DE10008373A1

DE10008373A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung der Ionenkanalaktivität

Info

Publication number: DE10008373A1
Application number: DE2000108373
Authority: DE
Inventors: Helmut Adelsberger
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-02-23
Filing date: 2000-02-23
Publication date: 2001-09-13
Anticipated expiration: 2020-02-24
Also published as: DE10008373C2

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Bestimmung der Aktivität von Ionenkanälen in Zellen, wobei die Ionenkanäle liganden- oder spannungsaktivierbar sind. Die Ionenkanalaktivität wird durch die Messung der Leitfähigkeit oder des Widerstandes bestimmt, wobei eine Reihe spezifischer Meßprobleme zu berücksichtigen sind.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung der Aktivität von Ionenkanälen in Zellen.

Ionenkanäle sind transmembranöse, ionenselektive Proteine, die auf nahe zu allen Arten von Zellen, wie z. B. Nervenzellen, Muskelzellen, endokrinen Zellen, Gliazellen, Epithel- und Endothelzellen, vorliegen. Diese Proteine dienen der Aufrechterhaltung der physiologischen Ionenkonzentrationen in den Zellen und der Weiterleitung von Signalen zwischen den Zellen, indem sie im geöffneten Zustand die Durchleitung von niedermolekularen Ionen ermöglichen und im geschlossenen Zustand deren Durchleitung verhindern.

Das Öffnen oder das Schließen der Ionenkanäle erfolgt durch vorbestimmte Reize, denen die betreffenden Zellen oder Moleküle, die die Ionenkanäle bilden, ausgesetzt sind. Danach können zwei Hauptgruppen der Ionenkanä le unterschieden werden:

A) Ligandenaktivierte Ionenkanäle sind Ionenkanäle, bei denen durch die Bindung einer vorzugsweise körpereigenen Wirksubstanz, eines sogenann ten Liganden, an den Ionenkanal, das Öffnen des Ionenkanals ausgelöst wird. Dazu gehören auch die second-messenger-gesteuerten Ionenkanäle. Hierbei bindet ein Ligand an einen transmembranösen Rezeptor an, wobei als Folge dieser Anbindung eine intrazelluläre Enzymkaskade aktiviert wird, die zu einer enzymatischen Modifikation des Ionenkanals führt, wodurch sich der Ionenkanal öffnet.
B) Spannungsgesteuerte Ionenkanäle werden durch einen Spannungsreiz zum Öffnen veranlaßt. Derartige Ionenkanäle sind u. a. an Nervenzellen zu finden.

Häufig sind Ionenkanäle Angriffspunkte für Pharmaka, Toxine, Insektizide oder Anthelminthika. Bei der Erforschung der Wirkung von z. B. pharma zeutischen Wirksubstanzen ist es notwendig, den Einfluß dieser Wirksub stanzen auf Ionenkanäle zu untersuchen. Derartige Untersuchungen sind sehr aufwendig, da meist eine große Anzahl von Wirksubstanzen oder de ren Derivate zu untersuchen ist.

Zusammenfassend ist festzustellen, daß sowohl bei den ligandengesteuer ten als auch bei den spannungsgesteuerten Ionenkanälen die Änderungen des Öffnungs- und Schließverhaltens bei der Zugabe einer Wirksubstanz, z. B. eines Pharmazeutikums, ermittelt werden sollen.

Um die Ionenkanalaktivitäten zu messen, sind ganz spezielle, darauf abge stimmte Vorrichtungen und Verfahren entwickelt worden.

Bei der sogenannten Path-Clamp-Methode, die u. a. in den Dokumenten DE 197 44 649, WO 9919729, WO 9613721 und in JP 4338240 beschrieben ist, werden sehr dünne Elektroden auf die zu untersuchenden Zellen auf gesetzt, und es wird der Widerstand gegenüber einer Umgebungslösung gemessen, wobei sich Widerstände im Megaohm- bis Gigaohmbereich ausbilden. Diese Technik ist kompliziert und insbesondere für eine Auto matisierung wenig geeignet.

Eine weitere Untersuchungsmethode der Ionenkanalaktivität ist die Fluo reszenzmethode, bei der die Zellen mit ionenselektiven, fluoreszierenden Farbstoffen beladen werden. Diese Farbstoffe ändern ihr Fluoreszenzver halten, wenn sich nach der Öffnung der Ionenkanäle die intrazelluläre Ionenkonzentration infolge des Ionenflusses durch die Ionenkanäle ändert. Mittels photometrischer Messungen des Fluoreszenzunterschieds ist die Ionenkanalaktivität bestimmbar. Beispiele für dieses Verfahren können aus der PCT/US 92/11090, WO 9858074, US 4748129, WO 9313423, WO 0002045 und aus der US 5932417 entnommen werden.

Obwohl die Fluoreszenzmethode bereits ausgereift und auch für automati sche Messungen geeignet ist, bestehen jedoch auch Nachteile. Durch die Zugabe von fluoreszierenden Substanzen kann die Aktivität der Ionenkanä le unvorhersehbar beeinflußt werden, wobei manche Farbstoffe auf die betreffenden Zeilen sogar eine toxische Wirkung haben können. Daher müssen für bestimmte Zellarten bzw. für jede Art von Ionenkanälen spe zielle Farbstoffe häufig erst entwickelt werden.

Es ist demzufolge die Aufgabe der Erfindung, die Bestimmung der Ionen kanalaktivität zu verbessern, wobei insbesondere außer den Wirkstoffen keine zusätzlichen Substanzen beigefügt werden sollen. Weiterhin soll die Bestimmung einfach und kostengünstig sowie prinzipiell für eine Automa tisierung geeignet sein.

Diese Aufgabe wird mittels der Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3 und mittels Vorrichtungen nach den Ansprüchen 4 und 5 gelöst.

Nach Anspruch 1 wird ein Verfahren zur Bestimmung der Ionenkanalaktivi tät an ligandenaktivierbaren Zellen bereitgestellt, wobei das Verfahren nachfolgende Schritte aufweist:

a) Anordnen einer ersten Menge von zu untersuchenden Zellen auf einer Trägerelektrode.
Dem Fachmann ist klar, daß die Zellen mit der Trägerelektrode in elektri schem Kontakt sein müssen. Weiterhin ist aus dem Stand der Technik bekannt, daß es verschiedene Möglichkeiten gibt, Zellen auf einer Träger oberfläche aufwachsen zu lassen. Der Fachmann kann daher auf Grund seines Fachwissens für einen speziellen Zelltyp ein geeignetes Material und ein geeignetes Verfahren zum Aufwachsen auswählen, wobei das Auf wachsen nur eine der Möglichkeiten zum Anordnen von Zellen auf einer Trägeroberfläche ist.
b) Anordnen einer Trägergegenelektrode in Gegenüberlage der Zellen. Die Zellen und die Elektroden sind in einer Meßkammer angeordnet, die mit einer leitfähigen Flüssigkeit auf ein Niveau gefüllt ist, bei dem die Zellen und die Elektroden von der Flüssigkeit benetzt sind.
c) Einleiten eines Liganden auf die Zellen, d. h., die Ionenkanäle dieser Zeilen werden einer Substanz ausgesetzt, die ihrer natürlichen Funktion entspricht.
d) Bestimmen des Öffnungsverhaltens der Ionenkanäle durch Messen des elektrischen Widerstandes oder der Leitfähigkeit der Zellen zwischen den Elektroden, bevor sich die Ionenkanäle wieder geschlossen haben, um ein Meßergebnis E1 zu erhalten. Die Art und Höhe der Spannung sind von der Meßanordnung abhängig. Vorzugsweise wird eine Wechselspannung ange legt, um Polarisierungseffekte an der Meßanordnung zu vermeiden.
e) Austauschen der ersten Menge der zu untersuchenden Zellen gegen ei ne zweite Menge der zu untersuchenden Zellen. Dieser Schritt ist erforder lich, da sich die meisten Ionenkanäle bei Anwesenheit des Liganden nicht erneut aktivieren lassen, d. h. die meisten Ionenkanäle schließen sich nach einer vorbestimmten Zeit und bleiben geschlossen. In seltenen Fällen blei ben die Ionenkanäle geöffnet.
f) Einleiten des Liganden und einer Wirksubstanz auf die Zellen der zweiten Menge, d. h., es wird Arbeitsschritt c wiederholt, jedoch wird zusätzlich eine Wirksubstanz beigegeben.
g) Bestimmen des Öffnungsverhaltens der Ionenkanäle durch Messen des elektrischen Widerstandes oder der Leitfähigkeit der Zellen zwischen den Elektroden, bevor sich die Ionenkanäle wieder geschlossen haben, um ein Meßergebnis E2 zu erhalten, d. h., es wird der Arbeitsschritt d wiederholt, wobei das Meßergebnis E2 durch die Wirksubstanz beeinflußt ist.
h) Vergleichen des Meßergebnisses E1 mit dem Meßergebnis E2, wobei der Einfluß der Wirksubstanz auf die Ionenkanalaktivität ermittelt wird. Dieser Vergleich wird in den Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Nach Anspruch 2 wird ein zu Anspruch 1 alternatives Verfahren bereitge stellt, wobei die Zellen für beide Messungen verwendet werden. Dazu ist es erforderlich, die Flüssigkeit in der Meßzelle nach dem Schritt d auszu tauschen und durch eine Flüssigkeit, die keinen Ligand enthält, zu erset zen, d. h., die Meßzelle wird gespült. Die weiteren Schritte f, g und h ver laufen dann entsprechend nach Anspruch 1.

Nach Anspruch 3 wird ein Verfahren zur Bestimmung der Ionenkanalaktivi tät an spannungsaktivierbaren Zellen bzw. Ionenkanälen bereitgestellt. Obwohl dieses Verfahren einige gemeinsame Merkmale mit dem Verfahren nach Anspruch 1 aufweist, handelt es sich um eine eigenständige Erfin dung, da die zu untersuchenden Zellen völlig andere Eigenschaften aufwei sen. Spannungsaktivierbare Ionenkanäle öffnen sich beim Anlegen eines Spannungsimpulses. Das Verfahren weist die Schritte a und b des Verfah rens nach Anspruch 1 auf. In einem Verfahrensschritt c werden die Ionen kanäle durch einen Spannungsimpuls aktiviert, d. h. geöffnet. Nach einer vorbestimmten Zeitdauer schließen sich die Ionenkanäle wieder.

In einem Verfahrensschritt d wird der elektrische Widerstand oder die Leit fähigkeit des geöffneten Ionenkanals bestimmt. Nachdem sich der Ionen kanal wieder geschlossen hat, wird in dem Verfahrensschritt e die Wirksubstanz auf die Zellen geleitet, und es wird erneut ein Spannungsim puls angelegt. Die Ionenkanäle öffnen sich wieder, jedoch unterscheiden sich das Öffnungsverhalten, wie z. B. die Öffnungsdauer und die Öff nungsgeschwindigkeit, sowie der Widerstand oder die Leitfähigkeit in die ser Phase von der Phase ohne Wirksubstanzzugabe.

In einem Verfahrensschritt f erfolgt das Bestimmen des Öffnungsverhaltens der Ionenkanäle durch Messen des elektrischen Widerstandes oder der Leitfähigkeit der Ionenkanäle.

Nach Anspruch 4 wird eine Vorrichtung zur Bestimmung der Ionenkanal aktivität an ligandenaktivierbaren Ionenkanälen mit nachfolgenden Merkma len bereitgestellt: In einer Meßkammer ist eine flächige Trägerelektrode vorgesehen, auf der die zu untersuchenden Zellen angeordnet sind. Von der Trägerelektrode ist eine Trägergegenelektrode beabstandet angeordnet. Die Meßkammer ist mit einer Flüssigkeit gefüllt, die eine vorbestimmte Leitfähigkeit und vorbestimmte Eigenschaften bezüglich der Ionenkanalak tivität aufweist. Weiterhin ist eine Dosiervorrichtung zum Einbringen von Liganden und zu untersuchenden Wirksubstanzen vorgesehen. An die Elek troden ist eine Leitfähigkeitsmeßvorrichtung angeschlossen.

Nach Anspruch 5 wird eine Vorrichtung zur Bestimmung der Ionenkanal aktivität an spannungsaktivierbaren Ionenkanälen bereitgestellt, deren Auf bau dem nach Anspruch 4 entspricht. Zusätzlich ist eine Spannungsimpul serzeugungsvorrichtung vorgesehen, die einen vorbestimmten Span nungsimpuls zur Aktivierung der Ionenkanäle bereitstellt.

Nach Anspruch 6 ist eine Umschalteinheit vorgesehen, die beim Anlegen des Spannungsimpulses an die Trägerelektrode und an die Trägergegene lektrode die Leitfähigkeitsmeßvorrichtung abschaltet, wodurch die Meßge nauigkeit erhöht wird. Dadurch wird verhindert, daß die Leitfähigkeitsmeß vorrichtung durch den Spannungsimpuls weit außerhalb ihres Meßberei ches angesteuert wird.

Nach Anspruch 7 sind eine Zusatzelektrode, die von der Trägerelektrode beabstandet angeordnet ist, und eine Zusatzgegenelektrode vorgesehen, die von der Trägergegenelektrode beabstandet angeordnet ist, wobei zwi schen der Zusatzelektrode und der Zusatzgegenelektrode eine vorbestimm te Spannung anliegt.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit schematischen Zeichnungen näher erläutert.

Fig. 1 zeigt eine Schnittdarstellung der Erfindung in einer prinzi piellen Ausführungsform.

Fig. 2 zeigt ein Meßdiagramm eines ligandenaktivierbaren Ionenkanals.

Fig. 3 zeigt ein Meßdiagramm eines spannungsaktivierbaren Ionenkanals.

Fig. 4, 5 zeigen das Prinzip einer Automatisierungslösung.

Die Fig. 1 zeigt eine Meßkammer 1 mit einer flüssigkeitsdichten Kammer wandung. In der Meßkammer 1 ist eine flache Trägerelektrode 2 angeord net. Auf dieser Trägerelektrode 2 ist eine Membran mit den zu untersu chenden Zellen 3 aufgebracht. Dem Fachmann ist geläufig, unter welchen Bedingungen Zellen auf einer Unterlage auszusähen und im Brutschrank zu behandeln sind, damit sich die Zellen vermehren und den sogenannten Zellrasen ausbilden, so daß möglichst die gesamte Oberfläche der Membran bedeckt ist. Über der Trägerelektrode 2 ist in einem Abstand von 3- 5 mm eine ring- oder gitterförmige Trägergegenelektrode 4 angeordnet, wobei diese beiden Elektroden 2, 4 an eine Spannungsmeßvorrichtung an geschlossen sind. Unterhalb der Trägerelektrode 2 ist eine Zusatzelektrode 5 angeordnet, und oberhalb der Trägergegenelektrode 4 ist eine zugehöri ge Zusatzgegenelektrode 6 angeordnet, wobei die beiden Elektroden 5, 6 an eine Wechselspannungsquelle angeschlossen sind. Im vorliegenden Ausführungsbeispiel wird eine Wechselspannung von 10 mV und einer Frequenz von 10 kHz verwendet.

Die Meßkammer ist mit einer physiologischen Salzlösung 7 bis zu einem Niveau gefüllt, bei dem alle Elektroden von der Salzlösung benetzt werden. Die Salzlösung 7 soll die natürliche Umgebung der lebenden Zellen in ihrem Organismus ersetzen. Daher wird die Zusammensetzung der Salzlösung durch die Art der zu untersuchenden Zellen bestimmt, ob z. B. Zellen eines Säugetiers oder eines Insekts vorliegen.

Durch eine Bohrung im oberen Bereich der Meßkammer 1 ist eine Glaska pillare 8 eingeführt, durch die die Liganden und die zu untersuchenden Wirksubstanzen eingetragen werden. Bei der vorliegenden Ausführungs form wird zum Eintragen der Wirksubstanzen Druckluft benutzt. Da das Verfahren und die Technik zum Dosieren von Substanzen dem Fachmann hinreichend bekannt sind, wird darauf nicht näher eingegangen.

Nachfolgend sollen anhand von Fig. 2a, b, c die Funktion und die Wirkung einer Wirksubstanz bei ligandenaktivierten Ionenkanälen erläutert werden.

Die Fig. 2a zeigt ein Meßdiagramm eines ligandenaktivierbaren Ionenka nals, bei dem der zeitliche Verlauf der Kanalaktivität dargestellt ist.

Im Zeitabschnitt a ist der Ionenkanal geschlossen und weist eine Grundleit fähigkeit auf. Durch die Zugabe eines Liganden L zu einem Zeitpunkt b wird der Ionenkanal aktiviert, so daß nach einer kurzen Totzeit die Leitfä higkeit, d. h. das Durchlaßvermögen für Ionen, ansteigt. Nach einigen Se kunden (Bereich c) schließt sich der Ionenkanal von selbst, so daß der mit dem Bezugszeichen P gekennzeichnete Peak entsteht. Zu einem Zeitpunkt d ist die Leitfähigkeit näherungsweise auf ihren ursprünglichen Wert zu rückgegangen. Wie bereits erwähnt, gehört es zu den spezifischen Eigen schaften der meisten Ionenkanäle, daß durch eine erneute Zugabe eines Liganden keine erneute Öffnung der Kanäle bewirkt werden kann. Dieser Umstand erklärt sich daraus, daß der zum Zeitpunkt b eingetragene Ligand L noch an den Ionenkanälen anliegt und eine erneute Aktivierung des Ka nals verhindert.

In Fig. 2b wird eine erste Auswirkung einer Wirksubstanz auf die Ionenka nalaktivität eines Ionenkanals nach Fig. 2a gezeigt. Zum Zeitpunkt b wird der Ionenkanal mit einer Mischung aus dem Liganden L und einer ersten Wirksubstanz WS_1a beaufschlagt. Die Wirksubstanz WS_1a erhöht die Io nenkanalaktivität. Der Peak P_1a zeigt, daß eine Wirksubstanz WS_1a vorran gig die Leitfähigkeit erhöht, die Zeitdauer der Öffnung des Ionenkanals je doch nur unwesentlich beeinflußt. Der Peak P_1b zeigt, daß eine Wirksub stanz WS_1b vorrangig die Zeitdauer der Öffnung des Ionenkanals verlän gert, die Leitfähigkeit jedoch nur unwesentlich beeinflußt.

In Fig. 2c wird eine zweite Auswirkung einer Wirksubstanz auf die Ionen kanalaktivität eines Ionenkanals nach Fig. 2a gezeigt. Zum Zeitpunkt b wird der Ionenkanal mit einer Mischung aus dem Liganden L und einer zweiten Wirksubstanz WS_2a beaufschlagt. Die Wirksubstanz WS_2a blockiert die Ionenkanalaktivität. Der Peak P_2a zeigt, daß eine Wirksubstanz WS_2a vorrangig die Leitfähigkeit verringert, die Zeitdauer der Öffnung des Ionen kanals jedoch nur unwesentlich beeinflußt. Der Peak P_2b zeigt, daß eine Wirksubstanz WS_2b vorrangig die Zeitdauer der Öffnung des Ionenkanals verkürzt, die Leitfähigkeit jedoch nur unwesentlich beeinflußt.

Nachfolgend sollen anhand von Fig. 3a, b, c die Funktion und die Wirkung einer Wirksubstanz bei spannungsaktivierten Ionenkanälen erläutert wer den.

Die Fig. 3a zeigt ein Meßdiagramm eines spannungsaktivierbaren Ionenka nals, bei dem der zeitliche Verlauf der Ionenkanalaktivität dargestellt ist. Im Zeitabschnitt a ist der Ionenkanal geschlossen und weist eine Grundleit fähigkeit auf. Durch Aufbringen eines Spannungsimpulses U_Imp in einem Zeitpunkt b wird der Ionenkanal aktiviert, so daß nach einer kurzen Totzeit die Leitfähigkeit für Ionen ansteigt. Nach einigen Sekunden schließt sich der Ionenkanal von selbst, so daß der mit dem Bezugszeichen P gekenn zeichnete Peak entsteht. Im Punkt d ist die Leitfähigkeit näherungsweise auf ihren ursprünglichen Wert (Grundleitfähigkeit) zurückgegangen. Durch ein erneutes Aufbringen des Spannungsimpulses U_Imp zu einem Zeitpunkt e ist der Ionenkanal erneut aktivierbar.

In Fig. 3b wird die Auswirkung einer ersten Wirksubstanz auf die Ionenka nalaktivität eines Ionenkanals nach Fig. 3a gezeigt. Zum Zeitpunkt e wird der Ionenkanal mit einer ersten Wirksubstanz WS_1a beaufschlagt, die die Ionenkanalaktivität erhöht. Der Peak P_1a zeigt, daß eine Wirksubstanz WS_1a vorrangig die Zeitdauer der Öffnung des Ionenkanals verlängert, die Leit fähigkeit jedoch nur unwesentlich beeinflußt. Der Peak P_1b zeigt, daß eine Wirksubstanz WS_1b vorrangig die Leitfähigkeit erhöht, die Zeitdauer der Öffnung des Ionenkanals jedoch nur unwesentlich beeinflußt.

In Fig. 3c wird die Auswirkung einer zweiten Wirksubstanz WS₂ auf die Ionenkanalaktivität eines Ionenkanals nach Fig. 3a gezeigt. Zum Zeitpunkt e wird der Ionenkanal mit der zweiten Wirksubstanz WS_2a beaufschlagt, die die Ionenkanalaktivität blockiert. Der Peak P_2a zeigt, daß eine Wirksub stanz WS_2a vorrangig die Leitfähigkeit des Ionenkanals verringert, die Zeit dauer der Öffnung des Ionenkanals jedoch nur unwesentlich beeinflußt. Der Peak P_2b zeigt, daß eine Wirksubstanz WS_2b vorrangig die Zeitdauer der Öffnung des Ionenkanals verkürzt, die Leitfähigkeit jedoch nur unwe sentlich beeinflußt.

Die Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung einer Automatisierungslö sung für die Erfindung. Meßkammern 1a-n sind auf einer Platte zusam mengefaßt. Derartige Platten sind als sogenannte Mikrotiterplatten im La boreinsatz weit verbreitet. Die Mikrotiterplatten finden vor allem Einsatz in der automatisierten Laboranalysentechnik. Es ist ebenfalls bekannt, derar tige Mikrotiterplatten mit elektrischen Anschlüssen zu versehen, so daß ein modularer Aufbau aus einer Vielzahl von Meßzellen nach Fig. 1 erzeugt werden kann.

Die Fig. 5 zeigt einen schematischen Aufbau einer Meßzelle nach Fig. 1. Es ist zu erkennen, daß ein Meßkopf mit den Elektroden und der Eintrag vorrichtung in der nach oben offenen Meßzelle in Richtung des Doppelpfei les ein- und ausfahrbar ist.

Somit ist für den Fachmann erkennbar, daß die vorliegende Erfindung, im Gegensatz zu der Patch-Clamp-Technik, gut automatisierbar ist, wobei be kannte Technologien und Vorrichtungen Anwendung finden können.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Ionenkanalaktivität von ligandenaktivier baren Ionenkanälen, wobei das Verfahren nachfolgende Schritte aufweist:

a) Anordnen einer ersten Menge von zu untersuchenden Zellen (3) auf ei ner Trägerelektrode (2),
b) Anordnen einer Trägergegenelektrode (4) in Gegenüberlage der Zellen (3), wobei die Zellen (3) und die Elektroden in einer Meßkammer (1) ange ordnet sind, die mit einer leitfähigen Flüssigkeit gefüllt ist, so daß die Zel len (3) und die Elektroden von der Flüssigkeit benetzt sind,
c) Einleiten eines Liganden auf die Zellen (3),
d) Bestimmen des Öffnungsverhaltens der Ionenkanäle durch Messen des elektrischen Widerstandes oder der Leitfähigkeit der Zellen zwischen den Elektroden, bevor sich die Ionenkanäle wieder geschlossen haben, um ein Meßergebnis E1 zu erhalten,
e) Austauschen der ersten Menge der zu untersuchenden Zellen (3) gegen eine zweite Menge der zu untersuchenden Zellen (3),
f) Einleiten des Liganden und einer Wirksubstanz auf die Zellen der zweiten Menge,
g) Bestimmen des Öffnungsverhaltens der Ionenkanäle durch Messen des elektrischen Widerstandes oder der Leitfähigkeit der Zellen zwischen den Elektroden, bevor sich die Ionenkanäle wieder geschlossen haben, um ein Meßergebnis E2 zu erhalten,
h) Vergleichen der Meßergebnisse E1 und E2, wobei der Einfluß der Wirksubstanz auf die Ionenkanalaktivität ermittelt wird.

2. Verfahren zur Bestimmung der Ionenkanalaktivität von ligandenaktivier baren Ionenkanälen, wobei das Verfahren nachfolgende Schritte aufweist:

a) Anordnen einer Menge von zu untersuchenden Zellen (3) auf einer Trä gerelektrode (2),
b) Anordnen einer Trägergegenelektrode (4) in Gegenüberlage der Zellen (3), wobei die Zellen (3) und die Elektroden in einer Meßkammer (1) ange ordnet sind, die mit einer leitfähigen Flüssigkeit gefüllt ist, so daß die Zel len (3) und die Elektroden von der Flüssigkeit benetzt sind,
c) Einleiten eines Liganden auf die Zellen (3),
d) Bestimmen des Öffnungsverhaltens der Ionenkanäle durch Messen des elektrischen Widerstandes oder der Leitfähigkeit der Zellen zwischen den Elektroden, bevor sich die Ionenkanäle wieder geschlossen haben, um ein Meßergebnis E1 zu erhalten,
e) Austauschen der Flüssigkeit der Meßzelle durch ligandenfreie, leitfähige Flüssigkeit,
f) Einleiten des Liganden und einer Wirksubstanz auf die Zellen (3),
g) Bestimmen des Öffnungsverhaltens der Ionenkanäle durch Messen des elektrischen Widerstandes oder der Leitfähigkeit der Zellen zwischen den Elektroden, bevor sich die Ionenkanäle wieder geschlossen haben, um ein Meßergebnis E2 zu erhalten,
h) Vergleichen der Meßergebnisse E1 und E2, wobei der Einfluß der Wirksubstanz auf die Ionenkanalaktivität ermittelt wird.

3. Verfahren zur Bestimmung der Ionenkanalaktivität an spannungsakti vierbaren Ionenkanälen, wobei das Verfahren nachfolgende Schritte auf weist:

a) Anordnen der zu untersuchenden Zellen (3) auf einer Trägerelektrode
b) Anordnen einer Trägergegenelektrode (4) in Gegenüberlage der Zellen (3), wobei die Zellen (3) und die Elektroden in einer Meßkammer (1) ange ordnet sind, die mit einer leitfähigen Flüssigkeit gefüllt ist, so daß die Zel len (3) und die Elektroden von der Flüssigkeit benetzt sind,
c) Anlegen eines vorbestimmten Spannungsimpulses an die Elektroden, so daß ein Öffnen der Ionenkanäle bewirkt wird,
d) Bestimmen des Öffnungsverhaltens der Ionenkanäle durch Messen des elektrischen Widerstandes oder der Leitfähigkeit der Zellen zwischen den Elektroden, bevor sich die Ionenkanäle wieder geschlossen haben, um ein Meßergebnis E1 zu erhalten,
e) Einleiten einer Wirksubstanz auf die Zellen, nachdem sich die Ionenkanä le geschlossen haben,
f) Bestimmen des Öffnungsverhaltens der Ionenkanäle durch Aufbringen eines erneuten Spannungsimpulses und durch Messen des elektrischen Widerstandes oder der Leitfähigkeit der Zellen zwischen den Elektroden, bevor sich die Ionenkanäle wieder geschlossen haben, um ein Meßergebnis E2 zu erhalten,
g) Vergleichen der Meßergebnisse E1 und E2, wobei der Einfluß der Wirksubstanz auf die Ionenkanalaktivität ermittelt wird.

4. Vorrichtung zur Bestimmung der Ionenkanalaktivität an ligandenaktivier baren Zellen, wobei die Vorrichtung nachfolgende Merkmale aufweist:

- eine Meßkammer (1),
- eine flächige Trägerelektrode (2), auf der die zu untersuchenden Zellen (3) angeordnet sind,
- eine Trägergegenelektrode (4), die von der Trägerelektrode (2) beabstan det angeordnet ist,
- eine Flüssigkeitsfüllung (7) mit einer vorbestimmten Leitfähigkeit und mit vorbestimmten Eigenschaften bezüglich der Ionenkanalaktivität,
- eine Dosiervorrichtung (8) zum Einbringen einer zu untersuchenden Wirksubstanz, wobei die Elektroden durch die Flüssigkeitsfüllung (7) be netzt sind, und
- eine Widerstands- oder Leitfähigkeitsmeßvorrichtung (9), die an die Trä gerelektrode (2) und an die Trägergegenelektrode (4) angeschlossen ist.

5. Vorrichtung zur Bestimmung der Ionenkanalaktivität an spannungsakti vierbaren Zellen, wobei die Vorrichtung nachfolgende Merkmale aufweist:

- eine flüssigkeitsdichte Meßkammer (1),
- eine flächige Trägerelektrode (2), auf der die zu untersuchenden Zellen (3) angeordnet sind,
- eine Trägergegenelektrode (4), die von der Trägerelektrode (2) beabstan det angeordnet ist,
- eine Flüssigkeitsfüllung (7) mit einer vorbestimmten Leitfähigkeit und mit vorbestimmten Eigenschaften bezüglich der Ionenkanalaktivität und
- eine Dosiervorrichtung (8) zum Einbringen einer zu untersuchenden Wirksubstanz, wobei die Elektroden durch die Flüssigkeitsfüllung (7) be netzt sind,
- eine Spannungsimpulserzeugungsvorrichtung zum Erzeugen einer zur Aktivierung der Ionenkanäle erforderlichen Spannung und
- eine Widerstandsmeßvorrichtung (9), die an die Trägerelektrode (2) und an die Trägergegenelektrode (4) angeschlossen ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß eine Um schalteinheit vorgesehen ist, die beim Anlegen eines Spannungsimpulses an die Trägerelektrode (2) und an die Trägergegenelektrode (4) die Wider standsmeßvorrichtung (9) abschaltet.

7. Vorrichtung nach den Ansprüchen 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß

- eine Zusatzelektrode (5) vorgesehen ist, die von der Trägerelektrode (2) beabstandet angeordnet ist, und

- eine Zusatzgegenelektrode (6) vorgesehen ist, die von der Trägergegen elektrode (4) beabstandet angeordnet ist, wobei zwischen der Zusatzelek trode (5) und der Zusatzgegenelektrode (6) eine vorbestimmte Spannung anliegt.