DE4020013A1 - Vorrichtung einer vertikalen transportkammer - Google Patents

Description

Titel

Vorrichtung einer vertikalen Transportkammer, die mit zwei Halbkammern eine geeignete Präparateabdichtung und die Messung des Kurzschlußstromes, der transepithelialen Potentialdifferenz und der transepithelialen Widerstände an Ladungen transportierenden sehr kleinflächigen Epithelien und Cuticulae mit Kreismeßflächen kleiner als 1 mm ⌀ bis 0,5 mm ⌀ ermöglicht, verwendbar für pharmakologisch, ökotoxikologische und transportphysiologische Untersuchungen.

Angaben zur Gattung

Die Vorrichtung dieser Transportkammer ermöglicht es, sehr kleine Epithelflächen (stammend aus Mikropräparationen) von Organismen bzw. deren Organen transportphysiologisch, pharmakologisch und ökotoxikologisch zu untersuchen. Dabei dient ein "relatives Maximum" des Präparatewiderstandes mit justierbaren Halbkammern der geeigneten Ableitung der Meßgrößen. Die vertikale Anordnung der Halbkammern sichert eine ideale Perfusion, O₂-Versorgung und geeignetes Stoffangebot bei konstantem Fließverhältnis (Mariott'sche System) und isobarem Druck am Präparat im Vergleich zu horizontalen asymmetrischen Transportkammern. Zudem liegt eine Mikroversion einer Transportkammer vor. Diese Transportkammer ist geeignet für die Handhabung unter dem Stereomikroskop bzw. Binokular. Dies sind notwendige Voraussetzungen und Bedingungen für die Untersuchung o. g. aktiv und passiv transportierender Epithelien und Deckschichten mit kleiner Fläche.

Stand der Technik

Diese Transportkammern sind seit Ussing, Zerahn (1951) bekannt. Bisher ist nur eine Transportkammer mit einer kleinen Kreismeßfläche von 2 mm ⌀ für die Untersuchung des passiven Transportes an Cuticulae von Crustaceen bekannt (Avenet, Lignon 1985).

Literatur

Ussing, H. H.; Zerahn, K (1951):
Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin.
Acta physiol. Scand. 23, 17-49.
Avenet, P.; Lignon, J. M. (1985):
Ionic permeabilities of the gill lamina cutitcle of the crayfish, Astacus leptodactylus (E.).
J. Physiol. 363, 377-401.

Kritik

Kleine Kreismeßflächen wurden bisher ignoriert, weil man allgemein annahm, daß die Widerstände der Transportkammern stark ansteigen und die Epithelien wegen eines hohen "edge damage" nicht zu untersuchen sind. Dem ist nicht so, wie bereits die o. g. Transportkammer mit 2 mm ⌀ zeigt. Es gibt z. Zt. keine wissenschaftlich akzeptable Begründung, warum unterhalb von 2 mm Lochdurchmesser nicht gemessen werden sollte. Selbst die Fachwissenschaft traute sich bisher nicht, diesen Grenzbereich zu unterschreiten. Es ist dagegen aus Patch-Clamp-Versuchen der biologischen Elektrophysiologie bekannt, daß die Mikroöffnungen der Elektroden deutlich höhere Widerstände zeigen. Diese bleiben aber insofern unberücksichtigt, weil die Präparatewiderstände mit den Elektrodenwiderständen immer additive Werte bilden und nur abgezogen werden brauchen. Die Widerstände dieser Transportkammern liegen unter Verwendung physiologischer Salzlösungen ohne eingesetztes Präparat bei um 5-12 Ω · cm².

Aufgabe

Der Erfindung kommt die Aufgabe zu, ein noch zukünftig zu erschließendes Gebiet unbekannter Epithelien kleiner Organismen bzw. Organe hinsichtlich ihrer Transporteigenschaften (Transportsysteme der Membranen für Substrate und Ionen) zu untersuchen. Das sind Anwendungsgebiete der Ökotoxikologie, Pharmakologie und der Transportphysiologie in der Biologie und Medizin. Das Transportverhalten der Epithelien kann genutzt werden, um Schadstoffeinflüsse auf den Transport unter Normalbedingungen zu untersuchen. Dabei können nicht nur die Systemverhaltensweisen bekannter Epithelien überprüft und mit neuen Epithelien kleinerer Organismen verglichen werden. Es können auch schädliche Einflüsse erkannt und diese Untersuchungsergebnisse präventiv eingesetzt werden.

Das gleiche gilt für die Anwendung von Pharmaka, Hemmstoffen, Hormonen und anderen Stoffen. Dosiswirkungen sind u. a. die Darstellungsformen für die Interpretation der Stoffeinflüsse auf die Veränderung der Meßgrößen. Reversibilität und Irrversibilität der Werte der Meßgrößen sind Kennzeichen für inhibierte aktive, aber auch passive Prozesse. Irreversible Inhibitionen von Transportsystemen der Ionentransporte und der Atmungskette können den Zelltod (Epitheltod) nach sich ziehen. Klassische Beispiele sind nach Anwendungen von Cyaniden für die Atmungskette bekannt (oder Dinitrophenol).

Lösung der Aufgabe

• 1. Es werden geeignete Epithelien gewählt, oder es werden mit der Transportkammer neue Epithelien gefunden. Dafür dienen die Meßgrößen als Indikatoren.
• 2. Die Erfüllung der Aufgabe ist mit Anwendung der Patentansprüche 1-5 gegeben.

Vorteile: Es sind unterschiedlich dicke, sehr kleine Epithelflächen zu verwenden. Der Meßbereich von 0,5 mm ⌀ Kreismeßfläche erschließt Epithelien einer viel größeren Artenvielfalt als bisher. Es können sehr kleine Organismen bzw. Organe untersucht werden. Die Transportkammer kann dazu dienen, Indikatororganismen zu finden, deren Epithelien deutlich Schadstoffreaktionen oder Reaktionen auf Anwendungen von Pharmaka zeigen, z. B. im Vergleich zu bekannten anderen Testverfahren. Die Präparationen sind unter dem Stereomikroskop auch auf den Halbkammern möglich, um die Mikropräparation besser zu gewährleisten. Ferner ist eine optimale O₂-Versorgung möglich. Schneller Stoffaustausch ist gegeben. Situationen wie in vivo sind zu simulieren. Es können Tiergruppen untersucht werden, die nicht wie z. B. bei den Fröschen erhöhten Tierschutzbestimmungen unterliegen.

Anleitung zu Handhabung der Transportkammer:

• - Konstruktionszeichnung der Transportkammer: Anlage 1.
• - Bedienungsanleitung/Beschreibung: Anlage 2.
• - Beispielpräparate: Isolierte, halbierte Kiemenplättchen von Eriocheir sinensis (Wollhandkrabbe) oder Operculraepithel von Fischen, Darmepithelien kleiner Organismen, Froschhautepithel.

Anlage 2 Zur Konstruktionszeichnung

Für die Untersuchung der Kiemenplättchen relativ kleiner Krabben erwies sich die Transportkammer nach Avenet, Lignon 1984 als nicht geeignet. Wegen der empfindlichen Präparate der Cuticulae und halbierten Kiemenplättchen mit einer nur sehr kleiner Präparatefläche wurde eine neue Transportkammer konstruiert.

Dazu wurde eine perfundierbare, mit vertikal angeordneten symmetrischen Halbkammern ausgestattete Transportkammer hergestellt (Schwarz, Graszynski 1989). Besondere Charakteristika sind: Wechselbare Kreismeßflächen von 2-0,5 mm ⌀ (→a). Die Kammerhälften sind mit je 12 mm Breite (→b) flach bemessen, so daß erstmals die Handhabung bzw. Einfügung des Präparates unter dem Stereomikroskop in horizontaler Lage möglich wurde. Während des Meßvorganges können die Seitverschraubungen (→c) nachgezogen werden, um eine nahezu maximale Abdichtung zu ermöglichen, die bei kontinuierlicher Widerstandsmessung zu verfolgen ist. Führungsstutzen der Halbkammern (→d) können mit verschieden starken O-Ringen aus Gummi umlegt werden, die beim kontinuierlichen Absenken der zweiten Halbkammer auf das Präparat als Abstandshalter bzw. Puffer dienen. Die Perfusionszugänge und -ausgänge (→e) sind in ihrer Höhe so angelegt, daß eine schnelle zirkulär vollständige Durchspülung der Transportkammer (Volumen einer Halbkammer bei ≈1000 mm³1 ml) in sehr kurzer Zeit von ≈15 sec bei 6-10 ml/min Fließgeschwindigkeit gegeben ist. Der Zirkulationsstrom vermeidet das Auftreten ungerührter Schichten vor dem Präparat, was Tests mit niedermolekularen Farbstoffen (z. B. Bromphenolblau- bzw. Kaliumpermanganatlösung) belegen. Damit ergaben sich gleichzeitig erste Hinweise auf eine optisch einwandfreie Abdichtung der Präparate, wenn nur eine Halbkammer mit einem Farbstoff perfundiert wurde. Das Strömungsverhalten in der Kammer begünstigt gleichzeitig einen geeigneten Abtransport von Luftblasen vor dem Präparat. Die Innenseite jeder Halbkammer weist zentral deckungsgleich eine Kreisöffnung auf, die "Kreis"-Meßfläche, die vom Präparat überdeckt wird und nach einer geraden Bohrung von ≈0,5 mm Strecke konisch in den Kammerraum übergeht und dann wieder in einer geraden Bohrung mit einem Durchmesser von 10 mm endet.

Im oberen Teil der Halbkammern liegen konische Bohrungen (→f) vor, die zum Kammerinnenraum einen Durchmesser von 2  mm aufweisen und als Einsatz von KCl-Agar-Meßbrücken (→g) als Ableitelektroden (3% Agar/KCl 3 mol/l) dienen. Diese Meßbrücken stehen über Kalomelelektroden (KCl 3 mol/l) mit dem Spannungsmeßteil in Verbindung. Die Schraubverschlüsse mit Dichtring (→h) sind zentral mit einer ≈1,2-mm-⌀-Bohrung (→i) versehen, in die mit einer Quetschverschraubung die Ag/AgCl-Stromelektroden (→k) (Silberdrähte von ≈1 mm ⌀ (Fa. Götze, Berlin) auf 1 cm Länge chloriert, bis die Sättigung eintrat) eingefaßt sind. Die Elektroden stehen mit dem Stromgeber der Meßeinrichtung in Verbindung.

Montage der Präparate Abdichtung der Präparate

Für die Abdichtung der Präparate (Kiemenplättchen, isoliertes halbiertes Kiemenplättchen und Cuticulae) wurden Dichtringe von 1,2 mm ⌀ (innen) hergestellt. Dazu wurden mit Paraplast gefüllte und im Paraplast eingebettete Siliconschläuche am Minot-Mikrotom (Typ 1212, Fa. Leitz) in unterschiedlicher Schnittstärke von ≈1-20 µm mit relativ ebenen Schnittflächen hergestellt. Auf der gegenüberliegenden Kammer wurde um die Kreismeßfläche eine sehr feine Silicongummierung aufgezogen, die nach Aufpressung eines Siliconringes und Aushärtung als zentrische Schablone des Silicongummiringes der anderen Halbkammer dient.

Montage, Justierung und Kontrolle der Widerstände

Der Einbau der Präparate in die Transportkammer erfolgt unter dem Stereomikroskop. Das in den Salinetropfen überführte Präparat wird unter Ausnutzung der Oberflächenspannung des Wassers über die Meßfläche gezogen und durch Wasserentzug mit Filterpapier abgesenkt. Dabei liegt die apicale Seite (auch mukosal oder luminal) mit der Cuticula nach unten und die basolaterale Seite (auch serosal) mit dem Epithel und der Basallamine nach oben. Sowohl die Cuticula (aufgrund der Interferenzfarben im diffusen Licht) als auch das Kiemenepithel (aufgrund der Epithelreste am Präparaterand) sind deutlich zu unterscheiden. Nach Absenken der zweiten Kammerhälfte (mit dem Silicondichtring) in den Führungsstutzen bis dicht vor das Präparat wird das Anziehen der Schraubverbindungen unter Beobachtung des Präparates im Stereomikroskop durchgeführt.

Die Transportkammer wird dann mit dem Perfusionssystem (Verbindung der Perfusionsschläuche mit den Zuläufen der Transportkammer) und der Meßapparatur (KCl-Agar-Meßbrücken, Ag/AgCl-Elektroden) verbunden. Die Endjustierung der Abdichtung erfolgt während des Meßvorganges unter Beobachtung der Veränderung des Widerstandes nach kontinuierlichem Nachstellen der Schraubverbindungen, bis im Meßsystem die Widerstandsveränderung nur noch beliebig klein ist und der Präparatewiderstand ein relatives Maximum erreicht, also eine optimale Abdichtung vorliegt. Dabei dienen auch Spannung und Strom als Indikatoren für die Unversehrtheit eines Epithels. Tests, bei denen über dieses rel. Maximum des Präparates hinaus die Schraubverbindung weiterhin nachzustellen versucht wird, zeigen, daß der Präparatewiderstand aufgrund des in diesem Verfahren synthetisch erzeugten "edge-damage" auf den Widerstandswert der Transportkammer (Kammerleerwert) zusammenbricht.

Perfusionssystem der Anlage

Die Transportkammer wird über die Zuläufe an das Perfusionssystem (Perfusionssysteme und -verbindungen der Fa. Braun) angeschlossen. Die Dreiwegehähne werden gleichzeitig für beide Halbkammern geöffnet, um die Kammer bei gleichem hydrostatischen Druck zu füllen und Präparatebelastungen zu vermeiden. Die Vorratsbehälter bestehen aus selbstgebauten Mariott'schen Flaschen (Cooper 1981), Kunststoffflaschen (Fa. Werkstätten, Berlin), die mit einem Lufteinlaßstutzen versehen wurden und somit einen relativ konstanten hydrostatischen Druck - auch bei ungleich gefüllten Vorratsbehältern - gewährleisten, um den Faktor Druck als bekannten Fremdeinfluß dieses symmetrischen Systems zu beseitigen. Darüber hinaus kann durch Sicherheitsschleifen im Perfusionsschlauch ein Leerlaufen der Transportkammer vermieden werden.

Claims (5)

1. Vorrichtung einer vertikalen Transportkammer, verwendbar für pharmakologische, ökotoxikologische und transportphysiologische Untersuchungen mit elektrophysiologischen Meßapparaturen, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung der vertikalen Transportkammer, die perfundierbar ist, mit den zwei justierbaren Halbkammern eine geeignete Präparateabdichtung und die Messung des Kurzschlußstromes, der transepithelialen Potentialdifferenz und der transepithelialen Widerstände an Ladungen transportierenden, sehr kleinflächigen Epithelien und Cuticulae mit Kreismeßflächen kleiner als 1 mm ⌀ bis 0,5 mm ⌀ ermöglicht.

2. Vorrichtung einer vertikalen Transportkammer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

• a) daß die Bauart einer vertikalen Transportkammer - bestehend aus zwei flachen, justierbaren und perfundierbaren Halbkammern - geeignet ist,
  • a1) für Präparationen und Justierungen unter dem Stereomikroskop oder Binokular beim Einfügen des Präparates,
  • a2) für die Handhabung von Mikropräparaten in physiologischem oder anderem Medium, auf Tropfen direkt auf den flachen Innenseiten der Halbkammern, unter mikroskopischer Bestrahlung,
  • a3) bei isobarem Druck auf die Systeme der beiden Halbkammern mit symmetrischer Anordnung und gleichen Halbkammervolumina die Epithelien bei konstanten Faktoren zu untersuchen,
  • a4) symmetrisch mit Lösungen bei gleichem Fließdruck oder asymmetrisch beidseitig des Epithels zu perfundieren und das Epithel entsprechend modifiziert zu versorgen, bei Druckkonstanz, gewährleistet durch ein Perfusionssystem mit Mariott'schen Flaschen,
  • a5) sogar in wenigen Sekunden ein halbmaximalen Stoffaustausch der in Lösungen angebotenen Stoffe zu ermöglichen, wie es für transportphysiologische Untersuchungen für die Ermittlung und den Vergleich von Stoffwirkungen notwendig ist, vertreten durch Stoffanwendungen wie u. a.:
    • 1) Hemmstoffe des Ionentransports und der pH-Regulation,
    • 2) Hormone,
    • 3) Pharmaka/Gifte/Mischungen,
    • 4) sonstige Substrate, u. a. Zucker, Aminosäuren, Fette/Fettsäuren,
    • 5) Schadstoffe des ökotoxikologischen Bereichs, u. a. Cd, Pb,
  • zur Ermittlung der Reversibilität, Irreversibilität und anderen aus Kinetiken abzuleitenden Verhaltensmustern, meßbar und beurteilbar über elektrophysiologische Größen wie der transepithelialen Potentialdifferenz, des transepithelialen Kurzschlußstromes und der Widerstände u. a.

3. Vorrichtung einer vertikalen Transportkammer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

• a) daß die Verwendung/Untersuchung sehr kleiner Epithelflächen von kleinen Organismen bzw. kleinen Organen, also kleinen Epithelien bisher noch nicht untersuchter Arten mit dieser Methode erstmals möglich ist und für verschiedene Epithelflächen funktionell vereinfacht ist, aufgrund der
  • a1) Verwendbarkeit dieser Epithelien mit einer Gesamtfläche der Epithelien von ca. 0,7 mm bis 1,2 mm ⌀, leicht größer (zum Abdichten) als die Kreismeßflächen von 0,5 mm bis 1,0 mm ⌀ in gewünschten Bohrmaßen,
  • a2) auswechselbaren Kreismeßflächen als zentrische Bohrungen, z. B.
    • - mit 0,5 mm ⌀,
    • - mit 1,0 mm ⌀,
    • - auch 2 mm ⌀,
  • eingelassen in auswechselbaren oder fest einklebbaren Kunststoffscheiben (den Präparateauflageflächen) der beiden Halbkammern der Transportkammer. (Anmerkung: Größere Meßflächen können nützlich sein, wenn der Kurzschlußstrom [µA] sehr klein ist und erst bei größerer Meßfläche [größere Transportkapazität] im Meßbereich der Geräte aufzuzeichnen ist.)

4. Vorrichtung einer vertikalen Transportkammer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

• a) daß eine optimale Justierbarkeit der Halbkammern über Schraubverbindungen mit dem dazwischenliegenden Präparat auch während des Meßvorganges gegeben ist,
  • a1) unterstützt durch die Präparateschonung durch Abstandshalter, die mit den Gummiringen umlegten Führungsstutzen der Halbkammern besteht,
  • a2) durch die Justierbarkeit der Halbkammern auf einen angenähert maximalen transepithelialen Widerstand des Präparates als Indikator für ideale Meßaufzeichnungen für die Potentialdifferenz und den Kurzschlußstrom, auch als Hinweis für eine geeignete optimale Abdichtung,
  • a3) auch weil eine entsprechend geeignete Abdichtung mit Silicondichtringen erzielt wird, die dafür auf einem Mikrotom geschnitten werden, wenn die Siliconschläuche in Paraplast eingebettet sind. Es werden geeignete Schnittstärken hergestellt (im µm-Bereich). Eine feine Siliconschicht dient auf der 2. Halbkammer als Schablone, um das Präparat mit dem Dichtring dort zu befestigen (abzudichten),
  • a4) durch die Reduzierung/Vermeidung eines "edge damage" (sogenannte Randperforation durch Andrücken der Halbkammern an das Präparat), wenn bereits zu Beginn der Abdichtung eines Präparates nach vorgenanntem Verfahren a1) bis a4) gearbeitet wird.

5. Vorrichtung einer vertikalen Transportkammer nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

• a) daß die Anwendbarkeit/Messung elektrischer Parameter mittels einfacher Meßgeräte der Elektrotechnik besteht, durch
  • a1) die Anwendbarkeit von einfachen Spannungsmeßgeräten kombiniert mit Stromimpulsgebern,
  • a2) die Anwendbarkeit von Voltage-Clamp-Meßeinrichtungen,
  • a3) die Anwendbarkeit von Rauschanalysemeßeinrichtungen,
  • a4) Permeabilitätsmessungen und Leitfähigkeitsmessungen mit diesen Meßeinrichtungen (a1-a3),
  • a5) Verwendung von Epithelien generell und an deren Deckschichten, z. B. den Cuticulae der Evertebraten.