DE102017101853B3

DE102017101853B3 - System oder Test und Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens von Bakterien insbesondere bei der bovinen Mastitis

Info

Publication number: DE102017101853B3
Application number: DE102017101853.0A
Authority: DE
Inventors: Volker Krömker; Stefanie Leimbach; Jan-Hendrik Paduch
Original assignee: Quidee GmbH
Current assignee: Quidee GmbH
Priority date: 2017-01-31
Filing date: 2017-01-31
Publication date: 2018-05-17
Anticipated expiration: 2037-02-01
Also published as: WO2018141474A1

Abstract

In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Anmeldung auf ein System oder einen Test zur Bestimmung des Vorliegens von Bakterien und gegebenenfalls zur Entscheidungshilfe zur Behandlung dieser insbesondere bei bovinen Mastitiden, dieses System oder Test umfasst dabei ein erstes Gefäß mit einem Flüssignährmedium mit einem Indikator, wie einem Redoxindikator, ein zweites Gefäß mit einem Flüssignährmedium umfassend einen Indikator, wie einen Redoxindikator, und Antibiotika, wobei diese Antibiotika im Wesentlichen auf eine Gruppe der bakteriellen Keime ausgewählt aus Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien wirkt, wobei die Gefäße derart ausgebildet sind, dass sie ein maximales Volumen von 5 ml, wie 2 ml Flüssignährmedium aufnehmen können. In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens von Bakterien und gegebenenfalls zur Entscheidungshilfe zur Behandlung dieser in einer Probe bereitgestellt. Das erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße System erlauben dabei eine Schnellanalyse des Vorliegens von Bakterien in einer zu analysierenden Probe innerhalb von 12 Stunden und ist insbesondere ein Verfahren oder ein Test zur Bestimmung des Vorhandenseins bestimmter Erregergruppen bei bovinen Mastitiden.

Description

In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Anmeldung auf ein System oder einen Test zur Bestimmung des Vorliegens von bakteriellen Keimen (Bakterien) und gegebenenfalls zur Entscheidungshilfe zur Behandlung dieser insbesondere bei bovinen Mastitiden, dieses System oder Test umfasst dabei ein erstes Gefäß mit einem Flüssignährmedium mit einem Indikator, wie einem Redoxindikator, ein zweites Gefäß mit einem Flüssignährmedium umfassend einen Indikator, wie einen Redoxindikator, und Antibiotika, wobei diese Antibiotika im Wesentlichen auf eine Gruppe der bakteriellen Keime ausgewählt aus Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien wirkt, wobei die Gefäße derart ausgebildet sind, dass sie ein maximales Volumen von 5 ml, wie 2 ml Flüssignährmedium aufnehmen können. In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens von Bakterien und gegebenenfalls zur Entscheidungshilfe zur Behandlung dieser in einer Probe bereitgestellt, wobei das erfindungsgemäße Verfahren aufgrund eines geeigneten Indikators, wie eines Redoxindikators, und dem Vorliegen von Antibiotika in einem Testgefäß von mindestens zwei Testgefäßen eine Unterscheidung von Gram-positiven und Gram-negativen bakteriellen Keimen erlaubt. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt dabei eine Schnellanalyse des Vorliegens von Bakterien in einer zu analysierenden Probe innerhalb von 12 Stunden und ist insbesondere ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins von bestimmten Erregergruppen bei bovinen Mastitiden und ein Verfahren zur Entscheidungshilfe zur Behandlung dieser bovinen Mastitiden.
Stand der Technik
Es zeigte sich, dass in Ländern mit einer systematischen Datenerfassung etwa 50% aller Milchkühe einmal im Jahr an Mastitiden erkranken und dabei antibiotisch behandelt werden. Für Deutschland ergibt dieses ein Auftreten von circa 2,15 Millionen Mastitiden pro Jahr bei circa 4,3 Millionen Milchkühen (Stand 2015).
Üblicherweise erfolgt die Therapie unmittelbar nach Erkrankungsauftritt durch Gabe von Antibiotika, um eine Verschlimmerung der Erkrankung oder gegebenenfalls den Tod des Tieres zu verhindern. Eine bakteriologische Untersuchung, die die Voraussetzung für eine differenzierte Therapie ist, kann vor Therapiebeginn bislang vielleicht eingeleitet, aber in der Regel nicht abgeschlossen werden. Ursächlich hierfür ist u.a. die Dauer von der Probenentnahme bis zum Vorliegen des Ergebnisses, da dieses je nach Labor und zugehöriger Probenlogistik zwischen zwei und sieben Tage dauern kann. Wichtig ist hierbei die Tatsache, dass tatsächlich Eutererkrankungen ohne nachweisbaren verursachenden Mikroorganismus - entsprechend circa 30% aller Fälle - oder solche mit Infektionen durch Gram-negative Mikroorganismen - circa 20% aller Fälle - von einer antibiotischen Therapie nicht profitieren können. Tatsächlich können in diesen Fällen, also bei der Hälfte aller klinischen Mastitiden, die eingesetzten Antibiotika eingespart werden. Eine solche Einsparung hat verschiedenste Vorteile: So hat die Europäische Union in ihren Leitlinien für die umsichtige Verwendung von antimikrobiellen Mitteln in der Veterinärmedizin (Commission Notice 2015/C 299/04) die Förderung der Verwendung von Schnelldiagnosetests zur Identifizierung von Keimen, die Mastitis verursachen, beschlossen, um so die Verwendung sowohl intramammär zu applizierender als auch injizierbarer antimikrobieller Mittel bei milchgebenden Kühen auf ein Mindestmaß zu beschränken. Die Auswertung amerikanischer Publikationen zeigte, dass auch außerhalb von Europa ein ausgeprägtes Interesse an Mastitis-Schnelldiagnosetests besteht.
Es gibt verschiedene Systeme auf dem deutschen Markt, die eine Bestimmung der bakteriellen Keime bei einer Mastitis erlauben. Ein Problem dieser Systeme ist allerdings, dass diese Systeme nur durch einen Tierarzt vertrieben und von diesem durchgeführt werden dürfen. Darüber hinaus sind die Kosten eines Tests hoch und der Zeitraum zum Nachweis des Vorliegens von bakteriellen Keimen beträgt mindestens 24 Stunden, so dass entsprechend bisher vorbeugend die Antibiotikatherapie gestartet wird ohne zu wissen, ob tatsächlich bakterielle Keime und, wenn ja, welche vorliegen.
Die Firma Virbac vertreibt zum Beispiel den Speed Mam Color Test, ein Schnelltest zur in vitro Diagnostik und Bakterienbestimmung sowie zur Erstellung eines Antibiogramms in der Mastitismilch der Kuh. Dabei werden Proben in Testvertiefungen eingebracht. Die Bestimmung von möglichen bakteriellen Keimen erfolgt auf Gattungsebene, zusätzlich kann ein einfaches Antibiogramm durchgeführt werden, die Inkubationszeit für den entsprechenden Test beträgt mindestens 24 Stunden bis zu einer Woche, derzeit liegt der Anwenderpreis bei circa 17 Euro pro Probe. Dieser Test kann nur über einen Tierarzt vertrieben und nur durch den Tierarzt angewendet werden.
Alternativ gibt es von der Firma Vetoquinol den Test VetoRapid auf dem Markt. Hierbei werden Agarplatten mit verschiedenen Selektivnährmedien zur Selektion von Streptokokken, Staphylokokken oder coliformen Mikroorganismen eingesetzt. Es findet eine einfache Information auf Gattungsebene zu möglichen Bakterienkeimen statt. Die Bebrütungszeit beträgt 24-72 Stunden. Es handelt sich bei diesem Test um einen unter Verwendung von Fertigagarplatten, deren Haltbarkeit gering ist (üblicherweise drei Wochen). Der Preis liegt bei circa 8 Euro pro Probe. Der Test wird über den Tierarzt vertrieben und die Durchführung ist dem Tierarzt vorbehalten.
Schließlich gibt es weitere Tests auf Basis von Petrifilmen beziehungsweise Agarplattensystemen, die eine Differenzierung zwischen Gram-positiven oder Gram-negativen Keimen erlauben. Diese Tests benötigen mindestens 24 Stunden, um eine Aussage zu erlauben.
Die Anwendung eines Schnelldiagnostiktests hat allerdings nicht nur den Vorteil, dass Antibiotikakosten gegen Diagnosekosten ausgetauscht werden, sondern auch die mit Mastitiden in Verbindung stehenden Kosten erheblich reduziert werden, da die Milch der aufgrund des Tests nicht mehr antibiotisch behandelten Tiere nach Verschwinden der klinischen Symptome schneller wieder als Lebensmittel in die Lebensmittelkette gelangen darf.
Aus der US 2 609 275 A ist ein bakterieller Milchtest unter Nutzung des Indikators Resazurin bekannt. Daran anschließende Veröffentlichungen beschreiben einfache Mastitisschnelltests unter Nutzung des Indikators Resazurin. So behauptet Kobayashi, 1978, J. Diary Sci, 1978, 61, eine Mastitisdiagnose auf Basis des Indikators Resazurin innerhalb einer Stunde bei 37°C zu erhalten.
Wang, J., et al, China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2016, 43(2) beschreibt ein Verfahren bei dem Resazurin als Indikator eingesetzt wird um selektiv E.coli nachzuweisen.
Die Nutzung von Antibiotika zur Differenzierung zwischen Gram-positiven Bakterien und Gram-negativem Bakterium ist in der Literatur bekannt, so werden die beiden Antibiotika Nalidixinsäure und Colistin zur diagnostischen Differenzierung von Gram-positiven Mikroorganismen aus einer Mischkultur beschrieben.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens und eines Systems zum Beispiel in Form eines Schnelltests zur Bestimmung des Vorliegens von Bakterien und gegebenenfalls zur Entscheidungshilfe zur Behandlung dieser Bakterien in der Veterinärmedizin, insbesondere in Bezug auf bovine Mastitiden.
Dabei soll der Test eine Schnelldiagnose erlauben, nämlich innerhalb von 12 Stunden, um als Entscheidungshilfe zur Antibiotikatherapie bei der Mastitis zu dienen. Insbesondere ist dieser Test geeignet durch den Landwirt selbst durchgeführt zu werden und bedarf nicht die Durchführung durch den Tierarzt.
In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein veterinärmedizinisches System oder einen veterinärmedizinischen Test zur Bestimmung des Vorliegens von Bakterien und gegebenenfalls zur Entscheidungshilfe zur Behandlung dieser, umfassend:

ein erstes Gefäß mit einem Flüssignährmedium umfassend einen Indikator, wie einen Redoxindikator;
ein zweites Gefäß mit einem Flüssignährmedium umfassend einen Indikator, wie einen Redoxindikator, und Antibiotika, wobei diese Antibiotika im Wesentlichen auf eine Gruppe der Bakterien ausgewählt aus Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien, wirkt, wobei die Gefäße derart ausgebildet sind, dass sie ein maximales Volumen von 5 ml, wie 2 ml Flüssignährmedium aufnehmen können.

Es zeigte sich, dass durch Auswahl des Redoxindikators und der Antibiotika die Differenzierung zwischen den Bakterien ausgewählt aus Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien möglich ist. Dieses kann mit dem Test schnell, innerhalb von 12 Stunden erfolgen, benötigt ein sehr geringes Volumen des Flüssignährmediums und erlaubt die Durchführung durch den Landwirt selbst.
Dieser Test ist insbesondere zur Diagnostik bovider Mastitiden einschließlich Rinder, Schafe und Ziegen, insbesondere boviner Mastitiden geeignet.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens von Bakterien und gegebenenfalls zur Entscheidungshilfe zur Behandlung dieser in einer Probe umfassend die Schritte

- der Entnahme der Probe aus dem zu untersuchenden Testmaterial, wie der zu untersuchenden Flüssigkeit;
- Hinzufügen einer vorbestimmten Menge der zu untersuchenden Probe in ein erstes Gefäß gefüllt mit einem Flüssignährmedium umfassend einen Indikator, wie einen Redoxindikator, insbesondere Resazurin;
- Abgabe einer vorbestimmten Menge der Probe in das zweite Gefäß mit einem Flüssignährmedium umfassend einen Indikator, wie einen Redoxindikator, insbesondere Resazurin, und Antibiotika, wobei diese Antibiotika im Wesentlichen auf eine Gruppe der Bakterien ausgesucht und dann ausgewählt aus Gram-positiven und Gram-negativen wirken, die im Wesentlichen identisch ist mit der Menge im vorigen Schritt,
- Inkubieren des ersten Gefäßes und des zweiten Gefäßes bei geeigneter Temperatur, insbesondere im Bereich von 34°C bis 40°C, wie bei circa 37°C für einen Zeitraum ausreichend um ein Wachstum der Bakterien zu ermöglichen,
- Bestimmen des Wachstums der Bakterien anhand der Färbung des Flüssignährmediums in dem ersten Gefäß und dem zweiten Gefäß zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit Gram-positiver und/oder Gram-negativer Bakterien.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Bestimmung des Vorliegens bakterieller Keime und eine Differenzierung hiervon in Gram-positive und Gram-negative Bakterien innerhalb einer kurzen Zeit, wie zum Beispiel innerhalb von 12 Stunden, um so eine Entscheidungshilfe darzustellen für den Milcherzeuger, ob eine Antibiotikagabe sinnvoll ist oder nicht.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
In einem ersten Aspekt wird ein veterinärmedizinisches System oder veterinärmedizinischer Test zur Bestimmung des Vorliegens von Bakterien und gegebenenfalls zur Entscheidungshilfe zur Behandlung dieser, umfassend:

- ein erstes Gefäß mit einem Flüssignährmedium umfassend einen Indikator, wie einen Redoxindikator;
- ein zweites Gefäß mit einem Flüssignährmedium umfassend einen Indikator, wie einen Redoxindikator, und Antibiotika, wobei diese Antibiotika im Wesentlichen auf eine Gruppe der Bakterien ausgewählt aus Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien, wirkt, wobei die Gefäße derart ausgebildet sind, dass sie ein maximales Volumen von 5 ml, wie 2 ml Flüssignährmedium aufnehmen können, bereitgestellt.

Dieses veterinärmedizinische System oder dieser veterinärmedizinische Test ist insbesondere geeignet zur Verwendung bei boviden einschließlich bovinen Mastitiden. Es zeigte sich, dass das erfindungsgemäße System beziehungsweise der erfindungsgemäße Test den Nachweis bakterieller Erreger innerhalb von 12 Stunden erlaubt und damit gegenüber den bisher bekannten Tests, Schnelltests und Systemen vorteilhaft ist.
Mithilfe des erfindungsgemäßen veterinärmedizinischen Systems oder veterinärmedizinischen Tests ist es möglich, bovide, wie bovine Mastitiden einfach in solche Gruppen zu differenzieren, die aufzeigen, ob eine Antibiotikatherapie sinnvoll ist oder nicht. Dadurch ist es möglich, die Verwendung von antimikrobiellen Mitteln in der Veterinärmedizin, insbesondere den von Antibiotika bei der Behandlung der Mastitiden deutlich zu reduzieren und somit große Einsparungen zu erlauben und darüber hinaus eine mögliche Entwicklung von Resistenzen von Bakterien zu vermeiden. Aufgrund der schnellen Bestimmung des Vorhandenseins von Bakterien und insbesondere der Differenzierung zwischen Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien kann der Einsatz von Antibiotika um bis zu 50% reduziert werden. Darüber hinaus erlaubt das erfindungsgemäße veterinärmedizinische System beziehungsweise der erfindungsgemäße veterinärmedizinische Test eine Verwendung durch den Milcherzeuger selbst, ohne dass ein Tierarzt diesen Test durchführen muss.
Der erfindungsgemäße schnelle Diagnosetest überwindet die oben genannten Mängel in Bezug auf die Zeit und in Bezug auf die Durchführung durch das Fachpersonal. Es kann daher davon ausgegangen werden, dass dieses zu einer Reduzierung des Antibiotikaeinsatzes insbesondere des prophylaktischen Antibiotikaeinsatzes vor Kenntnis eines bakteriellen Erregers führt und somit sowohl die entsprechende Milch nicht separat gelagert werden muss als auch früher andere therapeutische Maßnahmen erfolgen können.
Das erfindungsgemäße veterinärmedizinische System beziehungsweise der veterinärmedizinische Test stellt eine Entscheidungsgrundlage für die Einleitung der weiteren Maßnahmen für gegebenenfalls betroffene Tiere dar, diese beinhalten zum Beispiel das Trockenstellen unter antibiotischem Schutz.
In einem Aspekt ist das erfindungsgemäße System beziehungsweise der erfindungsgemäße Test zur Verwendung in der Bestimmung einer Keimfreiheit von Proben, zum Beispiel Rohmilchproben. Hierbei sollte allerdings eine verlängerte Inkubationszeit erfolgen, um auch geringe Belastungen zu erkennen. Bei Anwendung zur Bestimmung einer Keimfreiheit empfehlen sich daher Inkubationszeiten zwischen 12 Stunden und maximal 48 Stunden, wie maximal 24 Stunden.
Der erfindungsgemäße Test beziehungsweise das erfindungsgemäße System besteht aus mindestens zwei Gefäßen, die mit einem Flüssignährmedium gefüllt sind. Die Flüssignährmedien können in ihrer Grundzusammensetzung dabei in beiden Gefäßen identisch oder verschieden sein. In einer Ausführungsform werden identische Flüssignährmedien eingesetzt, die einen Indikator, insbesondere einen Redoxindikator beinhalten. In einer Ausführungsform handelt es sich bei diesem Redoxindikator um Resazurin.
Während im ersten Gefäß darüber hinaus keine Antibiotika vorliegen, sind im zweiten Gefäß Antibiotika vorhanden, wobei diese Antibiotika im Wesentlichen auf einer Gruppe der Bakterien ausgewählt aus Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien wirkt. Das heißt, diese antibiotischen Hemmstoffe, insbesondere Nalidixinsäure und Colistin, erlauben ein Wachstum Gram-positiver Bakterien während das Wachstum Gram-negativer Bakterien gehemmt wird.
Somit wird in dem ersten Gefäß ohne Antibiotikum ein Wachstum von sowohl Gram-positiven als auch Gram-negativen Bakterien erfolgen, während im zweiten Gefäß mit Antibiotika eine Differenzierung im Wachstum erfolgt, dahingehend, dass in Abhängigkeit vom ausgewählten Antibiotikum entweder Gram-positive, wie im Falle der Verwendung von Nalidixinsäure und Colistin, oder Gram-negative Bakterien wachsen.
Der eingesetzte Indikator, wie der Redoxindikator, insbesondere Resazurin, zeigt ein Wachstum durch Farbumschlag an. Im Falle von Resazurin ist dieser Farbumschlag einer von rosa zu farblos aufgrund der bei vorhandener Stoffwechselaktivität auftretenden Reaktion des Resazurins zu Dehydroresorufin.
In einer Ausführungsform sind dabei der Indikator Resazurin und das Antibiotikum eine Kombination aus Nalidixinsäure und Colistin. Sie erlaubt die Bestimmung des Vorhandenseins von Gram-positiver Bakterien oder Gram-negativer Bakterien oder einer Keimfreiheit in der Probe, zum Beispiel der Rohmilchprobe.
In einer Ausführungsform ist dabei das Flüssignährmedium eines, das keine Blutbestandteile in isolierter oder aufbereiteter Form aufweist, das heißt das erfindungsgemäße Flüssignährmedium ist ein blutfreies Flüssignährmedium.
Das erfindungsgemäße veterinärmedizinische System oder der veterinärmedizinische Test umfasst in einer Ausführungsform dabei weiterhin eine Vorrichtung zur Entnahme der zu untersuchenden Probe und zum Einbringen dieser in das erste Gefäß und in das zweite Gefäß. Diese Vorrichtung kann in einer Ausführungsform eine Einmalpipette sein, die ein Aufnehmen der Probe zum Beispiel aus der Rohmilch erlaubt und die gegebenenfalls derart ausgebildet ist, dass sie vorbestimmte Mengen der Probe in die Gefäße jeweils abgeben kann. Eine solche Ausbildung der Abgabe vorbestimmter Mengen erlaubt, dass auch nicht geschultes Personal, wie der Milcherzeuger selbst, neben dem Fachpersonal wiederholbar diese Tests durchführen kann.
Es wird dabei gewährleistet, dass gleiche Mengen an Probe in das erste Gefäß und in das zweite Gefäß eingebracht werden.
Die Gefäße im erfindungsgemäßen System beziehungsweise im erfindungsgemäßen Test sind dabei solche, die ein maximales Volumen von 5 ml, wie 2 ml, zum Beispiel 1,5 ml, Flüssignährmedium aufnehmen können.
In einer Ausführungsform handelt es sich dabei um Mikroreaktionsgefäße bekannter Art, unter anderem auch gattungsgemäß als „Eppendorf-Gefäße“ bekannt. In einer Ausführungsform sind diese Gefäße dabei farblich unterschiedlich markiert, um Anwendungsfehler weiter zu vermeiden. Gleiches gilt für die entsprechende Einrichtung zum Einbringen der Probe in die Gefäße zum Beispiel mit der Einmalpipette. Diese Einmalpipette kann zum Beispiel eine sein, welche aufgrund einer Überlauffunktion das genaue Inokulationsvolumen generiert, um entsprechende Anwendungsfehler zu vermeiden.
In einer Ausführungsform werden dabei 1 ml des Flüssignährmediums vorgelegt und mit 100 µl der zu testenden Probe inokuliert.
In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Anmeldung auf Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens von Bakterien und gegebenenfalls zur Entscheidungshilfe zur Behandlung dieser in einer Probe umfassend die Schritte

- der Entnahme der Probe aus der zu untersuchenden Flüssigkeit;
- Hinzufügen einer vorbestimmten Menge der zu untersuchenden Probe in ein erstes Gefäß gefüllt mit einem Flüssignährmedium umfassend einen Indikator, wie einen Redoxindikator, insbesondere Resazurin;
- Abgabe einer vorbestimmten Menge der Probe in das zweite Gefäß mit einem Flüssignährmedium umfassend einen Indikator, wie einen Redoxindikator, insbesondere Resazurin, und Antibiotika, wobei diese Antibiotika im Wesentlichen auf eine Gruppe der Bakterien ausgesucht und dann ausgewählt aus Gram-positiven und Gram-negativen wirken, die im Wesentlichen identisch ist mit der Menge im vorigen Schritt,

- Inkubieren des ersten Gefäßes und des zweiten Gefäßes bei geeigneter Temperatur, insbesondere im Bereich von 34°C bis 40°C, wie bei circa 37°C für einen Zeitraum ausreichend um ein Wachstum der Bakterien zu ermöglichen,
- Bestimmen des Wachstums der Bakterien anhand der Färbung des Flüssignährmediums in dem ersten Gefäß und dem zweiten Gefäß zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit Gram-positiver und/oder Gram-negativer bakterieller Keime.

Mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein schnelles und einfaches Bestimmen von Bakterien in einer Probe möglich und kann gegebenenfalls zur Entscheidungshilfe zur Behandlung dieser in der Probe möglicherweise vorliegenden Bakterien dienen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere eines zum Bestimmen des Vorliegens von bakteriellen Keimen bei boviden, wie bovinen Mastitiden und gegebenenfalls zur Entscheidungshilfe zur Behandlung dieser boviden, wie bovinen Mastitiden.
Bei Einsatz von Resazurin als Indikator und den Antibiotika Nalidixinsäure und Colistin erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die Differenzierung zwischen der An- und Abwesenheit Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien beziehungsweise einer Keimfreiheit der zu untersuchenden Probe. Während Gram-positive und Gram-negative Bakterien in dem Flüssignährmedium enthaltend Resazurin aber in Abwesenheit von Antibiotika wachsen, erlaubt die Verwendung der Mischung oben genannter Antibiotika die Hemmung des Wachstums Gram-negativer Bakterien, so dass hier nur Gram-positive Bakterien wachsen. Erfindungsgemäß betrifft die vorliegende Anmeldung somit ein Verfahren, wobei der Indikator Resazurin und die Antibiotika Nalidixinsäure und Colistin sind, wobei im Schritt der Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit Gram-positiver und Gram-negativer bakterieller Keime sich das Vorliegen Gram-positiver Bakterien durch weiße Färbung des Flüssignährmediums im ersten Gefäß und im zweiten Gefäß auszeichnet, sich das Vorliegen Gram-negativer Bakterien durch eine weiße Färbung des Flüssignährmediums im ersten Gefäß und eine rosa Farbe des Flüssignährmediums im zweiten Gefäß auszeichnet sowie sich das Vorliegen keiner bakteriellen Keime durch die rosa Farbe der Flüssignährmedien in sowohl dem ersten Gefäß als auch dem zweiten Gefäß auszeichnet.
In einer Ausführungsform erfolgt die Inkubation der Flüssignährmedien mit der Probe nach Inokulation für maximal 12 Stunden. Dadurch ist es möglich ein schnelles Verfahren bereitzustellen, um zum Beispiel im Falle von Verdachtsmomenten bovider, wie boviner Mastitiden eine Erstdiagnose zu erlauben, um eine evidenzbasierte Therapie und entsprechendes Management der Erkrankung zu ermöglichen.
So sollte bei ausbleibendem Nachweis von bakteriellen Keimen eine antibiotische Therapie vermieden werden. Darüber hinaus ist bekannt, dass eine antibiotische Behandlung leichter und mittelschwerer Mastitiden (Grad 1 und 2) beim Nachweis Gram-negativer Mastiserreger keinen nennenswerten positiven Effekt auf die Eutergesundheit beziehungsweise Heilungsrate hat. Entsprechend kann auch hier bei alleinigem Nachweis Gram-negativer Erreger auf eine antibiotische Therapie verzichtet werden. Hingegen sollte bei dem Vorliegen Gram-positiver Erreger die lokale (intramammäre) antibiotische Therapie eingeleitet werden. Eine solche Einleitung ist somit bereits innerhalb von 12 Stunden nach Auftreten sinnfälliger Veränderungen der Milch möglich. Durch die erfindungsgemäße Analyse der bakteriellen Keime können die unterschiedliche Behandlungsstrategien bei milden bis moderaten klinischen Mastitiden früh bestimmt und entsprechende Therapien eingeleitet werden. Natürlich sind tierindividuelle Parameter entsprechend zu berücksichtigen.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt somit eine Entscheidungshilfe zur Behandlung bakterieller Keime, wobei bei i) Vorliegen Gram-positiver Bakterien eine lokale (intramammäre) Antibiotikabehandlung erfolgt oder ii) wobei bei Vorliegen Gram-negativer Bakterien oder bei nicht-Vorliegen von bakteriellen Keimen in der Probe keine lokale (intramammäre) Antibiotikabehandlung erfolgt. Je nach Schwere der Mastitiden kann eine systematische Behandlung erfolgen, zum Beispiel bei Mastitiden Grad 3 mit Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens der Kuh wird auch bei Gram-negativem Befund eine Antibiose system isch durchgeführt.
Das erfindungsgemäße Verfahren und das erfindungsgemäße veterinärmedizinische System beziehungsweise der erfinderische veterinärmedizinische Test erlaubt somit innerhalb von maximal 12 Stunden, also zum Beispiel bis zur nächsten Melkzeit, die Differenzierung in Gram-negativ, Gram-positiv beziehungsweise kein Erreger nachweisbar um entsprechende Therapieentscheidungen in Bezug auf die bovide, wie bovine Mastitis zu treffen.
Bei Vorliegen von Gram-positiven oder Gram-negativen bakteriellen Keimen (Erreger) kann sich natürlich die bekannte konventionelle Erregerdiagnostik und Sensibilitätsprüfung anschließen. Der vorliegende erfindungsgemäße Test beziehungsweise das erfindungsgemäße System und das erfindungsgemäße Verfahren dienen einer Schnelldiagnose, um die ersten Behandlungsschritte einzuleiten.
Dadurch können Verzögerungen, wie sie bisher bei den bekannten Systemen und Verfahren auftreten, vermieden werden und dienen somit dem Tierwohl als auch einer Vermeidung des Antibiotikaeinsatzes.
Zum Beispiel kann folgendes zweistufiges Diagnose- und Behandlungsschema durchgeführt werden:
2stufiges Diagnose und -Behandlungsschema in Abhängigkeit von Testergebnis und Schweregrad der Mastitis:

1. Stufe: bei Feststellung einer klinischen Mastitis (parallel zum Ansetzen des Schnelltests):

Schwere der Mastitis	Leicht (Grad 1): Flocken/Milchcharakter verändert	Mittel (Grad 2): Euterveränderungen vorhanden	Schwer (Grad 3): Störung des Allgemeinbefindens/ Fieber
unmittelbare Behandlung	Entzündungshemmer	Entzündungshemmer	Entzündungshemmer + parenterales Breitband-Antibiotikum

2. Stufe: nach Auswertung des Schnelltests (12 h) zusätzlich:

Testergebnis/Mastitisgrad	Leicht (Grad 1)	Mittel (Grad 2)	Schwer (Grad 3)
kein Erreger nachgewiesen	Keine weitere Maßnahme	Keine weitere Maßnahme	Keine weitere Maßnahme
Gram-negativ	Keine weitere Maßnahme	Keine weitere Maßnahme	Keine weitere Maßnahme
Gram-positiv	Antibiose lokal^d	Antibiose lokal^d	Antibiose lokal^d
^dAusnahmen von der Standardbehandlung in Abhängigkeit von individuellen Tierfaktoren: Therapieresistente Kuh (>2 Mastitiden i. d. Laktation, 3x >700.000 Zellen/ml): keine lokale Antibiose
Aufwändigere Erstbehandlung beim ersten Fall in den ersten drei Laktationen: verlängerte lokale Antibiose 5 Tage

Die vorliegende Erfindung wird mithilfe der folgenden Beispiele weiter ergänzt:
Beispiel 1
Zusammensetzung der Flüssignährmedien:
Flüssignährmedium 1 (ohne Antibiotikum), Angaben in g/l:

- Caseinpepton 5,0
- Hefeextrakt 2,5
- Glucose 1,0
- Resazurin 0,003
- Aqua dest. Ad 1l

Flüssignährmedium mit Antibiotikum (Flüssignährmedium 2):
Zu dem Flüssignährmedium gemäß Testmedium 1 wurden zusätzlich 0,015 g/l Nalidixinsäure und 0,010 g/l Colistin hinzugefügt.
Versuchsdurchführung:
Die Probenentnahme aus aseptisch entnommenen Viertelanfangsgemelksproben und die weiteren Verfahrensschritte sollten steril erfolgen.
Die Gefäße mit dem Flüssignährmedium 1 und Flüssignährmedium 2, gegebenenfalls unterschiedlich farblich markiert, werden bereitgestellt.
Die Rohmilchprobe wird vor Entnahme geschwenkt und steril werden die Proben mittels Einmalpipette (zum Beispiel Pasteur Pipet Dual Bulb 100µl, (Alpha Laboratories/Chemicals, Eastleigh, UK)) entnommen. Anschließend wird zu dem ersten Gefäß 100 µl der Probe zu 1 Milliliter Testmedium 1 zugefügt, wobei darauf geachtet wird, dass die Einmalpipette das Gefäß nicht berührt.
Nach Einbringen der 100 µl Probe in 1 ml Flüssignährmedium 1 wird das Gefäß verschlossen und mehrmalig geschwenkt.
Die genannten Schritte werden ebenfalls mit dem zweiten Gefäß gefüllt mit dem Flüssignährmedium 2 (1 ml) durchgeführt, so dass 100 µl Probe auch hier zugegeben wird. Die Gefäße werden anschließend bei 37°C inkubiert.
Nach 12 stündiger Inkubation können die folgenden Ergebnisse festgestellt werden:

Die Testmedien entfärben sich nur von rosa zu weiß, wenn bakterielle Keime in den Medien wachsen. Flüssignährmedium 1 entfärbt sich sowohl bei Gram-positiven Bakterien als auch bei Gram-negativen Bakterien. Im Gegensatz dazu entfärbt sich Flüssignährmedium 2 nur bei Vorliegen Gram-positiver Bakterien. Bleiben beide Medien rosafarben, ist kein Erregerwachstum nachweisbar. Zusammengefasst konnten folgende Ergebnisse erzielt werden:

Testmedium 1 -weiß markiert (Erregerwachstum allgemein)	Testmedium 2 -gelb markiert (Gram-positiv)	Testergebnis
Weiß	rosa	Gram-negativ bzw. Coliforme^a
Weiß	weiß	Gram-positivb
Rosa	rosa	kein Erreger nachgewiesen
^aE. coli, Klebsiella spp., (andere) coliforme Keime (Citrobacter, Enterobacter),
^b S. aureus, Koagulase-negative Staphylokokken (KNS), S. agalactiae, S. dysgalactiae, S. uberis, Enterokokken, Lactococcus lactis lactis Kein Wachstum von: Corynebakterien, Pseudomonaden, Hefen

Bei der Nutzung des Schnelltestsystems zur Überprüfung der Keimfreiheit ist eine verlängerte Inkubationsdauer von 24-48 Stunden zu empfehlen.
Es zeigte sich, dass mithilfe des erfindungsgemäßen Testsystems und des erfindungsgemäßen Verfahrens einfach und schnell die Differenzierung in Gram-Positive Bakterien, Gram-negative Bakterien und keine Bakterien bei bovinen Mastitiden erfolgen kann, um frühzeitig den Antibiotikaeinsatz zu bestimmen.
Das erfindungsgemäße System erlaubt dabei eine langfristige Lagerung über mehrere Monate. Darüber hinaus kann die Entsorgung nach Sterilisation einfach erfolgen.
Beispiel 2

Zur Überprüfung der im Beispiel 1 dargestellten Leistung des erfindungsgemäßen Tests wurden mithilfe von Verdünnungsreihen in ultrahocherhitzter Milch (UHT) die häufigsten Mastitiserreger auf ihr Verhalten im Testsystem überprüft. Folgende Stämme und Isolate wurden als Testmikroorganismen eingesetzt (Auswertung nach 12 Stunden):

Stamm/Isolat ^c	Test 1	Test 2	Inokulat (koloniebildende Einheiten)
E. coli DSM 4230/K12	+	-	25,8 × 10³
E. coli DSM 1103	+	-	0,07 × 10³
Klebsiella sp. 3277/13	+	-	0,12 × 10³
Proteus vulgaris DSM30119	+	-	0,54 × 10³
Pseudomonas sp. 9928	-	-	bis 2 × 10³
S. aureus ATCC 12600	+	+	6,15 × 10³
S. aureus ATCC 29213	+	+	8,75 × 10³
S. aureus 5435	+	+	13,8 × 10³
Koagulase-negative Staphylokokken (KNS) 7443	+	+	15,6 × 10³
KNS 4748	(+)	-	11,1 × 10³
KNS 4737	+	-	2,7 × 10³
Sc. uberis ATCC 700407	+	+	0,3 × 10³
Sc. uberis 10010	+	+	0,03 × 10³
Enterococcus ssp. 3235/13	+	+	0,06 × 10³
Enterococcus ssp. 10043	+	+	0,5 × 10³
Sc. agalactiae ATCC 27956	+	+	0,04 × 10³
Sc. dysgalactiae 9916	+	+	0,05 × 10³
Bacillus cereus ATCC 13061	+	-	0,13 × 10² -0,13 × 10⁴
Lactococcus lactis lactis ATCC 11454	+	+	0,83 × 10³
Candida rugosa 2728/12	-	-	Bis 0,3 × 10³
Trueperella pyogenes 9961	-	-	Bis 7,3 × 10³
Coryneforme 9987	-	-	Bis 7,4 × 10³
Negativkontrolle (UHT-Milch)	-	-
^c: Falls nicht anders angegeben (ATCC), handelt es sich um Isolate der hauseigenen Sammlung

Es zeigte sich, dass das erfindungsgemäße System beziehungsweise der erfindungsgemäße Schnelltest mit dem erfindungsgemäßen Verfahren einfach den Nachweis der bakteriellen Keime in den Milchproben erlaubt.

Claims

Veterinärmedizinisches System oder veterinärmedizinischer Test zur Bestimmung des Vorliegens von Bakterien und gegebenenfalls zur Entscheidungshilfe zur Behandlung dieser, umfassend: - ein erstes Gefäß mit einem Flüssignährmedium umfassend einen Indikator, wie einen Redoxindikator; - ein zweites Gefäß mit einem Flüssignährmedium umfassend einen Indikator, wie einen Redoxindikator, und Antibiotika, wobei diese Antibiotika im Wesentlichen auf eine Gruppe der Bakterien ausgewählt aus Gram-positiven und Gram-negativen Bakterien, wirkt, wobei die Gefäße derart ausgebildet sind, dass sie ein maximales Volumen von 5 ml, wie 2 ml Flüssignährmedium aufnehmen können.
Veterinärmedizinisches System oder veterinärmedizinischer Test zur Bestimmung des Vorliegens von Bakterien und gegebenenfalls zur Entscheidungshilfe zur Behandlung dieser nach Anspruch 1, wobei der Redoxindikator Resazurin ist.
Veterinärmedizinisches System oder veterinärmedizinischer Test zur Bestimmung des Vorliegens von Bakterien und gegebenenfalls zur Entscheidungshilfe zur Behandlung dieser nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Antibiotika solche sind, die das Wachstum von Gram-negativen Bakterien hemmen, insbesondere wobei die Antibiotika eine Mischung aus Nalidixinsäure und Colistin sind.
Veterinärmedizinisches System oder veterinärmedizinischer Test zur Bestimmung des Vorliegens von Bakterien und gegebenenfalls zur Entscheidungshilfe zur Behandlung dieser nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das vorliegende Flüssignährmedium ein blutfreies Flüssignährmedium ist und/oder das Flüssignährmedium in dem ersten Gefäß und dem zweiten Gefäß identisch ist.
Veterinärmedizinisches System oder veterinärmedizinischer Test zur Bestimmung des Vorliegens von Bakterien und gegebenenfalls zur Entscheidungshilfe zur Behandlung dieser, wobei als Indikator Resazurin und als Antibiotika Nalidixinsäure und Colistin vorliegt zur Bestimmung des Vorliegens von bakteriellen Keimen bei möglichen bovinen Mastitiden und gegebenenfalls zur Entscheidungshilfe zur Behandlung einer vorliegenden bovinen Mastitis.
Veterinärmedizinisches System oder veterinärmedizinischer Test nach einem der vorhergehenden Ansprüche weiterhin umfassend eine Vorrichtung, insbesondere eine Einmalpipette, zur Entnahme der zu untersuchenden Probe und zum Einbringen dieser in das erste Gefäß und in das zweite Gefäß, bevorzugt ist diese Einrichtung derart ausgebildet, dass sie vorbestimmte Mengen der Probe abgeben kann.
Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens von Bakterien und gegebenenfalls zur Entscheidungshilfe zur Behandlung dieser in einer Probe umfassend die Schritte - der Entnahme der Probe aus der zu untersuchenden Flüssigkeit; - Hinzufügen einer vorbestimmten Menge der zu untersuchenden Probe in ein erstes Gefäß gefüllt mit einem Flüssignährmedium umfassend einen Indikator, wie einen Redoxindikator, insbesondere Resazurin; -Abgabe einer vorbestimmten Menge der Probe in das zweite Gefäß mit einem Flüssignährmedium umfassend einen Indikator, wie einen Redoxindikator, insbesondere Resazurin, und Antibiotika, wobei diese Antibiotika im Wesentlichen auf eine Gruppe der Bakterien ausgesucht und dann ausgewählt aus Gram-positiven und Gram-negativen wirken, die im Wesentlichen identisch ist mit der Menge im vorigen Schritt, - Inkubieren des ersten Gefäßes und des zweiten Gefäßes bei geeigneter Temperatur, insbesondere im Bereich von 34°C bis 40°C, wie bei circa 37°C, für einen Zeitraum ausreichend um ein Wachstum der Bakterien zu ermöglichen, - Bestimmen des Wachstums der Bakterien anhand der Färbung des Flüssignährmediums in dem ersten Gefäß und dem zweiten Gefäß zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit Gram-positiver und/oder Gram-negativer Bakterien.
Verfahren nach Anspruch 7 zum Bestimmen des Vorliegens von Bakterien bei bovinen Mastitiden und gegebenenfalls zur Entscheidungshilfe zur Behandlung dieser bovinen Mastitiden.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, wobei der Indikator Resazurin und die Antibiotika Nalidixinsäure und Colistin sind, wobei im Schritt der Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien sind das Vorliegen Gram-positiver Bakterien durch weiße Färbung des Flüssignährmediums im ersten Gefäß und im zweiten Gefäß auszeichnet, sich das Vorliegen Gram-negativer Bakterien durch eine weiße Färbung des Flüssignährmediums im ersten Gefäß und einer rosa Farbe des Flüssignährmediums im zweiten Gefäß auszeichnet sowie sich das Vorliegen keiner Bakterien durch eine rosa Farbe der Flüssignährmedien in sowohl dem ersten Gefäß als auch dem zweiten Gefäß auszeichnet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei nach Inokulation der Flüssignährmedien mit der Probe die Inkubation maximal 12 Stunden erfolgt, um eine Entscheidungshilfe zur Behandlung potentiell vorliegender Bakterien zu ermöglichen, insbesondere als Entscheidungshilfe zur Behandlung boviner Mastitiden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9 zur Bestimmung der Keimfreiheit, wobei die Inkubationsdauer mindestens 12 Stunden und maximal 48 Stunden, wie maximal 24 Stunden beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11 zur Entscheidungshilfe zur Behandlung von Bakterien, wobei bei i) Vorliegen Gram-positiver Bakterien eine Antibiotikabehandlung erfolgt oder ii) wobei bei Vorliegen Gram-negativer Bakterien oder bei Nichtvorliegen von Bakterien keine Antibiotikabehandlung erfolgt.