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Antimikrobische
Verbindungen wie Antibiotika und Medikamente wurden als Teil der
Milchviehhaltung über
viele Jahrzehnte eingesetzt. Leider können in diesen Behandlungen
verwendete antimikrobische Verbindungen in die Milchversorgung gelangen.
Wenn sie einmal in Milch vorhanden sind, können sie schwer beseitigt werden;
ihr Vorhandensein betrifft die öffentliche
Gesundheit.
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Geschätzte 5%
bis 10% der amerikanischen Erwachsenen sind gegen Antibiotika hypersensibel.
Nach Aufnahme von lediglich 0,003 IE Penicillin G können allergische
Reaktionen auftreten. Antibiotische Rückstände können gleichfalls eine Umgebung
schaf fen, die für
resistente Bakterienstämme
vorteilhaft ist. In Milch vorhandene Antibiotika führten gleichfalls
zu Problemen in der milchverarbeitenden Industrie, wie unzureichende Milchgerinnung,
nicht ordnungsgemäßes Käsereifen
und verringerte Säure
oder Geschmackseinbußen. Über eine
50%ige Inhibierung von Käse
und Joghurt Startkulturen durch 0,2 IE/ml Penicillin wurde berichtet.
Das FDA sieht mit Antibiotika kontaminierte Milch als verfälscht an.
Daher ist der Test auf antimikrobische Verbindungen wie Antibiotika
in Milch wichtig für
die milchverarbeitende Industrie.
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Die
Empfindlichkeiten einer Reihe derzeit verwendeter Verfahren zum
Auffinden von Penicillin G in Milch sind im Sarcinia lutea Zylinderplattenverfahren
0,02 IE/ml, im Penzymetest 0,01 IE/ml, in der Bacillus stearothermophilus
Plattenuntersuchung 0,005 IE/ml, im Charmtest 0,005 IE/ml und im
Delvotest-P 0,005 IE/ml. Zum Auffinden von Rückstandsspuren (< 0,005 IE/ml) des
Penicillins G in Milch wird ein empfindlicheres und bevorzugt automatisches
Verfahren benötigt.
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Die Änderungen
der elektrischen Eigenschaften der Kulturmedien wurden zum schnellen
Abschätzen der
gesamten mesophilen und psychrotrophischen Zählungen, von Coliformen, Salmonellen,
abnormer Milch und Bakteriophagen bei der Cheddarkäse Herstellung
ausgenutzt. Die elektrische Änderung
wurde gleichfalls als ein Wachstumsindex für Milchsäurebakterien in Milch verwendet.
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Okigbo
und Richardson berichteten über
ein Impedanzverfahren, das ein Baktometer 123 Impendanzinstrument
zum Auffinden von Streptomycin oder Penicillin G in mit 5% aktiver
oder 5% inaktiver Lactic-Kultur geimpfter steriler Milch verwendet.
Okigbo, O.N. und G.H. Richardson (1985), Detection of penicillin
and streptomycin in milk by impedance microbiology, J. Food Protection,
48 979. Obwohl der Test empfindlicher (0,001 IE/ml) als die zuvor
erwähnten
Tests ist, konnten keine quantitativen Ergebnisse erhalten werden.
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Aus
der
US 4 946 777 und
der
US 4 381 343 sind
Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Antibiotika in einem
Medium bekannt.
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Gemäß
DE 30 40 329 A1 wird
die Potentialdifferenz zwischen zwei Elektroden in einem Medium
gemessen. Eine deutliche Änderung
der Potentialdifferenz entspricht einem bestimmten Grad an Wachstum
der Mikroorganismen in dem Medium. Der Zeitpunkt, zu dem diese deutliche Änderung
der Potentialdifferenz auftritt, kann zur Identifizierung der Art
der Mikroorganismen und zur Bestimmung der Wirkung von Arzneimitteln auf
die Mikroorganismen verwendet werden.
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Die
DE 26 57 150 A1 offenbart
ein Verfahren zur Bestimmung des Einflusses eines antimikrobiellen Mittels
oder Ereignisses auf wachsende Mikroorganismen. Das Verfahren basiert
auf der Messung der Potentialdifferenz zwischen zwei Elektroden,
die mit einem Medium in Kontakt stehen, welches die Mikroorganismen und
das antimikrobielle Mittel enthält.
Die Änderung
der Potentialdifferenz stellt ein Maß für den Einfluss des antimikrobiellen
Mittels auf die Mikroorganismen dar.
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Die
US 4 160 205 lehrt die Bestimmung
der resistiven Komponente der Impedanz eines Mediums. Der Wert dieser
resistiven Komponente korreliert mit der Menge an Mikroorganismen
in dem Medium.
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Die
US 4 156 180 offenbart ein
Verfahren zur Bestimmung der metabolischen Aktivität in einem
Medium. Bei dem Verfahren gemäß
US 4 156 180 wird in das
Medium ein Strom eingeprägt,
wodurch ein bestimmter Spannungsabfall über das Medium induziert wird,
der dann als Referenzwert dient. Als Antwort auf eine metabolische
Aktivität
in dem Medium verändert
sich der Spannungsabfall über
das Medium. Durch Veränderung
der Stromstärke
kann der Spannungsabfall wieder auf den Referenzwert eingestellt
werden. Das Ausmaß der
Veränderung
der Stromstärke
korreliert mit der metabolischen Aktivität in dem Medium.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen der Konzentration
von antimikrobischen Verbindungen in einer Probe mit den Schritten
Zugeben der Probe zu einem Kulturmedium, Wachsenlassen eines Mikroorganismus
in dem Kulturmedium, wobei das Wachstum des Mikroorganismus gegenüber der
Inhibierung durch die Verbindung empfindlich ist, Messen eines elektrischen
Parameters des Kulturmediums über
einen Zeitraum, Bestimmen eines ersten Zeitpunkts, bei dem eine
beschleunigte Änderung
des elektrischen Parameters auftritt, wobei die Änderung vom Wachstum des Mikroorganismus
herrührt
und Vergleichen des ersten Zeitpunkts mit mehreren anderen Zeitpunkten,
um die Konzentration der Verbindung zu bestimmen, wobei jeder der
anderen Zeitpunkte wie der erste Zeitpunkt bestimmt wird, mit dem
Unterschied, dass die Verbindung in dem Kulturmedium in einer bekannten
Konzentration vorhanden ist und weiterhin eine lineare Beziehung
zwischen den anderen Zeitpunkten und ihren entsprechenden Konzentrationen
besteht.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
des obigen Verfahrens wird der erste Zeitpunkt weiterhin mit einem
zweiten Zeitpunkt verglichen, der wie der erste Zeitpunkt bestimmt
ist, jedoch mit dem Unterschied, daß ein die antimikrobische Wirkung
der Verbindung aufhebendes Reagens dem Kulturmedium zugesetzt wird,
wodurch das Vorhandensein der Verbindung bestätigt wird. Wenn beispielsweise
die aufzufindende Verbindung ein Lactamantibiotikum (beispielsweise
Penicillin G) ist, kann β-Lactamase
zum Inaktivieren jedes im Kulturmedium vorhandenen Lactamantibioti kums
verwendet werden, bevor der zweite Zeitpunkt bestimmt wird. Ein weiterer
erfindungsgemäßer Aspekt
betrifft ein Verfahren zum Testen der Resistenz eines Mikroorganismus (beispielsweise
Bakteriums) gegenüber
einer antimikrobischen Verbindung mit den folgenden Stufen: (i) Wachsen
lassen eines zu testenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium,
das eine Verbindung in einer gegebenen Konzentration enthält; (ii)
Messen eines elektrischen Parameters des Kulturmediums, beispielsweise
Leitfähigkeit, über einen
Zeitraum; (iii) Bestimmen einer ersten Zeit, die für das Auftreten
einer beschleunigten Änderung
des elektrischen Parameters notwendig ist (Detektionszeit, oder "DT"), die vom Wachstum des
zu testenden Mikroorganismus herrührt; und (iv) Vergleichen der
ersten Zeit mit einer zweiten Zeit, die wie die erste Zeit bestimmt
ist, jedoch mit dem Unterschied, daß die Verbindung im Kulturmedium
fehlt. Der getestete Mikroorganismus wird als gegen die Verbindung
resistent definiert, wenn die erste Zeit gleich der zweiten Zeit
bei einer gegebenen Konzentration der Verbindung ist, und wird als
gegen die Verbindung nicht resistent bezeichnet, wenn die erste
Zeit größer als
die zweite Zeit ist.
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Das
Verfahren zum Auffinden einer antimikrobischen Verbindung kann zum
Auffinden von Lactamantibiotika bei einer Konzentration von lediglich
0,00016 IE/ml verwendet werden, was etwa 30 mal empfindlicher als
bei verschiedenen, derzeit verwendeten Verfahren. Zusätzlich ist
die Messung der elektrischen Parameter vollautomatisch; viele Proben
(beispielsweise 120 oder 240) können
gleichzeitig analysiert werden.
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Andere
erfindungsgemäße Vorteile
und Merkmale werden anhand der folgenden Zeichnungen und Beschreibung
der bevorzugten Ausführungsformen,
sowie aus den beigefügten
Ansprüchen
deutlich.
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1 zeigt
ein Diagramm mit Leitfähigkeitskurven,
wobei vier verschiedene Medien mit Bazillus Stearothermophilus-Sporen
verwendet wurden.
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2 zeigt
ein Diagramm mit Leitfähigkeitskurven,
wobei ein PM Indikatoragar mit drei Impfstoffkonzentrationen des
Bazillus Stearothermophilus-Sporen verwendet wurden.
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3 zeigt
ein Diagramm der Leitfähigkeitskurven
zubereiteter nicht-fetter Trockenmilchproben mit verschiedenen Penicillin
G-konzentrationen.
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4 zeigt
ein Diagramm mit einer linearen Beziehung zwischen Detektionszeit
("DT") und Penicillin G
Konzentration in nicht-fetten Trockenmilchproben.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
zum Auffinden antimikrobischer Verbindungen beruht auf der inhibierenden
Wirkung einer antimikrobischen Verbindung auf das Wachstum eines
Mikroorganismus. Die Änderung
eines elektrischen Parameters in einem Kulturmedium mit der Probe
und dem Mikroorganismus wurde kontinuierlich durch einen mikrobiologischen
Analysator angezeigt, wobei die Detektionszeit (d.h. den Wendepunkt
der Kurve, die durch Auftragen des elektrischen Parameters als Funktion
der Zeit gewonnen wird) verzögert
wird, wenn eine antimikrobische Verbindung in der Probe vorhanden
ist. Die DT kann entweder automatisch durch Software oder von Hand
aus einer elektrischer-Parameter/Zeit-Kurve bestimmt werden. Allgemein
gilt, je höher
die Konzentration der antimikrobischen Verbindung, um so größer die
DT. Innerhalb eines bestimmten Bereichs besteht in der Tat ein linearer
Zusammenhang zwischen der DT und der Konzentration der antimikrobischen
Verbindung.
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Das
obige Verfahren ist hochempfindlich. Jedoch ist es möglich die
Empfindlichkeit dieses Verfahrens durch Verändern der Untersuchungsbedingungen
(beispielsweise Medien, Mikroorganismuskonzentrationen, Inkubationstemperaturen
oder Testmikroorganismen) zu vermindern, um eine geringere Empfindlichkeit
für die praktische
Anwendung in der milchverarbeitenden Industrie zu erhalten. Dieses
Verfahren kann gleichfalls als ein schneller Übersichtstest durch Festlegen
einer entsprechenden DT für
nega tive Proben verwendet werden; Proben mit einem höheren DT
als der voreingestellte DT werden dann als eine antimikrobische
Verbindung haltige Probe angesehen. Natürlich sollte ein Pufferbereich
beim Einstellen einer derartigen DT Schwelle berücksichtigt werden, um experimentelle
Ungenauigkeiten zuzulassen.
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Ein
weiteres erfindungsgemäßes Verfahren
kann dazu verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein Mikroorganismus
gegen eine gegebene antimikrobische Verbindung resistent ist, in
dem die beim Wachsen der Mikroorganismen erhaltenen DTs mit und
ohne der antimikrobischen Verbindung entsprechend verglichen werden.
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In
folgendem Beispiel wird eine Leitfähigkeitsmessung zum Auffinden
von Penicillin G in Milch mit einem Malthus 2000 mikrobiologischen
Analysator (Malthus Instruments Limited, Crawley, England) mit B.
Stearothermophilus als Testorganismus durchgeführt. Jedoch ist die Messung
der Impedanz oder Kapazitanz anstelle der Leitfähigkeit gleichfalls möglich. Beispielsweise
kann ein Baktometer von Vitek Systems, Hazelwood, MS, U.S.A. zum
Messen der Leitfähigkeit,
Kapazität
und Impedanz verwendet werden. In gleicher Weise kann das im folgenden
Beispiel als Testmikroorganismus verwendete B. Stearothermophilus
durch bestimmte andere Mikroorganismen ersetzt werden. Beispielsweise
ist von Sarcinia Lutea bekannt, gegen Antibiotika der Lactamfamilie
(beispielsweise Cephaprin, Cloxicillin und Penicillin) empfindlich
zu sein, und kann daher gleichfalls zum Auffinden von Penicillin
G oder dessen Analoga verwendet werden. Die erfindungsgemäße Untersuchungsanordnung
ist zum Auffinden aller Arten antimikrobischer Verbindungen geeignet,
solange geeignete Testmikroorganismen und Testbedingungen gewählt werden.
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In
diesem Zusammenhang sollte darauf hingewiesen werden, daß, da B.
Stearothermophilus gleichfalls gegen andere antimikrobische Verbindungsfamilien,
wie der Tetracyclin- (beispielsweise Tetracyclin, Chlortetracyclin
und Oxytetracyclin), der Erythromycin- (beispielsweise Erythromycin,
Lincomycin und Clindamycin), der Aminoglycosid- (beispielsweise
Streptomycin), der Novobiocin- (beispielsweise Novobiocin), der Chloramphenicol- (beispielsweise
Chloramphenicol) und der Sulfonamidfamilie (beispielsweise Sulfamethazin,
Sulfamethoxazol und Sulfisoxazol) empfindlich ist [siehe Charm,
S.E. und Chi, R., 1988, Microbial receptor assay for rapid detection
and identification of seven families of antimicrobial drugs in milk:
Zusammenarbeitsstudie, J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71: 304] sensitiv
ist, die erfindungsgemäße Untersuchung
gleichfalls zum Auffinden dieser Verbindungen in Proben unter Einsatz
von B. Stearothermophilus als Testmikroorganismus verwendet werden
kann.
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Die
Erfindung wird anhand des folgenden Beispiels näher erläutert.
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Materialien
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Trypticase
Sojaagar und Trypticase Sojabrühe
wurden von BBL (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) bezogen. SPYE-Brühe (Katalog
Nr. 490-001) war ein Produkt von Malthus Instruments (Crawley, England).
Bacillus Stearothermophilus ATCC 10149 Sporensuspension (Katalog
Nr. 1801-60-6), Bacto-PM Positivkontrollmedium (fettarme Trockenmilch
mit 0,12 IE Kaliumpenicillin; Katalog Nr. 1802-33-9), Bacto-PM Negativ-Kontrollmedium
(inhibitorfreie nicht-fette Trockenmilch; Katalog Nr. 1803-63-1),
Bacto-PM Indikatoragar (Katalog Nr. 1800-15-3) und Penicillin G
wurden von Difco Laboratories (Detroit, MI) bezogen. β-Lactamase
(EC 3.5.-2.6; Katalog
Nr. P-0389) war ein Produkt von Sigma (St. Louis, MO).
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Optimierung der Bedingungen
der Leitfähigkeitsmessung
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Ein
erfolgreiches Leitfähigkeitsmeßverfahren
hängt von
der Qualität
der Kurven ab, die durch die spezifische Proben und Medienkombinationen
beeinflußt
werden. Eine Leitfähigkeitskurve
guter Qualität
sollte eine stabile Grundlinie aufweisen, gefolgt von einer stark
zunehmenden Steigung und einem hohen Peak-Wert. Siehe Firstenberg-Eden,
R., und G. Eden (1984) Impedance Microbiology, John Wiley & Sons Inc., New
York, NY. Da einige Metabolitendprodukte ein stärkeres Leitfähigkeitssignal
ergeben, ist die Wahl eines geeigneten Mediums entscheidend.
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In
diesem Beispiel werden die in Microsiemens (μS) gemessenen Leitfähigkeitsänderungen
automatisch aufgezeichnet und graphisch durch ein Software Paket
von einem Malthus 2000 Microbiological Analyzer (Malthus Instruments
Limited, Crawley, England) dargestellt. Um eine Leitfähigkeitskurve
guter Qualität
zu erhalten, (d.h. eine Kurve mit einer stabilen Grundlinie, einer
scharfen Steigung und einem hohen Leitfähigkeitswert) wurden vier verschiedene
Medien (Trypticase Sojabrühe,
Trypticase Sojaagar, SPYE-Brühe
und Bacto-PM Indikatoragar) für
die Impfung von B. Stearothermophilus Sporen verwendet. Die Medien
wurden bei 121°C über 15 min.
im Autoklaven behandelt und mit Sporen versetzt, um eine Konzentration
von 1% (1 ml der Grundsporensuspension wurde zu 100 ml sterilem
Medium gegeben, Endkonzentration etwa 106 Sporen/ml)
zu ergeben. Die Sporen enthaltenden Medien wurden anschließend in
Mengen von 2 ml in Leitfähigkeitszellen
mit 5 ml Fassungsvermögen
aufgeteilt und danach bei 55°C
in einem Wasserbad des Malthus 2000 Microbiological Analyzer inkubiert.
Die Leitfähigkeitswerte
jeder Zelle wurde alle 6 min. über
24 Stunden genommen. Die Ergebnisse wurden numerisch als Leitfähigkeitsdaten
oder graphisch als Leitfähigkeitszunahmekurven
erhalten. Die Detektionszeit ("DT") wurde für jede Zelle
automatisch durch die Instrumentsoftware bestimmt, sobald die Leitfähigkeitswerte
um 1 μS
oder mehr in drei aufeinanderfolgenden Messungen anstiegen. Die
Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
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Vier
Leitfähigkeitsänderungskurven
in 1 (A, B, C und D) wurden beim Einsatz des PM Indikatoragars,
der Trypticase Sojabrühe,
des tryptic Sojaagars bzw. der SPYE-Brühe als Medien erhalten. Die
Buchstaben a, b und c bezeichnen die Detektionszeiten der Kurven
A, B und C; Kurve D besitzt keine meßbare Detektionszeit. Wie in 1 gezeigt,
entspricht PM Indikatoragar den Anforderungen einer qualitativ guten
Kurve. Zusätzlich
ist die durch den PM Indikatoragar erzeugte Leitfähigkeitsamplitude
mindestens zweimal so groß wie
die durch die anderen drei Medien erhaltenen. Daher wurde der PM
Indikatoragar als Medium für
weitere Tests gewählt.
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Obwohl
1% (etwa 106 Sporen/ml) der Sporensuspension
allgemein für
die B. Stearothermophilus Plattenuntersuchung empfohlen wird, kann
diese Konzentration für
das Leitfähigkeitsverfahren
nicht geeignet sein. Drei Impfstoffkonzentrationen wurden in den
PM Indikatoragar zur Bestimmung des Impfstoffeinflusses auf die Leitfähigkeitskurven
verwendet; die Ergebnisse sind in 2 gezeigt.
Kurven A, B, und C in 2 stehen für Leitfähigkeitsänderungen von PM Indikatoragar
mit drei Impfmittelkonzentrationen der Bazillus Stearothermophilus
Sporen: A, 1% (106 Sporen/ml); B, 0,1% (105 Sporen/ml); und C, 0,01% (104 Sporen/ml).
Die Buchstaben a, b und c sind die entsprechenden Detektionszeiten
der Kurven A, B und C. Wie in 2 dargestellt,
besaß die
Sporenkonzentration wenig Einfluß auf die Kurvenqualität, abgesehen
davon, daß die
DT umgekehrt proportional zu den verwendeten Sporenkonzentrationen
war. Die DTs betrugen 3,3; 3,9 und 4,2 Stunden für die Sporenkonzentrationen
1; 0,1 und 0,01%. Jedoch zeigten die drei Leitfähigkeitskurven den gleichen
Trend des Leitfähigkeitswechsels
und besaßen
unabhängig
von der ursprünglichen
Sporenmenge gleiche Leitfähigkeitspeakwerte.
Da Zeit ein wichtiger Faktor für
die Qualitätskontrolle
von Milch ist, wurde eine Sporenkonzentration von 1% in den folgenden
Experimenten verwendet.
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Beziehung zwischen Detektionszeit
und Penicillin G Konzentration
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Die
Experimente wurden durchgeführt,
um den Einfluß von Penicillin
G auf die Leitfähigkeitskurven und
die Empfindlichkeit dieses Leitfähigkeitsverfahrens
zu bestimmen.
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Das
positive Kontrollmedium mit 0,12 IE Penicillin G (Difco) wurde der
Reihe nach zweifach mit dem negativen Kontrollmedium (Difco) verdünnt, um
Proben mit abnehmenden Antibiotikakonzentrationen zu erhalten. Nach
Zugabe von 1 ml des jeweiligen verdünnten positiven Kontrollmediums
in die Leitfähigkeitszelle (sechs)
wurden 2 ml 50°C
PM Indikatoragar mit 1% Sporensuspension in jede Zelle gegeben,
gründlich
gemischt und bei 55°C
zum Aufzeichnen der Leitfähigkeitsänderung
inkubiert. Die Empfindlichkeit des Leitfähigkeitsversuchs wurde definiert
als die Konzentration des Penicillin G, die einen höheren DT-Wert,
als der negative Vergleich bei einem signifikanten Wert von 0,01
unter Einsatz des t-Tests besaß.
Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt.
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In 3 entsprechen
die Kurven A, B, C, D, E und F den. Proben mit 0 IE/ml, 0,00008
IE/ml, 0,00016 IE/ml, 0,00031 IE/ml, 0,00062 IE/ml, 0,00125 IE/ml,
0,0025 IE/ml und 0,005 IE/ml Penicillin G. Die Buchstaben a, b,
c, d, e und f bezeichnen entsprechend die Detektionszeit der Kurven
A, B, C, D, E und F. Es ist offensichtlich, daß die DT mit zunehmender Penicillin
G Konzentration länger
wird. Der negative Vergleich besaß eine DT von 3,1 Stunden.
Wenn die Antibiotikakonzentration stieg, war die DT länger und
die Steigung der Leitfähigkeitskurve
geringer. Wenn die Penicillin G Konzentration ≥ 0,0025 IE/ml war, (3;
Kurven G und H), war die Inhibierung des B. Stearothermophiluswachstums
so stark, daß eine
annähernd
horizontal verlaufende Kurve erhalten wurde. Unter diesen Bedingungen
konnte keine DT während
einer 24stündigen
Inkubation erhalten werden. Bei einer Penicillin G Konzentration
von 0,0012 IE/ml (3; Kurve F) war die Steigung
der Kurve so gering, daß es
schwierig war, eine korrekte DT festzulegen. Zwangsläufig können die
negativen und positiven Vergleiche einem Wandel unterliegen, da
der physiolo gische Zustand und die Konzentration der Sporensuspension
schwierig auf festen Werten zwischen Chargen und zwischen Experimenten
gehalten werden kann. Jedoch betrug der DT negativer Vergleiche
in vielen getrennten Experimenten zwischen 2,6 und 3,2 Stunden.
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Beim
Testen einer Verdünnungsreihe
positiver Proben konnten die DTs der Proben mit mehr als 0,005 IE/ml
Penicillin G nicht vollständig
auf den negativen Vergleichswert durch Behandlung mit β-Lactamase
(Endkonzentration 15 U/ml) bei 37°C über 30 min.
zurückgeführt werden.
Dieses kann an der unvollständigen
Verdauung des Penicillin G durch das Enzym unter den verwendeten
Bedingungen liegen. Vollständige
Umkehrung konnte durch ordnungsgemäße Verdünnung der Proben mit Penicillin
G Konzentrationen von > 0,005 IE/ml
erreicht werden.
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Die
Empfindlichkeit der Leitfähigkeitsuntersuchung
für Penicillin
G betrug 0,00016 IE/ml; bei dieser Konzentration betrug DT 3,38
Stunden (Mittelwert aus sechs Wiederholungen), was signifikant höher (α = 0,01) als
bei dem negativen Vergleich (DT) 3,11 Stunden) war.
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In 4 ist
eine lineare Regressionsgerade (r = 0,99), in der die DT (in Stunden;
sechs Wiederholungen) und die Konzentration (internationale Einheiten
pro ml) des Penicillin G zueinander in Verhältnis gesetzt werden: A, 0,00008
IE/ml (DT 3,18 ± 0,07
Stunden); B, 0,00015 IE/ml (DT 3,38 ± 0,18 Stunden); C, 0,00031 IE/ml
(DT 3,98 ± 0,38
Stunden) und D, 0,00062 IE/ml (DT 5,33 ± 0,44 Stunden). Der für die quantitative
Bestimmung von Penicillin G geeignete Bereich liegt zwischen 0,00016
und 0,00062 IE/ml. Folgende Gleichung für die Regressionslinie wurde
erhalten: DT = 4000 × (Penicillin
G) + 2,8. Die Genauigkeit der Leitfähigkeitstechnik (6 Wiederholungen)
war hoch; die Varianzkoeffizienten betrugen 2,2; 5,3; 9,5 und 8,3%
für die
entsprechenden Penicillin G Konzentrationen von 0,00008; 0,00016;
0,00031 und 0,00062 IE/ml. Der erhöhte Varianzkoeffi zient bei
höheren
Antibiotikakonzentrationen kann zum Teil auf die wesentlich geringeren
Steigungen der Leitfähigkeitskurven
(3, Kurven D, E und F) zurückgeführt werden. Die geringen Steigungen
erschwerten die genaue DT Bestimmung, was zu größeren Fehlern und somit zu
höheren
Varianzkoeffizienten führt.
Jedoch betrugen die Varianzkoeffizienten aller Konzentrationen im
quantitativen Bereich (0,00016 bis 0,00062 IE/ml) weniger als 10%,
was für
die Spurenanalyse akzeptabel ist. Auf jeden Fall sollten aufgrund
der hohen Empfindlichkeit und des vergleichsweise kleinen Bereichs
für die
quantitative Analyse beim Leitfähigkeitsverfahren
(4) Milchproben mit Penicillin G Konzentrationen
von > 0,00062 IE/ml
zur quantitativen Bestimmung geeignet verdünnt werden.
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Bestimmung von Penicillin
G in 12 Milchproben
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Nach
Festlegen der Leitfähigkeitsmessungsbedingungen
wurde dieses Verfahren zum Testen von 12 auf dem Markt erhältlichen
Milchprodukten eingesetzt, wobei es sich um sechs Trockenmilchpulver
und sechs Säuglingsformulierungen
handelte.
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10
g des jeweiligen Produkts wurden zu 90 ml entionisiertem Wasser
gegeben und der Reihe nach zweifach mit dem negativen Vergleichsmedium
(Difco) verdünnt.
Jede verdünnte
Probe wurde in zwei Portionen aufgeteilt, wovon eine Portion (1
ml) über
3 min. bei 82°C
erwärmt,
anschließend
unverzüglich
in einem Eisbad gekühlt
und mit 0,1 ml β-Lactamase
(165 U/ml) bei 37°C über 30 min.
behandelt wurde. Anschließend wurde
1 ml jeder Probe (positive und negative Vergleichsproben und enzymbehandelte
und unbehandelte Proben) in die Leitfähigkeitszelle gegeben; 2 ml
PM Indikatoragar mit 1% B. Stearothermophilus Spore wurde zugesetzt
und gründlich
gemischt. Die Zellen wurden bei 55°C zum Messen der Leitfähigkeitsänderung
inkubiert. Penicillin G in Milchprodukten wurde gleichfalls durch
die B. Stearothermophilus Plattenuntersuchung bestimmt. Siehe Bishop,
J. R., G. F. Senyk, und S. E. Duncan (1992), "Detection of antibiotic/drug residues
in milk and dairy products" in
Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 16. Aufl.,
R. T. Marshall, Am. Publ. Health Assoc., Washington, DC..
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Wie
in Tabelle 1 aufgeführt,
waren sechs Proben (3 Trockenmilchprodukte und drei Säuglingsformulierungen,
d.h. Milchpulver A, B und C und Säuglingsformulierungen A, D
und E) mit β-Lactamantibiotika
in einem Bereich von 0,01 bis 0,08 IE/g (Wirksamkeitsäquivalent
zu Penicilling G) kontaminiert, was durch die Behandlung mit β-Lactamase
bestätigt
wurde. Die drei anderen Proben (Milchpulver E und F und Säuglingsformulierung
F) waren mit anderen Inhibitoren als β-Lactamantibiotika kontaminiert,
da die DT nicht nach der Behandlung mit β-Lactamase zurückgeführt oder
verkürzt
werden konnten. Jedoch aufgrund der relativ geringen Empfindlichkeit
des B. Stearothermophilus Plattenversuchs (Detektionsgrenze 0,005
IE/ml; d.h. 0,05 IE/g Milchpulver) war lediglich eine Probe (Säuglingsformulierung
E) zum Erzeugen von Inhibierungszonen durch den Plattenversuch in
der Lage. Es ist offensichtlich, daß das vorliegendes Leitfähigkeitsverfahren
niedrige Penicillin G Konzentrationen in Milchprodukten erkennen
kann, die durch die derzeit verwendeten Untersuchungen nicht erkannt
würden. Tabelle
1 Auffinden
von Penicillin G in Milchpulvern und Säuglingsformulierungen
