DE4020013C2

DE4020013C2 - Transportkammer

Info

Publication number: DE4020013C2
Application number: DE19904020013
Authority: DE
Inventors: Hans-Joachim Schwarz
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-06-21
Filing date: 1990-06-21
Publication date: 2000-03-16
Anticipated expiration: 2010-06-22
Also published as: DE9007573U1; DE4020013A1

Description

Die Vorrichtung betrifft eine vertikale Transportkammer, die mit zwei Halbkam mern eine geeignete Präparateabdichtung und die Messung des Kurz schlußstromes, der transepithelialen Potentialdifferenz und der tran sepithelialen Widerstände an Ladungen transportierenden sehr klein flächigen Epithelien und Cuticulae mit Kreis-Meßflächen kleiner oder gleich 1 mm ∅ bis 0,5 mm ∅ ermöglicht, und die verwendbar für pharmakologisch, ökoto xikologische und transportphysiologische Untersuchungen ist.

Angaben zur Gattung

Die Vorrichtung dieser Transportkammer ermöglicht es, sehr kleine Epithelflächen (stammend aus Mikropräparationen) von Organismen bzw. deren Organen transportphysiologisch, pharmakologisch und ökotoxikologisch zu untersuchen. Dabei dient ein "relatives Maximum" des Präparatewiderstandes mit justierbaren Halbkammern der geeigne ten Ableitung der Meßgrößen. Die vertikale Anordung der Halbkam mern sichert eine ideale Perfusion, O₂-Versorgung und geeignetes Stoffangebot bei konstantem Fließverhältnis (Mariott'sche System) und isobarem Druck am Präparat im Vergleich zu horizontalen asym metrischen Transportkammern. Zudem liegt eine Mikroversion einer Transportkammer vor. Diese Transportkammer ist geeignet für die Handhabung unter dem Stereomikroskop bzw. Binokular. Dies sind notwendige Voraussetzungen und Bedingungen für die Untersuchung o. g. aktiv und passiv transportierender Epithelien und Deckschichten mit kleiner Fläche.

Stand der Technik

Diese Transportkammern sind seit Ussing, Zerahn (1951) bekannt. Bisher ist nur eine Transportkammer mit einer kleinen Kreis-Meßflä che von 2 mm ∅ für die Untersuchung des passiven Transportes an Cuticulae von Crustaceen bekannt (Avenet, Lignon 1985).

Literatur

Ussing, H. H.; Zerahn, K. (1951):
Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin.
Acta physiol. Scand. 23, 17-49

Avenet, P.; Lignon, J. M. (1985):
Ionic permeabilities of the gill lamina cuticle of the crayfish, Astacus leptodactylus (E.).
J. Physiol. 363, 377-401

Kritik

Kleine Kreis-Meßflächen wurden bisher ignoriert, weil man allgemein annahm, daß die Widerstände der Transportkammer stark ansteigen und die Epithelien wegen eines hohen "edge damage" nicht zu untersu chen sind. Dem ist nicht so, wie bereits die o. g. Transportkammer mit 2 mm ∅ zeigt. Es gibt z. Zt. keine wissenschaftlich akzeptable Be gründung, warum unterhalb von 2 mm Lochdurchmesser nicht gemes sen werden sollte. Selbst die Fachwissenschaft traute sich bisher nicht diesen Grenzbereich zu unterschreiten. Es ist dagegen aus Patch-Clamp-Versuchen der biologischen Elektrophysiologie bekannt, daß die Mikroöffnungen der Elektroden deutlich höhere Widerstände zeigen. Diese bleiben aber insofern unberücksichtigt, weil die Präpa ratewiderstände mit den Elektrodenwiderständen immer additive Wer te bilden und nur abgezogen werden brauchen. Die Widerstände dieser Transportkammern liegen unter Verwendung physiologischer Salzlö sungen ohne eingesetztes Präparat bei um 5-12 Ω.cm².

Aufgabe

Der Erfindung kommt die Aufgabe zu, ein noch zukünftig zu erschlies sendes Gebiet unbekannter Epithelien kleiner Organismen bzw. Organe hinsichtlich ihrer Transporteigenschaften (Transportsysteme der Membranen für Substrate und Ionen) zu untersuchen. Das sind An wendungsgebiete der Ökotoxikologie, Pharmakologie und der Tran sportphysiologie in der Biologie und Medizin. Das Transportverhalten der Epithelien kann genutzt werden, um Schadstoffeinflüsse auf den Transport unter Normalbedingungen zu untersuchen. Dabei können nicht nur die Systemverhaltensweisen bekannter Epithelien überprüft und mit neuen Epithelien kleinerer Organismen verglichen werden. Es können auch schädliche Einflüsse erkannt und diese Untersuchungs ergebnisse präventiv eingesetzt werden.

Das gleiche gilt für die Anwendung von Pharmaka, Hemmstoffen, Hor monen und anderen Stoffen. Dosiswirkungskurven sind u. a. die Darstel lungsformen für die Interpretation der Stoff-Einflüsse auf die Ve ränderung der Meßgrößen. Reversibilität und Irreversibilität der Wer te der Meßgrößen sind Kennzeichnen für inhibierte aktive aber auch passive Prozesse. Irreversible Inhibitionen von Transportsystemen des Ionentransportes und der Atmungskette können den Zelltod (Epi theltod) nach sich ziehen. Klassische Beispiele sind nach Anwendungen von Cyaniden für die Atmungskette bekannt (oder Dinitrophenol).

Lösung der Aufgabe

1. Es werden geeignete Epithelien gewählt oder es werden mit der Transportkammer neue Epithelien gefunden. Dafür dienen die Meß größen als Indikatoren.
2. Die Erfüllung der Aufgabe ist mit Anwendung der Patentansprüche 1.-5. gegeben.

Vorteile: Es sind unterschiedlich dicke, sehr kleine Epithelflächen zu verwenden. Der Meßbereich von 0,5 mm ∅ Kreis-Meßfläche erschließt Epithelien einer viel größeren Artenvielfalt als bisher. Es können sehr kleine Organismen bzw. Organe untersucht werden. Die Transport kammer kann dazu dienen, Indikatororganismen zu finden, deren Epi thelien deutlich Schadstoffreaktionen oder Reaktion auf Anwendungen von Pharmaka zeigen, z. B. im Vergleich zu bekannten anderen Test verfahren. Die Präparationen sind unter dem Stereomikroskop auch auf den Halbkammern möglich, um die Mikropräparation besser zu gewährleisten. Ferner ist eine optimale O₂-Versorgung möglich. Schneller Stoffaustausch ist gegeben. Situationen wie in vivo sind zu simulieren. Es können Tiergruppen untersucht werden, die nicht wie z. B. bei den Fröschen erhöhten Tierschutzbestimmungen unterliegen.

Anleitung zur Handhabung der Transportkammer

- Beispiel-Präparate: Isolierte, halbierte Kiemenplättchen von Erio cheir sinensis (Wollhandkrabbe) oder Opercularepithel von Fischen, Darmepithelien kleiner Organismen, Froschhautepithel.

Zur Konstruktionszeichnung

Für die Untersuchung der Kiemenplättchen relativ kleiner Krabben er wies sich die Transportkammer nach Avenet, Lignon 1985 als nicht geeignet. Wegen der empfindlichen Präparate der Cuticulae und hal bierten Kiemenplättchen mit einer nur sehr kleinen Präparatefläche, wurde eine neue Transportkammer konstruiert.

Dazu wurde eine perfundierbare, mit vertikal angeordneten symmetri schen Halbkammern ausgestattete Transportkammer hergestellt. Besondere Charakteristika sind: Wech selbare Kreis-Meßflächen von 2-0,5 mm ∅ (→ a). Die Kammerhälf ten sind mit je 12 mm Breite (→ b) flach bemessen, so daß erstmals die Handhabung bzw. Einfügung des Präparates unter dem Stereomikro skop in horizontaler Lage möglich wurde. Während des Meßvorganges können die Seitverschraubungen (→ c) nachgezogen werden, um eine nahezu maximale Abdichtung zu ermöglichen, die bei kontinuierlicher Widerstandsmessung zu verfolgen ist. Führungsstutzen der Halbkam mern (→ d) können mit verschieden starken O-Ringen aus Gummi um legt werden, die beim kontinuierlichen Absenken der zweiten Halb kammer auf das Präparat als Abstandshalter bzw. Puffer dienen. Die Perfusionszugänge und -ausgänge (→ e) sind in ihrer Höhe so ange legt, daß eine schnelle zirkulär vollständige Durchspülung der Tran sportkammer (Volumen einer Halbkammer bei ≈ 1000 mm³ ≘ 1 ml) in sehr kurzer Zeit von ≈ 15 sec bei 6-10 ml/min Fließgeschwindigkeit gegeben ist. Der Zirkulationsstrom vermeidet das Auftreten unge rührter Schichten vor dem Präparat, was Tests mit niedermolekularen Farbstoffen (z. B. Bromphenolblau- bzw. Kaliumpermanganat-Lösung) belegen. Damit ergaben sich gleichzeitig erste Hinweise auf eine op tisch einwandfreie Abdichtung der Präparate, wenn nur eine Halbkam mer mit einem Farbstoff perfundiert wurde. Das Strömungsverhalten in der Kammer begünstigt gleichzeitig einen geeigneten Abtransport von Luftblasen vor dem Präparat. Die Innenseite jeder Halbkammer weist zentral deckungsgleich eine Kreisöffnung auf, die "Kreis"-Meß fläche, die vom Präparat überdeckt wird und nach einer geraden Boh rung von 0,5 mm Strecke konisch in den Kammerraum übergeht und dann wieder in einer geraden Bohrung mit einem Durchmesser von 10 mm endet.

Im oberen Teil der Halbkammern liegen konische Bohrungen (→ f) vor, die zum Kammerinnenraum einen Durchmesser von ≧ 2 mm aufweisen und als Einsatz von KCl-Agar-Meßbrücken (→ g) als Ableitelektroden (3% Agar/KCl 3 mol/l) dienen. Diese Meßbrücken stehen über Kalo melelektroden (KCl 3 mol/l) mit dem Spannungsmeßteil in Verbindung. Die Schraubverschlüsse mit Dichtring (→ h) sind zentral mit einer ≈ 1,2 mm ∅ Bohrung (→ i) versehen, in die mit einer Quetschverschrau bung die Ag/AgCl-Stromelektroden (→ k) (Silberdrähte von ≈ 1 mm ∅ (Fa. Götze Berlin) auf 1 cm Länge chloriert, bis die Sättigung ein trat) eingefaßt sind. Die Elektroden stehen mit dem Stromgeber der Meßeinrichtung in Verbindung.

Montage der Präparate Abdichtung der Präparate

Für die Abdichtung der Präparate (Kiemenplättchen, isoliertes hal biertes Kiemenplättchen und Cuticulae) wurden Dichtringe von 1,2 mm ∅ (innen) hergestellt. Dazu wurden mit Paraplast gefüllte und im Pa raplast eingebettete Siliconschläuche am Minot-Mikrotom (Typ 1212, Fa. Leitz) in unterschiedlicher Schnittstärke von ≈ 1-20 µm mit rela tiv ebenen Schnittflächen hergestellt. Auf der gegenüberliegenden Kammer wurde um die Kreis-Meßfläche eine sehr feine Silicon-Gum mierung aufgezogen, die nach Aufpressung eines Silicon-Ringes und Aushärtung als zentrische Schablone des Silicon-Gummiringes der anderen Halbkammer dient.

Montage, Justierung und Kontrolle der Widerstände

Der Einbau der Präparate in die Transportkammer erfolgt unter dem Stereomikroskop. Das in den Salinetropfen überführte Präparat wird unter Ausnutzung der Oberflächenspannung des Wassers über die Meßfläche gezogen und durch Wasserentzug mit Filterpapier abge senkt. Dabei liegt die apicale Seite (auch mukosal oder luminal) mit der Cuticula nach unten und die basolaterale Seite (auch serosal) mit dem Epithel und der Basallamina nach oben. Sowohl die Cuticula (auf grund der Interferenzfarben im diffusen Licht), als auch das Kiemen epithel (aufgrund der Epithelreste am Präparaterand) sind deutlich zu unterscheiden. Nach Absenken der zweiten Kammerhälfte (mit dem Silicon-Dichtring) in den Führungsstutzen bis dicht vor das Präparat, wird das Anziehen der Schraubverbindungen unter Beobachtung des Präparates im Stereomikroskop durchgeführt.

Die Transportkammer wird dann mit dem Perfusionssystem (Verbin dung der Perfusionsschläuche mit den Zuläufen der Transportkam mer) und der Meßapparatur (KCl-Agar-Meßbrücken, Ag/AgCl-Elek troden) verbunden. Die Endjustierung der Abdichtung erfolgt während des Meßvorganges unter Beobachtung der Veränderung des Wider standes nach kontinuierlichem Nachstellen der Schraubverbindungen, bis im Meßsystem die Widerstandsveränderung nur noch beliebig klein ist und der Präparatewiderstand ein relatives Maximum erreicht, also eine optimale Abdichtung vorliegt. Dabei dienen auch Spannung und Strom als Indikatoren für die Unversehrtheit eines Epithels. Tests, bei denen über dieses rel. Maximum des Präparates hinaus die Schraubverbindung weiterhin nachzustellen versucht wird, zeigen, daß der Präparatewiderstand aufgrund des in diesem Verfahren synthe tisch erzeugten "edge-damage" auf den Widerstandswert der Tran sportkammer (Kammer-Leerwert) zusammenbricht.

Perfusionssystem der Anlage

Die Transportkammer wird über die Zuläufe an das Perfusionssystem (Perfusionssysteme und -verbindungen der Fa. Braun) angeschlossen. Die Dreiwegehähne werden gleichzeitig für beide Halbkammern ge öffnet, um die Kammer bei gleichem hydrostatischen Druck zu füllen und Präparatebelastungen zu vermeiden. Die Vorratsbehälter beste hen aus selbstgebauten Mariott'schen Flaschen (Cooper 1981), Kunst stofflaschen (Fa. Werkstätten, Berlin), die mit einem Lufteinlaßstut zen versehen wurden und somit einen relativ konstanten hydrostati schen Druck - auch bei ungleich gefüllten Vorratsbehältern - gewähr leisten, um den Faktor Druck als bekannten Fremdeinfluß dieses sy metrischen Systems zu beseitigen. Darüber hinaus kann durch Sicher heitsschleifen im Perfusionsschlauch ein Leerlaufen der Transport kammer vermieden werden.

Leistungsfähigkeit Anwendungen, Vorzüge, Möglichkeiten der Transportkammer

Die Vorrichtung einer vertikalen Transportkammer, verwendbar für pharmako logische, ökotoxikologische und transportphysiologische Untersuchungen mit elektophysiologischen Meßapparaturen ist dadurch besonders geeignet, daß die Vorrichtung der "vertikalen Transportkammer" am bzw. vor dem Präparat (apical und basolateral sowie luminal und serosal) entlang und nicht gegen das Präparat - somit schonend - perfundierbar ist und mit den zwei justierbaren Halbkammern eine geeignete Präparateabdichtung und die Messung des Kurz schlußstromes, der transepithelialen Potentialdifferenz, der transepithelialen und transcuticulären Widerstände an Ladungen/Stoffen transportierenden, sehr kleinflächigen Epithelien sowie Geweben beliebiger Art und Cuticulae (Deck schichten) mit Kreis-Meßflächen kleiner 1 mm ∅ bis ≦ 0,5 mm ∅ ermöglicht.

a) Die Vorzüge liegen u. a. in der Bauart einer vertikalen Transportkammer - bestehend aus zwei flachen, justierbaren und vertikal perfundierbaren Halbkammern - die besonders geeignet sind:
- 1. für Präparationen und Justierungen unter dem Stereomikroskop oder Binokular, beim Einfügen und zur späteren Kontrolle/Untersuchung der Veränderung das Präparates nach der Perfusionsanwendung.
- 2. für die Handhabung von Mikropräparaten in physiologischem oder anderem Medium, auf Tropfen direkt auf den flachen Innenseiten der Halbkammern, unter mikroskopischer Beobachtung.
- 3. bei isobarem Druck auf die Systeme der beiden Halbkammern mit symme trischer Anordnung und gleichen Halbkammer-Volumina, bei Vermeidung von Gasansammlungen (Blasen vor dem Epithel/Gewebe) die Epithelien bei konstanten Faktoren zu untersuchen.
- 4. symmetrisch-konzentriert mit Lösungen bei gleichem Fließdruck oder asymmetrisch-konzentriert beidseitig des Epithels zu perfundieren und das Epithel entsprechend modifiziert zu versorgen, bei Druckkonstanz, gewährleistet durch ein Perfusionssystem mit Mariott'schen Flaschen.
- 5. sogar in wenigen Sekunden einen halbmaximalen Stoffaustausch der in Lösungen angebotenen Stoffe zu ermöglichen, wie es für transport physiologische Untersuchungen für die Ermittlung und den Vergleich von Stoffwirkungen notwendig ist, vertreten durch div. Stoffanwendungen wie u. a.:
  - 1. Hemmstoffe des Ionentransports und der pH-Regulation
  - 2. Hormone
  - 3. Pharmaka/Gifte/Mischungen
  - 4. sonstige Substrate, u. a. Zucker, Aminosäuren, Fette/Fettsäuren
  - 5. Schadstoffe des ökotoxikologischen Bereichs u. a. Cd, Pb
  zur Ermittlung der Reversibilität, Irreversibilität und anderen aus Kinetiken abzuleitenden Verhaltensmustern, meßbar und beurteilbar über elektro physiologische Größen wie der transepithelialen Potentialdifferenz, des transepithelialen Kurzschlußstromes und der Widerstände u. a.
b) Möglichkeiten und Vorzüge der Transportkammer bestehen auch darin, daß die Verwendung/Untersuchung sehr kleiner Epithelflächen/Gewebe von kleinen Organismen bzw. kleinen Organen, also von kleinen Epithelien bisher noch nicht untersuchter Arten mit dieser Methode erstmals möglich ist und für verschiedene Epithelflächen funktionell vereinfacht ist, aufgrund der
- 1. Verwendbarkeit dieser Epithelien mit einer Gesamtfläche der Epithelien von ca. 0,7 mm bis 1,2 mm ∅ leicht größer (zum Abdichten) als die Kreis-Meßflächen von 0,5 mm bis 1,0 mm ∅ in gewünschten Bohrmaßen.
- 2. auswechelbaren Kreis-Meßflächen als zentrische Bohrungen, z. B.
  - 1. mit 0,5 mm ∅
  - 2. mit 1,0 mm ∅
  - 3. auch 2,0 mm ∅
  eingelassen in auswechselbaren oder fest einklebbaren Kunststoffscheiben (den Präparate-Auflageflächen) der beiden Halbkammern der Transport kammer. Anmerkung: Größere Meß-Flächen können nützlich sein, wenn der Kurzschlußstrom (µA) sehr klein ist und erst bei größerer Meßfläche ent sprechend größere Transportkapazität im Meßbereich der Geräte aufzu zeichnen ist.
c) Vorzüge und Möglichkeiten bestehen auch darin, daß eine "optimale" Justierbarkeit der Halbkammern über Schraubverbindungen mit dem da zwischen liegenden Präparat auch während des Meßvorganges gegeben ist,
- 1. unterstützt durch die Präparateschonung durch Abstandshalter, die mit den Gummiringen umlegten Führungsstutzen der Halbkammern besteht.
- 2. durch die Justierbarkeit der Halbkammern auf einen angenähert maxi malen transepithelialen Widerstand des Präparates, als Indikator für ideale Meßaufzeichnungen für die Potentialdifferenz und den Kurzschluß strom, auch als Hinweis für eine geeignete optimale Abdichtung.
- 3. auch weil eine entsprechend geeignete Abdichtung mit Silicon-Dicht ringen erzielt wird, die dafür auf einem Mikrotom geschnitten werden, wenn die Siliconschläuche in Paraplast eingebettet sind. Es werden geeignete Schnittstärken hergestellt (im µm-Bereich). Eine feine Siliconschicht dient auf der 2. Halbkammer als Schablone, um das Präparat mit dem Dichtring dort zu festigen (abzudichten).
- 4. durch die Reduzierung/Vermeidung eines "Edge damage" (sogenannte Randperforation durch Andrücken der Halbkammern an das Präparat), wenn bereits zu Beginn der Abdichtung eines Präparates nach vorge nanntem Verfahren c1) bis c4) gearbeitet wird.
d) Vielseitige Anwendungen Vorzüge und Möglichkeiten des Einsatzes der Transportkammer zur Untersuchung verschiedener Präparate sind dadurch gegeben, daß die Messung verschiedener elektrischer Parameter mittels einfacher Meßgeräte der Elektrotechnik bei Einsatz verschiedener biologi scher Objekte besteht, durch
- 1. die Anwendbarkeit von einfachen Spannungsmeßgeräten kombiniert mit Stromimpulsgebern.
- 2. die Anwendbarkeit von Voltage-Clamp-Meßeinrichtungen.
- 3. die Anwendbarkeit von Rauschanalyse-Meßeinrichtungen.
- 4. Permeabilitätsmessungen und Leitfähigkeitsmessungen mit diesen Meßeinrichtungen (d1-d3).
- 5. Verwendung von Epithelien/Geweben generell und anderen Deckschichten, z. B. den Cuticulae der Evertebraten.

Claims

1. Transportkammer zur Untersuchung der pharmakologischen, ökotoxikolo gischen und/oder transportphysiologischen Wirkung von Substanzen, die zwei symmetrische, vertikal angeordnete Halbkammern mit je einer wechselbaren Kreismeßfläche (a), zwischen denen ein flächiges biolo gisches Präparat eingespannt wird, umfaßt, wobei die wechselbaren Kreismeßflächen zentral Öffnungsdurchmesser von 0,5 bis 2 mm auf weisen, die achsial in einer horizontal durchgehenden Bohrung als Meßöffnung in der Tansportkammer angeordnet sind, und die Perfusionsein- und ausgänge (e) aufweist, und die Strom- und Meßelektroden (k und g) zur Messung elektrophysiologischer Größen besitzt; hierbei wird die Abdichtung der Präparation in der Kammer durch opitimale Justierung der Halbkammern über die Schraubverbindungen (c) auch während des Meßvor ganges durch Widerstandsmessungen kontrolliert.

2. Transportkammer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie an ein Perfusionssystem angeschlossen ist, welches entlang dem Präparat vertikal perfundiert.

3. Transportkammer nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das flächige biologische Präparat ein beliebiges Epithel bzw. Gewebe schicht und/oder eine Cuticula ist.

4. Transportkammer nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß die Strominduktions- und Meßelektroden mit Impuls- und Meßeinrichtungen zur Messung des Kurzschlußstromes, der transepithelialen Potentialdifferenz und der transepithelialen sowie transcuticulären Wider stände bzw. Leitfähigkeiten über das Präparat verbunden sind.

5. Transportkammer nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die auf ihre pharmakologische, ökotoxikologische und/oder transport physiologische Wirkung am jeweiligen Präparat zu untersuchenden Substanzen unter anderem Hemmstoffe des Ionentransports und der pH-Regulierung, Hormone, Pharmaka, Gifte oder Mischungen davon, Zucker, Aminosäuren, Fette oder Fettsäuren u. a. Schadstoffe des ökotoxikologischen Bereichs sind.