemäss einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bestehend aus einer metallisierten Schale mit einer Gelschicht, vor dem Aufbringen der Proben in die durch die Gelschicht hindurch gebildeten Schächte,

Figur lb einen Querschnitt durch die Vorrichtung nach Figur la entlang der Linie lb-lb,

Figur 2a eine Draufsicht auf die Vorrichtung nach Figur la nach der Diffusion der Proben und der Bildung der Niederschlagslinien,

Figur 2b einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur 2a entlang der Linie 2b- 2b,

Figur 3a eine Draufsicht einer Vorrichtung aus metallisiertem Substrat mit Gelschicht gemäss einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vor dem Aufbringen der Proben in die durch die Gelschicht gebildeten Schächte,

Figur 3b einen Querschnitt durch die Vorrichtung nach Figur 3a entlang der Linie 3b-3b,

Figur 4a eine Draufsicht auf die Vorrichtung nach Figur 3a nach der Diffusion der Proben und der Bildung der Niederschlagslinien,

Figur 4b einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur 4a entlang der Linie 4b-4b,

Figur 5A eine Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform der Vorrichtung nach der vorliegenden Erfindung zu einem Zeitpunkt, zu dem zwei Tropfen von Lösungen, die biologische Teilchen enthalten können, auf eine Celluloseacetat-Membran aufgebracht sind,

Figur 5B einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur 5A entlang der Linie 5B-5B,

Figur 6A eine Draufsicht auf die Vorrichtung nach Figur 5A nach der Diffusion der beiden Tropfen und der Bildung des Niederschlags,

Figur 6B einen Querschnitt der Vorrichtung nach Figur 6A entlang der Linie 6B-6B,

In den Figuren la und lb ist eine Ausführungsform der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung gezeigt, zum Nachweis 5 einer immunologischen Reaktion. Im einzelnen besteht diese Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung aus einem geeigneten Behälter 10, wie einer kleinen Schale aus Glas, Metall oder Kunststoff oder einem Trog oder einer anderen Art Behälter aus geeignetem festem Material, wobei der Behälter i0einen sich im allgemeinen vertikal erstreckenden Randteil aufweist, um ein flüssiges Medium innerhalb des Behälters zu halten. Auf die innere Bodenfläche des Behälters 10 sind Metallteilchen aufgedampft und sie bilden eine nicht-durchgehende Schicht 11 aus solchen Metallteilchen, um einen metallisierte 15 Oberfläche auf der Innenseite des Behälters zu schaffen. Ein typisches Beispiel für die Metallisierung des Behälters 10 ist eine nicht-durchgehende Schicht aus Indiumkügelchen mit einer durchschnittlichen Dicke von 2000 bis 4000 Â. Es kann aber auch ein durchgehender Film aus einem einzigen Metall oder 20 einer Legierung aus zwei Metallen oder ein einzelnes Metall oder eine Legierung aus zwei Metallen mit einem Oxydfilm auf einem der Metalle als Metallisierung für die Oberfläche des Behälters 10 benutzt werden. Eine geeignete Legierung ist z.B. die aus Indium und Gold. Ein typisches Beispiel für ein einzel-25 nes Metall mit Oxyd ist Indium mit einem Indiumoxydfilm von einigen hundert Â Dicke oder Nickel/Nickeloxyd. Schliesslich ist eine typische Metallisierung aus einer Legierung aus zwei Metallen mit einem Oxydfilm eines der Metalle eine Gold/In-diumlegierung mit einem Indiumoxydfilm darauf, der aus einer 30 kontinuierlichen oder nicht-kontinuierlichen Schicht von Indiumteilchen besteht, wie in der oben genannten US-Patentanmeldung Serial No. 445 204 beschrieben.

Der metallisierte Behälter 10 wird dann auf einem geeigneten Träger angeordnet, und eine geringe Menge Gel in den 35 Behälter 10 gegossen, um die metallisierte Oberfläche bis zu einer Dicke von weniger als 1 mm zu bedecken und auf diese Weise eine Diffusionsschicht aus Gel 12 in einer Dicke von weniger als 1 mm zu bilden. Die üblichsten Gele, die für die immunologischen Reaktionstests geeignet sind, sind Agar und 40 Agarose. Die in den Behälter 10 gegossene Gellösung kann eine Salzlösung, eine Lösung in destilliertem Wasser und eine gepufferte Lösung sein, je nach den Lösungen der biologischen Teilchen, die in dem Test benutzt werden sollen, wie dies in dem oben genannten Buch «Methods in Immunology and Immuno-45 chemistry» auf den Seiten 147/148 beschrieben ist. Nachdem das Gel sich verfestigt hat, wird eine Vielzahl im geringen Abstand voneinander angeordneter Schächte 13a-e durch die dünne Gelschicht 12 in irgendeiner geeigneten Weise eingebracht, wie auf Seite 149 des vorgenannten Buches beschrieben. 50 Die Hauptunterschiede zwischen der vorliegenden Erfindung und dem Stand der Technik hinsichtlich der Diffusion in Gel, wie in dem vorgenannten Buch beschrieben, sind, wie gesagt:

(1 ) Die erfindungsgemässe Vorrichtung erfordert eine me-55 tallisierte feste Oberfläche, da die sichtbare Niederschlagslinie, die von einer immunologischen Reaktion biologischer Teilchen herrührt, auf der metallisierten Oberfläche gebildet wird (obwohl die Niederschlagslinie auch in dem Gel gebildet wird). Hinsichtlich der bekannten Vorrichtung ist keine metallisierte 60 feste Oberfläche offenbart, vielmehr ist lediglich ein Mittel zum Tragen der Gelschicht genannt.

(2) Die in der vorliegenden Erfindung benutzte Gelschicht ist wesentlich dünner als die bekannte Gelschicht, wobei die bekannte Gelschicht mindestens 1 mm aufweist, und in dem 65 vorgenannten Buch als in dem Bereich von 1 bis 3 mm liegend beschrieben ist, während die Diffusionsschicht nach der vorliegenden Erfindung eine Dicke von weniger als 1 mm aufweist.

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Dieser beträchtliche Unterschied in der Dicke rührt von der Tatsache her, dass in der erfindungsgemässen Vorrichtung das Gel als eine Diffusionsschicht lediglich für eine Diffusion benutzt wird, d.h. zum Zwecke des Haltens von Feuchtigkeit in einem unbeweglichen Zustand, so dass Proben der immunologisch reaktiven biologischen Teilchen entlang der metallisierten festen Oberfläche diffundieren können und darauf die reproduzierbaren Niederschlagslinien bilden. Bei der Vorrichtung nach dem Stand der Technik wird die Niederschlagslinie in dem Gel gebildet und deshalb ist eine dickere Gelschicht erforderlich, um eine ausreichend dicke Niederschlagslinie zu bilden, die sichtbar ist.

(3) Als Ergebnis von (2) wird die gemäss der vorliegenden Erfindung gebildete Niederschlagslinie ein dauerhafter Nachweis der immunologischen Reaktion, der kein Anfärben erfordert, um sichtbar zu sein. Bei der bekannten Vorrichtung erfordert das Gel häufig ein Anfärben, um die Niederschlagslinie für das blosse Auge sichtbar zu machen und selbst dann erhält man weniger Kontrast zwischen der Linie und dem Hintergrund als in der vorliegenden Erfindung.

(4) In der vorliegenden Erfindung werden die Schächte vollkommen durch die Gelschicht hindurch gebildet. Bei der Vorrichtung nach dem Stand der Technik, wie er auf Seite 151 des vorgenannten Buches gegeben ist, müssen die Böden der Schächte von der Oberfläche einer Platte, auf der das Gel getragen ist, abgedichtet sein. Obwohl die erfindungsgemässe Vorrichtung auch zufriedenstelltend arbeitet, wenn die Böden der Schächte von der metallisierten Oberfläche des Behälters 10 abgedichtet sind, ist ein solches Abdichten der Böden der Schächte nicht erforderlich, und es ist bevorzugt, die Schächte vollkommen durch die Gelschicht hindurch zu bilden, wie in allen Figuren dargestellt. Dieser deutliche Unterschied zwischen den Schächten ergibt sich aus der Tatsache, dass die sichtbare Niederschlagslinie in der erfindungsgemässen Vorrichtung auf einer metallisierten festen Oberfläche gebildet ist, während sie nach dem Stand der Technik im Gel selbst gebildet wird.

Die Schächte 13a-e, die durch die Gelschicht 12 hindurch gebildet werden, sind im allgemeinen kreisförmig im Querschnitt und im allgemeinen weisen sie einen gleichen Durchmesser von etwa 1 bis zu mehreren mm auf. Die erfindungsgemässe Vorrichtung unmittelbar vor dem Einbringen der Proben immunologisch reaktiver biologischer Teilchen in die Schächte ist in den Figuren la und lb gezeigt.

In den Figuren 3a und 3b ist eine zweite Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung gezeigt, in der das Teil mit der metallisierten festen Oberfläche nun ein metallisiertes Substrat oder ein metallisierter Objektträger ist, wie er in der US-Patentanmeldung Serial No. 445 204 beschrieben ist. Im einzelnen weist das Substrat 30 eine im wesentlichen flache obere Oberfläche auf und ist aus einem geeigneten Material hergestellt, das Metall, Glas, Kunststoff oder ein ähnliches Material sein kann. Das Substrat 30 ist vorzugsweise in Glasobjektträger, wie ein übliches Mikroskop-Deckglas. Die obere flache Oberfläche des Substrates wird gemäss der vorgenannten US-Patentanmeldung metallisiert. Diese Metallisierung kann z.B. bestehen aus (1) einer nicht durchgehenden Schicht, d.h. aus Metallteilchen oder -kügelchen, wobei Indium ein typisches Beispiel wäre, oder (2) einer ersten Schicht aus Indiumkügelchen, über die ein dünner Goldfilm gelegt ist oder (3) eine Schicht aus Indiumkügelchen (oder eine durchgehende Schicht aus Indium konstanter Dicke), über der ein dünner Goldfilm angeordnet ist. der mit dem Indium legiert ist, und dünner Indiumoxydfilm oder (4) ein Metall, wie Nickel, und Oxydfilm davon. Die Metallisierung mit Indiumteilchen ist häufig die bevorzugte Ausführungsform für im allgemeinen gleich grosse Teilchen, während das mit Indium/Gold-Legierung und Indiumoxyd beschichtete Substrat häufig die bevorzugte Ausführungsform ist für sehr verschieden grosse Teilchen, z.B. wenn man auf Hepatitis untersucht. Die nicht durchgehende Schicht aus Indiumteilchen als Metallisierung erfordert die Anwendung eines lichtdurchlässigen Substrates, wie Glas oder Kunststoff, und die Indiumteilchen werden auf die Substratoberfläche aufgedampft mit Durchmessern in 5 der Grössenordnung von 1000 Â, obwohl die genaue Grösse der Teilchen nicht kritisch ist, solange sie Durchmesser gleich einem grossen Anteil einer Wellenlänge des sichtbaren Lichtes haben. Die Farbe der Indiumteilchen-Metallisierung ist leicht braun. Im Falle der Indium/Gold-Legierung/Indiumoxyd-Me-io tallisierung ist die Dicke des Indiums etwa das Doppelte der Dicke des Goldes, wenn sie anfänglich aufgebracht ist (Indiumdicke etwa 2000 Â, Golddicke etwa 1000 Â) und die Dicke des Indiumoxydfilmes beträgt einige hundert Â, um eine Bronzefarbe eine solchen Filmes zu erhalten. Wie in der vorgenannten 15 US-Patentanmeldung erwähnt, bestimmt der Grad der Oxydation des Indiummetalles die Farbe des oxydierten Filmes, so dass verschiedene Oxydationsgrade verschieden gefärbte Objektträger erzeugen, die unterschiedliche Empfindlichkeiten für verschiedene Dicken der Schichten aus biologischen Teilchen 20 aufweisen.

Im Falle der metallisierten Beschichtung 31 auf der oberen Oberfläche des Substrates 30, die aus Kügelchen allein oder Kügelchen aus einem ersten Metall wie Indium, einem Film aus einem zweiten Metall wie Gold und dem Indiumoxydfilm gebil-25 det ist, ist die obere Oberfläche einer solchen metallisierten Beschichtung leicht irregulär. Wird andererseits eine solche metallisierte Beschichtung mit einer durchgehenden Indiumschicht konstanter Dicke, einem Film aus Gold und dem Indiumoxyd gebildet, dann ist die obere Oberfläche im wesentlichen flach. In 30 der vorliegenden Erfindung können beide Arten metallisierten Substrates 30 benutzt werden. Das Substrat 30 braucht nur eine Grösse von etwa 3,25 cm2 (entsprechend '/: Zoll2) zu haben. Weitere Einzelheiten hinsichtlich der Substratmetallisierung und deren Herstellung sind in den oben genannten DT-OS ge-35 geben.

Die Vorrichtung mit dem metallisierten Substrat 30 wird in gleicher Weise wie die erste Ausführungsform hergestellt. Es wird daher eine dünne Schicht (weniger als 1 mm Dicke) aus Gel 12 auf der metallisierten Oberfläche des Substrates gebildet 40 und zwei oder mehr Schächte 13a und 13b werden vorzugsweise durch die ganze Gelschicht hindurch gebildet.

In den Figuren 5A und 5B ist eine dritte Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung gezeigt, um eine immunologische Reaktion nachzuweisen. Im einzelnen besteht diese 45 Ausführungsform der Vorrichtung aus einem metallisierten Substrat 10 und einer feuchtigkeitshaltigen Cellulose-Membran als einer Diffusionsschicht 11, die mindestens einen Teil der metallisierten Oberfläche des Substrates bedeckt. Das Substrat 10 weist eine im wesentlichen flache obere Oberfläche auf und so ist aus einem geeigneten Material, wie Metall, Glas, Kunststoff oder ähnlichem Material, hergestellt. Das Substrat 10 ist vorzugsweise ein Glasobjektträger, wie ein übliches Mikroskop-Deckglas, das leicht im Handel erhältlich ist. Die obere flache Oberfläche des Substrates wird wie bei der vorbeschriebenen 55 ersten und zweiten Ausführungsform metallisiert. Die Metallisierung kann z.B. folgendermassen sein: (1) eine nicht durchgehende Schicht, d.h. Metallteilchen oder -kügelchen, wobei Indium ein typisches Metall ist, oder (2) eine erste Schicht aus Indiumkügelchen, die mit einem dünnen Goldfilm überlappt 60 sind oder (3) eine Schicht aus Indiumkügelchen (oder eine durchgehende Indiumschicht konstanter Dicke), die mit einem dünnen Goldfilm überlappt sind, der mit dem Indium legiert ist, sowie einem dünnen Indiumoxydfilm oder (4) einem Metall, wie Nickel, und dessen Oxydfilm. Die Indiumteilchen-Metallisie-« rung ist häufig eine bevorzugte Ausführungsform für im allgemeinen gleich grosse biologische Teilchen, während das Indium' Gold-Legierung- und Indiumoxyd-beschichtete Substrat häufig eine bevorzugte Ausführungsform für sehr verschieden grosse

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Teilchen ist, z.B. für den Nachweis der Hepatitis. Die nicht durchgehende Schicht aus Indiumteilchen-Metallisierung erfordert die Anwendung eines lichtdurchlässigen Substrates, wie Glas oder Kunststoff, und die Indiumteilchen, die auf das Substrat aufgedampft sind, weisen Durchmesser in der Grössenord-nung von 1000 Â auf, obwohl die genaue Grösse der Teilchen nicht kritisch ist, solange sie Durchmesser haben, die gleich einem grossen Anteil einer Wellenlänge des sichtbaren Lichtes sind. Die Farbe der Metallisierung aus Indiumteilchen ist leicht braun. Im Falle der Indium/Gold-Legierung und Indiumoxyd-Metallisierung beträgt die Dicke des Indiums etwa das Doppelte der Dicke des Goldes, wenn sie am Anfang aufgebracht ist (Indiumdicke etwa 2000 Â, Golddicke etwa 1000 Â) und der In-diumoxydfilm ist einige hundert Â dick und man erhält eine Bronzefarbe des Filmes. Der Oxydationsgrad des ersten Metalles bestimmt die Farbe des oxydierten Films, so dass verschiedene Oxydationsgrade zu unterschiedlich gefärbten Objektträgern führen, die verschiedene Empfindlichkeiten für unterschiedliche Dicken der Schichten aus biologischen Teilchen aufweisen.

In dem Falle, in dem die metallisierte Beschichtung 10b auf der oberen Oberfläche des Substrates aus Indiumkügelchen oder der Indium/Gold-Legierung und dem Indiumoxydfilm gebildet ist, ist die obere Oberfläche der metallisierten Schicht leicht irregulär. Ist andererseits die metallisierte Beschichtung aus einer durchgehenden Indiumschicht konstanter Dicke, dem Goldfilm und dem Indiumoxyd gebildet, dann ist die obere Oberfläche im wesentlichen flach. In der vorliegenden Erfindung kann jede der beiden Arten metallisierten Substrates verwendet werden. Dies ist gleichermassen auf die anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung anwendbar. Die Cellulose-Membran 11 ist eine geeignete sehr dünne Membran aus Cellulose oder einem Cellulosederivat, wie Celluloseacetat, und sie kann irgendein poröses Papier sein, wie irgendeines der üblichen Filterpapiere oder einfach ein Seidenpapier. Die Dimensionen der Membran 11 können gleich oder verschieden von denen des Substrats 10 sein. Die Membran 11 ist so dünn, wie sie bequemerweise verwendet werden kann und sie weist weniger als 1 mm Dicke auf und sie ist dünner als das Papier, das bei den Doppeldiffusionstechniken nach dem Stand der Technik benutzt wurde. In einer typischen Anwendung und zur besseren Darstellung der erfindungsgemässen Vorrichtung ist die Membran 11 mit geringerer Breite und Länge als das Substrat 10 dargestellt. Das Substrat 10 braucht nur eine Fläche von etwa 3,25 cm2 aufzuweisen. Hinsichtlich weiterer Einzelheiten der Substratmetallisierung und deren Herstellung wird auf die oben genannten DT-OS verwiesen.

Die Cellulose-Membran 11 wird angefeuchtet, bevor oder nachdem sie auf dem Substrat 10 angeordnet ist. Die Membran 11 sollte glatt mit ausreichender Sorgfalt auf der metallisierten Oberfläche angeordnet werden, so dass sie sich entlang ihrer ganzen unteren Oberfläche in Kontakt mit der metallisierten Oberfläche befindet.

Nach dem Zusammenlegen wird das Substrat mit seiner Diffusionsschicht in einer Feuchtigkeitskammer angeordnet und eine erste Lösung, die erste immunologisch reaktive biologische Teilchen enthält, wird in einem ersten Schacht angeordnet, z.B. dem zentral angeordneten Schacht 13a in dem Falle, in dem die Diffusionsschicht ein Gel ist oder auf einem ersten ausgewählten Bereich, wenn die Diffusionsschicht eine feuchte Cellulose-Membran ist. Jede der Proben kann aus einem oder mehreren Tropfen der entsprechenden Lösung bestehen. Unmittelbar nachdem die erste Probe auf der Diffusionsschicht angeordnet ist (z.B. in dem Schacht 13a der Figur 1 a oder auf der Membran 11 der Figur 5A) oder zur gleichen Zeit wird eine Probe einer Testlösung oder eine zweite Probe, von der man annimmt, dass sie zweite immunologisch reaktive biologische Teilchen enthält, die spezifisch zu den ersten Teilchen sind, auf der Diffusionsschicht angeordnet (z.B. in den Schächten 13c, 13b derFigur la oder auf der Membran 11 der Figur 5A), die sich im Abstand von der ersten befinden, und man lässt die beiden Proben in die Schicht diffundieren.

Die erste und die Testlösung enthalten im allgemeinen auch 5 andere (unspezifische) biologische Teilchen, wobei ein typisches Beispiel eine erste Lösung aus Kaninchen-Antiserum und eine Testlösung aus menschlichem Serum ist. Während der Diffusion der Proben in der Diffusionsschicht diffundieren die ersten und anderen (unspezifischen) biologischen Teilchen der ersten Proche in die Schicht und werden auf der Oberfläche der metallisierten festen Oberfläche adsorbiert (z.B. bei 11 der Figur 1 a, 31 der Figur 4b oder 1 Ob der Figur 5B) und bilden eine monomolekulare Schicht (z.B. 13a' bei Figur 2a oder 12a bei Figur 6A) solcher Teilchen darauf. In gleicherweise diffundieren irgend-15 welche zweiten und anderen (unspezifischen) Teilchen der Testlösung oder der zweiten Probe in die Membran und werden auf der Oberfläche des metallisierten Objektträgers unter Bildung einer monomolekularen Schicht solcher Teilchen dort adsorbiert (z.B. 13b' der Figur 2a oder 13a der Figur 6A). Entlang 2o des Schnittbereiches der diffundierenden Proben wird eine komplexierte Protein-Niederschlagslinie gebildet (z.B. 15 in Figur 2a oder 14 in Figur 4a oder 14 in Figur 6A), die verschiedene Schichten dick ist und aus einer immunologischen Reaktion des ersten und zweiten Teilchen resultiert. Die Diffusion der 25 Proben in der Diffusionsschicht (z.B. Gel 12 oder Membran 11 ) findet radial nach aussen statt unter Bildung kreisförmiger Muster, so dass die Niederschlagslinie eine gerade oder gebogene Linie ist, in Abhängigkeit von der Art der Teilchen und deren Konzentrationen. Die Zeit für die Vervollständigung der Diffu-30 sion und der Bildung der Niederschlagslinie ist eine Funktion der Arten der teilnehmenden ersten und zweiten biologischen Teilchen, der Konzentration jedes Teilchens in seiner Lösung, der Temperatur und des Abstandes der Proben auf der Diffusionsschicht. Ein enger Abstand der Proben führt zu raschen 35 sich schneidenden Diffusionen und somit zu der rascheren Bildung der Niederschlagslinie, als wenn die Proben in grösserem Abstand voneinander aufgebracht sind. Die Proben können im Abstand von nur wenigen mm angeordnet werden. Die Zeit für die Diffusion der Proben und der Bildung der Niederschlagslinie 40 beträgt im allgemeinen einige Stunden, obwohl das Verfahren so beschleunigt werden kann, dass nur einige Minuten erforderlich sind, wie im Falle der Elektrophorese oder der erzwungenen Strömung der Lösungen. Das Feuchtigkeitsmittel in der Diffusionsschicht kann destilliertes Wasser, eine Salzlösung 45 oder eine gepufferte Lösung sein, die mit den Proben nicht reagiert und bei der die Feuchtigkeit unbeweglich gehalten ist, so dass eine kontrollierte Diffusion der Proben in der Schicht stattfindet, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.

Nach Bildung der Niederschlagslinie auf der metallisierten so Oberfläche des Substrates wird die Diffusionsschicht, d.h. das Gel 12 oder die Membran 11, von der Substratoberfläche abgezogen und die Substratoberfläche mit der daran haftenden Niederschlagslinie wird gewaschen, üblicherweise mit destilliertem Wasser, und getrocknet, vorzugsweise durch Blasen von Luft 55 bei Raumtemperatur über das Substrat. Die metallisierte feste Oberfläche des Substrates wird dann durch visuelle Betrachtung untersucht. Diese Untersuchung kann eine direkte visuelle Beobachtung mit dem blossen Auge sein, um das von der metallisierten Oberfläche reflektierte oder hindurchgehende Licht zu 60 beobachten. So wird z.B. die Metallisierung aus Indiumteilchen im durchgehenden Licht betrachtet, während die Metallisierung aus Indium/Gold-Legierung und Indiumoxyd im reflektierten Licht betrachtet wird. Die Farbe des Niederschlags hängt hauptsächlich von der Farbe der metallisierten Oberfläche ab. 65 Die komplexierte Protein-Niederschlagslinie ist mit dem blossen Auge sichtbar und sie zeigt einen guten Kontrast zum Hintergrund und dies ermöglicht den Nachweis der biologischen Teilchen in einer Empfindlichkeit, die sehr viel grösser ist als

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die, die mit den üblichen Doppeldiffusionstechniken erhalten wurde. Weiter ist kein Anfärben der Niederschlagslinie erforderlich, und dies im Unterschied zum Stand der Technik, da der Kontrast zwischen der Niederschlagslinie und dem Hintergrund sehr viel grösser ist als nach dem Stand der Technik.

Die Empfindlichkeit ist wesentlich höher als die Empfindlichkeit bei den üblichen Doppeldiffusionstechniken, insbesondere den Techniken, die in dem oben genannten Buch «Me-thods in Immunology and Immunochemistry» Band 3 beschrieben sind. Es ist daher nur eine sehr geringe Menge der biologischen Teilchen erforderlich, um mit der vorliegenden Erfindung nachweisbar zu sein.

Bei dem oben beschriebenen Nachweisverfahren wurde angenommen, das,s die erste Lösung eine bekannte Lösung war, die erste biologische Teilchen enthielt. Andererseits können aber auch die erste und die zweite Lösung Testlösungen sein, von denen man annimmt, dass sie die ersten und zweiten Teilchen enthalten, in welchem Falle die Bildung der Niederschlagslinie anzeigen würde, dass solche Teilchen tatsächlich in den entsprechenden Lösungen vorhanden sind, während die Abwesenheit der Niederschlagslinie nur anzeigen würde, dass eine oder beide Lösungen nicht die entsprechenden Teilchen enthalten haben. Im Falle der bekannten Lösung, die die ersten Teilchen enthält, können solche ersten Teilchen in Laboratoriumskulturen hergestellt oder aus höheren lebenden biologischen Systemen erhalten werden, wie oben beschrieben, und sie sind im Handel in hochreiner Form erhältlich oder sie können, wenn nicht im Handel erhältlich, chemisch gereinigt werden. Die typische Lösung der ersten biologischen Teilchen kann eine Lösung von Salz in Wasser oder einer anderen Flüssigkeit sein, die geeignet und nicht reaktiv ist für die ersten biologischen Teilchen oder eine menschliche Serumprobe.

Die oben als erste und zweite biologische Teilchen bezeichneten biologischen Teilchen können Antigene, Antikörper, Viren, Bakterien, Hormone, Enzyme oder andere biologische Teilchen sein, die man leicht züchten oder in andererWeise isolieren und sammeln kann oder die in menschlichem Serum oder einer anderen untersuchten Lösung vorhanden sind. Ein typisches Beispiel spezieller biologischer Teilchen, die durch das erfindungsgemässe Verfahren nachgewiesen werden, ist Hepatitis B-Antigen, nachfolgend HBAg genannt, als erste biologische Teilchen und Antikörper zur Hepatitits (HB Ab genannt) als zweite biologische Teilchen.

Ein vielen Fällen wird die Probe der ersten Teilchen eine Probe sein, die spezielle Antigene, wie HBAg, enthält. In einem solchen Falle wäre die Testlösung ein Tropfen menschlichen Serums, das man von einem Patienten entnommen hat, von dem man annimmt, dass er Hepatitis B habe. In einem direkten Test dafür würde die Anwesenheit der Antikörper HBAb nachgewiesen werden durch direkte visuelle Beobachtung der Nieder-schlagslinie 14. Andererseits können die Teilchen in der ersten Probe auch Antikörper für eine besondere Krankheit sein und in einem direkten Test würde die Anwesenheit der Antigene zu solchen Antikörpern in der Serumprobe mit dem erfindungsgemässen Nachweistest bestimmt werden.

Ein indirekter oder Inhibitionstest für den Nachweis besonderer immunologisch reaktiver biologischer Teilchen kann mit der erfindungsgemässen Vorrichtung ebenfalls ausgeführt werden. Das Prinzip des Inhibitionstests ist es, dass die ersten Teilchen, wenn sie in ausreichender Menge vorhanden sind, freie sekundäre Teilchen in Lösung neutralisieren. Bei dem Inhibitionstest neutralisieren also HBAg-Teilchen, wenn sie in ausreichender Menge vorhanden sind, freie Antikörper zur Hepatitis B in Lösung. Diese Reaktion hindert die Antikörper an der Bildung beobachtbarer Komplexe mit HBAg, wenn die Testprobe auf die unbeweglich gemachte Feuchtigkeitsschicht aufgebracht wird.

Der Inhibitionstest für ein Antigen und spezifisch für HBAg wird folgendermassen ausgeführt: Eine Probe bekannter Lösung von HBAg wird auf die Diffusionsschicht aufgebracht und das HBAg und andere in der Lösung vorhandene Teilchen wer-5 den als monomolekulare Schicht auf der metallisierten Oberfläche des Substrates adsorbiert, wie bei dem oben beschriebenen direkten Test. Die Testlösung wird zubereitet, indem man eine Probe zu untersuchenden menschlichen Serums zu einer Lösung von HBAb in einem Glasfläschchen oder einem anderen geeig-io neten Behälter hinzugibt. Das Glasfläschchen wird dann für eine Zeit gelagert, die ausreicht, damit das HBAb mit dem HBAg in dem menschlichen Serum komplexiert, wenn das Antigen darin vorhanden ist. Das Glasfläschen wird vorzugsweise bewegt, um die Komplexierungsgeschwindigkeit zu erhöhen. 15 Schliesslich wird die Probe der Testlösung auf der unbeweglich gemachten Feuchtigkeitsschicht angeordnet und nach einer geeigneten Zeit für die Diffusion der Proben wird die Diffusionsschicht (d.h. das Gel 12 oder die Membran 11) von dem Substrat entfernt und die metallisierte Oberfläche wird visuell un-2o tersucht. Die Ergebnisse des Inhibitionstests sind entgegengesetzt zu denen des direkten Tests, d.h. die Anwesenheit des HBAg in der Probe menschlichen Serums führt nicht zur Bildung einer Niederschlagslinie, während die Anwesenheit einer solchen Niederschlagslinie die Abwesenheit des HBAg in der 25 Probe menschlichen Serums anzeigt.

Der Inhibitionstest für den Nachweis von HBAb wird ähnlich ausgeführt wie der Inhibitionstest für HBAg, wozu in jeder der Stufen Antigen durch Antikörper und Antikörper durch Antigen ersetzt werden.

30 In den obigen Hepatitistests kann das HBAb aus menschlichem Serum eines Patienten erhalten werden, von dem man weiss, dass er Hepatitis B gehabt hat oder es kann in einer Ziege, einem Kaninchen oder einem anderen geeigneten Tier entwickelt werden durch Injizieren des HBAg, Warten einer 35 geeigneten Inkubationszeit, wie zwei Wochen, und dann Abnehmen von Blut aus dem Tier, welches den spezifischen Antikörper enthält und Abtrennen des Antikörpers von den übrigen Blutteilchen.

Im Falle, dass die erste Lösung bekanntermassen erste bio-4o logische Teilchen enthält, kann die Probe der ersten Lösung zentral auf der Diffusionsschicht angeordnet werden und man kann Proben der verschiedenen Testlösungen, von denen man annimmt, dass sie zweite biologische Teilchen enthalten, auf der Diffusionsschicht um die erste Lösung herum aufbringen. Ist 45 eine ausreichende Konzentration vorhanden, dann bildet sich danach eine gerade oder gebogene Niederschlagslinie an dem Schnitt der nach aussen diffundierenden zentral aufgebrachten und der nachfolgend aufgebrachten verschiedenen Testlösungen. Die Wirkung des obigen ist es, einen Test für die Anwesen-5o heit der zweiten biologischen Teilchen in den Testlösungen zu schaffen.

Wenn die erste zentrale Lösung bekanntermassen erste biologische Teilchen enthält und die diese umgebenden Testlösungen eine bekannte Konzentration der zweiten Teilchen enthal-55 ten, dann kann die relative Lage der auf der metallisierten Oberfläche gebildeten Niederschlagslinie zwischen der ursprünglich zentralen Lösung und der bekannten Lösung, welche die Testlösung umgibt, als Standard benutzt werden, mit dem die relativen Lagen der anderen Niederschlagslinien, die als Er-6o gebnis der Reaktion der in den Testlösungen enthaltenen zweiten biologischen Teilchen mit der ersten zentralen Lösung gebildet werden, um die Konzentration der zweiten Teilchen in solchen Testlösungen zu bestimmen. Ist die Lage der Niederschlagslinie der ersten zentralen Probe und einer unbekannten 65 Testlösung dichter bei der zentralen Lösung als die «Standards-Niederschlagslinie, so zeigt dies, dass die Konzentration der zweiten Teilchen in der Testlösung grösser ist als die «Stan-dard»-Konzentration. Bei diesem Konzentrationstest bringt

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man die die erste zentrale Probe umgebenden Proben der Test- brauchbar sind. Da die metallisierten Teile, z.B. Objektträger,

lösungen im gleichen Abstand von der zentralen Probe auf. wiederholt mit identischen Eigenschaften hergestellt werden können, sind die Ergebnisse des Nachweises der biologischen

Aus der vorgenannten Beschreibung kann entommen wer- Teilchen gemäss der vorliegenden Erfindung sehr beständig und den, dass die vorliegende Erfindung ein verbessertes Doppeldif- 5 sie können für viele brauchbare Zwecke verwendet werden, be-

fusionsverfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung des sonders auf dem Gebiet der medizinischen Diagnostik bei der

Verfahrens schafft zum Nachweisen immunologisch reaktiver Analyse menschlichen Serums, z.B. zum Nachweis der verschie-

biologischer Teilchen in einer Testlösung durch direkte visuelle denen darin enthaltenen Antikörper und Antigene. Da der visu-

Beobachtung der metallisierten Oberfläche eines festen Teiles, eile Kontrast zwischen der Niederschlagslinie und der monomo-

auf dem ein komplexierter Protein-Niederschlag gebildet wird 10 lekularen Schicht biologischer Teilchen sehr bestimmt ist, wenn als Ergebnis einer immunologischen Reaktion zwischen ersten die erfindungsgemässe metallisierte feste Oberfläche benutzt biologischen Teilchen und den speziellen erforschten biologi- wird, ist der Nachweis durch direkte Beobachtung mit dem blos-

schen Teilchen, die spezifisch zu den ersten Teilchen sind. Die sen Auge möglich, und es ist keine komplizierte Testausrüstung erfindungsgemässen Verfahren und die Vorrichtungen zur erforderlich. Schliesslich ist zu bemerken, dass die Nieder-

Durchführung der Verfahren sind sehr einfach, da lediglich eine i5 schlagslinie, die gemäss der vorliegenden Erfindung erhalten

Diffusionsschicht auf der Oberfläche eines festen Teiles ange- wird, in dauerhafter Form vorliegt.

ordnet werden muss, um die Diffusion der Proben zu gestatten. Neben den beschriebenen besonderen Ausführungsformen Weiter vermeidet die einzigartige und hohe Empfindlichkeit des des erfindungsgemässen Mittels können selbstverständlich noch erfindungsgemässen metallisierten Teilchens die Notwendigkeit andere Modifikationen und Variationen vorgenommen werden des Anfärbens der Diffusionsschicht oder des Substrates, um die 2o im Rahmen der vorliegenden Erfindung. So können die Gestalt Niederschlagslinie durch direkte visuelle Beobachtung nachzu- und die Grösse der verschiedenen Substrate und der damit verweisen. Die in der erfindungsgemässen Vorrichtung benutzte bundenen Teile und der unbeweglich gemachten Feuchtigkeits-Diffusionsschicht kann beträchtlich dünner sein als die im Stand schichten variiert werden, und es kann irgendein Paar immuno-der Technik benutzte, da sie nur für die Diffusion der Proben logisch reaktiver biologischer Teilchen, die miteinander immu-benutzt wird, während nach dem Stand der Technik eine be- 25 nologisch reagieren, bei den erfindungsgemässen Vorrichtungen trächtliche Dicke benötigt wird, um die Niederschlagslinie darin verwendet werden. D.h. die oben als erste und zweite Teilchen zu bilden. Das erfindungsgemässe Nachweisverfahren ist sehr bezeichneten biologischen Teilchen können Antigene, Antikör-viel empfindlicher als die üblichen Doppeldiffusionsverfahren per, Viren, Bakterien, Hormone, Enzyme und andere Teilchen zum Nachweisen immunologisch reaktiver biologischer Teil- sein, die leicht gezüchtet oder in anderer Weise isoliert und chen, und es sind mit dem erfindungsgemässen Verfahren BSA- 30 gesammelt werden können oder die im menschlichen Serum Antikörper in einer Menge von 10~9 g nachgewiesen worden, oder in einer anderen untersuchten Lösung vorhanden sind, und es kann sogar noch höhere Empfindlichkeit erbringen. Bei Weiter können verschiedene andere Metallisierungen als die dem erfindungsgemässen Verfahren können die in den oben spezifisch hier erwähnten verwendet werden, und sie können genannten DT-OS beschriebenen metallisierten Teile so ange- eine hervorragende Empfindlichkeit für besondere biologische passt werden, dass sie für eine Doppeldiffusion von Proben in 35 Teilchen haben, wobei ein Beispiel der Metall/Metalloxyd-Me-einer Diffusionsschicht zum Nachweis der biologischen Teilchen tallisierung die von Nickel sein kann.

C

3 Blatt Zeichnungen

Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Mittel zur Prüfung auf An- bzw. Abwesenheit von bestimmten immunologisch reaktiven biologischen Teilchen in Untersuchungsmustern, gekennzeichnet durch

(a) eine Feststoffunterlage mit einer metallisierten Oberfläche darauf und

(b) eine weniger als 1 mm dicke Diffusionsschicht, die dazu bestimmt ist, den immunologisch reaktive biologische Teilchen enthaltenden Proben die Diffusion zu gestatten, und die in direktem Kontakt mit der genannten metallisierten Oberfläche steht.
2. Mittel gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Feststoffunterlage eine flache Platte ist.
3. Mittel gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Feststoffunterlage eine Schale ist.
4. Mittel gemäss Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Feststoffunterlage aus einem lichtdurchlässigen Material, z.B. Kunststoff oder Glas besteht.
5. Mittel gemäss Patentanspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Feststoffunterlage aus Metall besteht.
6. Mittel gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Diffusionsschicht ein Gel ist, welches ein oder mehrere Schächte enthält, um ein oder mehrere Proben für die Analyse einführen zu können.
7. Mittel gemäss Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Gel Agar oder Agarose ist.
8. Mittel gemäss einem der Patentansprüche 1 bis 5,

dadurch gekennzeichnet, dass die Diffusionsschicht aus Cellu-losematerial besteht, wobei das Material feucht ist.
9. Mittel gemäss Patentanspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Cellulosematerial Celluloseacetat oder poröses Papier oder Filterpapier oder Seidenpapier ist.
10. Mittel gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Diffusionsschicht durch einen festen Teil abgeschlossen wird, der ein oder mehrere durchgehende Löcher aufweist als Mittel zum Einführen der Probe.
11. Mittel gemäss Patentanspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass — zum Einführen der Probe — das Mittel weiter ein Rohr umfasst, dessen erstes Ende mit einer unter Druck stehenden Quelle der Probe verbunden ist und dessen zweites Ende mit einem Loch in dem festen Teil verbunden ist, so dass eine erzwungene Strömung der Probe zu der Diffusionsschicht erzeugt wird.
12. Mittel gemäss Patentanspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es weiter einen engen Kanal umfasst, der durch die untere Oberfläche des festen Teils gebildet ist und ein erstes Ende, das mit dem Loch in dem festen Teil überlappt, und ein zweites Ende entlang einer Kante des festen Teils, die sich in weitem Abstand vom Loch durch das Teil befindet, aufweist.
13. Mittel gemäss Patentanspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es weiter einen Kanal umfasst, der in der unteren Oberfläche des festen Teils gebildet ist und ein erstes Ende, das ein Loch in dem festen Teil überlappt, und ein zweites Ende in enger Nachbarschaft zu einer Kante des festen Teils, die in weitem Abstand zu dem Loch durch das Teil liegt, und eine erste Elektrode, die an einem ersten Ende mit dem engen Kanal verbunden ist, und eine zweite Elektrode, die an einem zweiten Ende mit dem Kanal verbunden ist, aufweist.
14. Mittel gemäss einem der Patentansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die metallisierte Oberfläche der Feststoff unterlage ein nicht durchgehender Film aus Metallteilchen ist.
15. Mittel gemäss einem der Patentansprüche 1,4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass die metallisierte Oberfläche der Feststoffunterlage aus einer Legierung zweier Metalle gebildet ist.
16. Mittel gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die metallisierte Oberfläche auf der Feststoffunterlage aus einer Legierung zweier Metalle gebildet ist und einen äusseren Oxydfilm eines der beiden Metalle trägt.
17. Mittel gemäss Patentanspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Metalle Indium und Gold sind und der

5 Oxydfilm ein Indiumoxydfilm ist.
18. Mittel gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die metallisierte Oberfläche der Feststoffunterlage aus einem Metall und einem äusseren Film eines Oxyds des Metalles gebildet ist.

io 19. Mittel gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es weiter eine monomolekulare Schicht immunologisch aktiver, biologischer Teilchen zwischen der metallisierten Oberfläche der Feststoffunterlage und der Diffusionsschicht aufweist.
20. Verwendung der Mittel gemäss Patentanspruch 1 in 15 Verfahren zum Nachweisen einer immunologischen Reaktion biologischer Teilchen, gekennzeichnet durch folgende Stufen:

(a) Aufbringen einer Menge einer ersten Probe, die ein erstes immunologisch reaktives biologisches Teilchen enthält, auf einen ersten Bereich der Diffusionsschicht,

20 (b) Aufbringen einer Menge einer Testprobe, von der man annimmt, dass sie ein zweites immunologisch reaktives biologisches Teilchen enthält, auf einen zweiten Bereich der Diffusionsschicht,

(c) Diffundierenlassen der ersten und der Testprobe für eine 25 bestimmte Zeit durch die Diffusionsschicht zur metallisierten

Oberfläche, um mit der Oberfläche und miteinander in Wechselwirkung zu treten, und

(d) Untersuchen der metallisierten Oberfläche auf eine immunologische Reaktion durch Beobachten.

30 21. Verwendung gemäss Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Stufe des Aufbringens der Testprobe von der man annimmt, dass sie zweite biologische Teilchen enthält, auf die Diffusionsschicht im Aufbringen der Testprobe in geringem Abstand zu der Aufbringung der ersten Probe besteht, so 35 dass die ausgewählten, ersten und zweiten Bereiche auf der Diffusionsschicht im Abstand von einigen Millimetern zueinander angeordnet sind.
22. Verwendung gemäss Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Probe ein bestimmtes Antigen ent-40 hält, und die zweite Probe, von der man annimmt, dass sie zweite biologische Teilchen enthält, Antikörper enthält, die spezifisch zum bestimmten Antigen sind, und dass die Untersuchung der metallisierten Oberfläche im Nachweis der Antikörper resultiert.

45 23. Verwendung gemäss Patentanspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Probe einen bestimmten Antikörper enthält und die zweite Probe, von der man annimmt, dass sie zweite biologische Teilchen enthält, ein Antigen enthält, zum besonderen Antikörper spezifisch, und dass die Untersuchung 50 der metallisierten Oberfläche im Beobachten des von der metallisierten Oberfläche reflektierten Lichtes besteht.