EP2092319A1 - Vorrichtung und verfahren zur messung biologischer und elektronischer eigenschaften einer probe - Google Patents

Vorrichtung und verfahren zur messung biologischer und elektronischer eigenschaften einer probe

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EP2092319A1
EP2092319A1 EP07817752A EP07817752A EP2092319A1 EP 2092319 A1 EP2092319 A1 EP 2092319A1 EP 07817752 A EP07817752 A EP 07817752A EP 07817752 A EP07817752 A EP 07817752A EP 2092319 A1 EP2092319 A1 EP 2092319A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sample
effect transistor
field effect
voltage
measured
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07817752A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Sven Ingebrandt
Norbert Wolters
Günter Wrobel
Herbert Bousack
Andreas Offenhäusser
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Publication of EP2092319A1 publication Critical patent/EP2092319A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/403—Cells and electrode assemblies
    • G01N27/414—Ion-sensitive or chemical field-effect transistors, i.e. ISFETS or CHEMFETS

Definitions

  • the invention relates to an apparatus and a method for measuring biological and electronic properties of a sample.
  • Biological properties of cellular samples are measured by electrical means, inter alia, with impedance sensors.
  • a small alternating current flows between a reference electrode and a working electrode.
  • Overgrowing the working electrode with a biological sample changes the AC impedance of the system (impedance) and thus the current flowing through the device. This change is measured.
  • Such a measuring arrangement is known for example from US Pat. No. 5,187,096.
  • the device according to the invention comprises a field effect transistor with contacting means for contacting the sample with the gate of the field effect transistor.
  • field effect transistors are, for example, non-metallized open-gate field effect transistors, in particular so-called ion-selective field effect transistors (ISFETs), metallized or non-metallized floating gate field effect transistors, metallized or non-metallized nano-field effect transistors, carbon nanotube field effect transistors or metallized or non-metallized Nanowires suitable.
  • ISFETs ion-selective field effect transistors
  • metallized or non-metallized floating gate field effect transistors metallized or non-metallized nano-field effect transistors
  • carbon nanotube field effect transistors or metallized or non-metallized Nanowires suitable.
  • any electrically conductive element is suitable, which is connected to the gate of the field effect transistor and can be brought into contact with the sample.
  • aqueous measuring solutions or hydrogels or polyelectrolytes are preferably used.
  • the gate electrode itself can be provided as a contacting means, on which the sample can be applied directly.
  • stimulation means are provided for applying a voltage to the sample.
  • These stimulation means advantageously comprise a reference electrode introduced into a liquid or gelatinous contacting agent, such as a chlorinated silver wire (Ag / AgCl electrode), an electrochemical reference electrode, a metal wire, a metallized surface of a microfluidic chamber, or preferably at least one on-chip accommodates the field effect transistor, integrated reference electrode.
  • a reference electrode introduced into a liquid or gelatinous contacting agent
  • a chlorinated silver wire Al / AgCl electrode
  • an electrochemical reference electrode such as a metal wire, a metallized surface of a microfluidic chamber, or preferably at least one on-chip accommodates the field effect transistor, integrated reference electrode.
  • stimulating agents that are applied directly to the sample or introduced into it, such as patch clamps or intracellular electrodes.
  • the sample Since the sample is electrically connected at least partially between the stimulation means and the gate of the field-effect transistor, it depends on the specific properties of the sample in each case to what extent an applied alternating voltage leads to a loading of the gate with a potential.
  • the sample changes the input impedance of the field effect transistor.
  • the charges that cause the potential at the gate need not be concentrated on the gate, but may, for example, also be on the contactor or on the sample contacted with it.
  • the potential present at the gate can be measured directly or indirectly with the aid of the field-effect transistor, preferably via the strength of a current which flows through the source-drain path of the field-effect transistor. This current does not flow through the sample because the source-drain path in a field-effect transistor is isolated from the gate. A change in the potential on the gate then leads to a change in the current higher by the amplification factor of the field effect transistor.
  • a measuring instrument for measuring the amplitude and phase of a current flowing through the source-drain path of the field effect transistor is provided, which is preferably converted in a first amplifier stage by means of suitable electronics into an output voltage (V out ).
  • V out an output voltage
  • the time course of these quantities includes a convolution of the impedance of the sample with the transfer function of the field effect transistor.
  • the frequency response of a current flowing through the source-drain path or a variable derived therefrom in dependence on the frequency of the alternating voltage is understood as the transfer function of the field-effect transistor in the sense of this invention.
  • this transfer function is known, for example, from a measurement without sample leaves invert the convolution and determine the impedance of the sample by unfolding.
  • the impedance is in biology, a common measure of, so that the possibility of the device to determine this, comparability Messergebm sse 'increased significantly with the results of other tests.
  • the measuring instrument is frequency-selective.
  • the current can be measured, which has the same frequency as the AC voltage with which the sample is applied. This reduces the influence of external disturbances.
  • a frequency-selective measuring instrument also simultaneously, to measure at frequencies other than the frequency of the applied alternating voltage. In particular, it is possible and useful to measure on a discrete or continuous spectrum of frequencies. In particular, it is then possible to track slower biological effects that alter several frequency components of the current.
  • a lock-in amplifier is suitable for simultaneously characterizing a signal component with a specific measurement frequency and a signal component which can be regarded approximately as a direct current component compared to this frequency.
  • a passive low-pass filter may also be provided in order to separate off such a DC-like component of the signal.
  • a further advantageous embodiment of the arrangement additionally comprises excitation means for applying a further electrical voltage to the sample.
  • excipients are understood to mean those agents which can apply a sufficiently high voltage to the sample in such a way that a biological reaction in the sample is thereby produced.
  • a patch-clamp arrangement or an intracellular electrode is suitable.
  • the measurable with the device electrical activity of the sample can be stimulated independently of a current inventive measurement of other biological properties.
  • means for carrying out further simultaneous measurements such as amperometry, voltammetry, Coulombmetrie, gravimetry, optometry, Hall measurement, atomic force microscopy (AFM), light microscopy, temperature jump method, calorimetry or 2-, 3- or 4-pole measurement , be provided.
  • the arrangement comprises at least one further field-effect transistor, which in particular can be constructed identically to the first field-effect transistor. Then this can be used to determine the transfer function of the field effect transistor as such (without sample) and in particular the typical drift of the output signal either for the purpose of subsequent signal processing or to charge from the outset by differential measurement with the measurement signal.
  • This is particularly advantageous when it is intended to determine the impedance of the sample by unfolding.
  • the further field effect transistor is electrically isolated from the sample.
  • the transfer function of the field effect transistor is dependent on the input impedance of the field effect transistor, for example. Any changes in the impedance of the path between the stimulation means and the gate of the field effect transistor thereby change the input impedance of the field effect transistor.
  • the device comprises means for contacting a plurality of field effect transistors with the same sample. If these means are arranged, for example, in an array of at least 2 to several thousand field-effect transistors, it is possible, for example, to measure many samples simultaneously. However, it is also possible to perform spatially resolved measurements on an extended sample. For example, the response of different functional areas of a cell to the AC voltage can be studied simultaneously. This is due to the fact that field effect make transistors that are significantly smaller than a cell. Typical sizes of biological cells are 2 mm diameter (oocytes) up to 1 ⁇ m (bacteria). Nanowires as the smallest conceivable field effect transistors typically have diameters up to 10 nm.
  • the stimulation means comprise a liquid reservoir.
  • a reservoir can be produced, for example, by adhering glass rings to a chip containing the field-effect transistor in a moisture-tight manner.
  • the reservoir should be large enough to completely wet the sample, the field effect transistor, and the reference electrode serving as the stimulation means.
  • the liquid reservoir is closed. It may have an inlet or a drain (microfluidics).
  • the volume should in this case be at least so large that the sample and the reference electrode are wetted. This makes it possible, for example, to supply cell poisons in increasing gradients to the sample. Likewise, it is advantageously possible to switch back and forth between different substances within the shortest or respectively defined periods or to supply sequences of different fluids to the sample. The use of microfluidic systems further reduces the volumes required for measurement.
  • the contacting means comprise a liquid reservoir, which may in particular be identical to the reservoir which is already part of the stimulation means. Contacting via a liquid is easy to handle, controllable via the chemical composition of the liquid and can be dissolved again without residue.
  • One of the stimulation or contacting means comprising liquid reservoir is advantageously filled with an electrolyte.
  • the method according to the invention for measuring biological properties of a sample provides for applying an alternating voltage to the sample.
  • the sample exchanges charges with the gate of a field effect transistor (FET).
  • FET field effect transistor
  • One of the potential at the gate of the Field effect transistor-dependent primary physical quantity is measured.
  • a change in the potential at the gate leads to a change in the primary physical measured variable which is higher by one amplification factor.
  • a current flowing through the source-drain path of the field-effect transistor can be measured as the primary physical measured variable, wherein the amplification factor is the usual amplification factor of the field-effect transistor.
  • the amplification factor is influenced, for example, by the sample changing the input impedance of the field effect transistor.
  • the frequency of the alternating voltage applied to the sample is preferably between 0.1 Hz and 1 GHz, more preferably between 1 Hz and 100 MHz and most preferably between 1 Hz and 10 MHz. At these frequencies, the expected measurement effects are greatest.
  • the amplitude of the alternating voltage applied to the sample is preferably between 0.001 mV and 10 V, more preferably between 0.1 mV and 1 V and most preferably between 1 mV and 100 mV.
  • the amplitude should be so large that sufficient transmission and amplification is ensured for the field effect transistor used in each case. An upper limit is reached in case of an influence up to the destruction of the sample by an alternating voltage with too high an amplitude.
  • the amplitude of the alternating voltage is advantageously kept constant during the measurement. However, it is also possible to vary the amplitude approximately at a constant frequency of the alternating voltage and thus to operate in terms of amplitude spectroscopy.
  • this method can measure the response of a biological sample to an applied AC voltage without current flow through the sample.
  • this response was measured by the impedance of the sample, with a very small current flowing at least partially through the sample. It was recognized that the metrological difficulties in measuring these very small currents were the limiting factor for the signal-to-noise ratio and thus also for the sensitivity in the measurement of very small samples. This was all the more true, the longer the paths were, the current had to go back to the first amplifier.
  • the response of the sample is amplified directly at the place of its formation by the field effect transistor. The sensitivity is thus large enough to take measurements on biological Samples such as single cells, subregions of cells, cell fragments, cell membranes, artificial model membranes, proteins or biomolecules to carry out.
  • the sample is subjected to alternating voltages of different frequencies.
  • the response of a sample to an AC voltage is generally frequency dependent. From this frequency dependence biological properties of the sample can be derived.
  • amplitude and phase of the primary physical quantity are measured.
  • the time course of these variables includes a convolution of further characteristics of the sample with the transfer function of the field effect transistor.
  • the time course of the amplitude and phase of the primary physical measured variable is measured between 1 and 100, preferably between 3 and 30 and particularly preferably between 5 and 10 oscillations of the applied alternating voltage.
  • This time periodically represents a compromise between the necessary measuring time and the information content for the subsequent evaluation, for example for determining the impedance.
  • the time characteristic of the primary physical measured quantity and the transfer function of the field effect transistor are processed to determine further characteristics of the sample.
  • the time characteristic of the primary physical measured variable may represent a convolution of such a characteristic with the transfer function of the field effect transistor. If the transfer function of the field effect transistor is known, for example, by a prior measurement without a sample, the characteristic sought can then be obtained by a development, ie an inversion of the folding process, from the recorded time course.
  • the transfer function can also be at least partially offset with the time characteristic of the primary physical quantity, for example by differentially measuring it with a second field effect transistor not directly contacted with the sample, which is preferably arranged adjacent to the first field effect transistor, for example in the same array.
  • the parameter can also be determined, for example, by a mathematical model of the time characteristic of the primary physical quantity containing the transfer function of the field effect transistor, which contains the parameter sought as a parameter, while varying this Parameters is fitted to the recorded time course.
  • the impedance of the sample can be determined from the primary physical measured variable, for example by the above-described calculation of the time characteristic of the primary measured variable with the transfer function of the field effect transistor.
  • the determination of the impedance with the method according to the invention significantly increases the comparability of the measurement results with the results of other experiments.
  • a further secondary physical measured variable is measured.
  • This measured variable advantageously represents a measure of an electrical activity of the sample, which in turn advantageously allows conclusions to be drawn about the biological activity.
  • the electrical activity may be, for example, an extracellular voltage that is applied either spontaneously or in response to the application of the AC voltage to the sample.
  • the electrical activity of the sample and its response to the AC voltage are advantageously measured with one and the same field effect transistor, which avoids errors due to deviations in the properties of different transistors.
  • the sample is subjected to a stimulation of electrical activity with a further electrical voltage, for example by a further external voltage source, such as by contacting by patch-clamp technique or intracellular electrodes.
  • a further electrical voltage can also be advantageously applied together with the AC voltage, for example, by the AC voltage is modulated to a DC voltage as further electrical voltage.
  • the secondary physical measured variable may be, for example, a low-frequency component of the current flowing through the source-drain path of the field-effect transistor in comparison to the frequency of the alternating voltage. This can be considered approximately as DC component.
  • the primary and secondary physical quantities can be measured simultaneously. This is particularly advantageous when the primary physical quantity of the current flowing through the source-drain path of the field effect transistor and the secondary physical quantity is a low-frequency, approximately considered as a direct current component of this stream. Then advantageously a lock-in amplifier can be selected as a measuring instrument.
  • the current flowing through the source-drain path of the field-effect transistor or generally the primary physical measured variable, at frequencies other than the frequency of the alternating voltage.
  • low-frequency components can be extracted. Many slow biological effects, such as extracellular activities, change the current at several frequencies that are low compared to the frequency of the AC voltage. They are modulated to these frequencies, analogous to the signals in the telecommunications, which are modulated on carrier frequencies.
  • a sample is selected which comprises a plurality of interacting biological samples, such as several biomolecules or a cell and a substance acting on this cell, which substance may be for example a protein or a chemical agent.
  • biological samples such as several biomolecules or a cell
  • substance acting on this cell which substance may be for example a protein or a chemical agent.
  • the biological effect of this literary action can be studied. For example, initially only one biological sample may be present and the other sample added during the measurement. For example, biomolecular binding reactions between an antigen and the associated antibody can be studied.
  • cell membranes can be examined before, during and after the addition of biological or artificial membrane-permeable proteins, such as antibiotics.
  • the sample is applied to a support electrically connected to the gate.
  • This support may advantageously consist of a material which is more resistant to the substances contained in the sample than the gate.
  • a sample may be chosen that would chemically modify the gate itself, for example.
  • the carrier can be prepared in any way with the sample and connected to the gate just before the measurement. The connection of the carrier to the gate can advantageously be made detachable. Then, for example, more samples can be stored on carriers than field effect transistors are available.
  • cells, biomolecules, proteins or parts thereof may be applied in a suspension which may comprise a nutrient medium.
  • the components to be measured then settle on the ground by their mass in the solution and adhere to the surface of the carrier. Already this process of adhesion can be analyzed after the electrical connection of the carrier to the gate.
  • a carrier is selected with adhesives that support the adhesion of the sample.
  • adhesives for example, linker molecules are suitable which react chemically with the carrier and the sample.
  • proteins such as fibronectin, polylysine, laminin or other proteins are also suitable.
  • the choice of a carrier with adhesive is particularly advantageous when the sample contains cell membranes or artificial lipid membrane systems.
  • the membranes can be transferred to the support by various methods, for example by self-assembled monolayer formation, by layered membrane deposition or as a Langmuir film.
  • a carrier is selected on which the adhesive is laterally structured. Then, for example, the migration of cells along the lateral structures, which may include, for example, lines or nodes, can be observed.
  • the sample is capable of replication, it can be incubated before measurement to increase the number of cells and thus the signal strength. In this case, a sufficient for cell growth level of humidity and carbon dioxide is presented.
  • the sample can also be incubated during the measurement in order to use the method according to the invention Study process of cell division.
  • all measurements can be performed spatially and temporally resolved and temporal changes of the respective measured variable can be determined.
  • Figure 1 Block diagram of a Aus Concreteangsbeispiels of the device according to the invention.
  • FIG. 2 shows two measurements carried out with the device from FIG. 1 with and without a biological sample.
  • FIG. 3 Change of the measuring signal as a function of the salt concentration in the liquid reservoir 3 a.
  • FIG. 4 Change in the detection sensitivity for the sample as a function of the salt concentration in the liquid reservoir 3 a.
  • Figure 5 Normalized transfer functions of two field effect transistors 2, of which only one is overgrown with a cell.
  • FIG. 6 Detection of cell detachment with the method according to the invention.
  • FIG. 7 Difference between the time courses of the normalized transfer function with or without a sample.
  • FIG. 1 shows the block diagram of an embodiment of the device according to the invention in operation.
  • the device is realized in this embodiment as a sensor chip.
  • a cell 1 is contacted with the gate of a field effect transistor 2.
  • the field effect transistor 2 comprises a source terminal 2a, a drain terminal 2b and a gate 2c.
  • Above the cell is a liquid reservoir 3a, which is arranged as a small culture dish above the gate surface.
  • a bath electrode 3 is immersed in this liquid reservoir 3a.
  • the bath electrode 3 is acted upon by a voltage and frequency generator 4 with an AC voltage tunable frequency.
  • the liquid reservoir 3a, the bath electrode 3 and the voltage and frequency generator 4 together form a unit that represents the stimulation means.
  • the contacting means also comprise a liquid film between the gate of the field effect transistor and the cell 1.
  • a readout and amplifier electronics 5 acts on the source-drain path of the field effect transistor 2 with a voltage and measures the current flowing through this path. Since in the field effect transistor the source-drain path is isolated from the gate, this current does not flow through the sample.
  • the electronics 5 internally convert the current into a voltage so that it ultimately performs a voltage measurement.
  • the measured voltage which is a measure of the response of the sample to the AC voltage supplied by the voltage and frequency generator 4, and the AC voltage can be processed and displayed by an evaluation unit 6.
  • Embodiment 1 Influence of the Presence of a Biological Sample on the Frequency Dependence of the Normalized Transfer Function
  • FIG. 2 shows by way of example two measurements carried out with the apparatus shown in FIG. 1 in a logarithmic representation.
  • V S in / V 0 Ut is plotted against the frequency of the applied alternating voltage, wherein V S in the voltage applied to the bath electrode 3 AC voltage and V out is the output voltage supplied by the readout and amplifier electronics 5.
  • the field effect transistor was first cleaned before the measurement and coated with the protein poly-L-lysine as a sample. Thereafter, a liquid reservoir was filled with an aqueous electrolyte solution (standard electrophysiological solution: 5 mM KCl, 140 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM glucose, pH 7.4 adjusted with NaOH).
  • the curve ⁇ in FIG. 2 shows by way of example the measurement of the normalized transfer function V s i n / V 0Ut after a renewed cleaning of the surface and thus after the removal of the biological sample (protein) from the surface.
  • the diluent used was distilled water in each case.
  • FIG. 4 shows the difference ⁇ (V S i n / Vout) of the respective transfer functions in the presence and absence of the poly-L-lysine for different salt concentrations (of ⁇ -decreasing salt concentration of the electrolyte solution).
  • ⁇ V S i n / Vout
  • the present invention is useful for detecting biomolecules such as proteins or DNA. It was also clearly demonstrated that the present invention is suitable for detecting the adhesion of biomolecules to the field effect transistors. By a differential measurement even a quantitative statement regarding the amount of bound biomolecules is possible.
  • Exemplary Embodiment 2 Differential Measurement for Investigating the Properties of a Single Cell.
  • FIG. 5 shows an example of a differential measurement series of the normalized transfer function of two different, equally coated (poly-L-lysine) field-effect transistors on the same sensor chip with the device according to the invention according to FIG
  • the difference between the two field effect transistors is that one cell (HEK293) has grown on one of the field effect transistors ( ⁇ ), while there is no cell on the other field effect transistor ( ⁇ ).
  • This chip was stored for incubation after application of the cell suspension for a period of three days in an incubator under constant CO 2 atmosphere and constant temperature.
  • FIG. 6 shows by way of example a time-dependent measurement of the change in the transfer function of the two field effect transistors shown in FIG. 5 with and without a cell on the field effect transistor.
  • Plotted is the normalized transfer function V s j n / V 0Ut against the time t.
  • the graph shows only slight differences between the transmission function long-time signals of the field effect transistors with cell (curve ⁇ ) and without cell (curve ⁇ ) up to 240 s.
  • the change in the adhesion of a single cell to a field effect transistor is significantly detectable.
  • the present invention is suitable for the study of both the site-and time-resolved cell adhesion, as well as the site-and time-resolved cell detachment.
  • This can be used, for example, in toxicology or to demonstrate the presence of others Cell detachment triggering substances are used.
  • Exemplary embodiment 4 Detection of micromovements of a cell.
  • FIG. 7 shows the result of a measurement carried out analogously to FIG.
  • the normalized transfer function was measured in a time-dependent manner analogous to FIG.
  • the system did not intervene during the measurement.
  • the upper part of Figure 7 shows the normalized transfer function of the field effect transistor with cell, the lower part of Figure 7 that of the field effect transistor without a cell.
  • the transfer functions are plotted against time t.
  • Figure 7 shows the only slightly visible in Figure 6 differences between two transfer functions in magnification. While only small fluctuations are to be registered for the field effect transistor without a cell (below), significant changes in the transfer function can already be observed for the field effect transistor with cell. These changes in the transfer function can be correlated with local micro-movements of the adherent cell.
  • the present invention is useful for the rapid and efficient measurement of the toxicity of unknown substances, as such micro-movements of the cell as well as cell motility is a parameter strongly linked to cell vitality, which is significantly changed by toxic substances.
  • the embodiments shown here do not limit the invention to biological samples.
  • the basic idea, to use a field effect transistor for the currentless measurement of an AC resistance, can be realized on any system which can be charged with an AC voltage and which can exchange charges with the gate of a field effect transistor.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Messung biologischer Eigenschaften einer Probe, wobei die Probe mit dem Gate eines Feldeffekttransistors kontaktiert ist. Erfindungsgemäss ist vorgesehen, dass die Probe mit einer Wechselspannung beaufschlagt wird. Es hängt dann von der Beschaffenheit der Probe ab, inwieweit Ladungen auf das Gate übertragen werden. Das Vorhandensein derartiger Ladungen ist über den Feldeffekttransistor, beispielsweise durch einen Source-Drain-Strom, abfragbar. Mit der Erfindung kann die Antwort einer biologischen Probe auf eine Wechselspannung stromlos und daher sehr viel empfindlicher gemessen werden als durch Impedanzmessungen nach dem Stand der Technik, bei denen kleine Ströme zu messen sind. Es sind Untersuchungen an Einzelzellen oder auch Teilen von Zellen möglich, wo nach dem Stand der Technik ein ausreichend grosses Signal nur an Zellverbünden mit vielen Zellen erzielt werden konnte.

Description

B e s c h r e i b u n g
Vorrichtung und Verfahren zur Messung biologischer und elektronischer Eigenschaften einer Probe
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Messung biologischer und elektronischer Eigenschaften einer Probe.
Stand der Technik
Biologische Eigenschaften zellulärer Proben werden auf elektrischem Weg unter anderem mit Impedanzsensoren gemessen. Dabei fließt zwischen einer Referenzelektrode und einer Arbeitselektrode ein kleiner Wechselstrom. Das Bewachsen der Arbeitselektrode mit einer biologischen Probe ändert den Wechselstromwiderstand des Systems (Impedanz) und damit den durch die Anordnung fließenden Strom. Diese Änderung wird gemessen. Eine derartige Messanordnung ist beispielsweise aus dem US-Patent 5,187,096 bekannt.
Nachteilig werden mit einer fortschreitenden Miniaturisierung der Elektroden und der Proben die zu messenden Ströme immer kleiner. Daher werden höhere Messfrequenzen notwendig, bei denen wiederum parasitäre Effekte der Zuleitungen und externe Störungen einen immer größeren Einfluss gewinnen. Dann reicht das Signal-Rausch- Verhältnis zur Untersuchung von einzelnen Zellen oder gar Teilen davon gegebenenfalls nicht aus.
Aufgabe und Lösung
Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, die Messung biologischer und elektronischer Eigenschaften einer Probe auf elektrischem Weg mit einem besseren Signal-Rausch- Verhältnis zu ermöglichen als dies nach dem Stand der Technik möglich ist.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch eine Vorrichtung gemäß Hauptanspruch und ein Verfahren gemäß Nebenanspruch. Die Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ist Gegenstand eines weiteren Nebenanspruchs. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich jeweils aus den darauf rückbezogenen Unteransprüchen. Gegenstand der Erfindung
Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst einen Feldeffekttransistor mit Kontaktierungsmit- teln zur Kontaktierung der Probe mit dem Gate des Feldeffekttransistors.
Als Feldeffekttransistoren sind beispielsweise nicht metallisierte open-gate Feldeffekttransistoren, insbesondere sogenannte ionen-selektive Feldeffekttransistoren (ISFETs), metallisierte oder nicht metallisierte floating-gate Feldeffekttransistoren, metallisierte oder nicht metallisierte Nano-Feldeffekttransistoren, Carbon-Nano-Tube-Feldeffekttransistoren oder metallisierte oder nicht metallisierte Nanowires geeignet.
Als Kontaktierungsmittel ist jedes elektrisch leitende Element geeignet, welches mit dem Gate des Feldeffekttransistors verbunden ist und in Kontakt mit der Probe gebracht werden kann. Vorzugsweise werden hierzu wässrige Messlösungen oder Hydrogele bzw. Polyelektro- lyte verwendet. Insbesondere kann die Gateelektrode selbst als Kontaktierungsmittel vorgesehen sein, auf dem die Probe unmittelbar aufgebracht werden kann.
Erfindungsgemäß sind Stimulationsmittel zur Beaufschlagung der Probe mit einer Wechselspannung vorgesehen. Diese Stimulationsmittel umfassen vorteilhaft eine in ein flüssiges oder gelförmiges Kontaktierungsmittel eingebrachte Referenzelektrode, wie beispielsweise einen chlorierten Silberdraht (Ag/AgCl-Elektrode), eine elektrochemische Referenzelektrode, einen Metalldraht, eine metallisierte Oberfläche einer Mikrofluidik-Kammer oder vorzugsweise mindestens eine auf dem Chip, welcher den Feldeffekttransistor beherbergt, integrierte Referenzelektrode. Es sind aber auch Stimulationsmittel geeignet, die unmittelbar auf die Probe aufgebracht oder in sie eingeführt sind, wie beispielsweise Patch-Clamps oder Intrazellularelektroden.
Da die Probe elektrisch zumindest teilweise zwischen die Stimulationsmittel und das Gate des Feldeffekttransistors geschaltet ist, hängt es von den jeweils konkreten Beschaffenheiten der Probe ab, inwieweit eine angelegte Wechselspannung zu einer Beaufschlagung des Gates mit einem Potential führt. Beispielsweise ändert die Probe die Eingangsimpedanz des Feldeffekttransistors. Die Ladungen, die das Potential am Gate hervorrufen, müssen nicht auf dem Gate konzentriert sein, sondern können beispielsweise auch auf dem Kontaktierungsmittel oder auf der damit kontaktierten Probe sitzen. Das am Gate vorhandene Potential lässt sich mit Hilfe des Feldeffekttransistors direkt oder indirekt messen, vorzugsweise über die Stärke eines Stroms, der durch die Source-Drain- Strecke des Feldeffekttransistors fließt. Dieser Strom fließt nicht durch die Probe, da die Source-Drain-Strecke in einem Feldeffekttransistor vom Gate isoliert ist. Eine Änderung des Potentials auf dem Gate fuhrt dann zu einer um den Verstärkungsfaktor des Feldeffekttransistors höheren Änderung des Stroms.
Es wurde erkannt, dass sich mit einer derartigen Vorrichtung die Antwort einer biologischen Probe auf eine angelegte Wechselspannung vorteilhaft ohne Stromfluss durch die Probe messen lässt. Nach dem US-Patent 5,187,096 wurde diese Antwort über die Impedanz der Probe gemessen, wobei ein sehr kleiner Strom floss. Dieser Strom floss in der Regel zumindest teilweise durch die Probe. Es wurde erkannt, dass die messtechnischen Schwierigkeiten bei der Messung dieser sehr kleinen Ströme der begrenzende Faktor für das Signal-Rausch- Verhältnis und damit auch für die Empfindlichkeit bei der Messung sehr kleiner Proben waren. Dies galt umso mehr, je länger die Wege waren, die der Strom bis zum ersten Messver- stärker zurücklegen musste. Erfindungsgemäß wird die Antwort der Probe unmittelbar am Ort ihrer Entstehung durch den Feldeffekttransistor verstärkt. Die Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist damit groß genug, um Messungen an Einzelzellen, aber auch an Teilbereichen von Zellen oder auch nur Zellfragmenten, Zellmembranen, künstlichen Modellmembranen, Proteinen oder Biomolekülen durchführen zu können.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist ein Messinstrument zur Messung von Amplitude und Phase eines durch die Source-Drain-Strecke des Feldeffekttransistors fließenden Stroms vorgesehen, der hierzu vorzugsweise in einer ersten Verstärkerstufe mittels geeigneter Elektronik in eine Ausgangsspannung (Vout) gewandelt wird. Der Zeitverlauf dieser Größen enthält eine Faltung der Impedanz der Probe mit der Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors.
Unter der Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors im Sinne dieser Erfindung wird insbesondere der Frequenzgang eines durch die Source-Drain-Strecke fließenden Stroms oder einer davon abgeleiteten Größe in Abhängigkeit der Frequenz der Wechselspannung verstanden.
Ist diese Übertragungsfunktion bekannt, beispielsweise aus einer Messung ohne Probe, lässt sich die Faltung invertieren und die Impedanz der Probe durch Entfaltung ermitteln. Die Impedanz ist in der Biologie eine gängige Messgröße, so dass die Möglichkeit der Vorrichtung, diese zu bestimmen, die Vergleichbarkeit der Messergebm'sse mit den Ergebnissen anderer Versuche deutlich erhöht.
In einer weiteren besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung ist das Messinstrument frequenzselektiv. Im einfachsten Fall kann dann lediglich der Strom gemessen werden, der die gleiche Frequenz hat wie die Wechselspannung, mit der die Probe beaufschlagt wird. Dies vermindert den Einfluss äußerer Störungen. Es ist mit einem frequenzselektiven Messinstrument aber auch möglich, auch simultan, auf anderen Frequenzen als der Frequenz der angelegten Wechselspannung zu messen. Insbesondere ist es möglich und sinnvoll, auf einem diskreten oder kontinuierlichen Spektrum von Frequenzen zu messen. Dann ist es insbesondere möglich, langsamere biologische Effekte zu verfolgen, die mehrere Frequenzkomponenten des Stroms verändern.
Ein Beispiel für derartige langsame biologische Effekte sind extrazelluläre Spannungen, die mit oder ohne äußere Stimulation an biologischen Zellen auftreten können. Diese Spannungen beaufschlagen das Gate des Feldeffekttransistors ebenfalls mit einem Potential. Die extrazellulären Spannungen ändern sich nur sehr langsam im Vergleich zu den typischen Frequenzbereichen, die zur Impedanzanalyse genutzt werden. Sie bewirken daher im durch die Source- Drain-Strecke fließenden Strom einen Anteil, der näherungsweise als Gleichstromanteil angesehen werden kann. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und hier insbesondere mit dem frequenzselektiven Messinstrument ist es möglich, die elektrische Aktivität der Probe und deren Antwort auf die Wechselspannung zeitgleich und unter Verwendung ein und desselben Feldeffekttransistors zu messen. Es kann auch ein und dasselbe Instrument, wie beispielsweise ein Lock-In- Verstärker, zur simultanen Messung von Amplitude und Phase bei verschiedenen Messfrequenzen vorgesehen sein. Ein Lock-In- Verstärker eignet sich insbesondere, um gleichzeitig einen Signalanteil mit einer bestimmten Messfrequenz und einen Signalanteil, der im Vergleich zu dieser Frequenz näherungsweise als Gleichstromanteil angesehen werden kann, zu charakterisieren. Es kann aber auch ein passiver Tiefpassfilter vorgesehen sein, um einen derartigen gleichstromähnlichen Anteil des Signals abzutrennen.
Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Anordnung umfasst zusätzlich Anregungsmittel zur Beaufschlagung der Probe mit einer weiteren elektrischen Spannung. Unter Anregungsmitteln im Sinne dieser Erfindung werden solche Mittel verstanden, die die Probe mit einer ausreichend hohen Spannung in einer Weise beaufschlagen können, dass dadurch eine biologische Reaktion in der Probe hervorgerufen wird.
Als ein solches Mittel ist beispielsweise eine Patch-Clamp-Anordnung oder eine Intrazellularelektrode geeignet. Mit diesen Anregungsmitteln kann die mit der Vorrichtung messbare elektrische Aktivität der Probe unabhängig von einer laufenden erfindungsgemäßen Messung der sonstigen biologischen Eigenschaften stimuliert werden.
Vorteilhaft können Mittel zur Durchführung weiterer simultaner Messungen, wie beispielsweise Amperometrie, Voltammetrie, Coulombmetrie, Gravimetrie, Optometrie, Hallmessung, Atomic-Force Mikroskopie (AFM), Lichtmikroskopie, Temperatur-Sprungverfahren, Kalori- metrie oder 2-, 3- beziehungsweise 4-Polmessung, vorgesehen sein.
Vorteilhaft umfasst die Anordnung mindestens einen weiteren Feldeffekttransistor, der insbesondere identisch zum ersten Feldeffekttransistor aufgebaut sein kann. Dann kann dieser genutzt werden, um die Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors als solcher (ohne Probe) sowie insbesondere die typische Drift des Ausgangssignals entweder zum Zweck einer späteren Signalverarbeitung zu ermitteln oder von vornherein durch differenzielle Messung mit dem Messsignal zu verrechnen. Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn beabsichtigt ist, die Impedanz der Probe durch Entfaltung zu bestimmen. Hierzu ist es insbesondere vorteilhaft, wenn der weitere Feldeffekttransistor elektrisch von der Probe isoliert ist. Die Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors ist beispielsweise von der Eingangsimpedanz des Feldeffekttransistors abhängig. Jegliche Änderungen der Impedanz der Strecke zwischen den Stimulationsmitteln und dem Gate des Feldeffekttransistors ändern dabei die Eingangsimpedanz des Feldeffekttransistors.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung umfasst die Vorrichtung Mittel zur Kontaktierung mehrerer Feldeffekttransistoren mit derselben Probe. Sind diese Mittel beispielsweise in einem Array von mindestens 2 bis zu mehreren Tausend Feldeffekttransistoren angeordnet, können beispielsweise viele Proben simultan vermessen werden. Es können aber auch ortsaufgelöste Messungen an einer ausgedehnten Probe durchgeführt werden. Beispielsweise kann die Antwort verschiedener Funktionsbereiche einer Zelle auf die Wechselspannung simultan studiert werden. Dies ist dem Umstand geschuldet, dass sich Feldeffekt- transistoren herstellen lassen, die deutlich kleiner als eine Zelle sind. Typische Grössen biologischer Zellen sind 2 mm Durchmesser (Oozyten) bis zu 1 μm (Bakterien). Nanowires als kleinste vorstellbare Feldeffekttransistoren weisen typischerweise Durchmesser bis zu 10 nm auf.
Li einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung umfassen die Stimulationsmittel ein Flüssigkeitsreservoir. Ein solches Reservoir lässt sich beispielsweise herstellen, indem auf einen Chip, der den Feldeffekttransistor enthält, Glasringe feuchtigkeitsdicht aufgeklebt werden. Es können aber auch Einfräsungen oder Bohrungen in die Chip-Verkapselung feuchtigkeitsdicht eingebracht werden, so dass eine kleine Kulturschale mit Volumina von bevorzugt größer 0,1 μl, besonders bevorzugt größer 10 μl und ganz besonders bevorzugt von größer 100 μl entsteht. Das Reservoir sollte so groß sein, dass die Probe, der Feldeffekttransistor und die als Stimulationsmittel dienende Referenzelektrode vollständig benetzt sind.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführung der Erfindung ist das Flüssigkeitsreservoir geschlossen. Es kann einen Zu- bzw. einen Ablauf aufweisen (Mikrofluidik). Das Volumen sollte hierbei mindestens so groß sein, dass die Probe und die Referenzelektrode benetzt sind. Dadurch ist es möglich beispielsweise Zellgifte in steigenden Gradienten der Probe zuzuführen. Ebenso ist es vorteilhaft möglich, zwischen unterschiedlichen Substanzen innerhalb kürzester beziehungsweise definierter Zeiträume hin- und herzuschalten bzw. Sequenzen unterschiedlicher Fluide der Probe zuzuführen. Durch die Verwendung mikrofluidischer Systeme werden die zur Messung benötigten Volumina weiter verringert.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung umfassen die Kontaktierungsmit- tel ein Flüssigkeitsreservoir, welches insbesondere mit dem Reservoir identisch sein kann, das bereits Teil der Stimulationsmittel ist. Die Kontaktierung über eine Flüssigkeit ist einfach handhabbar, über die chemische Zusammensetzung der Flüssigkeit regelbar sowie rückstandsfrei wieder zu lösen.
Ein von den Stimulations- oder Kontaktierungsmitteln umfasstes Flüssigkeitsreservoir ist vorteilhaft mit einem Elektrolyten gefüllt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Messung biologischer Eigenschaften einer Probe sieht vor, die Probe mit einer Wechselspannung zu beaufschlagen. Dabei tauscht die Probe Ladungen mit dem Gate eines Feldeffekttransistors (FET) aus. Eine vom Potential am Gate des Feldeffekttransistors abhängige primäre physikalische Messgröße wird gemessen. Dabei führt eine Änderung des Potentials am Gate zu einer um einen Verstärkungsfaktor höheren Änderung der primären physikalischen Messgröße. Es kann insbesondere ein durch die Source- Drain-Strecke des Feldeffekttransistors fließender Strom als primäre physikalische Messgröße gemessen werden, wobei der Verstärkungsfaktor der übliche Verstärkungsfaktor des Feldeffekttransistors ist. Der Verstärkungsfaktor wird beispielsweise dadurch beeinflusst, dass die Probe die Eingangsimpedanz des Feldeffekttransistors ändert.
Die Frequenz der Wechselspannung, mit der die Probe beaufschlagt wird, liegt bevorzugt zwischen 0,1 Hz und 1 GHz, besonders bevorzugt zwischen 1 Hz und 100 MHz und ganz besonders bevorzugt zwischen 1 Hz und 10 MHz. Bei diesen Frequenzen sind die erwarteten Messeffekte am größten.
Die Amplitude der Wechselspannung, mit der die Probe beaufschlagt wird, liegt bevorzugt zwischen 0,001 mV und 10 V, besonders bevorzugt zwischen 0,1 mV und 1 V und ganz besonders bevorzugt zwischen 1 mV und 100 mV. Die Amplitude sollte so groß sein, dass eine ausreichende Übertragung und Verstärkung für den jeweils verwendeten Feldeffekttransistor gewährleistet ist. Eine Obergrenze ist bei einer eventuellen Beeinflussung bis hin zur Zerstörung der Probe durch eine Wechselspannung mit zu hoher Amplitude erreicht.
Die Amplitude der Wechselspannung wird vorteilhaft während der Messung konstant gehalten. Es ist aber auch möglich, etwa bei konstanter Frequenz der Wechselspannung die Amplitude zu variieren und somit im Hinblick auf die Amplitude Spektroskopie zu betreiben.
Es wurde erkannt, dass mit diesem Verfahren die Antwort einer biologischen Probe auf eine angelegte Wechselspannung ohne Stromfluss durch die Probe gemessen werden kann. Nach dem genannten Stand der Technik wurde diese Antwort über die Impedanz der Probe gemessen, wobei ein sehr kleiner Strom zumindest teilweise durch die Probe floss. Es wurde erkannt, dass die messtechnischen Schwierigkeiten bei der Messung dieser sehr kleinen Ströme der begrenzende Faktor für das Signal-Rausch- Verhältnis und damit auch für die Empfindlichkeit bei der Messung sehr kleiner Proben waren. Dies galt umso mehr, je länger die Wege waren, die der Strom bis zum ersten Messverstärker zurücklegen musste. Erfmdungsgemäß wird die Antwort der Probe unmittelbar am Ort ihrer Entstehung durch den Feldeffekttransistor verstärkt. Die Empfindlichkeit ist damit groß genug, um Messungen an biologischen Proben wie Einzelzellen, Teilbereichen von Zellen, Zellfragmenten, Zellmembranen, künstlichen Modellmembranen, Proteinen oder Biomolekülen durchfuhren zu können.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird die Probe mit Wechselspannungen verschiedener Frequenzen beaufschlagt. Die Antwort einer Probe auf eine Wechselspannung ist im Allgemeinen frequenzabhängig. Aus dieser Frequenzabhängigkeit lassen sich biologische Eigenschaften der Probe ableiten.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung werden Amplitude und Phase der primären physikalischen Messgröße gemessen. Der Zeitverlauf dieser Größen enthält eine Faltung weiterer Kenngrößen der Probe mit der Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors.
Vorteilhaft wird der Zeitverlauf von Amplitude und Phase der primären physikalischen Messgröße über zwischen 1 und 100, bevorzugt zwischen 3 und 30 sowie besonders bevorzugt zwischen 5 und 10 Schwingungen der angelegten Wechselspannung gemessen. Diese Zeit stellt regelmäßig einen Kompromiss zwischen der notwendigen Messzeit und dem Informationsgehalt für die spätere Auswertung, beispielsweise zur Bestimmung der Impedanz, dar.
Vorteilhaft werden der Zeitverlauf der primären physikalischen Messgröße und die Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors zur Ermittlung weiterer Kenngrößen der Probe verarbeitet. Beispielsweise kann der Zeitverlauf der primären physikalischen Messgröße eine Faltung einer solchen Kenngröße mit der Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors darstellen. Sofern die Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors bekannt ist, beispielsweise durch eine vorherige Messung ohne Probe, kann die gesuchte Kenngröße dann durch eine Entfaltung, also eine Inversion des Faltungsprozesses, aus dem aufgenommenen Zeitverlauf erhalten werden. Die Übertragungsfunktion kann aber auch bereits während der Messung zumindest teilweise mit dem Zeitverlauf der primären physikalischen Messgröße verrechnet werden, beispielsweise, indem diese mit einem zweiten, nicht direkt mit der Probe kontaktierten Feldeffekttransistor differenziell gemessen wird, der vorzugsweise benachbart zum ersten Feldeffekttransistor angeordnet ist, beispielsweise im selben Array. Die Kenngröße kann aber beispielsweise auch ermittelt werden, indem ein die Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors enthaltendes mathematisches Modell des Zeitverlaufs der primären physikalischen Messgröße, welches die gesuchte Kenngröße als Parameter enthält, unter Variation dieses Parameters an den aufgenommenen Zeitverlauf gefittet wird. Diese Maßnahmen zur Verarbeitung des Zeitverlaufs der primären physikalischen Messgröße und der Übertragungsfunktion haben die Wirkung, dass die Übertragungsfunktion quasi aus dem Zeitverlauf herauskorrigiert wird.
Insbesondere kann aus der primären physikalischen Messgröße die Impedanz der Probe ermittelt werden, beispielsweise durch die oben beschriebene Verrechnung des Zeitverlaufs der primären Messgröße mit der Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors. Die Bestimmung der Impedanz mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhöht die Vergleichbarkeit der Messergebnisse mit den Ergebnissen anderer Versuche deutlich.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird eine weitere sekundäre physikalische Messgröße gemessen. Diese Messgröße stellt vorteilhaft ein Maß für eine elektrische Aktivität der Probe dar, die wiederum vorteilhaft Rückschlüsse auf die biologische Aktivität zulässt. Die elektrische Aktivität kann beispielsweise eine extrazelluläre Spannung sein, die entweder spontan oder als Reaktion auf die Beaufschlagung mit der Wechselspannung an der Probe anliegt. Die elektrische Aktivität der Probe und ihre Antwort auf die Wechselspannung werden vorteilhaft mit ein und demselben Feldeffekttransistor gemessen, was Fehler durch Abweichungen in den Eigenschaften verschiedener Transistoren vermeidet.
Vorteilhaft wird die Probe zur Stimulation elektrischer Aktivität mit einer weiteren elektrischen Spannung beaufschlagt, beispielsweise durch eine weitere externe Spannungsquelle, wie beispielsweise durch eine Kontaktierung mittels Patch-Clamp-Technik oder Intrazellulat- Elektroden. Die weitere elektrische Spannung kann aber auch vorteilhaft gemeinsam mit der Wechselspannung angelegt werden, beispielsweise, indem die Wechselspannung auf eine Gleichspannung als weitere elektrische Spannung aufmoduliert wird.
Die sekundäre physikalische Messgröße kann beispielsweise ein im Vergleich zur Frequenz der Wechselspannung niederfrequenter Anteil des durch die Source-Drain-Strecke des Feldeffekttransistors fließenden Stroms sein. Dieser kann näherungsweise als Gleichstromanteil betrachtet werden.
Vorteilhaft können die primäre und die sekundäre physikalische Messgröße gleichzeitig gemessen werden. Dies ist besonders dann vorteilhaft, wenn die primäre physikalische Messgröße der durch die Source-Drain-Strecke des Feldeffekttransistors fließende Strom und die sekundäre physikalische Messgröße ein niederfrequenter, näherungsweise als Gleichstromanteil zu betrachtender Anteil dieses Stroms ist. Dann kann vorteilhaft ein Lock-In- Verstärker als Messinstrument gewählt werden.
Generell ist es vorteilhaft, den durch die Source-Drain-Strecke des Feldeffekttransistors fließenden Strom, oder allgemein die primäre physikalische Messgröße, bei anderen Frequenzen zu messen als der Frequenz der Wechselspannung. Insbesondere ist es vorteilhaft, ein Frequenzspektrum des Stroms, oder allgemein der primären physikalischen Messgröße, aufzunehmen. Aus diesem lässt sich dann der Strom bei der Frequenz der Wechselspannung als primäre physikalische Messgröße extrahieren. Als sekundäre physikalische Messgröße lassen sich niederfrequente Anteile extrahieren. Viele langsame biologische Effekte, wie beispielsweise extrazelluläre Aktivitäten, ändern den Strom bei mehreren Frequenzen, die niedrig im Vergleich zur Frequenz der Wechselspannung sind. Sie sind auf diese Frequenzen auf moduliert, analog zu den Signalen in der Nachrichtentechnik, die auf Trägerfrequenzen aufmoduliert sind.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung wird eine Probe gewählt, die mehrere interagierende biologische Proben umfasst, wie beispielsweise mehrere Biomoleküle oder eine Zelle und ein auf diese Zelle wirkender Stoff, wobei dieser Stoff beispielsweise ein Protein oder auch ein chemischer Wirkstoff sein kann. Dann kann vorteilhaft die biologische Wirkung dieser Literaktion studiert werden. Beispielsweise kann zunächst nur eine biologische Probe vorhanden sein und die andere Probe während der Messung hinzudosiert werden. So lassen sich zum Beispiel biomolekulare Bindungsreaktionen zwischen einem Antigen und dem dazugehörigen Antikörper studieren. Ebenso lassen sich Zellmembranen vor, während und nach der Zugabe biologischer oder künstlicher membrangängiger Proteine, wie beispielsweise Antibiotika, untersuchen.
Zur Manipulation der Probe, insbesondere zu ihrer Kontaktierung mit den Kontaktierungs- und/oder Stimulationsmitteln, können beispielsweise mikromechanische, optische und elek- trokinetische Verfahren verwendet werden. Weitere mögliche Messmethoden wären z. B. Amperometrie, Voltammetrie, Coulombmetrie, Gravimetrie, Optometrie, Hallmessung, Ato- mic-Force Mikroskopie (AFM), Lichtmikrospkopie, Temperatur-Sprungverfahren, Kalori- metrie oder 2-, 3- beziehungsweise 4-Polmessung. Vorteilhaft wird die Probe auf einen elektrisch mit dem Gate verbundenen Träger aufgebracht. Dieser Träger kann vorteilhaft aus einem Material bestehen, das gegen die in der Probe enthaltenen Substanzen beständiger ist als das Gate. Dann kann auch eine Probe gewählt werden, die das Gate selbst beispielsweise chemisch modifizieren würde. Zudem kann der Träger in beliebiger Weise mit der Probe präpariert und erst unmittelbar vor der Messung mit dem Gate verbunden werden. Die Verbindung des Trägers mit dem Gate kann vorteilhaft lösbar ausgestaltet sein. Dann können beispielsweise mehr Proben auf Trägern bevorratet werden als Feldeffekttransistoren zur Verfügung stehen.
Beispielsweise können Zellen, Biomoleküle, Proteine oder Teile davon in einer Suspension aufgebracht werden, die ein Nährmedium aufweisen kann. Die zu vermessenden Bestandteile setzen sich dann durch ihre Masse in der Lösung auf dem Boden ab und adhärieren auf der Oberfläche des Trägers. Bereits dieser Vorgang der Adhäsion kann nach der elektrischen Verbindung des Trägers mit dem Gate analysiert werden.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung wird ein Träger mit Haftmitteln gewählt, die die Anhaftung der Probe unterstützen. Als Haftmittel sind beispielsweise Linker-Moleküle geeignet, die chemisch mit dem Träger und der Probe reagieren. Es sind aber auch beispielsweise Proteine, wie etwa Fibronectin, Polylysin, Laminin oder andere Proteine geeignet. Die Wahl eines Trägers mit Haftmittel ist insbesondere vorteilhaft, wenn die Probe Zellmembranen oder künstliche Lipidmembransysteme enthält. Dabei können die Membranen mit unterschiedlichen Methoden auf den Träger transferiert werden, wie beispielsweise durch selbstorganisierte Bildung von Monolagen, durch schichtweise Membranabscheidung oder als Lang- muir-Film.
In einer weiteren besonders vorteilhaften Ausgestaltung wird ein Träger gewählt, auf dem die Haftmittel lateral strukturiert sind. Dann kann beispielsweise die Wanderung von Zellen entlang der lateralen Strukturen, die beispielsweise Linien oder Knoten umfassen können, beobachtet werden.
Ist die Probe vermehrungsfähig, so kann sie vor der Messung inkubiert werden, um die Anzahl der Zellen und damit die Signalstärke zu steigern. Dabei wird ein für das Zellwachstum ausreichendes Maß an Luftfeuchtigkeit und Kohlendioxid vorgelegt. Die Probe kann aber auch während der Messung inkubiert werden, um mit dem erfindungsgemäßen Verfahren den Vorgang der Zellteilung zu studieren.
Durch Messungen konnte belegt werden, dass beispielsweise die folgenden biologischen Eigenschaften von Proben mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung und dem erfindungsgemäßen Verfahren gemessen werden können, wobei vorteilhaft die Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens verwendet wird:
- elektrische Eigenschaften der Zelle;
- Auswirkungen biologischer, chemischer und physikalischer Einflussfaktoren, wie beispielsweise toxischer Substanzen, auf eine Zelle;
- elektrische Abdichteigenschaften zwischen Zelle und Oberfläche des Gates oder der Referenzelektrode
- Mikrobewegungen von Zellen;
- Signalübertragung von und zu sowie zwischen Zellen;
- Veränderung der chemischen Zusammensetzung einer Messlösung im Flüssigkeitsreservoir beziehungsweise zwischen der Zelle und der Oberfläche der Gates oder der Referenzelektrode;
- Zelladhäsion;
- Zellmotilität;
- Zellwanderung;
- Zellvitalität.
Bei einer geeigneten Auswertung ist auch die Untersuchung der folgenden, nach dem Stand der Technik bislang nur an Zellverbünden erfassbaren Eigenschaften und Vorgänge an Einzelzellen mit der Erfindung durchführbar:
- Abstand zwischen einer auf der Oberfläche eines Feldeffekttransistors oder der Referenzelektrode adhärierten Zelle und der jeweiligen Oberfläche;
- Apoptose;
- mutagenes Potential bekannter sowie unbekannter Substanzen;
- Signaltransduktion;
- Toxikologie;
- Zellstoffwechsel;
- Zellverhalten unter Strömung in fluidischen Systemen; - Elektroporation der Zellen.
Bei einer geeigneten Auswertung erscheint auch die Untersuchung der folgenden, erfassbaren Eigenschaften und Vorgänge an Zellfragmenten, Zellmembranen, künstlichen Modellmembranen, Proteinen oder Biomolekülen mit der Erfindung durchführbar, die nach dem Stand der Technik bislang nicht erfasst werden konnten:
- Bildung von Zellmembranen bzw. künstlichen Modellmembranen;
- Spreitung und Fusion von Vesikeln;
- Domänenseparation in künstlichen Modellmembranen;
- Fluktuationen in Zellmembranen bzw. künstlichen Modellmembranen;
- Aktivität von Ionenkanälen;
- Pharmakologie an Ionenkanälen;
- Rekonstitution von Ionenkanälen bzw. Proteinen in Zellmembranen bzw. künstlichen Modellmembranen;
- Bildung von Poren in Ionenkanälen, der Zellmembranen bzw. künstlichen Modellmembranen;
- Elektroporation der Zellmembranen bzw. künstlichen Modellmembranen;
- Adhäsion von Biomolekülen an die Oberfläche;
- Bindungsassays von Biomolekülen;
Dabei können sämtliche Messungen orts- und zeitaufgelöst durchgeführt sowie zeitliche Veränderungen der jeweiligen Messgröße festgestellt werden.
Spezieller Beschreibungsteil
Nachfolgend wird der Gegenstand der Erfindung anhand von Figuren näher erläutert, ohne dass der Gegenstand der Erfindung dadurch beschränkt wird. Es ist gezeigt:
Figur 1 : Blockschaltbild eines Ausführangsbeispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Figur 2: Zwei mit der Vorrichtung aus Figur 1 durchgeführte Messungen mit und ohne biologische Probe.
Figur 3 : Änderung des Messsignals in Abhängigkeit der Salzkonzentration im Flüssigkeitsreservoir 3 a. Figur 4: Änderung der Nachweisempfindlichkeit für die Probe in Abhängigkeit der Salzkonzentration im Flüssigkeitsreservoir 3 a.
Figur 5 : Normierte Übertragungsfunktionen zweier Feldeffekttransistoren 2, von denen lediglich einer mit einer Zelle bewachsen ist.
Figur 6: Nachweis einer Zellablösung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Figur 7: Unterschied zwischen den Zeitverläufen der normierten Übertragungsfunktion mit bzw. ohne Probe.
Figur 1 zeigt das Blockschaltbild eines Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Vorrichtung im Betrieb. Die Vorrichtung ist in diesem Ausführungsbeispiel als Sensor-Chip realisiert. Eine Zelle 1 ist mit dem Gate eines Feldeffekttransistors 2 kontaktiert. Der Feldeffekttransistor 2 umfasst einen Source-Anschluss 2a, einen Drain- Anschluss 2b und ein Gate 2c. Über der Zelle befindet sich ein Flüssigkeitsreservoir 3a, welches als kleine Kulturschale über der Gateoberfläche angeordnet ist. Eine Badelektrode 3 ist in dieses Flüssigkeitsreservoir 3a eingetaucht. Die Badelektrode 3 wird von einem Spannungs- und Frequenzgeber 4 mit einer Wechselspannung durchstimmbarer Frequenz beaufschlagt. Das Flüssigkeitsreservoir 3a, die Badelektrode 3 sowie der Spannungs- und Frequenzgeber 4 bilden zusammen eine Einheit, die das Stimulationsmittel darstellt. Die Kontaktierungsmittel umfassen auch einen Flüssigkeitsfilm zwischen dem Gate des Feldeffekttransistors und der Zelle 1. Eine Auslese- und Verstärkerelektronik 5 beaufschlagt die Source-Drain-Strecke des Feldeffekttransistors 2 mit einer Spannung und misst den durch diese Strecke fließenden Strom. Da in dem Feldeffekttransistor die Source-Drain-Strecke vom Gate isoliert ist, fließt dieser Strom nicht durch die Probe. Die Elektronik 5 wandelt den Strom dabei intern in eine Spannung um, so dass sie letztendlich eine Spannungsmessung durchführt. Die gemessene Spannung, die ein Maß für die Antwort der Probe auf die vom Spannungs- und Frequenzgeber 4 gelieferte Wechselspannung ist, sowie die Wechselspannung können von einer Auswerteeinheit 6 verarbeitet und dargestellt werden.
Ausführungsbeispiel 1 : Einfluss der Anwesenheit einer biologischen Probe auf die Frequenzabhängigkeit der normierten Übertragungsfunktion
Figur 2 zeigt exemplarisch zwei mit der in Figur 1 dargestellten Vorrichtung durchgeführte Messungen in logarithmischer Darstellung. In Figur 2 ist jeweils die normierte Übertragungsfunktion VSin / V0Ut gegen die Frequenz der angelegten Wechselspannung aufgetragen, wobei VSin die an die Badelektrode 3 angelegte Wechselspannung und Vout die von der Auslese- und Verstärkerelektronik 5 gelieferte Ausgangsspannung ist. Der Feldeffekttransistor war vor der Messung zunächst gereinigt und mit dem Protein Poly-L-Lysin als Probe beschichtet worden. Danach wurde ein Flüssigkeitsreservoir mit einer wässrigen Elektrolytslösung (elektrophysiologische Standardlösung: 5 mM KCl, 140 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM Glucose, pH 7.4 eingestellt mit NaOH) gefüllt.
Die Übertragungsfunktion des Probe-Feldeffekttransistor-Systems wurde bei unterschiedlichen Frequenzen von fs;n = 1 Hz - 750 kHz und einer Amplitude von VSjn = 20 mV gemessen (Figur 2, Kurve (D). Aufgrund der Gesamtimpedanz des Systems Referenzelektrode, Probe mit Kontaktierungsmittel, Feldeffekttransistor und erste Verstärkerstufe wird das Stimulationssignal nur bis zu Frequenzen von etwa fsjn = 90 kHz verstärkt. Für höhere Frequenzen nimmt insbesondere der Feldeffekttransistor nicht mehr an der Gesamtsignalverstärkung dieses Systems teil und somit werden wesentlich geringere Ausgangssignale Vout gemessen. Dies gilt nur für diese momentan verwirklichte Ausführung des Messsystems und stellt keine grundsätzliche Beschränkung des Einsatzbereichs der Erfindung dar.
Die Kurve © in Figur 2 zeigt exemplarisch die Messung der normierten Übertragungsfunktion Vsin / V0Ut nach einer erneuten Reinigung der Oberfläche und somit nach der Entfernung der biologischen Probe (Protein) von der Oberfläche. Der prinzipielle Verlauf der Übertragungsfunktion des Wechselspannungssignals in den Feldeffekttransistor ist dem in Anwesenheit des Proteins auf dem Feldeffekttransistor (Kurve (D in Figur 2) vergleichbar, jedoch erfolgt erst für Frequenzen oberhalb von fSjn = 300 kHz eine abnehmende Verstärkung von Vsin.
Die in Figur 2 gezeigte Messung mit Probe (Protein) wurde mit veränderten Salzkonzentrationen in der Elektrolytlösung wiederholt. Figur 3 zeigt die Ergebnisse dieser Messungen. Die Salzkonzentration nimmt von den Kurven (D bis ® ab: (D - unverdünnt © - 1:1 verdünnt (D - 1:10 verdünnt ® - 1 :20 verdünnt (D - 1:100 verdünnt © - 1:200 verdünnt © - 1:1000 verdünnt ® - 1:2000 verdünnt.
Als Verdünnungsmittel wurde jeweils destilliertes Wasser verwendet.
Es wird deutlich, dass sich hierdurch der Verlauf der normierten Übertragimgsfunktion Vsm / V0Ut in Abhängigkeit der Frequenz verändert. Hierbei bilden der Widerstand der wässrigen Elektrolytlösung REL und die Kapazität der Leiterbahn des Feldeffekttransistors CLB einen effektiven Tiefpass mit der Grenzfrequenz /π> = 1 / (2π x REL X CLB)- ES ist festzustellen, dass mit zunehmend geringerer Konzentration der Elektrolytlösung die Verstärkung der Übertragung des angelegten Wechselspannungssignals mit dem mit Poly-L-Lysin beschichteten Feldeffekttransistor bei zunehmend geringeren Frequenzen geringer wird.
Nach der Reinigung des Feldeffekttransistors (Entfernung der Probe) zeigt sich eine qualitativ vergleichbare Abhängigkeit der normierten Übertragungsfunktion von der Frequenz. Analog zu Figur 2 entscheidet die An- oder Abwesenheit der Probe jedoch über die Grenzfrequenz, bis zu der eine ungehinderte Übertragung erfolgen kann. Figur 4 zeigt die Differenz Δ(VSin/Vout) der jeweiligen Übertragungsfunktionen in An- und Abwesenheit des PoIy-L- Lysins für unterschiedliche Salzkonzentrationen (von Φ-® abnehmende Salzkonzentration der Elektrolytlösung). Die betragsmäßige Differenz, und damit die Empfindlichkeit der Messanordnung für den Nachweis des Vorhandenseins der Probe, wird mit abnehmender Salzkonzentration größer.
Es wird deutlich, dass sich die vorliegende Erfindung zum Nachweis von Biomolekülen wie beispielsweise Proteinen oder DNA eignet. Ebenso konnte eindeutig gezeigt werden, dass sich die vorliegende Erfindung zum Nachweis der Adhäsion von Biomolekülen auf den Feldeffekttransistoren eignet. Durch eine differentielle Messung ist sogar eine quantitative Aussage hinsichtlich der Menge der gebundenen Biomoleküle möglich.
Ausführungsbeispiel 2: Differentielle Messung zur Untersuchung der Eigenschaften einer Einzelzelle.
Figur 5 zeigt exemplarisch eine differentielle Messserie der normierten Übertragungsfunktion zweier unterschiedlicher, gleich beschichteter (Poly-L-Lysin) Feldeffekttransistoren auf demselben Sensor-Chip mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß Figur 1. Einziger Unterschied zwischen beiden Feldeffekttransistoren ist, dass auf einem der Feldeffekttransistoren eine Zelle (HEK293) gewachsen ist (©), während sich auf dem anderen Feldeffekttransistor keine Zelle befindet (©). Dieser Chip wurde zwecks Inkubation nach Auftragung der Zellsuspension für die Dauer von drei Tagen in einem Brutschrank unter konstanter CO2-Atmosphäre und konstanter Temperatur aufbewahrt.
Die normierte Übertragungsfunktion des Einzel-Zell-Feldeffekttransistor-Systems wurde bei unterschiedlichen Frequenzen von fsin = 1 Hz - 750 kHz und einer Amplitude von VSjn = 20 mV gemessen. Für den Feldeffekttransistor ohne Zelle erfolgt eine ungehinderte Gesamtsignalverstärkung des Systems, und die angelegten Wechselspannungssignale erfahren hierdurch eine höhere Verstärkung bis zu Frequenzen von etwa fsjμ = 70 kHz; für höhere Frequenzen erfolgt ein wesentlich geringere Verstärkung der übertragenen Wechselspannungssignale (Kurve ©). Für den Feldeffekttransistor mit der adhärierten Zelle ist ein signifikant unterschiedlicher Verlauf der Übertragimgsfunktion festzustellen (Kurve (D): Grundsätzlich führt die Zellabdeckung des Feldeffekttransistors zu einer unterschiedlichen Übertragungsfunktion des Wechselspannungssignals in den Feldeffekttransistor. In allen Fällen nimmt der Feldeffekttransistor schon bei wesentlich geringeren Frequenzen nicht mehr an der Gesamtsignalverstärkung des Systems teil, und die angelegte Wechselspannung wird nicht mehr verstärkt (hier: für Frequenzen oberhalb von fSjn = 10 kHz).
Aufgrund der gemessenen Übertragungsfunktion ist es durch eine geeignete Auswertung möglich, die elektrischen Abdichtungseigenschaften zwischen der Zelle und dem Feldeffekttransistor zu bestimmen. Für diese exemplarische Zelle ergab sich ein Abdichtwiderstand von etwa 1 MΩ.
Nach der Messung wurde der Sensor-Chip gereinigt, wobei sowohl die Zelle als auch die Beschichtungen entfernt wurden. Anschließend wurde erneut eine vollständige Messung des Frequenzgangs der normierten Übertragungsfunktion durchgeführt. Nach der Reinigung unterschieden sich die Übertragungsfunktionen der zuvor exemplarisch gezeigten Feldeffekttransistoren auf dem selben Sensor-Chip nicht mehr. Insofern ist eindeutig gezeigt, dass sich die vorliegende Erfindung zur Messung der Übertragungsfunktion sowie Veränderungen der Übertragungsfunktion durch die Anwesenheit von Einzel-Zellen auf den Feldeffekttransistoren eignet. Ausfuhrungsbeispiel 3: Messung des Zeitverlaufs einer Zellablösung.
Figur 6 zeigt exemplarisch eine zeitabhängige Messung der Veränderung der Übertragungsfunktion der beiden in Abb. 5 gezeigten Feldeffekttransistoren mit und ohne Zelle auf dem Feldeffekttransistor. Aufgetragen ist die normierte Übertragungsfunktion Vsjn / V0Ut gegen die Zeit t. Als konstante Frequenz der Wechselspannung wurde fSin = 200 kHz gewählt. Dies ist die Frequenz, bei der zwischen beiden Feldeffekttransistoren der maximale Unterschied in der Übertragungsfunktion festgestellt wurde (siehe Figur 5). Die Amplitude der Wechselspannung betrug VSi„ = 20 mV. Der Graph zeigt bis 240 s nur geringe Unterschiede zwischen den Übertragungsfünktions-Langzeitsignalen der Feldeffekttransistoren mit Zelle (Kurve Φ) und ohne Zelle (Kurve ©).
Nach 240 Sekunden wurde in die Kulturschale auf dem Sensor-Chip 100 μl Trypsin gegeben (Konzentration: Pfeil markiert die Zugabe). In diesem Ausführungsbeispiel war die Kulturschale so groß ausgestaltet, dass dadurch die Gates beider Feldeffekttransistoren mit dem Trypsin benetzt wurden. Dieses Enzym hat zur Folge, dass sämtliche membranständigen Proteine der Zellen - unter anderem auch die Proteine, die für die Adhäsion der Zellen auf der Oberfläche verantwortlich sind - enzymatisch abgebaut werden. Nach einiger Zeit lösen sich die Zellen von der Oberfläche. Optisch ist dies mit einer zunehmenden Abkugelung der Zellen zu beobachten.
In der Messung hat die Zugabe des Trypsins einen signifikanten Effekt zur Folge: Die normierte Übertragungsfunktion der Wechselspannung nimmt für den Feldeffekttransistor mit der adhärierten Zelle deutlich zu und erreicht schließlich einen stationären Wert, der etwa 80 % höher als zu Beginn der Messung liegt. Demgegenüber verändert sich die Übertragungsfunktion für den Feldeffekttransistor ohne Zelle nur geringfügig während der Zugabe des Trypsins.
Es ist deutlich nachgewiesen, dass mit der vorliegenden Erfindung die Veränderung der Adhäsion einer Einzel-Zelle auf einen Feldeffekttransistor signifikant nachweisbar ist. Insofern eignet sich die vorliegende Erfindung zur Studie der sowohl der orts- und zeitaufgelösten Zelladhäsion, sowie der orts- und zeitaufgelösten Zellablösung. Somit ist es möglich, die Ablösung einer Zelle, gleich aus welchem Anlass, zu registrieren. Dies kann beispielsweise in der Toxikologie oder zum Nachweis des Vorhandenseins anderer die Zellablösung auslösender Stoffe eingesetzt werden.
Ausführungsbeispiel 4: Nachweis von Mikrobewegungen einer Zelle.
Figur 7 zeigt das Ergebnis einer analog zu Figur 5 durchgeführten Messung. Im Unterschied zu Figur 5 wurde die normierte Überfragungsfunktion, analog zu Figur 6, zeitabhängig gemessen. Im Unterschied zu Figur 6 wurde während der Messung nicht in das System eingegriffen. Der obere Teil von Figur 7 zeigt die normierte Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors mit Zelle, der untere Teil von Figur 7 die des Feldeffekttransistors ohne Zelle. Die Übertragungsfunktionen sind jeweils gegen die Zeit t aufgetragen. Als konstante Frequenz der Wechselspannung wurde fsjn = 200 kHz gewählt. Dies ist die Frequenz, bei der zwischen beiden Feldeffekttransistoren der maximale Unterschied in der Übertragungsfunktion (siehe Figur 4) festgestellt wurde. Die Amplitude der Wechselspannung betrug Vsin = 20 mV.
Figur 7 zeigt die in Figur 6 nur geringfügig sichtbaren Unterschiede zwischen beiden Übertragungsfunktionen in Vergrößerung. Während für den Feldeffekttransistor ohne Zelle nur geringe Schwankungen zu registrieren sind (unten), sind für den Feldeffekttransistor mit Zelle schon deutliche Veränderungen in der Übertragungsfunktion festzustellen. Diese Veränderungen der Übertragungsfunktion lassen sich mit lokalen Mikrobewegungen der adhärierten Zelle korrelieren.
Insofern ist deutlich nachgewiesen, dass mit der vorliegenden Erfindung die Veränderung der Adhäsion einer Einzel-Zelle aufgrund von Mirkobewegungen der'Zelle signifikant nachweisbar ist. Daher eignet sich die vorliegende Erfindung zur schnellen und effizienten Messung der Toxizität unbekannter Substanzen, da solche Mikrobewegungen der Zelle wie auch die Zellmotilität ein stark an die Zellvitalität gekoppelter Parameter ist, der durch toxische Substanzen signifikant geändert wird.
Die hier gezeigten Ausführungsbeispiele schränken die Erfindung nicht auf biologische Proben ein. Die Grundidee, für die stromlose Messung eines Wechselstromwiderstands einen Feldeffekttransistor einzusetzen, ist an jedem System realisierbar, das mit einer Wechselspannung beaufschlagt werden kann und das Ladungen mit dem Gate eines Feldeffekttransistors austauschen kann.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
I . Vorrichtung zur Messung biologischer und elektronischer Eigenschaften einer Probe, umfassend einen Feldeffekttransistor (2) mit Kontaktierungsmitteln zur Kontaktierung der Probe mit dem Gate des Feldeffekttransistors, gekennzeichnet durch Stimulationsmittel (3, 3a, 4) zur Beaufschlagung der Probe (1) mit einer Wechselspannung.
2 . Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch ein Messinstrument (5) zur
Messung von Amplitude und Phase eines durch die Source-Drain-Strecke des Feldeffekttransistors fließenden Stroms.
3 . Vorrichtung nach Anspruch 2, gekennzeichnet durch ein frequenzselektives Messin- strument (5).
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch Anregungsmittel zur Beaufschlagung der Probe (1) mit einer weiteren elektrischen Spannung.
5 . Vorrichtung nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch eine Patch-Clamp Konfiguration als Anregungsmittel.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 bis 5, gekennzeichnet durch eine Intrazellularelektrode als Anregungsmittel.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend mindestens einen weiteren Feldeffekttransistor.
8 . Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der weitere Feldeffekttransistor elektrisch von der Probe isoliert ist.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch Mittel zur Kontaktierung mehrerer Feldeffekttransistoren (2) mit derselben Probe (1).
10 . Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, gekennzeichnet durch Stimulationsmittel (3, 3a) umfassend ein Flüssigkeitsreservoir (3a).
II . Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, gekennzeichnet durch Kontaktie- rungsmittel umfassend ein Flüssigkeitsreservoir (3 a). 2 . Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, gekennzeichnet durch ein Flüssigkeitsreservoir (3a) mit einem Volumen größer 0,1 μl, insbesondere größer 100 μl. 3 . Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, gekennzeichnet durch ein geschlossenes Flüssigkeitsreservoir (3 a). 4 . Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, gekennzeichnet durch ein Flüssigkeitsreservoir (3 a) mit einem Zu- und/oder einem Ablauf.
5 . Verfahren zur Messung biologischer Eigenschaften einer Probe mit den Schritten:
- die Probe (1) wird mit einer Wechselspannung beaufschlagt;
- die Probe tauscht Ladungen mit dem Gate eines Feldeffekttransistors (2) aus;
- eine vom Potential am Gate des Feldeffekttransistors (2) abhängige primäre physikalische Messgröße wird gemessen.
6 . Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass eine Wechselspannung mit einer Frequenz zwischen 0,1 Hz und 1 GHz, insbesondere zwischen 1 Hz und 10 MHz, gewählt wird. 7 . Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine Wechselspannung mit einer Amplitude zwischen 0,001 mV und 10 V, insbesondere zwischen 1 mV und 100 mV, gewählt wird. 8 . Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplitude der Wechselspannung während der Messung konstant gehalten wird.
9 . Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (1) mit Wechselspannungen verschiedener Frequenzen beaufschlagt wird.
o . Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass Amplitude und Phase der primären physikalischen Messgröße gemessen werden.
1 . Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Zeitverlauf von Amplitude und Phase der primären physikalischen Messgröße über zwischen 1 und 100, insbesondere über zwischen 5 und 10 Schwingungen der angelegten Wechselspannung gemessen wird.
22 . Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass ein durch die Source-Drain-Strecke des Feldeffekttransistors (2) fließender Strom als primäre physikalische Messgröße gemessen wird.
23 . Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass der
Zeitverlauf der primären physikalischen Messgröße und eine Übertragungsfunktion des Feldeffekttransistors (2) zur Ermittlung weiterer Kenngrößen der Probe verarbeitet werden.
24 . Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass aus der primären physikalischen Messgröße die Impedanz der Probe (1) ermittelt wird.
25 . Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass eine weitere sekundäre physikalische Messgröße gemessen wird.
26 . Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass eine sekundäre physikalische Messgröße gewählt wird, die ein Maß für eine elektrische Aktivität der Probe (1) ist.
27 . Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (1) zur Stimulation elektrischer Aktivität mit einer weiteren elektrischen Spannung beaufschlagt wird.
28 . Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass ein im Vergleich zur Frequenz der Wechselspannung niederfrequenter Anteil des durch die Source-Drain-Strecke des Feldeffekttransistors (2) fließenden Stroms als sekundäre physikalische Messgröße gewählt wird.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass primäre und sekundäre physikalische Messgröße gleichzeitig gemessen werden.
3 o . Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass eine
Probe (1) gewählt wird, die mindestens zwei interagierende biologische Proben umfasst.
31 . Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (1) auf einen elektrisch mit dem Gate verbundenen Träger aufgebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 31 , dadurch gekennzeichnet, dass ein Träger mit Haftmitteln gewählt wird, die die Anhaftung der Probe (1) unterstützen.
Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass ein Träger gewählt wird, auf dem die Haftmittel lateral strukturiert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (1) inkubiert wird.
Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 15 bis 34.
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