DE3040329A1

DE3040329A1 - Verfahren zur bestimmung des wachstums von bakterien

Info

Publication number: DE3040329A1
Application number: DE19803040329
Authority: DE
Inventors: Tadashi Ikoma Nara Eguchi; Junzo Suita Osaka Kodama; Hideto Toyonaka Osaka Kushiro; Michio Suita Osaka Tanaka
Original assignee: Kyoto Daiichi Kagaku KK
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1979-10-27
Filing date: 1980-10-25
Publication date: 1981-05-14
Also published as: JPS5663249A; IT1134056B; FR2468648A1; IT8025595A0; GB2063911A

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Wachstums von in oder auf einem flüssigen Nährmedium inokulierten Bakterien.

Zur Zeit wird bei der klinischen bakteriologischen Prüfung, wie dem Test auf Sensibilität gegenüber Arzneimitteln, der Unterscheidung zwischen inaktiven oder toten und aktiven Bakterien, der Bewertung der Wirksamkeit des Mediums durch Bioassay, der Identifizierung von Bakterien,, der Bestimmung des Volumens von Bakterien im Urin (screening) und dergleichen, neben der Genauigkeit der Bestimiuang intensiv die Vereinfachung und Schnelligkeit der Ausführung und ferner die Automation der Bestimmung verfolgt. Das Arbeiten in dieser Richtung ist dringend erforderlich, insbesondere auf dem Gebiet der Prüfung auf Sensibilität gegenüber Arzneimitteln, um ein neues Arzneimittel gegen die Bakterien, die gegen unlängst erzeugte Arzneimittel resistent sind, zu entwickeln, usw.

Allgemein gesagt kann die bakteriologische Prüfung genauestens durch mikroskopische Beobachtung der zu testenden Bakterien, die zum Wachstum in oder auf einem Nährmedium inokuliert sind, durchgeführt werden. Jedoch ist für diese Art von Technik viel Zeit, die Zeit des Bakterienwachstums, Geduld, Geschicklichkeit und Aufmerksamkeit bei der Messung erforderlich, und, was noch schlimmer ist, sie ist außerordentlich ineffektiv. Bei dieser Technik sind viele Stunden für die Bestimmung einer großen Probemenge notwendig.

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Aus diesem Gcund ist eine andere Art von Technik zum Zwecke der Automatisierung bakteriologischer Prüfungen entwickelt worden, welche zwei Methoden einschließt: die Bestimmung der Änderung das Trübungsgrades sowie die Bestimmung der Änderung der elektrischen Leitfähigkeit eines mit den Bakterien inokulierten Nährmediums. Die erste Methode wird mit Trübungsmeßmethode, die zweite mit Impedanzmethode bezeichnet. Bei der zuerst genannten Methode wird von dem Phänomen Gebrauch gemacht, daß die in oder auf ein flüssiges Nährmedium inokulierten Bakterien logarithmisch mit der Zeit wachsen und das Medium trüben, wobei der Trübungsgrad des Nährmediums mittels gebeugtem oder durchgelassenem Licht gemessen wird. Bei der zweiten, der Impedanzmethode, wird die. Änderung der elektrischen Leitfähigkeit eines flüssigen Nährmodiums bestimmt, die durch ein Stoffwechsel· produkt, das im Verlauf -des Bakterienwachstums entsteht, verursacht wird; die Leitfähigkeitsänderung wird mittels-einer Impedanzmeßbrücke ermittelt.

Die bekannten Methoden, wie die vorstehend erwähnten, haben jedoch mehrere Nachteile: bei der Trübungsmeßmethode ist es unerläßlich· das Nährmedium mittels eines Vibrators oder dergleichen zu rühren, wenn die Trübung ungleichmäßig ist, was von der Art der Bakterien abhängt. Manchmal wird es auch schwierig, die gleichmäßige Trübung des Mediums aufrechtzuerhalten und zu kontrollieren, weil eine Anzahl optischer Systeme aufgebracht

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werden muß. Ferner nimmt das Anzeigen der POp¹J ation solch anaerober Bakterien, cie eine kleine lvachstumsgeschwindigke.it haben, lange Zeit in Anspruch, was gelegentlich das Auftreten ι von Meßfehlern einschließt, weil die inaktiven oder toten Bak- ! terien gleichzeitig mit angezeigt werden. i

Bei der Impedanzmethode dagegen werden die Meßwerte durch die ; Flächen der Elektroden, den Elektrodenabstand, der Stärke und ■ Frequenz des elektrischen Stroms, der dem flüssigen Nährmedium zur Ze.xb der Messung aufgebracht wird, beeinflusst. Folglich , sind die gemessenen Werte Fehlern als einer Funktion der Menge der Proben zur Zeit der Bestimmung, der Schwingungen der·Elektroden und der Änderv.ng des elektrischen Stroms ausgesetzt. Auch die Haltbarkeit der Elektroden steht in diesem Fall in Frage.

Daneben hat man, um den Test auf Sensibilität gegenüber Arzneimitteln auf dem Gebiet der bakteriologischen Prüfung schneller zu machen, ein Verfahren zur Bestimmung des Grades des Bakteriumwachstums auf der Basis der Verwendung der Reduzierbarkeit von Hämoglobin entwickelt. Das Prinzip dieser Bestimmungsmethode beruht auf der Beurteilung wann und wie die oxidierte Form des in flüssigem Nährmedium vorliegenden Hämoglobins in die reduzierte Form übergeht, wobei sich der Farbton des flüssigen Nähr-mediums von Scharlach in Dunkelrot ändert. Da die Reduktion des Hämoglobins, d.h. dio Dissoziation der Sauerstoffmoleküle vom Hämoglobin infolge des Abfalls des Oxidations-Reduktions-Potentials seiner Lösung stattfindet, ist es denkbar, daß die Reduktion des Hämoglobins durch den Abfall des Oxidations-Reduktions-

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Potentials herbeigeführt wird.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur
Bestimmung- des Bakterienwachs turns- zu schaffen, das·,nicht durch
Farbänderung-oder Trübung eines ..Nahrmediums, Größe und Form
der Elektroden, die Anwesenheit toter Bakterien und dergleichen
beeinflusst wird. Das Verfahren soll in einer Vorrichtung durchführbar' sein, die einfach und von stabiler Konstruktion ist, und wenn gewünscht, soll es möglich sein, das Verfahren automatisch
durchüv.f uhren.

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung des
Wachstums von Bakterien, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der Grad des Bakterienwachstums als eine Änderung im Oxidations-Reduktions-Potential eines mit den Bakterien inokulierten flüssigen Nährmediums erfasst und die Potentialänderung als Potentialdifferenz zwischen einer Kohleelektrode und einer Metallelektrode gemessen wird.

Die Erfindung geht von dem eingangs geschilderten Stand der
Technik aus; sie' basiert auf der Entdeckung, daß sich das Oxidations-Reduktions-Potential in dem flüssigen Nährmedium mit dem Prozeß des Bakterienwachsturas ändert und daß es als Potentialänderung zwischen zwei festen Elektroden gemessen werden kann. Die

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Erfindung hat also ein Verfahren zur Bestimmung des Grades der. Bakterienwachstums zum Gegenstand, bei welchen in ein flüssiger» Nährmedium eine Kohleelektrode und eine Metallelektrode, die weder durch das flüssige Nährmedium beeinträchtigt wird, noch es beeinflusst, eingesetzt werden, wodurch eine Änderung im OxidationsrrReduktions-Potential des flüssigen Nährmediums im Verlauf der Bakterienvermehrung als eine Änderung im Potential zwischen den beiden Elektroden erfasst wird.

Kurze Erläuterung der beigefügten Figur: sie zeigt beispielshaft drei verschiedene Wachstumskurver» von Es.coli,die nach dem Verfahren der Erfindung erhalten wurden. In diesem Beispiel wurde als Nährmedium BHI-Boullion verwendet und als Elektroden eine Kohleelektrode an der Meßseite und eine Platinelektrode an der Bezugsseite. Die Kurven 1 bis 3 geben die folgenden Fälle wieder :

Kurve 1 einen Blindversuch; es wurden 0,2 % NaN^ zugegeben; im Fall der Kurve 2 wurde in oder auf 45 ml Nährmedium 2x10 Es. coli inokuliert; im Fall der Kurve 3 wurden in oder auf 45 ml Nährmedium 2x10 Es. coli inokuliert.

Ins einzelne gehende Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung: die Erfindung wird nun genauer beschrieben. Die Erfinder gingen von der Vermutung aus,- daß die Reduktion des Hämoglobins, das in einem flüssigen Nährmedium, in welches Bakterien inokuliert sind, enthalten ist, zum Abfall des Oxidations-

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Reduktions-Potentials im Nährmedium beitragen muß; sie kamen dann auf den Gedanken, daß der Grad des Bakterienwachsturas schnell durch ein Verfahren meß- oder bestimmbar sein sollte, bei welchem die Schwankung im Oxidations-ReduktionrPotential direkt gemessen wird.

Zur Bestimmung des Oxidations-Reduktions-Potentials wird zuerst eine Platinelektrode als Anzeigeelektrode mit Halbzellen, wie eine Wasserstoffelektrode, eine Kalomelelektrode, eine Silberchloridelektrode und dergleichen in der Eigenschaft als Zählerelektrode kombiniert, und danach wird das Potential regelmäßig zwischen ihnen zu messen sein. Jedoch sind die Zählerelektroden sehr kompliziert konstruiert, so äcä sie belüftet werden können und Flüssigkeitsübergänge haben. Als Folge davon ist zu befürchten, daß sie die Eigenschaften des Nährmediums beim Versuch der Kultivierung der Bakterien stören. Außerdem treten verschiedene kontroverse strukturelle und Betriebsprobleme auf, wie die Intrusion von Bakterien in Flüssigübergänge zur Zeit der Verwendung für mehrere Stunden, die Schwierigkeiten des Waschens und Sterilisierens zur Zeit der Wiederverwendung usw.

Diese Umstände in Betracht ziehend, haben die Erfinder einen Versuch gemacht, das Oxidations-Reduktions-Potential mit verschiedenen Kombinationen von festen Elektroden zu bestimmen, wie Platin (Pt) , Silber (Ag), Kohle (C) , Wolfram (W) , Titan (Ti) usw., wodurch eine Vereinfachung in der Konstruktion.zur erwarten war.

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Zur grundlegenden Untersuchung bestimmten die Erfinder die Änderungen des elektrischen Potentials von 1m Ferrichloridlösung und einem flüssigen Nährmedium (BHI-Boullion) zu der Zeit, zu der 0,1 m Ascorbinsäure zugesetzt wurden, um reduziert zu werden. Es wurden die nachstehenden Ergebnisse erhalten:

In Ferricblorid nahm die Potentialdifferenz mehr zu bei der Kombination von Pt-Ag um 35 mV, bei C-Ag um 167 mV, bei C-W um 65 mV, bei C-Ti um 120 mV, bei C-Pt um 114 mV, bei Pt-Ti um 35 mV und bei Ti-Ag um O mV im Vergleich zu dem Fall, bei dem Ascorbinsäure nicht zugesetzL worden ist. In BHI-Boullion dagegen nahm die Potentialdifferenz mehr zu bei: C-Ag um 165 mV, C-Ti um 57 mV, bei C-Pt um 216 mV und bei C-W um 124 mV.

Dann war die Stabilität jedes Elektrodenpaares zu messen. Wenn der Versuch zur Messung der Stabilität des'elektrischen Potentials jeder Elektrodenkombination mit Bezug auf die BHI-Boullion, in welche 0,2 % Natriumazid als Antiseptikum zugegeben worden waren, gemacht wurde, wurde festgestellt, daß das Potential jedes Elektrodenpaares nach Ablauf von 30 Minuten stabil war (Kurve 1 in der Figur).

Die Änderung im elektrischen Potential infolge des Bakterienwachstums wurde als eine 2-stufige Welle aufgezeichnet, die mit Beginn des Bakterienwachstums leicht ansteigt und sich nach der Stabilisierung für eine kurze Zeit abrupt ändert, eine steile

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Kurve beschreibend (d .h. die Potentialdifferenz nimmt zu) , wie in Kurve 2 und 3 zu sehen, wo die Änderungen im elektrischen Potential zum Beispiel bei C-Pt zur Zeit nach Inokulieren von Es. coli in 45 ml BHI~Boullion und Kultivieren bei 37 ⁰C wiedergegeben sind. Um genau zu sein, es geht gelegentlich nicht ohne einen Fall, wo die vorstehend genannten Wellen für eine Weile vor der abrupten Änderung fallen.

Wenn die Population der inokulierten Bakterien z.B. auf 1/10 oder 1/100 verdünnt wird, verzögert sich die Zeit des Beginns der Änderung, abhängig vom Verdünnungsverhältnis, ähnliche Kur^rsnformen wie die Kurven 2 und 3 der Figur zeigend. Jedoch besteht keine merkliche Differenz zwischen.den beiden Fällen mit Bezug auf den ' Grad der Änderung des elektrischen Potentials, das 150 mV beträgt.

Die Tatsache, daß sich die Potentialdifferenz zwischen Elektroden merklich in solcher Weise zu einem Zeitpunkt des fortgeschrittenen Stadiums des Grades des Bakterienwachstums ändert, kann so gedeutet werden, daß es dem Phänomen entspricht, daß sich das elektrische Potential plötzlich ändert, wenn, normalerweise in dem Oxidations-Reduktions-System, entweder die Substanz in der oxidierten oder die Substanz in der reduzierten Form eine sehr kleine Menge wird. Die Zahl der Bakterien zu dem Zeitpunkt, an dem sich die Potentialdifferenz merklich ändert, kann als nahezu konstant betrachtet werden, vorausgesetzt, der Bakterienstamm und die Art des Nährmediums oder der Elektroden sind im voraus spezifiziert. Demgemäß ist es möglich, wenn diese Zahl mikrosko-

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pisch ausgezählt ist, die Zeit zu finden, während der die in

oder auf dem Nährmedium inokulierten Bakterien anfangen bis zu <

der oben genannten Zahl zu wachsen (die Population der Bakterien !

αυτί Zeitpunkt, an dem sich die Potentialdifferenz merklich ändert) . « Umgekehrt, wenn die Zahl der ursprünglich vorhandenen Bakterien und die Zeit, die erforderlich ist, daß die Bakterien bis zu der !

1 oben erwähnten Zahl wachsen, in jedem möglichen Fall im voraus j gefunden sind, dann kann die Zahl der am Anfang inokulierten Bakterien leicht und schnell aus der Zeit, die für das Wachstum der j Bakterien zu der oben genannten Zahl erforderlich ist, abgelesen | werden.

Es ist auch möglich, die Bakterien auf Basis uer Form der Potentialdifferenzkurve, nämlich der Bakterienwachstumskurve, zu identifizieren und ferner nicht nur eine besondere bakteriologische Prüfung, sondern auch eine Gesamtvolumbestimmung (screening) der Bakterien zu machen, welche in Testproben, wie Urin und dergleichen vorliegen.

Andererseits ist es möglich den Test zur Bestimmung der Sensibilität von Bakterien gegenüber Arzneimitteln schnell und genau auf der Basis des Grades der Zeitverschiebung der vorgenannten Bezugszeit durchzuführen. In diesem Zusammenhang, die Wirksamkeit von Arzneimittelverabreichungen kann einfach dadurch bestimmt werden, daß man eine Testprobe in zwei Teile unterteilt, wovon der eine Teil intakt gelassen wird und dem anderen' Teil ,

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ein bestimmtes Arzneimittel zugesetzt wird. Man vergleicht die verschiedenen Zeiten, die für jeden der beiden. Teile erforderlich ist, um den Zeitpunkt zu erreichen, an dem sich die Potentialdifferenz zwischen ihnen merklich ändert. So wird es möglich, zu entscheiden, in welcher Dosis ein Arzneimittel einem Patienten zu verschreiben ist.

ICs wird nun auf die verschiedenen Elektrodenkombinationen bezug genommen, die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können. Wie aus den vorstehend beschriebenen experimentellen Ergebnissen zu ersehen, ist festgestellt worden, daß die Änderung im Potential der einen Kombination, bei der eine Kohleelektrode auf der einen Seite des Elektrodenpaares verwendet wird, größer ist als die der anderen Kombinationen, die ausschließlich Metallclektroden auf beiden Seiten des Elektrodenpaares verwenden. Folglich hat die zuerst genannte Elektrodenkombination eine bessere Meßempfindlichkeit.

Gelegentlich führt die Verwendung einer Silberelektrode zu dem Ergebnis, daß das Bakterienwachstum zurückgehalten wird. Es wurde angenommen, daß dies auf den sterilisierenden Effekt von SiI--ber.lonen, die durch Auflösen der Silberelektrode im Nährmedium entstehen, zurückzuführen ist. Dies ist der Grund, weshalb die Sinterelektrode nicht für die vorstehend beschriebene Bestimmung verwendet werden kann.

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Folglj.ch ist es zweckmäßig immer nur cine Kohleelektrode an der einen Seite des Elekt^odenpaares zu verwenden und auf der anderen Seite ein etwas stabiles Metall, das nicht durch das Nährmediun. angegriffen wird und es nicht beeinflusst; Beispiele sind Platin, Wolfram, Titan und dergleichen. Unter diesen ist Platin vom Standpunkt der Korrosionsbeständigkeit usw. am besten, aber hinsichtlich der Wirtschaftlichkeit oder Schwierigkeit der Kombination mit Nährmedium sind andere Metalle selbstverständlich auch mit Nutzen verwendbar. In diesem Zusammenhang sei erwähnt, obwohl die Kolxleelextrode, die in dem oben beschriebenen Versuch eingesetzt wurde, aus glasigem Kohlenstoff (glassy carbon) war, sind auch Grafit, pyrolytischer Kohlenstoff und andere Arten für diesen Zweck geeignet. Sie bleiben alle im Nährmedium stabil.

Die Änderung im Potential im Verlauf des Bakterienwachstums kann mit den vorstehend beschriebenen Paaren fester Elektroden mit Stetigkeit erfasst werden, wie vorstehend beschrieben. Dies trägt zu einem ausgezeichneten Effekt hinsichtlich der Vereinfachung des Tests auf Sensibilität bei, wie folgt:

Die Vorrichtung, konstruiert gemäß dem Verfahren der Erfindung, kann klein und fest gebaut sein ohne die Notwendigkeit der Vcrwerdung aller Arten von Gegenelektroden verwickelter Struktur, wie Halogenelektroden, Kalomelelektrodcn und dergleichen.

Das Verfahren kann ohne irgendeine optische Anzeige durchgeführt werden, so daß es nicht dem Einfluß von Verfärbung oder Trübung

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des Nährmittels unterworfen ist.

Für das Verfahren ist kein besonderer elektrischer Strom von außen erforderlich, wie bei der Impedanzmethode.

Das Oxidations-Reduktions-Potential zwischen der Elektrode und dem Nährmedium kann direkt entnommen werden, ohne irgendeine Zwischenschaltung, und unbeeinflusst von der Größe und Form der Elektroden.

Dieses Verfahren, das Anstieg und Abfall der Stoffwechselaktivität der Bakterien selbst erfasst, bietet die Möglichkeit schnell sogar eine Änderung des Wachstums von z.B. anaeroben Bakterien, die eine kleine Wachstumsgeschwindigkeit habe^, festzustellen und ist ferner zur Unterscheidung inaktiver Bakterien von toten geeignet sowie zur Beurteilung der Arzneimitteleffizienz mittels Bioassay.

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Claims

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1. Verfahren zur Bestimmung des Wachstums von Bakterien/ dadurch gekennzeichnet, daß der Grad des Bakterienwachstums als eine Änderung im Oxidations-Reduktions-Potential eines mit den Bak terien inokulierten flüssigen Nährmediums erfasst und die Potentialänderung als Potentialdifferenz zwischen einer Kohleelektrode und einer Metallelektrode gemessen v/ird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Metallelektrode eine Platin-, Titan- oder Wolfram-Elektrode verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß im voraus eine Beziehung zwischen der Zeit, die von Beginn

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der Bestimmung bis zu einer deutlichen Änderung des Potentials zwischen der Kohleelektrode und der MetalIeIe):^rode verstreicht, und der Bakterienpopulation in diesem Zeitpunkt aufgestellt wird.

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