DE3103792A1

DE3103792A1 - Verfahren und geraet zur untersuchung von biologischen zellparametern

Info

Publication number: DE3103792A1
Application number: DE19813103792
Authority: DE
Inventors: Ian B. London Shine
Original assignee: Coulter Electronics Inc 33010 Hialeah Fla; Coulter Electronics Inc
Current assignee: SHINE, IAN B., LONDON, GB
Priority date: 1980-02-05
Filing date: 1981-02-04
Publication date: 1981-11-26
Also published as: JPH034863B2; FR2475227B1; GB2068544B; GB2068544A; DE3103792C2; JPS56122958A; US4278936A; FR2475227A1

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. E. Eder

Dipl.-Ing. K. Schleschke - 7 - * 1 ΓΠ 7

8 München 40, Elisabethstraße 34 . W I U O /

COULTER ELECTRONICS ING. Hialeah, U.S.A.

Verfahren und Gerät zur Untersuchung von biologischen Zellparametern

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und einen neuen Diskriminator, welcher im Bereich der medizinischen Untersuchung und Sichtung einsetzbar i'st. Im einzelnen ist die Erfindung gerichtet auf ein Verfahren und ein Gerät, welches, in einer bevorzugten AusfUhrungsform, den elektrischen Widerstand von Zellen (beispielsweise Blutzellen) durch Osmose verändert. Die Änderung derartiger Zellparameter liefert einen Satz von zugehörigen Daten, welche Eigenschaften definieren, die charakteristisch sind für die Gesundheit oder die physiologische Kondition des menschlichen oder tierischen Lebewesens, von dem die Zellenprobe stammt. Die Untersuchung menschlicher Zellen für die medizinisehe Einteilung, Diagnose oder sonstige medizinische Zwecke ist allgemein bekannt. Beispielsweise sind Zähler für rote Blutzellen, für das mittlere Zellvolumen (MCV); für den Hämoglobingehalt und für das Hämatokrit allgemein bekannt und diese Parameter der roten Blutzellen werden vielfach bei der medizinischen Beobachtung und Versorgung von Patienten eingesetzt. Es ist typisch, das Hämoglobin von den roten Zellen durch Lysis, beispielsweise durch Zer-

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störung der Zellen, zu entfernen. Eine derartige Zellzerstörung wird durch eine Auflösung oder Aufbrechung des Stromas der Zelle erreicht und wird auch Häraolyse genannt.

Es ist allgemein bekannt, daß der osmotische Druck von Lösungen, d. h. ihre Osmolalität, beispielsweise bei Salzlösungen, mit ihrer Konzentration variiert und vom Typ der Lösung abhängt,und daß die Differenz zwischen dem osmotischen Druck innerhalb einer Zelle und dem seiner Umgebung bewirkt, daß die Zelle sich in ihrem Volumen und ihrem elektrischen Widerstand ändert.

Die sogenannte physiologische Salzlösung ist isotonisch und Zellen, welche in einer solchen Lösung suspendiert sind, werden in ihrem Volumen weder anschwellen noch schrumpfen und es wird auch ihr elektrischer Widerstand "nicht verändert. Destilliertes Wasser ist hypotonisch in Bezug auf eine isotonische Lösung, in der Blutzellen innerhalb des menschlichen Körpers sich befinden. Salzlösungen können isotonisch, hypotonisch oder hypertonisch sein, und zwar abhängig jeweils von ihrer Konzentration.

Eine relativ bekannte, jedoch relativ selten benutzte Untersuchung von roten Blutzellen ist die osmotische Zerstörbarkeit, bei welcher das Ausmaß der Hämolyse der gellen unter kontrollierten Änderungen des osmotischen Druckes gemessen wird. Der "Fragiligraph" ist ein Instrument, welches die osmotische Zerstörbarkeit bestimmt und über eine Periode von etwa fünf Minuten eine zunehmende Anzahl von roten Zellen in einer Probe hämolisiert. Dabei wird der Wert des verbleibenden Hämoglobin optisch gemessen und eine entsprechende (S-förmige) Kurve oder deren Ableitungen aufgezeichnet. Die Abszisse dieser Kurve stellt die Zeit dar und die Ordinate das Maß der Häraolyse. Eine Anzahl von Änderungen in der Kurvenform sind erfaßt worden und werden in Beziehung gesetzt zu verschiedenen Gesundheitszuständen.

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Es ist notwendig, die Beziehung zwischen osmotischem Druck und Hämolyse zu verstehen, um einzuschätzen, daß die vorliegende Erfindung auf einer Behandlung und Messung von Zellen besteht, welche das Stroma der Zellen nicht zerstört und somit sich von der Hämolyse grundlegend unterscheidet.

Zeil- und Teilchenzähler und entsprechende Meßinstrumente, beispielsweise bekannt unter dem Handelsnaraen "Coulter-Zähler" der Firma Coulter Electronics, Inc., Hialeah, Florida verwenden elektrische Fühleranordnungen, welche direkt auf den elektrischen Widerstand jeder Zelle ansprechen, um die Zellen einzeln zu zählen und zu messen und fortschreitend die Zellparameter einer Probe von Zellen in einer isotonischen Lösung aufzuzeichnen. Der Coulter-Zähler arbeitet auf dem bekannten Prinzip der Teilchenzählung und -messung unter Verwendung einer als Fühler dienenden öffnung, welches in dem US-Patent 2.656.508 und dem eine Weiterbildung darstellenden Patent 3.259.8^2 beschrieben ist.. Eine Ausführungsforra einer Meßeinrichtung für das mittlere Zellvolumen unter Benutzung eines Coulter-Zählers ist in dem US-Patent 3«V73«O1O beschrieben. Das Ansprechen des elektrischen Sensors bei einem Coulter-Zähler wird beeinflußt zumindest von der Form, der Deformierbarkeit und der Durchflußrate der mikroskopischen'Teilchen, welche in dem Augenblick geraessen werden, in welchem sie durch eine als Sensor dienende öffnung hindurchgehen. Weil jedoch die meisten Zellen einer gewissen Deformation unterworfen werden, wenn sie diese als Sensor dienende öffnung durchlaufen, weicht der elektrische Widerstand und das aufgezeichnete Volumen von ihrem tatsächlichen Volumen in einem gewissen Umfang ab.. Um zwischen dem tatsächlichen Volumen und dem gemessenen Volumen zu unterscheiden, wird der Begriff "scheinbares Volumen" nachfolgend benutzt, womit das gemessene Volumen gemeint ist.

Das Vei'fahren zur Untersuchung von Zellen ist gemäß der

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Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß

a) eine hypotonische Mischung mit mindestens einem Anteil von einer Zellprobe und mit einer ersten, eine spezifische Osmolalität aufweisenden Lösung gebildet wird, wobei die Zellen dieser Probe jeweils einen originalen Zustand der Parameterwerte aufweisen,

b) daß die Zellen in der Mischung für mindestens eine kurze bekannte Zeitdauer gehalten werden, während der die Zellen eine Änderung mindestens eines Parameterwertes gegenüber dem Wert der originalen Parameterwerte erfahren, wobei der Wert dieser Änderung von der Osmolalität der Mischung und der angeborenen und erreichten Eigenschaften jeder Zelle abhängt,

c) daß diese erreichte Änderung der Zellpararaeter gemessen wird und

d) daß die erreichte Änderung der Zellparameter dazu dient, Daten zu definieren, welche mit Daten von Parameteränderungen von Zellen vergleichbar sind, welche für einen bekannten Gesundheitszustand oder eine physiologische Kondition repräsentativ sind.

Dadurch daß die Zellen mit Lösungen zusammengebracht werden, die mehrere unterschiedliche hypotonische Konzentrationen aufweisen, ändern sich die Parameter des elektrischen Widerstandes der Zellen, wobei der Widerstand bis zu einem Spitzenwert ansteigt und dann abfällt, wenn die Osraolalität abnimmt. Wenn der Widerstand dazu benutzt wird, das scheinbare Volumen zu definieren und dann das mittlere Zellvolumen aufzuzeichnen, dann liefern diese Parameter Daten,die korrelierbar sind. Weil die verschiedenen hypotonischen Lösungen Änderungen des Zellvoluraens bewirken, werden sich auch einige Daten ergeben, die das tatsächliche Volumen anzeigen. Ein Ausdruck oder eine Aufzeichnung der bewirkten Änderungen der Zellparameter, und zwar in Abhängigkeit von der hypotonischen Konzentration liefert Daten- und Kurvenscharen, welche charakteristisch sind für die Natur der Zellen und

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von denen Rückschlüsse gezogen werden über die Gesundheit oder die .physiologische Kondition des Zellspenders. Das Kurvenmaximum und die Verteilung rund um dieses, die jeweilige Amplitude,, die Lage und die Form der Spitze der Kurve sowie der seitliche Abfall und die Steigung der Kurventeile liefern Anhaltspunkte,ausgehend von denen eine medizinische Diagnose durchgeführt wird.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Gerät zur Untersuchung von Zellen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß Mischungsmittel für die Aufnahme mindestens eines Anteils einer Ziellprobe und einer ersten Lösung vorgesehen sind, die eine spezifische Osmolalität. für die Bildung einer hypotonischen Mischung aufweist, daß die Zellen jederProbe jeweils einen originalen Parameterwert aufweisen, daß Zeitmittel an die Mischungsmittel angeschlossen sind, welche die Zellen der Probe für mindestens eine kurze Zeitdauer in der Mischung halten, während der die Zellen eine Änderung mindestens eines Paramterwertes gegenüber ihrem originalen Parameterwert erfahren, wobei die Größe dieser Änderung von der Osmolalität der Mischung und den angeborenen und erreichten Eigenschaften jeder Zelle abhängt, daß eine Meßeinrichtung an die Mischungsmittel für die Bestimmung der erreichten Änderung der Zellparameterwerte angekoppelt ist, und daß Mittel für die Bestimmung der erreichten Änderung der Zellparameterwerte vorgesehen sind, wobei die so erhaltenen Daten mit Daten von Änderungen von Zellparametern vergleichbar sind, die -für einen bekannten Gesundheitszustand oder eine physiologische Kondition repräsentativ sind.

Ein Gerät, welches eine Folge von hypotonischen Konzentrationen liefert und die Zellparameter in Abhängigkeit von den hypotonischen Konzentrationen mißt und auch korreliert, automatisiert das vorstehend beschriebene Untersuchungsverfahren und stellt eine Aus führung s form der Erfindung dar. Eine bevorzugte Realisierung eines solchen Gerätes enthält

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einen Coulter-Zähler als Instrument zur Messung der Zellen, welcher auf den elektrischen Widerstand jeder Zelle anspricht. Obwohl die vorliegende Erfindung mindestens eine hypotonische Lösung verwendet, um die zu messenden ZeIl-Pararaeter-Werte zu beeinflussen, wird nicht mit Hämolyse gearbeitet, und es werden auch keine die Zerstörbarkeit durch Osmose wiedergebenden Kurven erzeugt. Die durch die Erfindung getroffene neue Unterscheidung darf nicht verwechselt werden mit Kurven zur Feststellung der osmotischen Zerstörbarkeit und auch nicht mit den typischen Meßeinrichtungen zur Bestimmung des mittleren Zellvolumens, welche normalerweise im Zusammenhang mit einer isotonischen Umgebung arbeiten.

Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen wiedergegeben.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen

Fig. 1 eine Aufzeichnung von Kurvenscharen von roten Blutzellen, wobei der elektrische Widerstand gegen die Osmolalität für drei verschiedene physiologische Zustände aufgezeichnet ist,

Fig. 2 eine Ausführungsform eines Gerätes für die Gewinnung der Kurven nach Fig. 1 und

Fig. 3 eine andere Ausführungsform eines Gerätes für die Erzeugung! der Kurven nach Fig. 1.

Die nachfolgend beschriebenen Verfahren zur Untersuchung von Zellparametern können sowohl manuell als auch halb- oder vollautomatisch durchgeführt werden. Die Untersuchung beruht dabei auf der Tatsache, daß Zellen, beispielsweise rote Blutzellen, als Osmometer arbeiten und schnell ihr Volumen und ihren elektrischen Widerstand in einer hypotonischen Lösung ändern und dabei ein neues Zellvolumen und einen neuen Widerstand erhalten, welcher ausreichend lange stabil ist, um eine Messung der Zellparameter durchzufahren. Das Maß der Zelländerung hängt in erster Linie von der Osmolalität

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der hypotonischen Lösung ab sowie von den Eigenschaften

der
der Zellmembran und/genmäßigen Herkunft des Zellinhalts.

Ausführliche Untersuchungen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung haben bestätigt, daß Blutproben von einem normalen Individuum und einem erkrankten Patienten, reproduzierbare Daten liefern, von denen Tabellen und Kurven erhalten können, wobei ein Beispiel in Fig. 1 dargestellt ist.

Eine Zelle, beispielsweise eine rote Blutzelle, eine weiße Blutzelle oder ein Blutplättchen, welche .sich in einem hypotonischen Elektrolyten befindet, vergrößert sich in seinem gemessenen Widerstand, erreicht einen Spitzenwert des gemessenen Widerstandes und kehrt schnell wieder zu seinem ursprünglichen Widerstand zurück. Gleichzeitig unterliegt die Zelle korrelierten, jedoch nicht identischen. Änderungen im Zellvolumgen zumindest in Lösungen zwischen und lifO mOsm/kg. Nach Erreichen des Spitzenwertes verringert eine Zelle ihr Volumen schneller als sich ihr Widerstand verkleinert. Dies ist zumindest ein Grund für den Unterschied zwischen dem tatsächlichen Volumen und dem "scheinbaren Volumen", welches vorstehend bereits erwähnt worden ist. Diese osmotisch induzierten dynamischen Änderungen in den Parametern der Zellen können reproduziert werden durch die Messung des Wechsels, welcher durch eine Serie von speziellen Osmolalitäten bewirkt wird, worauf diese in einer graphischen Darstellung zusammengeführt werden. Diese graphische Darstellung gibt die dynamischen Änderungen in der gleichen Weise wieder, wie ein Film eine Bewegung simuliert. Die Verteilung der dynamischen Änderungen hat eine charakteristische Ausdehnung, Form und Position bei einem normalen gesunden Individuum und weist charakteristische Unterschiede und Abnorraalitäten in Abhängigkeit von dem jeweiligen Krankheitszustand auf, wobei zwei entsprechende Beispiele in Fig. 1 dargestellt sind.

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Fig. 1 zeigt Kurven 10, 12 und Ii+, die jeweils repräsentativ sind für drei Gruppen von Lebewesen, die ein normales Blut) ein solches mit geringer Beta-Thalassämie ("beta thalassaemia minor") sowie eine ererbte Spherocytose ("hereditary spherocytosis") aufweisen. Die Art und Weise, in der das Blut gesammelt und behandelt wird, um für die verschiedenen Proben die zugehörigen Kurven zu erhalten, wird später beschrieben. Es ist jedoch wichtig zu erkennen, daß diese Kurven und die Ordinaten- und Abszissenwerte, welche in entsprechenden Karten erfaßbar sind, eine neue und eindeutige Unterscheidungsmöglichkeit für· die verschiedenen Gesundheitsbedingungen darstellen. Wie aus Fig. 1 ersichtlich ist, wird auf der Abszisse in Milliosmolen per Kilogramm (mOsm/kg) die οsmotische Stärke der Salzlösung oder Verdünnung aufgetragen, in der die Zellen gelöst sind. Eine solche Lösung ist unter dem Warenzeichen Iso.ton II bekannt, welches die isotonische Verdünnung darstellt, die in typischer Weise bei dem Coulter-Zähler bei der Teilchenzählung und Größenerfassung benutzt wird, der bei der Entwicklung des vorliegenden Untersuchungsverfahrens benutzt.worden ist, und der auch das Meßgerät darstellen kann, welches in den Fig. 2 und 3 gezeigt ist. Andere Lösungen, welche in der Lage sind, die Osmolalität zu verändern, können ebenfalls bei dem Gerät oder bei einer manuellen Durchführung des vorliegenden Untersuchungsverfahrens benutzt werden. Eine physiologische Salzlösung hat eine Osmolalität von etwa 285 mOsra/kg und ist isotonisch. Die Ordinate von Fig. 1 zeigt den Prozentsatz in der Änderung des elektrischen Widerstandes roter Blutzellen, wobei der Wert null Prozent am Anfang liegt. Weil der Ausgabewert eines Coulter-Zählers auf der Basis des Widerstandes der Zellprobe beruht, kann die Ordinate in in Prozenten des Wechsels des mittleren Zellvolumens gegeben werden..

Eine kurze Betrachtung von Fig. 1 zeigt, daß die drei Kurven 10, 12 und \k in verschiedener signifikanter Weise vonein-

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ander verschieden sind. Die Kurve 10, welche typisch ist für eine normale Person, hat eine Spitze 16, die deutlich ausgeprägt ist bei etwa 95 °/o Zunahme in der Ordinate; sie liegt nahe bei 1^0 mOsm und ist relativ symmetrisch in Bezug auf ihre Anstiegs- und Abfallflanke und ist somit wenig verformt. Die Kurve 12, welche einen Fall von Beta-Thalassämie minor wiedergibt, zeigt ein stark abgerundetes Maximum 18 von 103 °/o Zunahme bei der Ordinate, und zwar bei dem V/ert nahe 125 mösm, wobei sie etwas nach rechts verschoben ist. Die ererbte Spherocytose, welche der Kurve 1*t entspricht, hat einen wesentlich niedrigeren Spitzenwert 20 von etwa 53 °/o auf der Ordinate und liegt nahe bei 165 mOsm. Die Seiten der Kurve 1^· sind divergenter als diejenigen der Kurve 10 und 12. Obwohl ein kompletter Satz von Daten aufeinanderfolgender Punkte entweder ausgedruckt als Kurve oder in einer numerischen Tabelle die meiste Information liefert, können auch schon einige wenige Datenpunkte ausreichend sein, um eine grobe medizinische überprüfung und gewisse Diagnosen durchzuführen. Da beispielsweise die normale Kurve eine relativ ausgeprägte Spitze bei 1^0 mOsm/kg aufweist, kann bereits eine sehr einfache überwachungseinrichtung herangezogen werden, die rur sehr wenige Messungen nahe dieses Spitzenwertes der Osmolalität liefert. Sogar eine Korrelation von Ordinate und Abszisse für einen bestimmten Punkt könnte für eine Klassifizierung bereits ausreichend sein. Die Entwicklung von die Zellparameteränderungen wiedergebenden Kurven durch die vorstehende Methode liefert für andere Gesundheitsbedingungen signifikante, schmale Meßbereiche, die für Überwachungszwecke besonders nützlich sind.

Es ist daraufhinzuweisen, daß unterschiedliche Meßinstrumente, Meßtechniken, Verdünnungen usw. gewisse Verschiebungen der Kurven und Daten, wie sie in Fig. 1 für eine spezielle Ausführungsform dargestellt sind, mit sich bringen können. Derartige Verschiebungen sind jedoch im wesentlichen für alle erhaltenen Daten und Kurven gleich, die von den jewei-

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ligen Meßgeräten erhalten werden und somit bleiben die gewonnenen Kurven nach wie vor entsprechend unterscheidbar. Beispielsweise "sieht" ein optisches Instrument für die Messung des mittleren Zellvolumens die Voluaienänderung der Zellen anders als das "scheinbare Volumen", welches bei einer elektronischen Messung des Widerstandes mittels des Coulter-Zählers bestimmt wird. Demnach wären die Amplitudenwerte für mit einer optischen Einrichtung erhaltene Kurven geringer im Vergleich zu denen, die mit einem Coulter-Zähler bestimmt werden. Außerdem haben Experimente gezeigt, daß bei unterschiedlichen Gesundheitsbedingungen die Zellen eine . unterschiedliche Tendenz und Fähigkeit zur Deformation zeigen, wenn sie durch den Sensor eines Coulter-Zählers hindurchtreten. Eine derartige Charakteristik von Zellen bezüglich ihrer Deformierbarkeit oder ihres Schwellverhaltens wird als ein Unterscheidungsparameter angesehen, welcher bei der Verwendung eines Coulter-Zählers für das Untersuchungsverfahren gewönnen werden kann.

Eine andere Variable bei der Untersuchung ist der pH-Wert. Es wurde gefunden, daß ein optimaler pH-Wert bei Benutzung eines Coulter-Zählers bei 7,k pH liegt. Ein Wechsel im pH-Wert vom Optimum weg verursacht Veränderungen im Bereich der größten Amplitudenwerte und Verschiebungen der Lage des Maximums in Abhängigkeit von der Osmolalität. Wenn die Verdünnung eine Salzlösung oder ein anderes Material ist und entsprechend gepuffert wird, wie es allgemein bekannt ist, dann ändert sich sogar bei einer Verdünnung von 35nOsm/kg der ph-Wert nicht wesentlich. Die unter dem Warenzeichen Isoton II bekannte Flüssigkeit ist ausreichend gepuffert.

Es wurde festgestellt, .daß es einige Bedingungen gibt, z.B. variierendes Hämoglobin, welche besser für die Identifizierung bei pH-Werten abweichend von 7,4 geeignet sind. Somit ist die.Überwachung des pH-V/ertes ebenfalls ein Parameter,

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welcher das vorliegende,Testverfahren verbessert.

Die Temperatur und die Frische der Probe, beispielsweise einer Blutprobe, kann gewisse Unterschiede in den erhaltenen Daten bedingen. Für Blut ist die normale Labortemperatur in der Nähe von 22⁰C passend. Es hat sich herausgestellt, daß Blut, welches am Tag der Entnahme untersucht worden ist, ebenso geeignet ist, wie Blut, das bei 1+⁰C bis zur Durchführung der Untersuchung aufbewahrt worden ist. Es haben jedoch auch andere Blutproben brauchbare Untersuchungswerte geliefert. Sowohl venöses als auch kapillares Blut mit oder ohne Antikoagulans (beispielswese mit Dinatrium- oder Trikalium-EDTA oder auch Natrium-Heparin) können in dem vorliegenden Testverfahren benutzt v/erden. Weiterhin ist Blut von der Nabelschnur ohne Antikoagulans verwendbar, was für den Einsatz bei der pränatalen Diagnose von Bedeutung ist.

Die Bereitung der Proben von Hand bei dem vorliegenden Testverfahren kann dadurch erfolgen, daß die Probe mit verschiedenen Konzentrationen einer Verdünnung, beispielsweise einer gepufferten isotonischen Salzlösung, Isoton II oder dergleichen zusammengebracht wird. Die Konzentrationsverhältnisse ihrer äquivalenten Osmolalitäten ergeben die in Fig. 1 gezeigte Abszisse. Die Parame.t eränderungen der Zellen erfolgen praktisch sofort und dann ist die jeweilige Lösung fertig für die Messung. Verschiedene "Schübe" von Zellproben, jede von ihnen in einer Lösung unterschiedlicher Osmolalität und dadurch mit unterschiedlichem elektrischen Widerstand entsprechend der jeweiligen Zellcharakteristik, können von Hand in das Meßgerät eingegeben und getrennt aufeinanderfolgend verarbeitet werden. Es ergibt sich so eine Datenfolge, die als elektrischer Widerstand gegenüber der Osmolalität oder Verdünnungskonzentration entsprechend Fig. 1 aufgetragen wird. Dann kann die erhaltene Datenfolge und/oder Kurve mit einer vorher erstellten Familie von Kurven und/oder Daten

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verglichen werden, von denen jede einen anderen Gesundheitszustand oder eine physiologische Kondition wiedergibt. Solche Vergleiche können bei der Untersuchung und bei diagnostischen Feststellungen eingesetzt werden.

Fig. 2 zeigt ein halbautomatisch arbeitendes Gerät für die Durchführung des vorliegenden Untersuchungsverfahrens. Bei den zu untersuchenden Zellen handelt es sich um rote Blutzellen, was aber nur ein Ausführungsbeispiel darstellt und keine Einschränkung der Erfindung bedeuten soll. Eine Blutprobe, welche sich in einer isotonischen Lösung befinden kann - gegebenenfalls mit Antikoagulans falls erforderlich ist in einem Behälter 22 vorhanden. Eine Anzahl von Verdünnungen in verschiedenen Konzentrationen (Verdünnung 1, Verdünnung 2, Verdünnung 3 ...bis Verdünnung ri) sind in getrennten Behältern Zk, 26, 28 und 30 untergebracht. Die Anzahl der verschiedenen Konzentrationen an Verdünnung ergibt die Anzahl von bei der Untersuchung erhältlichen Meßpunkten. Jeder Verdünnungsbehälter ist an ein selektives Ventil 32 angeschlossen, wobei.zu irgendeiner gegebenen Zeit irgendeine beliebige Verdünnungskonzentration ausgewählt werden kann. Die Mittel, welche notwendig sind, die Verdünnung zu dem Ventil zu bewegen, und um das Ventil entsprechend zu steuern-, sind konventioneller Art und werden hier nicht näher beschrieben. Die Ausgangsleitungen J>k und 36 von dem Behälter für die Blutprobe und dem Auswahlventil sind jeweils in eine Mischverbindung 38 geführt, bei der die hypotonische Verdünnung und die roten Blutzellen gemischt und an eine Meßeinrichtung

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weitergegeben werden, die als Widerstands-Meßeinrichtung/aufgebaut ist. Anstelle einer Widerstands-Meßeinrichtung können auch andere Formen verwendet werden, die es gestatten, die Zellparameter zu erfassen, beispielsweise eine Einrichtung zur Messung des Zellvolumens. Wie bereits erwähnt, könnte eine MCV-Meßeinrichtung durch einen der verschiedenen Coulter-Zähler gebildet werden, welche das mittlere Zellvolumen bestimmt und auch die gemessenen MCV-Werte für einen Schub

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oder eine Probe von Blutzellen bestimmt. Die Ausgabe kann mittels einer Aufzeichnungseinrichtung 1+2. durchgeführt werden oder auch mittels eines Kurvenschreibers, der entsprechend angeschlossen wird, um so Ausgangsdaten von der Meßeinrichtung auf der Leitung 1+1+ zusammen mit der Information über die Verdünnung zu verarbeiten, welche von der Stellung des Auswahlventils 32 über die Leitung 1+6 übertragen wird. Auf diese V/eise wird die änderung im Zellparameter abhängig von jeder Verdünnung erhalten und aufgezeichnet und entsprechend automatisch ausgedruckt. Die Auswahl der Positionsveränderung bei dem Auswahlventil 32 kann von Hand oder automatisch,beispielsweise durch einen Motor,im Hahmen bekannter Steuereinrichtungen erfolgen.

Wegen der großen Anzahl von roten Blutzellen sogar in einer kleinen Probe kann ein Teil z.3. 0,02 ml von Blut durch ein ml einer hypotonischen Lösung verdünnt und der Meßeinrichtung zugeführt werden. Die Art der Zuführung der verdünnten Probe sollte so sein, daß eine bestimmbare kurze Zeit vergangen ist, beispielsweise vier Sekunden, bevor die Mischung die Meßeinrichtung 1+0 erreicht, wodurch die Blutzellen lange genug in der Mischung vorhanden waren, um eine gewünschte Änderung der Parameter,z.B. im Volumen oder im Widerstand, aufzuweisen. Die Länge der Leitung 1+8, welche die Mischverbindung 38 an den Eingang des Meßgerätes führt, kann mit dazu herangezogen werden, die so vergangene Zeit zu bestimmen und eine wiederholbare Verzögerungszeitkonstante einzuführen, und zwar gültig für jede Probe und für jeden Schub. Jeder getrennte Probenschub kann in einigen wenigen Sekunden verarbeitet und angezeigt v/erden. Fünf bis zehn Sekunden haben sich als ausreichend erwiesen, um die akkumulierten Daten über die Zellenänderung festzustellen.

Anstelle eines vorbereiteten kompletten Satzes von Verdünnungen von bekannter Osmolalität/Oder von bekannten Konzentrationsunterschieden, wie es in Fig. 2 dargestellt ist, kann

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eine Vereinfachung und eine weitere Automatisierung auch dadurch erfolgen, daß nur zwei Verdünnungen vorgesehen sind, beispielsweise eine Verdünnung I und eine Verdünnung II, was in Fig. 3 näher dargestellt ist. Eine solche Verdünnung, beispielsweise die Verdünnung I, kann isotonisch und in dem Behälter 50 enthalten sein. Ein Behälter 52 kann die Verdünnung II enthalten, welche aus destilliertem Wasser besteht. Eine proportionale Mischeinrichtung, beispielsweise ein Mischventil 54 bekannten Aufbaus,kann die beiden Verdünnungen zugeführt bekommen und mißt jeweils proportionale Anteile desselben aus, um so zur gleichen Zeit verschiedene mögliche Konzentrationen zu erzeugen. Derartige Verdünnungen werden in diskreter Form auf den Ausgang der Leitung J>G zu der Mischverbindung 38 geführt. Anschließend werden die schubweise neue Parameter aufweisenden Werte dex Blutzellen an die Meßeinrichtung. /+0 über die Leitung 48 gegeben. Die Arbeitsweise der Meßeinrichtung 40' , der Anzeige- und Aufzeichnungseinrichtung 42 und der Daten- und Informationsleitungen 44 und 46 können die gleichen sein, wie im Zusammenhang mit Fig. 2 beschrieben. Das Proportional-Mischventil 54 kann so gesteuert werden, daß es viele verschiedene Konzentrationen über den vollen Bereich von Osmolalitäten liefert oder auch nur einige innerhalb eines engen Bereiches, beispielsweise solche, die nahe der Spitze 16 der normalen Kurve 10 in Fig. 1 liegen.

Eine andere Betriebsweise der Proportional-Mischeinrichtung 54 würde darin bestehen, eine fortlaufende stetige änderung der Konzentration der Verdünnung zu erzeugen. Dadurch wurden kontinuierlich sich ändernde Osmolalitäten und daraus resultierend eine kontinuierliche Änderung der Zellen erreicht und es könnte eine kontinuierlich verlaufende Kurve geschrieben werden, so wie sie in Fig. 1 dargestellt ist und nicht nur eine Anzahl von Einzelpunkten der Zellparameter. Wenn nur einzelne V/erte diskret ermittelt werden, dann muß von Hand oder automatisch durch eine Extrapolation der Kurven-

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punkte eine vollständige Kurve erzeugt v/erden. In Fig. 1 sind entlang der Kurve Punkte gezeichnet, um diejenigen Meßpunkte zu zeigen, von denen aus als diskrete Meßpunkte die vollständige Kurve .abgeleitet v/erden könnte.

Wie bereits erwähnt, können einige wenige Konzentrationen oder ein schmaler Bereich hiervon bereits als Information für eine Untersuchungseinrichtung ausreichend sein. '.Venn der Bereich von 120 bis 175 raOsm betrachtet wird oder sogar, beispielsweise zwei oder drei Punkte nahe bei iifOnOsm, dann ergeben sich bereits die signifikanten Unterschiede sowohl in der Amplitude als auch in der relativen Richtung der Kurvensegmente in diesem Teilbereich. Sowohl im Handbetrieb der Meßeinrichtung und des Verfahrens, als auch bei den Ausführungsformen nach Fig. 2 und 3 können kleine Bereiche und/oder ausgewählte Osmolalitäten erhalten werden und dafür dienen, solche Abschätzungen durchzuführen.

In Fig. 3 sind auch Einrichtungen 56 und 58 dargestellt, welche der Bestimmung des pH-Wertes und der Temperatur dienen und diese Werte jeweils ausgehend von der Leitung k& messen. Die so erhaltenen Meßwerte werden beispielsweise der Kontroll- und Aufzeichnungseinrichtung 2+2 zugeführt. Derartige Elemente können auch in der Ausführungsform nach Fig. 2 eingesetzt werden. Diese überwachungseinrichtungen können einen Alarm auslösen, eine Alarmbedingung ausdrucken, die Aufzeichnungseinrichtung abschalten oder sogar einen Kompensationsvorgang in der Aufzeichnungseinrichtung 1+2 und/oder der Meßeinrichtung i+0¹ einleiten.

Aus den vorhergehenden Erläuterungen geht hervor, daß die vorliegende Methode der Beeinflussung der Parameter der Zellen nicht die osmotische Zerstörbarkeit oder Hämolyse mißt und auch nicht die gleichen Informationen liefert, wie die.bekannten MCV-Meßeinrichtungen von roten Blutkörperchen in nur einer isotonischen Lösung. Das Untersuchungsverfahren

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und das Gerät nach der vorliegenden Erfindung definiert und liefert eine neue Unterscheidungseinrichtung für Zellen in der Hämatologie, in der Zytologie, Onkologie usw.

Die vorliegende Beschreibung der Figuren ermöglicht es dem Fachmann, die Erfindung im notwendigen Maß und unter den entsprechenden Bedingungen für eine optimale Nutzung heranzuziehen und innerhalb des durch die Ansprüche definierten Bereiches zu benutzen.

Patentanwälte

Dipl.-Ing. E. Eder

Dipl.-Ing. K. Schieschke

β München 40, Elisabethstraße 34

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Claims

Patentanwälte

DFp?.- Ing. E. Eder jf

DIpI.- Ing. K. Schieschke . 3103792

München 40, Elisabethstraße 34

COULTER ELECTRONICS INC. Hialeah, U.S.A.

Verfahren und Gerät zur Untersuchung von biologischen

Zellparametern

Patentansprüche

Verfahren zur Untersuchung von Zellen, dadurch gekennzeichnet,

a) daß eine hypotonische Mischung mit mindestens einem Anteil von einer Zellprobe und mit einer ersten, eine spezifische Osmolalität aufweisenden Lösung gebildet wird, wobei die Zellen dieser Probe jeweils einen originalen Zustand der Parameter-werte aufweisen,

b) daß die Zellen in der Mischung für mindestens eine kurze bekannte Zeitdauer gehalten werden, während der die Zellen eine Änderung mindestens eines Parameterwertes gegenüber dem V/ert der originalen Parameterwerte erfahren, wobei der Wert dieser Änderung von der Osmolalität der Mischung und der angeborenen und erreichten Eigenschaften jeder Zelle abhängt,

c) daß diese erreichte Änderung der Zellparameter gemessen wird und

d) daß die erreichte Änderung der Zellprameter dazu dient, Daten zu definieren, welche mit Daten von Parameteränderungen von Zellen vergleichbar sind, welche für einen bekannten Gesundheitszustand oder eine physiologische Kondition repräsentativ sind.

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2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

daß die Schritte a, b und c des Anspruchs 1 mindestens einmal mit einer Lösung wiederholt werden, welche eine unterschiedliche Osmolalität aufweist gegenüber der der ersten Lösung, so daß jede Wiederholung eine Lösung von unterschiedlicher Osmolalität benutzt, und daß die so erhaltenen Messungen der Änderungen der Zellpararaeter dazu herangezogen werden, einen Satz von Daten zu definieren, welcher mit mindestens einem Satz von Daten von Zellveränderungen vergleichbar ist, welche für mindestens eine korrespondierende bekannte gesundheitliche oder physiologische Kondition repräsentativ sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt c auf dem Prinzip der Bestimmung des Widerstandswerts der Zellen beruht.

/+. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt c die Volumenänderung der Zellen bestimmt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt c den Wert des mittleren Zellvolumens bei jeder spezifischen Osmolalität bestimmt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt a mit einer Osmolalität erfolgt, derart, daß der erhaltene Wechsel der Zellparameter nahe bei dem Wert liegt, welcher die maximale, von der Zellprobe erreichbare Änderung darstellt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß beim Schritt c eine Korrelation der maximal erhaltenen Zellparameter-Änderungen mit der spezifischen Osmolalität der Lösung durchgeführt wird,

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welche die maximale Zellenänderung ergibt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Korrelation der erhaltenen Werte der Änderungen der Zellparameter.mit dem Zustand originalen Zellparameter durchgeführt wird, um so den Prozentsatz der Änderung in Bezug auf die originalen Werte der Zellparameter zu erhalten.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß jede der verwendeten Lösungen einen bekannten pH-Wert hat.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9» dadurch gekennzeichnet, daß aus den erhaltenen Datenwerten eine Kurve ausgedruckt wira.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennezeichnet, daß jede hypotonische Lösung durch die Kombination zweier Verdünnun^Von unterschiedlicher Tonizität gebildet wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine der Lösungen ausreichend gepuffert ist, so daß der pH-Wert dieser Lösung im wesentlichen

• über einen großen Bereich von Osmolalität unverändert bleibt.

13· Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als weiterer Schritt der Schritt a des Anspruchs 1 mindestens einmal/im wesentlichen isotonischen Lösung durchgeführt wird, um auf diese Weise die originalen Parameterwerte der Zellen festzustellen und daß dann die Schritte b und c des Anspruchs 1 durchgeführt werden, um die Änderungen der Zellparameter in Bezug auf den Zustand der originalen Parameterwerte zu erfassen.

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Ii+. Gerät für die Untersuchung von Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß Mischungsmittel (38) für die Aufnahme mindestens eines Anteils einer Zellprobe (22) und einer ersten Lösung (Zk, 52) vorgesehen sind, die eine spezifische Osmolalität für die Bildung einer hypotonischen Mischung aufweist, daß die Zellen jeder Probe jeweils einen originalen Parameterwert aufweisen, daß Zeitmittel (i+8) an die Mischungsmittel (38) angeschlossen sind, welche die Zellen der Probe für mindestens eine kurze Zeitdauer in der Mischung halten, während der die Zellen eine Änderung mindestens eines Parameterwertes gegenüber ihrem originalen Pararaeterwert erfahren, wobei die Größe dieser Änderung von der Osraolalität der Mischung und den angeborenen und erreichten Eigenschaften jeder Zelle abhängt, daß eine Meßeinrichtung (40, 40') an die Mischungsmittel für die Bestimmung der. erreichten Änderung der Zellparameterwerte angekoppelt ist, wobei die so erhaltenen Daten mit Daten von Änderungen von, Zellparametern vergleichbar sind, die für einen bekannten Gesundheitszustand oder eine physiologische Kondition repräsentativ sind.

15· Gerät nach Anspruch Ii)-, dadurch gekennzeichnet, daß Steuereinrichtungen (32; 54) an die Versorgungseinrichtungen für die Lösungsmittel (26, 28, 30; 50) angeschlossen sind, um mindestens eine andere Lösung zu bilden, welche eine von der ersten Lösung unterschiedliche Osmolalität aufweist, wobei mindestens eine weitere Änderung der Werte der Zellparameter der genannten Mischung erhalten und von der Meßeinrichtung (2+0; 40·)

• um

bestimmt v/erden kann,/einen Satz von Daten zu definieren, welcher vergleichbar ist mit mindestens einem Satz von Daten- über Änderungen der Zellparameter, welche repräsentativ sind für mindestens einen bekannten gesundheitlichen oder physiologischen Zustand.

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16. Gerät nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßeinrichtung (40; 40') nach dem Prinzip der Bestimmung des Zellwiderstandes aufgebaut und angeordnet ,ist.

17. Gerät nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßeinrichtung (40; 40') so aufgebaut und angeordnet ist, daß mit ihr die Volumenänderung der Zellen bestimmt werden kann.

18. Gerät nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßeinrichtung (40; 40') so aufgebaut und angeordnet ist, daß mit ihr das mittlere Zellvolumen der Zellen bei jeder spezifischen Osmolalität bestimmt werden kann.

19· Gerät nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Meßeinrichtung (40; 40') und die Mittel für die Bestimmung der erreichten Daten (42) so in Kombination konstruiert und angeordnet sind, daß die Messung und Korrelation der erhaltenen Änderung der Werte der Zellparameter zusammen mit der spezifischen Osmolalität der Lösung, welche diese Änderungen liefert, erfaßbar ist.

20. Gerät nach einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel (50) für die Zuführung einer im wesentlichen isotonischen Verdünnung zu den Mischungsmitteln (38) vorgesehen sind, wobei der originale V/ert der Parameter der Zellprobe durch dieses Gerät bestätigt werden kann.

21. Gerät nach einem der Ansprüche 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß Mittel für die Steuerung (32; 54) derart konstruiert und angeordnet sind, daß die Bildung der Mischung mit einer Lösung erfolgt, welche eine

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Osmolalität liefert, die bei den Änderungen der Zeilparameter nahe bei denen liegt, welche die maximale,von der Zellprobe erreichte Änderung definiert.

22. Gerät nach einem der Ansprüche 1 if bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zur Steuerung (32; 5*+)
und die Mittel für die Bestimmung der Datenwerte (if2) so konstruiert und angeordnet sind, daß eine Korrelation der erhaltenen Änderungen der Zellparameter mit den
originalen Zellparameterwerten erreichbar ist, um so den Prozentsatz der Änderung relativ zu den originalen Vierten der Zellparameter zu erfassen.

23· Gerät nach einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zur Steuerung (3k) so
konstruiert und angeordnet sind, daß jede der hypotonischen Lösungen aus der Kombination zweier Verdünnungen (50, 52) von unterschiedlicher Tonizität gebildet wird.

2/+. Gerät nach einem der Ansprüche" 15 bis 23» dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel zur Steuerung (32) so
konstruiert und angeordnet sind, daß jede der hypotonischen Lösungen (2^,26, 28, 30) aus einer diskreten Quelle erhältlich ist.

itanwlhe Ina E. Eder

Dipi.-Irta.l^techieschke

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