DE1948259B2

DE1948259B2 - Verfahren zum pruefen der osmotischen zerreissbarkeit organischer zellen, insbesondere roter blutzellen

Info

Publication number: DE1948259B2
Application number: DE19691948259
Authority: DE
Inventors: Auf Nichtnennung Antrag
Original assignee: American Optical Corp
Current assignee: Warner Lambert Technologies Inc
Priority date: 1968-11-13
Filing date: 1969-09-19
Publication date: 1973-06-28
Also published as: CH506793A; FR2024844A1; JPS5036399B1; US3606539A; SE371014B; BE741065A; DE1948259C3; DE1948259A1; GB1289729A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Prüfen der osmotischen Zerreißbarkeit organischer Zellen, insbesondere ;jter Blutzellen, durch Herstellen einer isotonischen Flüssigke^:tssusp vision der Zellen und anschließendes allmähliches Herabsetzen der Saizkonzentration der Suspension Clüssigkeit innerhalb einer bestimmten Zeitspanne durch Verdünnen mit einer hypotonischen Flüssickeit (britische Patentschrift 1*069 443).

Bei dieser Verfahrensweise nach dem Stand der Technik erfolgt das Einstellen hypotonischer Bedingungen ausschließlich durch einen Diffusionsvorgang, da unter Anwenden eines isotonischen Susocnsionsmediums für die organischen Zellen und destillierten Wassers als Verdünnungsmittel dieses mit vorherbestimmter Geschwindigkeit innerhalb einer gegebenen Zeitspanne in die Probe eingeführt wird. Dir Geschwindigkeit wird hierbei durch die Wahl des Verdünnungsmittels bestimmt. Es handelt sich hierbei um das sogenannte Dialyseverfahren, das es gegenüber den weiter zurückliegenden Arbeitsweisen ermöglicht, die osmotische Zerreißbarkeit der Blutzellen schneller und mit größerer Leichtigkeit und Genauigkeit zu prüfen. Es sei nun jedoch vorab auf diesen früheren Stand der Technik kurz eingegangen unter Erläutern der bei derartigen Prüfverfahren eintretenden Vorgänge.

Prüfungen der osmotischen Zerreißbarkeit dienen dazu, eine Information bezüglich der Widerstandsfähigkeit der Zellen oder Mikroorganismen-Membranen gegenüber dem gewöhnlich durch Wasser entwickelten Innendruck zu ergeben.

In einem flüssigen Suspensionsmedium mit geringerer als isotonischer Salzkonzentration vorliegende Erythrozyten (rote Blutzellen) absorbieren die Flüssigkeit geringer Tonizität vermittels Osmose durch die Zellenmembran. Bei einem bestimmten osmotisehen Gradienten, der durch Tonizität des Suspensionsmediums bestimmt wird, entwickelt sich im Inneren der Zellen ein ausreichender Druck, der entweder zu einem Bersten der Membranen oder zum Öffnen zahlreicher Poren in denselben führt, durch die Hämoglobin in das umgebende Medium abgegeben wird. Diese Erscheinung wird gewöhnlich als Hämolyse bezeichnet. Dieselbe ist eine Funktion des Zustandes der Zellenmembran und der Salzkonzentration (Tonizität des Zellensuspensionsmediums) und beide sind veränderlich. Der erstere kann vermittels Steuern des letzteren bestimmt werden.

Die Hämolyse wird dadurch verursacht, daß das Suspensionsmedium hypotonisch gemacht wird, und bei Kenntnis des Zustandes (Konzentration des Salzes) des Suspensionsmediums der erforderlich ist. um die Hämolyse zu .erursachen oder ingangzubringen und für das vollständige Durchführen der Hämolyse erforderlich ist. ergibt sich ein Hinweis auf den Zustand der Zellenmembran. Dies kann seinerseits interpretiert werden in bezug auf die Gesundheit des Gastkörpers.

Bei dem sogenannten klassischen osmotischen Zerreißfestigkeitstest wird eine Reihe Reagenzgläser angewandt, in deren jedes die gleiche Menge an Blutzellen und Volumen an Salzlösung eingeführt wird, wobei jedoch die Salzkonzentration in der Reihe der Gläser progressiv kleiner ist. Nach einigem Stehen werden die nicht hämolysierten Blutzellen in jedem der Reagenzgläser abzentrifugiert und es werden Vergleiche zwischen den ursprünglichen Mengen an Blutzellen und der Sedimentation und zwar als eine Funktion der entsprechenden Konzentrationen der Salzlösungen in den Gläsern, graphisch für die Analyse der Zustände des Blutes aufgetragen.

Im Hinblick auf die zahlreichen hiermit verbundenen Arbeitsgänge, die immer die Möglichkeit eines menschlichen Fehlers bei dem Messen und dem Vorbereiten der Reagenzglasprobcn sowie dem Erfordernis nach ungewöhnlicher Geschicklichkeit und Beurteilungsfähigkeit des Analytikers zusammen mit dem Erschwernis langer Wartezeiten zwischen der ursprünglichen Probennahme des Blutes und dem Vorliegen der Testergebnisse. läßt das obige Testverfahren viel zu wünschen übrig. Die Langwierigkeit desselben ist für die routinemäßige klinische Anwendung oder für die Anwendung während der Operation unpraktisch, und die hierdurch gegebene Information ist erheblich beschränkt.

Wie weiter oben ausgeführt, wurde eine Verbesserung dieser sogenannten klassischen Verfahren durch die Verfahrensweise gemäß der genannten britischen Patentschrift 1 069 443 erreicht, und zwar durch Einführen eines Systems, das lediglich eine Probe erforderlich macht. Die Probe ist eine Suspension von Blutzellen in einer isotonischen Lösung, die in einem Dialysatorbehälter eingebracht wird, der seinerseits in einer hypotonischen Lösung eingeführt wird. Die Konzentration der Salze in dem Blutzellen-Suspensionsmedium wird allmählich vermittels osomotischer Wirkung durch den Dialysatorbehälter verringert, wodurch sich eine entsprechende Zunahme des osmotischen Drucks im Inneren der Blutzellen und schließlich Hämolyse ergibt. Vermittels Messen der Lichtdurchlässigkeit durch den Dialysatorbehälter hindurch wird eine Hämolysenkurve gebildet.

Die sich an Hand dieses Ergebnisses des Systems ergebende Hämolysenkurvc ist ein Maß der Lichtdurchlässigkeit als Funktion der Zeit, die ausgedrückt als Hämolyscgeschwindigkeit gedeutet werden kann und besitzt den Vorteil der Bildunsi relativ

_schndler „_imv_cia: auf die osmotischc Zerreißbarkeit

Pin V ach teil des Dialvsesystems sind jedoch Un-2? d B bülih d

te y

-iien und Begrenzungen bezüglich der ge-Towität des Blutzellen-Suspensionsmediums m ^ebenen Zeitpunkt oder Ausmaß der Ha-Γη e »enaue Wechselbeziehuno zwischen der md Tont/ilät oder Toniziiä, und"dem Ausmaß -diu™ hjsUmmt -der, kann,ttcjjigmoid^Kurve

Zusätzlich zu dem Reogenzgk- *e.s, c l .n -V wcndung kommende Vorrichtung --m nsirum.nt au das eine Prüfsiation besitzt, m der das d,. u ρ u fende Probe enthaltende Reagenzgas '^^ wird. Die Probe wird vermittels L.ch pro^kuon und

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der Natur undoes Ausmaßes der Blut-

ist das Dialysesystem bdasret durch das für spez.ell entworfene Prüfzellen, die Probe hindurchgesand« Licht und ein der elektrischer Schalt1 ,^s g,bt an ,.nc

g empfan-

Tct zweckmäßige DiffuMonsgcchwindieke.t Hu=.u,i>«c f Somit sind die Prüfzellen nicht unxersal an- ao druck- in der

ⁱⁿ der Zellen

^^S_gem_äße Verfahren _hl nun dadurch oekennzeichnet. daß die hypotonische Fluss.gkc.t in dio Flüssigkeiwsuspension direkt mit konstanter Rate

₄o

Hk-rd^hVird es weiterhin möglich unter An-,ondcn relativ einfacher vorrichtungsmaß.gcr H,ι fs-A an d,e Untersuchung der Λ .r-

,ondcn relativ einfacher vorrichtungg mittel ,ine Anpassung an d,e Untersuchung der Λ .rkunuc. verschiedener Arten und ^?"«n rat.oncn von'Droacn auf die osmot.schc Zerreißbarkei roter Bhnzellen sowie Untersuchungen bczughch der osmotischen Zerreißbarkeiten weiterer Arten. Formen und Größen von Zellen oder M.kroorgan.smcn durchzuführen.

Das Verfahren wird unter Anwenden lediglich einer Probe ausgeführt, die in ein herkömmliches Laboratoriumsrcagcnzglas eingeführt werden kann

in dem Falfdes Prüfens auf die ^-throz.iische osmofschc Zerreißbarkeit .st d.e Probe eine kleine Me₁₁₁Ie hcparinisiertcn Vollblutes, das in einer .sotonischen Salzlösung verdünnt ist.

Die Probe wird durchleuchtet und destilliertes Wasser direkt in dieselbe mit einer vorherbestimmten konstanten Geschwindigkeit «nter kont.nu.er!ichcni Vermischen eingeführt, um so ein Glcichgevn.cht der Tonizität in der Probe während des gesamten TlsIs aufrechtzuerhalten. Die Lichtdurchlass.gkc.t durch die Probe wird fotoelektrisch gemessen und vorzuesweise in Form einer Sigmo.d-Kurve aufgezeichnel. an Hand derer ein Maß bezüglich der Geschwür-

Smd^^

^% _{oebcn bcisp}idsvve,se Hämolyse-F ^g. ;^_de™ä_e ⁴ _e^_ndunpgc ^l _mäß ausgebildet wer-

den kön Jfⁿ· _{d Er}fi_nüdngsgegenstandes

^Das ^j,*¹^ _{dcr Fic}. j wiedergegeben Das

»s ehern ,™* _l{ _der zeHenmembranen

4= Prufc ^ dt _{Muster oder Prüfprobo 10}

^wrd m ->n , herkömmliches 1 abonuon-

^, ₁₂ eingebracht wird. ^^ ^_{r BlutM},_{lcn auf dic}

^ln ™^m _rk;?_t" _{kann eine} Küvette. z.B. ein 15 ml ⁵° η'_ϋι:ηΖα,_ας 12. das eine Probe H) bestehend aus hc- ^_Scm Vollblut in einer Menge von 0.1ml P™^iert^ , «; _m, _isotonischer Salzlösung enthält.

" _werden

TlO wird durchleuchtet vermittels Proji- ^ _{auscencnd von} der Lampe 14 mit

ziere ^n ^ ^ ^.^ _{lg und Reagcn7}gias

J ". d MB

55

system

6o ^ ^ ^^ _{lg und Rg}g ". photowiderstand 20 in dem MeB-

befindet sich in einem mit einer Stromquelle 24 und ^^ 26 einer Aufzeichmingsvor-_Aufzeichnungsvornchtung 28 ng ^a
pa£lclfecs^^J _{ißen ZwecRe würde es sich}

65 ^Fv^ ^.^^^,^ Aufzeichnungsvorrichtung ζ B. bei unci geei η _{dje mU ejner Ro}„_e _od,

Aufze4nun_gSpnpier 30 arbeitet, das »-

nchtung-

einem vorherbestimmten, konstanten linearen Ge- liehe Einwirkung auf das durch das Probesuspen-

schwindigkeit (z.B. 2.5cm/min) angetrieben wird und sionsmedium hindurch übertragene Licht,

über das ein Aufzeichnungsstift 32 von einer gegebe- Der durch die Probe 10 zu irgendeinem Zeitpunkt

nen Lage an einer Seite des Papiers in Richtung auf während des Versuchs hindurchgehende Lichtbetrag,

die gegenüberliegende Seite um Beträge bewegt wird, 5 wöbe' das Rotfilter 18 die Wirkung des in das ver-

die den Veränderungen der Amplitude eines auf den dünnte ZeHsuspensionsmcdium diffundierende HU-

Antriebsmechanismus 32« des Aufzeichnungsstiftes moglobin hintenanhält, entspricht dem Betrag der

32 beaufschlagten Signals entspricht. In diesem Falle Hämolyse, die bis zu diesem Zeitpunkt eingetreten

wird dieser Antriebsmechanismus durch einen elek- ist.

irischen Strom gesteuert, der parallel zu dem Wider- io In anderer Weise betrachtet, entspricht der Betrag stand 26 entwickelt wird, und Veränderungen in der des durchgelasscnen Lichtes der Menge der in der Amplitude desselben werden durch den veränderli- Suspension verbleibenden, nicht hämolysierten Blutchen Widerstand des Photowiderstandes 20 be zellen. Die nicht hämolysierten Zellen in der Suspenstimmt, da derselbe durch sich verändernde Intensi- sion gestalten das einfallende Licht diffus und absortäten des darauf auffallenden Lichtes beeinflußt is bieren dasselbe, wodurch die Lichtdurchlässigkeit wird. durch die Probe verringert wird. Bei zunehmender

Das Meßsystem 22 wird mit einer einstellbaren Hämolyse nimmt somit der Betrag des durch die Blende (z. B. Irisblende) 34 für die Standardisierung Probe hindurch übertragenen Lichtes zu. des Lichtbetrages kalibriert, der durch die Prüf- Da die Verdünnung der Probe mit bekannter konprobe vor Durchführen des Tests hindurch übertragen ao stanter Rate, wie bereits weiter oben ausgeführt, erwird. Hierdurch werden die Differenzen in den ZeI- folgt, stehen die Faktoren der Zeit, der Verdünnung, lenvolumen berücksichtigt, die bei dem Prüfen ver- des Betrages des durchgelassenen Lichtes und somit schiedener Proben auftreten können. die prozentuale Hämolyse in Beziehung zueinander.

Der Test bezüglich der Zellenzerreißbarkcit wird Bei Bewegen des Aufzeichnungspapiers 30 in ausgeführt, indem destilliertes Wasser oder andere »s Richtung des Pfeils z. B. mit einer bekannten Ge-VerdUnnungsflüssigkeit deren Wirkung auf die Hä- schwhidigkeit (z. B. 2,5 cm min) während des Versumolyse untersucht werden soll, der Probe 10 züge- ches ur.l Ausbilden eines elektrischen Signals durch setzt werden. Das Zuführungsrohr 36 wird für diesen den Photowiderstand 20 parallel zu dem Einlaß-Zweck angewandt und die Verdünnungsflüssigkeit widerstand 26 der Aufzeichnungsvorrichtung mit wird durch dasselbe mit einer vorherbestimmten kon- 30 einer der Amplitude des durch den Photowiderstand stanten Rate (z. B. 1 ml/min) innerhalb einer gegebe- 20 empfangenen Lichtes entsprechenden Amplitude nen Zeitspanne (z. B. 9 Minuten) zugesetzt, wodurch bildet der Aufzeichnungsstift 32 die Hämoiysenkurve sich eine direkte Beziehung zwischen »Zeit« und 42 aus.

»Verdünnung« ergibt. Somit kann die Verdünnung Die Kurve 42 entspricht der Geschwindigkeit und

zu irgendeinem speziellen Zeitpunkt als eine Funk- 35 dem Prozentsatz der in der Probe 10 eintretenden

tion der Zeit als solcher gemessen von dem Beginn Hämolyse gegen die Zeit wobei die Zeit in direkter

des Tests an erhalten werden. Beziehung zu der Tonizität des Blutzellen-Suspen-

Die Zuführung der Verdünnungsflüssigkeit erfolgt sionsmediums steht auf Grund der Verdünnung der

tief in der Prüfprobe, d. h. benachbart zu dem Boden Probe, die mit einer vorherbestimmten konstanten

des Reagenzglases 12 unter kontinuierlichem Vermi- 40 Rate (z. B. 1 ml/min) erfolgt

sehen vermittels des Rühres 38. Die Verdünnungs- In den Fig.2, 3 und 4 sind beispielsweise Hämo-

flüssigkeit wird eng benachbart zu dem Flügel 40 des lysenkurven wiedergegeben, wobei die Hämolyse an

Rührers 38 abgegeben unter Ausbilden eines Gleich- der rechten Kante jedes Aufzeichnungspapiers 44 be-

gewichtes der Tonizität in der gesamten Probe 10, ginnend dargestellt ist und erreicht in jedem Fall ein

bevor die darin vorliegenden Zellen Zeit haben, eine 45 Maximum. Das Maximum stellt die Stelle dar, in Ab-

Hämolyse zu erfahren auf Grund einer örtlich niedri- hängigkeit von der Zeit (Tonizität der Probe), wo

gen Tonizität an der Stelle, wo die Verdünnungsfiüs- eine vollständige Hämolyse eingetreten ist.

sigkeit zugesetzt wird. Die Flügel 40 α unterstützen Das Deuten der Hämoiysenkurve erfolgt vermittels

as Rühren, sobald das Verdünnen deren Höhe und Übersetzen der Zeit in die Salzkonzentration _vTonizi-

darüber in dem Reagenzglas 12 erreicht Durch das 50 tat) der Prüf probe, sowie der Ordinaten der Auf-

Rühren wird keine mechanische Hämolyse bedingt zeichnung in prozentuale Hämolyse. Die prozentuale Sobald die Salzkonzentration in dem Blutzellen- Hämolyse und Tonizität an vorgewählten Punkten Salzlösungssuspensionsmedium ¹⁴UrCh Verdünnen auf jeder Kurve können für eine ins einzelne gehende

von dem isotonischen Wert aus verringert wird, ab- Analyse der Zerreißbarkeit der Blutzellen bei der sorbieren die Zellen allmählich die Flüssigkeit mit 55 Diagnose der Blutdyscrasie angewandt werden,

geringerer Tonizität vermittels Osmose bis zu einem Die Hämoiysenkurve 42 α, s. F i g. 2, ist ein BeiPunkt wo im Inneren spezieller Zellen ein ausrei- spiel für eine Kurve, die durch das oben angegebene chender Druck entwickelt wird unter Offnen zahlrei- Prüfen des Blutes eines normalen gesunden Erwach-

cher Poren oder Berster der Membranen derselben, senen erhalten worden ist

wobei in jedem Falle deren Hämoglobin in das Sus- 60 Für Vergleichszwecke sind in den F i g. 3 und 4

peosionsmedium der Probe abgegeben wird. Kurven wiedergegeben, die durch das Prüfen eines

Bei Fortsetzen des Tests (Verdünnen) gibt eine anomalen Blutes erhalten worden sind, wie es die sich vergrößernde Anzahl an Zellen ihr Hämoglobin Kurven 42 & bzw. 42 c angeben. Die Kurve 426 ist ab. Die Hämoglobinkonzentration in dem Suspen- ein Beispiel für einen Fall von Thalassemie und die

sionsmedium und diejenige der im Inneren der zer- 65 Kurve 42 c ist ein Beispiel für einen Fall von Spheru-

rissenen Zellenmembranen wird schließlich praktisch zytose. Es ist von Interesse festzuhalten, darf an

gleich. Somit werden die zerrissenen Zellmembranen Hand dieser Kurven festgestellt werden kann, daß

gewissermaßen geistergleich und haben keine merk- Erythrozyten von Thalassemie-Patienten eine gxö-

ßere Widerstandsfähigkeit gegenüber Hämolyse aufweisen als Zellen von spherozytischen Patienten, wobei die letzteren eine größere osmotische Zerreißbarkeit als die ersteren besitzen.

Ins einzelne gehende Analysen spezieller Teile von H'.; :nolysenkurven können weiter durch Anwenden unterschiedlicher Werte der Salzkonzentration in dem Blut-Suspensionsmedium einer Probe und Zusatz von Lösungen geeigneter Toni^ität, an Stelle von Wasser, innerhalb eines breiten Bereiches der Zusatzgeschwindigkeiten untersucht werden. Der Test kann angewandt werden, um die Wirkungen verschiedener Arten und/oder Konzentrationen an Drogen auf die osmotische Zerreißbarkeit roter Blutzcllen zu untersuchen, indem die Drogen in die ursprüngliche Probe eingebracht oder in dem Verdünnungsmedium angewandt werden. Es kann ebenfall« Säure oder Alkalien für das Verursachen der Hämolyse durch Azidität, Aikalinität od. dgl. (Lysins) an ίο gewandt werden.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

309526/

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Prüfen der osmotischen Zerreißbarkeit organischer Zellen, insbesondere roter Bluizellen, durch Herstellen einer isotonischen Flüssigkeitssuspension der Zellen und anschließendes allmähliches Herabsetzen der SaIzkcnzentration der Suspensionsflüssigkeit innerhalb einer bestimmten Zeitspanne durch Verdünnen mit einer hypotonischen Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß die hypotonische Flüssigkeit in die Flüssigkeitssuspension direkt mit konstanter Rate eingeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß die Probe während des Einführens der hypotonischen Flüssigkeit kontinuierlich gerührt wird.

3. Verfahren nach Anspruch!, dadurch gekennzeichnet, daß während des Verdünnens der Probe deren LiehidurchKNsigkeit fortlaufend bestimmt wird.