DE10008373C2

DE10008373C2 - Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Ionenkanalaktivität

Info

Publication number: DE10008373C2
Application number: DE10008373A
Authority: DE
Inventors: Helmut Adelsberger
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-02-23
Filing date: 2000-02-23
Publication date: 2002-11-28
Anticipated expiration: 2020-02-24
Also published as: DE10008373A1

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung der Aktivität von Ionenkanälen in Zellen.

Ionenkanäle sind transmembranöse, ionenselektive Pro teine, die auf nahezu allen Arten von Zellen, wie z. B. Ner venzellen, Muskelzellen, endokrinen Zellen, Gliazellen, Epithel- und Endothelzellen, vorliegen. Diese Proteine die nen der Aufrechterhaltung der physiologischen Ionenkon zentrationen in den Zellen und der Weiterleitung von Signa len zwischen den Zellen, indem sie im geöffneten Zustand die Durchleitung von niedermolekularen Ionen ermöglichen und im geschlossenen Zustand deren Durchleitung verhin dern.

Das Öffnen oder das Schließen der Ionenkanäle erfolgt durch vorbestimmte Reize, denen die betreffenden Zellen oder Moleküle, die die Ionenkanäle bilden, ausgesetzt sind. Danach können zwei Hauptgruppen der Ionenkanäle unter schieden werden:

A) Ligandenaktivierte Ionenkanäle sind Ionenkanäle, bei denen durch die Bindung einer vorzugsweise kör pereigenen Wirksubstanz, eines sogenannten Ligan den, an den Ionenkanal, das Öffnen des Ionenkanals ausgelöst wird. Dazu gehören auch die second-messen ger-gesteuerten Ionenkanäle. Hierbei bindet ein Ligand an einen transmembranösen Rezeptor an, wobei als Folge dieser Anbindung eine intrazelluläre Enzymkas kade aktiviert wird, die zu einer enzymatischen Modi fikation des Ionenkanals führt, wodurch sich der Ionen kanal öffnet.
B) Spannungsgesteuerte Ionenkanäle werden durch ei nen Spannungsreiz zum Öffnen veranlaßt. Derartige Ionenkanäle sind u. a. an Nervenzellen zu finden.

Häufig sind Ionenkanäle Angriffspunkte für Pharmaka, Toxine, Insektizide oder Anthelminthika. Bei der Erfor schung der Wirkung von z. B. pharmazeutischen Wirksub stanzen ist es notwendig, den Einfluß dieser Wirksubstanzen auf Ionenkanäle zu untersuchen. Derartige Untersuchungen sind sehr aufwendig, da meist eine große Anzahl von Wirk substanzen oder deren Derivate zu untersuchen ist.

Zusammenfassend ist festzustellen, daß sowohl bei den ligandengesteuerten als auch bei den spannungsgesteuerten Ionenkanälen die Änderungen des Öffnungs- und Schließ verhaltens bei der Zugabe einer Wirksubstanz, z. B. eines Pharmazeutikums, ermittelt werden sollen.

Um die Ionenkanalaktivitäten zu messen, sind ganz spe zielle, darauf abgestimmte Vorrichtungen und Verfahren entwickelt worden.

Bei der sogenannten Path-Clamp-Methode, die u. a. in den Dokumenten DE 197 44 649, WO 9919729, WO 9613721 und in JP 4338240 beschrieben ist, werden sehr dünne Elektroden auf die zu untersuchenden Zellen aufgesetzt, und es wird der Widerstand gegenüber einer Um gebungslösung gemessen, wobei sich Widerstände im Me gaohm- bis Gigaohmbereich ausbilden. Diese Technik ist kompliziert und insbesondere für eine Automatisierung we nig geeignet.

Eine weitere Untersuchungsmethode der Ionenkanalakti vität ist die Fluoreszenzmethode, bei der die Zellen mit io nenselektiven, fluoreszierenden Farbstoffen beladen wer den. Diese Farbstoffe ändern ihr Fluoreszenzverhalten, wenn sich nach der Öffnung der Ionenkanäle die intrazellu läre Ionenkonzentration infolge des Ionenflusses durch die Ionenkanäle ändert. Mittels photometrischer Messungen des Fluoreszenzunterschieds ist die Ionenkanalaktivität be stimmbar. Beispiele für dieses Verfahren können aus der PCT/US 92/11090, WO 9858074, US 4748129, WO 9313423, WO 0002045 und aus der US 5932417 ent nommen werden.

Obwohl die Fluoreszenzmethode bereits ausgereift und auch für automatische Messungen geeignet ist, bestehen je doch auch Nachteile. Durch die Zugabe von fluoreszieren den Substanzen kann die Aktivität der Ionenkanäle unvor hersehbar beeinflußt werden, wobei manche Farbstoffe auf die betreffenden Zeilen sogar eine toxische Wirkung haben können. Daher müssen für bestimmte Zellarten bzw. für jede Art von Ionenkanälen spezielle Farbstoffe häufig erst ent wickelt werden.

Es ist demzufolge die Aufgabe der Erfindung, die Bestim mung der Ionenkanalaktivität zu verbessern, wobei insbe sondere außer den Wirkstoffen keine zusätzlichen Substan zen beigefügt werden sollen. Weiterhin soll die Bestimmung einfach und kostengünstig sowie prinzipiell für eine Auto matisierung geeignet sein.

Diese Aufgabe wird mittels der Verfahren nach den An sprüchen 1 bis 3 und mittels Vorrichtungen nach den An sprüchen 4 und 5 gelöst.

Es wird ein Verfahren zur Bestimmung der Ionenkanalaktivität an ligandenaktivierbaren Zellen bereit gestellt, wobei das Verfahren nachfolgende Schritte auf weist:

a) Anordnen einer ersten Menge von zu untersuchen den Zellen auf einer Trägerelektrode.
Dem Fachmann ist klar, daß die Zellen mit der Träger elektrode in elektrischem Kontakt sein müssen. Weiter hin ist aus dem Stand der Technik bekannt, daß es ver schiedene Möglichkeiten gibt, Zellen auf einer Träger oberfläche aufwachsen zu lassen. Der Fachmann kann daher auf Grund seines Fachwissens für einen speziel len Zelltyp ein geeignetes Material und ein geeignetes Verfahren zum Aufwachsen auswählen, wobei das Aufwachsen nur eine der Möglichkeiten zum Anord nen von Zellen auf einer Trägeroberfläche ist.
b) Anordnen einer Trägergegenelektrode in Gegen überlage der Zellen. Die Zellen und die Elektroden sind in einer Meßkammer angeordnet, die mit einer leitfähi gen Flüssigkeit auf ein Niveau gefüllt ist, bei dem die Zellen und die Elektroden von der Flüssigkeit benetzt sind.
c) Einleiten eines Liganden auf die Zellen, d. h., die Ionenkanäle dieser Zeilen werden einer Substanz aus gesetzt, die ihrer natürlichen Funktion entspricht.
d) Messen des elektrischen Widerstandes oder der Leitfähigkeit der Zellen zwischen den Elektroden, bevor sich die Ionenkanäle wieder geschlossen haben, um ein Meßergebnis E1 zu erhalten. Die Art und Höhe der Spannung sind von der Meßanordnung abhängig. Vorzugsweise wird eine Wechselspannung angelegt, um Polarisierungseffekte an der Meßanordnung zu ver meiden.
e) Austauschen der ersten Menge der zu untersuchen den Zellen gegen eine zweite Menge der zu untersu chenden Zellen. Dieser Schritt ist erforderlich, da sich die meisten Ionenkanäle bei Anwesenheit des Ligan den nicht erneut aktivieren lassen, d. h. die meisten Io nenkanäle schließen sich nach einer vorbestimmten Zeit und bleiben geschlossen. In seltenen Fällen blei ben die Ionenkanäle geöffnet.
f) Einleiten des Liganden und einer Wirksubstanz auf die Zellen der zweiten Menge, d. h., es wird Arbeits schritt c wiederholt, jedoch wird zusätzlich eine Wirk substanz beigegeben.
g) Bestimmen des Öffnungsverhaltens der Ionenka näle durch Messen des elektrischen Widerstandes oder der Leitfähigkeit der Zellen zwischen den Elektroden, bevor sich die Ionenkanäle wieder geschlossen haben, um ein Meßergebnis E2 zu erhalten, d. h., es wird der Arbeitsschritt d wiederholt, wobei das Meßergebnis E2 durch die Wirksubstanz beeinflußt ist.
h) Vergleichen des Meßergebnisses E1 mit dem Meß ergebnis E2, wobei der Einfluß der Wirksubstanz auf die Ionenkanalaktivität ermittelt wird. Dieser Vergleich wird in den Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Nach Anspruch 2 wird ein zu Anspruch 1 alternatives Verfahren bereitgestellt, wobei die Zellen für beide Messun gen verwendet werden. Dazu ist es erforderlich, die Flüssig keit in der Meßzelle nach dem Schritt d auszutauschen und durch eine Flüssigkeit, die keinen Ligand enthält, zu erset zen, d. h., die Meßzelle wird gespült. Die weiteren Schritte f, g und h verlaufen dann entsprechend nach Anspruch 1.

Nach Anspruch 3 wird ein Verfahren zur Bestimmung der Ionenkanalaktivität an spannungsaktivierbaren Zellen bzw. Ionenkanälen bereitgestellt. Obwohl dieses Verfahren einige gemeinsame Merkmale mit dem Verfahren nach Anspruch 1 aufweist, handelt es sich um eine eigenständige Erfindung, da die zu untersuchenden Zellen völlig andere Eigenschaf ten aufweisen. Spannungsaktivierbare Ionenkanäle öffnen sich beim Anlegen eines Spannungsimpulses. Das Verfah ren weist die Schritte a und b des Verfahrens nach Anspruch 1 auf. In einem Verfahrensschritt c werden die Ionenkanäle durch einen Spannungsimpuls aktiviert, d. h. geöffnet. Nach einer vorbestimmten Zeitdauer schließen sich die Ionenka näle wieder.

In einem Verfahrensschritt d wird der elektrische Wider stand oder die Leitfähigkeit des geöffneten Ionenkanals be stimmt. Nachdem sich der Ionenkanal wieder geschlossen hat, wird in dem Verfahrensschritt e die Wirksubstanz auf die Zellen geleitet, und es wird erneut ein Spannungsimpuls angelegt. Die Ionenkanäle öffnen sich wieder, jedoch unter scheiden sich das Öffnungsverhalten, wie z. B. die Öff nungsdauer und die Öffnungsgeschwindigkeit, sowie der Widerstand oder die Leitfähigkeit in dieser Phase von der Phase ohne Wirksubstanzzugabe.

In einem Verfahrensschritt f erfolgt das Bestimmen des Öffnungsverhaltens der Ionenkanäle durch Messen des elek trischen Widerstandes oder der Leitfähigkeit der Ionenka näle.

Nach Anspruch 4 wird eine Vorrichtung zur Bestimmung der Ionenkanalaktivität an ligandenaktivierbaren Ionenka nälen mit nachfolgenden Merkmalen bereitgestellt: In einer Meßkammer ist eine flächige Trägerelektrode vorgesehen, auf der die zu untersuchenden Zellen angeordnet sind. Von der Trägerelektrode ist eine Trägergegenelektrode beabstan det angeordnet. Die Meßkammer ist mit einer Flüssigkeit gefüllt, die eine vorbestimmte Leitfähigkeit und vorbe stimmte Eigenschaften bezüglich der Ionenkanalaktivität aufweist. Weiterhin ist eine Dosiervorrichtung zum Einbrin gen von Liganden und zu untersuchenden Wirksubstanzen vorgesehen. An die Elektroden ist eine Leitfähigkeitsmeß vorrichtung angeschlossen.

Nach Anspruch 5 wird eine Vorrichtung zur Bestimmung der Ionenkanalaktivität an spannungsaktivierbaren Ionenka nälen bereitgestellt, deren Aufbau dem nach Anspruch 4 entspricht. Zusätzlich ist eine Spannungsimpulserzeugungs vorrichtung vorgesehen, die einen vorbestimmten Span nungsimpuls zur Aktivierung der Ionenkanäle bereitstellt.

Nach Anspruch 6 ist eine Umschalteinheit vorgesehen, die beim Anlegen des Spannungsimpulses an die Träger elektrode und an die Trägergegenelektrode die Leitfähig keitsmeßvorrichtung abschaltet, wodurch die Meßgenauig keit erhöht wird. Dadurch wird verhindert, daß die Leitfä higkeitsmeßvorrichtung durch den Spannungsimpuls weit außerhalb ihres Meßbereiches angesteuert wird.

Nach Anspruch 7 sind eine Zusatzelektrode, die von der Trägerelektrode beabstandet angeordnet ist, und eine Zu satzgegenelektrode vorgesehen, die von der Trägergegen elektrode beabstandet angeordnet ist, wobei zwischen der Zusatzelektrode und der Zusatzgegenelektrode eine vorbe stimmte Spannung anliegt.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Ausfüh rungsbeispielen in Verbindung mit schematischen Zeich nungen näher erläutert.

Fig. 1 zeigt eine Schnittdarstellung der Erfindung in einer prinzipiellen Ausführungsform.

Fig. 2 zeigt ein Meßdiagramm eines ligandenaktivierba ren Ionenkanals.

Fig. 3 zeigt ein Meßdiagramm eines spannungsaktivier baren Ionenkanals.

Fig. 4, 5 zeigen das Prinzip einer Automatisierungslö sung.

Die Fig. 1 zeigt eine Meßkammer 1 mit einer flüssigkeits dichten Kammerwandung. In der Meßkammer 1 ist eine flache Trägerelektrode 2 angeordnet. Auf dieser Trägerelek trode 2 ist eine Membran mit den zu untersuchenden Zellen 3 aufgebracht. Dem Fachmann ist geläufig, unter welchen Bedingungen Zellen auf einer Unterlage auszusähen und im Brutschrank zu behandeln sind, damit sich die Zellen ver mehren und den sogenannten Zellrasen ausbilden, so daß möglichst die gesamte Oberfläche der Membran bedeckt ist. Über der Trägerelektrode 2 ist in einem Abstand von 3- 5 mm eine ring- oder gitterförmige Trägergegenelektrode 4 angeordnet, wobei diese beiden Elektroden 2, 4 an eine Spannungsmeßvorrichtung angeschlossen sind. Unterhalb der Trägerelektrode 2 ist eine Zusatzelektrode 5 angeordnet, und oberhalb der Trägergegenelektrode 4 ist eine zugehö rige Zusatzgegenelektrode 6 angeordnet, wobei die beiden Elektroden 5, 6 an eine Wechselspannungsquelle ange schlossen sind. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wird eine Wechselspannung von 10 mV und einer Frequenz von 10 kHz verwendet.

Die Meßkammer ist mit einer physiologischen Salzlösung 7 bis zu einem Niveau gefüllt, bei dem alle Elektroden von der Salzlösung benetzt werden. Die Salzlösung 7 soll die na türliche Umgebung der lebenden Zellen in ihrem Organis mus ersetzen. Daher wird die Zusammensetzung der Salzlö sung durch die Art der zu untersuchenden Zellen bestimmt, ob z. B. Zellen eines Säugetiers oder eines Insekts vorlie gen.

Durch eine Bohrung im oberen Bereich der Meßkammer 1 ist eine Glaskapillare 8 eingeführt, durch die die Liganden und die zu untersuchenden Wirksubstanzen eingetragen werden. Bei der vorliegenden Ausführungsform wird zum Eintragen der Wirksubstanzen Druckluft benutzt. Da das Verfahren und die Technik zum Dosieren von Substanzen dem Fachmann hinreichend bekannt sind, wird darauf nicht näher eingegangen.

Nachfolgend sollen anhand von Fig. 2a, b, c die Funktion und die Wirkung einer Wirksubstanz bei ligandenaktivierten Ionenkanälen erläutert werden.

Die Fig. 2a zeigt ein Meßdiagramm eines ligandenakti vierbaren Ionenkanals, bei dem der zeitliche Verlauf der Ka nalaktivität dargestellt ist.

Im Zeitabschnitt a ist der Ionenkanal geschlossen und weist eine Grundleitfähigkeit auf. Durch die Zugabe eines Liganden L zu einem Zeitpunkt b wird der Ionenkanal akti viert, so daß nach einer kurzen Totzeit die Leitfähigkeit, d. h. das Durchlaßvermögen für Ionen, ansteigt. Nach einigen Sekunden (Bereich c) schließt sich der Ionenkanal von selbst, so daß der mit dem Bezugszeichen P gekennzeich nete Peak entsteht. Zu einem Zeitpunkt d ist die Leitfähig keit näherungsweise auf ihren ursprünglichen Wert zurück gegangen. Wie bereits erwähnt, gehört es zu den spezifi schen Eigenschaften der meisten Ionenkanäle, daß durch eine erneute Zugabe eines Liganden keine erneute Öffnung der Kanäle bewirkt werden kann. Dieser Umstand erklärt sich daraus, daß der zum Zeitpunkt b eingetragene Ligand L noch an den Ionenkanälen anliegt und eine erneute Aktivie rung des Kanals verhindert.

In Fig. 2b wird eine erste Auswirkung einer Wirksubstanz auf die Ionenkanalaktivität eines Ionenkanals nach Fig. 2a gezeigt. Zum Zeitpunkt b wird der Ionenkanal mit einer Mi schung aus dem Liganden L und einer ersten Wirksubstanz WS_1a beaufschlagt. Die Wirksubstanz WS_1a erhöht die Io nenkanalaktivität. Der Peak P_1a zeigt, daß eine Wirksub stanz WS_1a vorrangig die Leitfähigkeit erhöht, die Zeitdauer der Öffnung des Ionenkanals jedoch nur unwesentlich be einflußt. Der Peak P_1b zeigt, daß eine Wirksubstanz WS_1b vorrangig die Zeitdauer der Öffnung des Ionenkanals ver längert, die Leitfähigkeit jedoch nur unwesentlich beein flußt.

In Fig. 2c wird eine zweite Auswirkung einer Wirksub stanz auf die Ionenkanalaktivität eines Ionenkanals nach Fig. 2a gezeigt. Zum Zeitpunkt b wird der Ionenkanal mit einer Mischung aus dem Liganden L und einer zweiten Wirksubstanz WS_2a beaufschlagt. Die Wirksubstanz WS_2a blockiert die Ionenkanalaktivität. Der Peak P_2a zeigt, daß eine Wirksubstanz WS_2a vorrangig die Leitfähigkeit verrin gert, die Zeitdauer der Öffnung des Ionenkanals jedoch nur unwesentlich beeinflußt. Der Peak P_2b zeigt, daß eine Wirk substanz WS_2b vorrangig die Zeitdauer der Öffnung des Io nenkanals verkürzt, die Leitfähigkeit jedoch nur unwesent lich beeinflußt.

Nachfolgend sollen anhand von Fig. 3a, b, c die Funktion und die Wirkung einer Wirksubstanz bei spannungsaktivier ten Ionenkanälen erläutert werden.

Die Fig. 3a zeigt ein Meßdiagramm eines spannungsakti vierbaren Ionenkanals, bei dem der zeitliche Verlauf der Io nenkanalaktivität dargestellt ist. Im Zeitabschnitt a ist der Ionenkanal geschlossen und weist eine Grundleitfähigkeit auf. Durch Aufbringen eines Spannungsimpulses U_Imp in ei nem Zeitpunkt b wird der Ionenkanal aktiviert, so daß nach einer kurzen Totzeit die Leitfähigkeit für Ionen ansteigt. Nach einigen Sekunden schließt sich der Ionenkanal von selbst, so daß der mit dem Bezugszeichen P gekennzeich nete Peak entsteht. Im Punkt d ist die Leitfähigkeit nähe rungsweise auf ihren ursprünglichen Wert (Grundleitfähig keit) zurückgegangen. Durch ein erneutes Aufbringen des Spannungsimpulses U_Imp zu einem Zeitpunkt e ist der Io nenkanal erneut aktivierbar.

In Fig. 3b wird die Auswirkung einer ersten Wirksubstanz auf die Ionenkanalaktivität eines Ionenkanals nach Fig. 3a gezeigt. Zum Zeitpunkt e wird der Ionenkanal mit einer er sten Wirksubstanz WS_1a beaufschlagt, die die Ionenkanalak tivität erhöht. Der Peak P_1a zeigt, daß eine Wirksubstanz WS_1a vorrangig die Zeitdauer der Öffnung des Ionenkanals verlängert, die Leitfähigkeit jedoch nur unwesentlich beein flußt. Der Peak P_1b zeigt, daß eine Wirksubstanz WS_1b vor rangig die Leitfähigkeit erhöht, die Zeitdauer der Öffnung des Ionenkanals jedoch nur unwesentlich beeinflußt.

In Fig. 3c wird die Auswirkung einer zweiten Wirksub stanz WS₂ auf die Ionenkanalaktivität eines Ionenkanals nach Fig. 3a gezeigt. Zum Zeitpunkt e wird der Ionenkanal mit der zweiten Wirksubstanz WS_2a beaufschlagt, die die Io nenkanalaktivität blockiert. Der Peak P_2a zeigt, daß eine Wirksubstanz WS_2a vorrangig die Leitfähigkeit des Ionen kanals verringert, die Zeitdauer der Öffnung des Ionenka nals jedoch nur unwesentlich beeinflußt. Der Peak P_2b zeigt, daß eine Wirksubstanz WS_2b vorrangig die Zeitdauer der Öffnung des Ionenkanals verkürzt, die Leitfähigkeit jedoch nur unwesentlich beeinflußt.

Die Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung einer Au tomatisierungslösung für die Erfindung. Meßkammern 1a-n sind auf einer Platte zusammengefaßt. Derartige Platten sind als sogenannte Mikrotiterplatten im Laboreinsatz weit ver breitet. Die Mikrotiterplatten finden vor allem Einsatz in der automatisierten Laboranalysentechnik. Es ist ebenfalls be kannt, derartige Mikrotiterplatten mit elektrischen An schlüssen zu versehen, so daß ein modularer Aufbau aus ei ner Vielzahl von Meßzellen nach Fig. 1 erzeugt werden kann.

Die Fig. 5 zeigt einen schematischen Aufbau einer Meß zelle nach Fig. 1. Es ist zu erkennen, daß ein Meßkopf mit den Elektroden und der Eintragvorrichtung in der nach oben offenen Meßzelle in Richtung des Doppelpfeiles ein- und ausfahrbar ist.

Somit ist für den Fachmann erkennbar, daß die vorlie gende Erfindung, im Gegensatz zu der Patch-Clamp-Tech nik, gut automatisierbar ist, wobei bekannte Technologien und Vorrichtungen Anwendung finden können.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Ionenkanalaktivität von ligandenakti vierbaren Ionenkanälen von Zellen, wobei das Verfahren nachfolgende Schritte aufweist:

a) Anordnen einer ersten Menge von zu untersuchenden Zellen (3) auf ei ner Trägerelektrode (2),
b) Anordnen einer Trägergegenelektrode (4) in Gegenüberlage der Zellen (3), wobei die Zellen (3) und die Elektroden in einer Meßkammer (1) ange ordnet sind, die mit einer leitfähigen Flüssigkeit gefüllt ist, so daß die Zel len (3) und die Elektroden von der Flüssigkeit benetzt sind,
c) Einleiten eines Liganden auf die Zellen (3),
d) Messen des elektrischen Widerstandes oder der Leitfähigkeit der Zellen an den Elektroden, bis sich die Ionenkanäle wieder geschlossen haben, um ein Meßergebnis E1 zu erhalten,
e) Austauschen der ersten Menge der zu untersuchenden Zellen (3) gegen eine zweite Menge der zu untersuchenden Zellen (3),
f) Einleiten des Liganden und einer Wirksubstanz auf die zweite Menge der zu untersuchenden Zellen (3),
g) Messen des elektrischen Widerstandes oder der Leitfähigkeit der Zellen an den Elektroden, bis sich die Ionenkanäle wieder geschlossen haben, um ein Meßergebnis E2 zu erhalten,
h) Vergleichen der Meßergebnisse E1 und E2 hinsichtlich des zeitlichen Verlaufs der Ionenkanalaktivität, wodurch der Einfluß der Wirksubstanz ermittelt wird.

2. Verfahren zur Bestimmung der Ionenkanalaktivität von ligandenakti vierbaren Ionenkanälen von Zellen, wobei das Verfahren nachfolgende Schritte aufweist:

a) Anordnen einer Menge von zu untersuchenden Zellen (3) auf einer Trä gerelektrode (2),
b) Anordnen einer Trägergegenelektrode (4) in Gegenüberlage der Zellen (3), wobei die Zellen (3) und die Elektroden in einer Meßkammer (1) ange ordnet sind, die mit einer leitfähigen Flüssigkeit gefüllt ist, so daß die Zel len (3) und die Elektroden von der Flüssigkeit benetzt sind,
c) Einleiten eines Liganden auf die Zellen (3),
d) Messen des elektrischen Widerstandes oder der Leitfähigkeit der Zellen an den Elektroden, bis sich die Ionenkanäle wieder geschlossen haben, um ein Meßergebnis E1 zu erhalten,
e) Austauschen der Flüssigkeit der Meßzelle durch ligandenfreie, leitfähige Flüssigkeit,
f) Einleiten des Liganden und einer Wirksubstanz auf die Zellen (3),
g) Messen des elektrischen Widerstandes oder der Leitfähigkeit der Zellen an den Elektroden, bis sich die Ionenkanäle wieder geschlossen haben, um ein Meßergebnis E2 zu erhalten,
h) Vergleichen der Meßergebnisse E1 und E2 hinsichtlich des zeitlichen Verlaufs der Ionenkanalaktivität, wodurch der Einfluß der Wirksubstanz ermittelt wird.

3. Verfahren zur Bestimmung der Ionenkanalaktivität an spannungsakti vierbaren Ionenkanälen von Zellen, wobei das Verfahren nachfolgende Schritte aufweist:

a) Anordnen der zu untersuchenden Zellen (3) auf einer Trägerelektrode
b) Anordnen einer Trägergegenelektrode (4) in Gegenüberlage der Zellen (3), wobei die Zellen (3) und die Elektroden in einer Meßkammer (1) ange ordnet sind, die mit einer leitfähigen Flüssigkeit gefüllt ist, so daß die Zel len (3) und die Elektroden von der Flüssigkeit benetzt sind,
c) Anlegen eines vorbestimmten Spannungsimpulses an die Elektroden, so daß ein Öffnen der Ionenkanäle bewirkt wird,
d) Messen des elektrischen Widerstandes oder der Leitfähigkeit der Zellen an den Elektroden, bis sich die Ionenkanäle wieder geschlossen haben, um ein Meßergebnis E1 zu erhalten,
e) Einleiten einer Wirksubstanz auf die Zellen,
f) Aufbringen eines erneuten Spannungsimpulses und Messen des elektri schen Widerstandes oder der Leitfähigkeit der Zellen zwischen den Elek troden, bis sich die Ionenkanäle wieder geschlossen haben, um ein Meßer gebnis E2 zu erhalten,
g) Vergleichen der Meßergebnisse E1 und E2 hinsichtlich des zeitlichen Verlaufs der Ionenkanalaktivität, wodurch der Einfluß der Wirksubstanz ermittelt wird.

4. Vorrichtung zur Bestimmung der Ionenkanalaktivität an ligandenakti vierbaren Ionenkanälen von Zellen, wobei die Vorrichtung nachfolgende Merkmale aufweist:

- eine Meßkammer (1),
- eine flächige Trägerelektrode (2), auf der die zu untersuchenden Zellen (3) angeordnet sind,
- eine Trägergegenelektrode (4), die von der Trägerelektrode (2) beabstan det angeordnet ist,
- eine Flüssigkeitsfüllung (7) mit einer vorbestimmten Leitfähigkeit und mit vorbestimmten Eigenschaften bezüglich der Ionenkanalaktivität,
- eine Dosiervorrichtung (8) zum Einbringen einer zu untersuchenden Wirk substanz, wobei die Elektroden durch die Flüssigkeitsfüllung (7) benetzt sind, und
- eine Widerstands- oder Leitfähigkeitsmeßvorrichtung (9), die an die Trä gerelektrode (2) und an die Trägergegenelektrode (4) angeschlossen ist.

5. Vorrichtung zur Bestimmung der Ionenkanalaktivität an spannungsakti vierbaren Ionenkanälen von Zellen, wobei die Vorrichtung nachfolgende Merkmale aufweist:

- eine flüssigkeitsdichte Meßkammer (1),
- eine flächige Trägerelektrode (2), auf der die zu untersuchenden Zellen (3) angeordnet sind,
- eine Trägergegenelektrode (4), die von der Trägerelektrode (2) beabstan det angeordnet ist,
- eine Flüssigkeitsfüllung (7) mit einer vorbestimmten Leitfähigkeit und mit vorbestimmten Eigenschaften bezüglich der Ionenkanalaktivität und
- eine Dosiervorrichtung (8) zum Einbringen einer zu untersuchenden Wirk substanz, wobei die Elektroden durch die Flüssigkeitsfüllung (7) benetzt sind,
- eine Spannungsimpulserzeugungsvorrichtung zum Erzeugen einer zur Ak tivierung der Ionenkanäle erforderlichen Spannung und
- eine Widerstandsmeßvorrichtung (9), die an die Trägerelektrode (2) und an die Trägergegenelektrode (4) angeschlossen ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekenn zeichnet, daß eine Umschalteinheit vorgesehen ist, die beim Anlegen eines Spannungsimpulses an die Träger elektrode (2) und an die Trägergegenelektrode (4) die Widerstandsmeßvorrichtung (9) abschaltet.

7. Vorrichtung nach den Ansprüchen 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß
eine Zusatzelektrode (5) vorgesehen ist, die von der Trägerelektrode (2) beabstandet angeordnet ist, und
eine Zusatzgegenelektrode (6) vorgesehen ist, die von der Trägergegenelektrode (4) beabstandet angeordnet ist, wobei zwischen der Zusatzelek trode (5) und der Zusatzgegenelektrode (6) eine vorbestimmte Spannung anliegt.