NL194335C

NL194335C - Werkwijze voor het bepalen van de concentratie van een anti-microbiÙle verbinding in een monster.

Info

Publication number: NL194335C
Application number: NL9400872A
Authority: NL
Inventors: Tsung Chain Chang; Hui Cheng Chen
Original assignee: Food Ind Res & Dev Inst
Priority date: 1994-05-26
Filing date: 1994-05-27
Publication date: 2002-01-04
Also published as: FR2720409B1; FR2720409A1; GB2289946A; GB9410623D0; NZ260609A; DE4419140A1; GB2289946B; NL9400872A; US5591599A; NL194335B; DE4419140B4

Description

1 194335

Werkwijze voor het bepalen van de concentratie van een anti-micröbiëie verbinding in een monster.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bepalen van de concentratie van een anti-microbiële verbinding in een monster, waarbij dat monster aan een kweekmedium wordt toegevoegd, in 5 dat kweekmedium een micro-organisme waarvan de groei voor remming door die anti-microbiêle verbinding vatbaar is gekweekt, over een tijd een elektrische parameter van dat kweekmedium wordt gemeten en een eerste tijdstip waarop een versnelling in het veranderen van die elektrische parameter optreedt, wordt vastgesteld.

Antimicrobiële stoffen, zoals antibiotica en geneesmiddelen, zijn al tientallen jaren gebruikt als deel van 10 het veevoer. Veelal kunnen bij die behandeling antimicrobiële stoffen in de melk terechtkomen. Als ze eenmaal in de meik zitten zijn ze er moeilijk uit te haien en hun aanwezigheid is een punt van zorg voor de volksgezondheid.

Naar schatting zijn 5 tot 10% der Amerikaanse volwassenen overgevoelig voor antibiotica. Na opname van slechts 0,003 IE penicilline G kunnen er allergische reacties optreden. Ook kunnen de antlbiotica-15 residuen een milieu scheppen dat gunstig is voor het optreden van resistente bacteriestammen. De aanwezigheid van antibiotica in melk heeft ook problemen in de zuivelindustrie gegeven, waaronder een onvoldoende stremmen van de melk, het niet op de juiste wijze rijpen van de kaas en een geringere productie van zuur of smaak. Er is 50% remming van de startcultures van kaas en yoghurt opgegeven met slechts 0,2 ΙΕ/ml penicilline. De Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) vindt dat er met de melk 20 geknoeid is ais er antibiotica in zitten. Daarom is een proefje voor het vinden van antimicrobiële stoffen, zoals antibiotica, in melk belangrijk voor de zuivelindustrie.

Enkele thans gangbare werkwijzen voor het aantonen van penicilline G in melk en de gevoeligheden daarvan zijn: die van de cilindrische plaat met Sarcinia lutea: 0,02 ΙΕ/ml, de Penzyme-test met 0,01 lE/ml; de schijfproef met Bacillus stearothermophilus met 0,005 ΙΕ/ml, de Charm-proef met 0,005 ΙΕ/ml en de 25 Delvotest-P met 0,005 ΙΕ/ml. Voor het aantonen van resten (<0,005 ΙΕ/ml) penicilline G in melk is een nog gevoeliger en bij voorkeur automatische werkwijze nodig.

Bij het maken van Cheddar-kaas zijn veranderingen in elektrische eigenschappen van het kweekmedium gebruikt voor het snel uitvoeren van snelle tellingen en voor het tellen van mesofielen, psychotrofen, colivormen en salmonellae en voor het aantonen van abnormale melk en bacteriofagen. Elektrische 30 veranderingen zijn ook gebruikt als groei-index van melkzuurbacteriën in melk. .

Okigbo en Richardson vermeldden een impedantiemethode met behulp van een instrument "Bactometer 123” voor het aantonen van streptomycins of penicilline G in steriele melk, die met 5% werkzame of 5% onwerkzame melkzuurculture beent was. Zie O.N. Okigbo en G.H. Richardson in ’’Detection of penicillin and streptomycin in milk by impedance microbiolog/’ in J. Food Protection 48 (1985) 979. Hoewel de proef 35 gevoeliger is (0,001 internationale eenheid (IE)/ml) dan de eerder genoemde proeven zijn er geen kwantitatieve uitkomsten mee verkregen.

Het Amerikaanse octrooi 4.160.205 beschrijft een werkwijze voor het bepalen van bacteriëje activiteit door een geschikt voedingsmedium met de bacterie te enten en de weerstandscomponent van de elektrische impedantie van het medium te volgen gedurende een tijd die lang genoeg is om een verandering 40 van die component als gevolg van metaboliserende bacteriën vast te stellen. De verkregen krommen zijn specifiek voor de soort bacterie en voor het mogelijk gebruik van de werkwiize voor het identificeren van bacteriën: Verder wordt voorgesteld de werkwijze toe te passen voor het meten van microbiéle groei in het algemeen, bijvoorbeeld voor het bepalen van de groeisnelheid, generatietijden, in zowel ladingsgewijze en continue cultuur of de groei in aanwezigheid van remstoffen zoals antibiotica.

45 Er bestaat echter nog steeds behoefte aan een werkwijze waarmee de concentratie van een antimicrobiële stof in een monster snel, met grote gevoeligheid en op een gemakkelijk te automatiseren wijze kan worden bepaald.

Er is nu gevonden, dat als de tijdstippen waarop een versnelling van de verandering van een elektrische parameter van een kweekmedium waarin een micro-organisme wordt gekweekt, worden gemeten voor 50 verschillende concentraties van een anti-microbiële verbinding, er een lineair verband is tussen die tijdstippen en concentraties, zodat een ijklijn kan worden vervaardigd met behulp waarvan onbekende concentraties van de anti-microbiële verbinding kunnen worden bepaald.

Derhalve voorziet de uitvinding in een werkwijze voor het bepalen van de concentratie van een anti-microbiële verbinding in een monster, omvattende 55 het toevoegen van het monster aan een kweekmedium, het kweken van een micro-organisme waarvan de groei vatbaar is voor remming door die anti-microbiële verbinding, in het kweekmedium, het over een tijd meten van een elektrische parameter van het kweekme- 194335 2 dium, het vaststellen van een eerste tijdstip waarop een versnelling in het veranderen van die elektrische parameter optreedt, het maken van een ijklijn die het lineaire verband geeft tussen dat eerste tijdstip en de concentratie van die anti-microbiële verbinding door de hiervoor beschreven stappen te herhalen voor 5 verschillende bekende concentraties van de anti-microbiële verbinding, het bepalen van de concentratie van de anti-microbiële verbinding in het monster met behulp van de verkregen rechte ijklijn.

Bij een bevoorkeurde uitvoeringsvorm van deze werkwijze wordt dat eerste tijdstip verder vergeleken met een tweede tijdstip dat op een zelfde wijze bepaald wordt als dat eerste tijdstip, behalve dat een reagens 10 toegevoegd wordt dat de antimicrobiële werking van die stof aan het kweekmedium te niet doet, waarbij de aanwezigheid van die stof aangetoond wordt. Als de aan te tonen stof bijvoorbeeld een lactam-antibioticum (bijv. penicilline G) is kan β-lactamase gebruikt worden om een eventueel in het kweekmedium aanwezig lactam-antibioticum te inactiveren voordat dat tweede tijdstip opgemeten wordt

Een ander aspect van deze uitvinding is een werkwijze voor het beproeven van een micro-organisme 15 (bijv. bacterie) op resistentie tegen een antimicrobiële verbinding, welke werkwijze bestaat uit de stappen: (i) het kweken van een te onderzoeken micro-organisme in een kweekmedium dat de verbinding tot een bepaalde concentratie bevat, (ii) het over een zekere tijd opmeten van een elektrische parameter van het kweekmedium, bijv. de geleidbaarheid, (iii) het vaststellen van een eerste tijdstip waarop een versnelling in het veranderen van die elektrische parameter ten gevolge van de groei van het onderzochte micro-20 organisme optreedt (aantoningstijd of ”DT”) en (iv) het vergelijken van dat eerste tijdstip met een tweede tijdstip dat op een zelfde wijze bepaald wordt als dat eerste tijdstip, behalve dat de verbinding in het kweekmedium afwezig is. Het onderzochte micro-organisme wordt tegen de verbinding "resistent” genoemd als de eerste tijd bij een bepaalde concentratie aan die verbinding gelijk is aan de tweede tijd, en wordt "niet resistent” genoemd als die eerste tijd groter is dan de tweede tijd.

25 De werkwijze voor het aantonen van de antimicrobiële stof kan gebruikt worden om lactam-antibiotica in concentraties van slechts 0,00016 lE/ml aan te tonen, wat 30 maal gevoeliger is dan meerdere thans gangbare methoden. Bovendien gaat het opmeten van de elektrische parameter volledig automa* en kan een groot aantal monsters (bijv. 120 of 240) tegelijkertijd onderzocht worden.

Andere aspecten en voordelen van deze uitvinding zullen duidelijk zijn uit de hierbij behorende tekenin-30 gen en de beschrijving van de bevoorkeurde uitvoeringsvormen, en ook uit de volgconclusies.

Eerst worden de tekeningen beschreven.

Figuur 1 is een grafiek die vier geleidbaarheidskrommen laat zien, van vier verschillende media die met sporen van Bacillus stearothermophilus beênt waren.

35 Figuur 2 is een grafiek die drie geleidbaarheidskrommen met PM-indicator-agar iaat zien bij drie verschillende entconcentraties aan sporen Bacillus stearothermophilus.

Figuur 3 is een grafiek die geleidbaarheidskrommen laat zien van weer met water aangemaakte monsters ondermelk met verschillende concentraties aan penicilline G.

Figuur 4 is een grafiek die het lineaire verband laat zien tussen de aantoningstijd (”DT”) en de concen-40 tratie aan penicilline G van monsters ondermelk.

De werkwijze volgens deze uitvinding voor het aantonen van antimicrobiële stoffen berust op de remming van de groei van een micro-organisme door een antimicrobiële stof. De verandering van een elektrische parameter in het kweekmedium dat zowel het monster als het micro-organisme bevatte werd continu in een 45 microbiologische analyzer opgenomen en de aantoningstijd (d.i. het buigpunt van de kromme bij het uitzetten van de elektrische parameter tegen de tijd) komt later als een antimicrobiële stof in het monster aanwezig is. De DT kan zowel automatisch bepaald worden, met een geëigend programma van de autoanalyzer, als met de hand uit een kromme van elektrische parameter tegen de tijd. In het algemeen is de aantoningstijd langer naarmate de concentratie aan antimicrobiële stof hoger is. Binnen een bepaald 50 traject is er inderdaad een lineair verband tussen de DT en de concentratie aan antimicrobiële stof.

Deze methode is zeer gevoelig. Maar het is mogelijk de gevoeligheid van die methode wat te beperken door de proefomstandigheden wat te veranderen (bijv. het medium, de concentratie aan micro-organisme, de incubatietemperatuur of zelfs het proeforganisme) zodat men voor praktisch gebruik in de zuivelindustrie een lagere gevoeligheid bereikt. Die methode kan ook gebruikt worden als snelle test voor een eerste 55 aftasten door een geschikte DT in te stellen voor negatieve monsters; monsters met een kortere DT dan die eerste zullen dan opgevat worden als monsters met antimicrobiële stof daarin. Natuuriijk moet er een zekere marge zijn in die DT om enige onnauwkeurigheid bij het proeven doen op te vangen.

3 194335

Een andere werkwijze volgens deze uitvinding kan gebruikt worden om vast te stellen of een microorganisms tegen een bepaalde antimicrobiële stof resistent is, door de DTs van dat micro-orgsmisme in aanwezigheid en afwezigheid van die antimicrobiële stof op te meten.

In het volgende voorbeeld werd de geleidbaarheid gemeten voor het aantonen van penicilline G in melk 5 met een microbiologische analyzer Malthus 2000 (van de Malthus Instruments Limited te Crawley,

Engeland), met B. stearothermophilus als proeforganisme. Maar het opmeten van de impedantie of de capaciteit in plaats van van de geleidbaarheid is ook mogelijk. Bijvoorbeeld kern een bij de Vitek Systems (te Hazelwood, MS, V.S.A.) verkrijgbare bactometer gebruikt worden voor het opmeten van de geleidbaarheid, de capaciteit en de impedantie. Evenzo is het mogelijk in plaats van B.stearothermophilus andere micro-10 organismen te gebruiken. Bijvoorbeeld is het bekend dat Sarcinia lutea voor antibiotica van de lactam-groep (bijv. cephaprine, cloxicilline en penicilline) gevoelig is en daarom gebruikt kan worden worden om penicilline G of analoga daarvan aan te tonen. Om het precies te zeggen, met de bepaling volgens deze uitvinding kan men alle soorten antimicrobiële stoffen aantonen zolang men daarvoor ook de juiste proeforganismen en proefomstandigheden kan vinden.

15 In dit verband moet er, daar B. stearothermophilus ook voor andere groepen van antimicrobiële stoffen gevoelig is, waaronder de tetracycline-groep bijv. tetracycline, chloortetracydine en oxytetracydine), de erythromicine-groep (bijv. erythromycine, lincomycine en clindamycine), de aminoglycoside-groep (bijv. streptomycins), de novobiocine-groep bijv. novobiodne), de chlooramfenicol-groep (bijv. chlooramfenicol) en de sulfonamidegroep (bijv. sulfamethazine, sulfamethoxazoo! en sulfisoxazool) [zie S.E. Charm en R. Chi in 20 ’’Microbial receptor assay for rapid detection and identification of seven families of antimicrobial drugs in milk: collaborative stud/’ in J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71 (1988) 304] op gewezen worden dat de bepaling volgens deze uitvinding ook gebruikt kan worden om deze verbindingen in monsters aan te tonen, met B.. stearothermophilus als proeforganisme.

Ook zonder dit hier nader uit te werken gelooft men dat een deskundige op basis van de beschrijving 25 hier de uitvinding volledig kan toepassen. De in het volgende voorbeeld beschreven specifieke uitvoeringsvorm moet daarom alleen maar als toelichtend opgevat worden, en niet als beperkend voor de rest van wat nu onthuld wordt, op wat voor wijze dan ook.

Materiaal 30 Trypticase soja-agar en trypticase soja-boulllon waren van BBL (Becton Dickinson te Cockeysviile, MD). SPYE-bouillon (catalogusnummer 490-001) was een product van Malthus Instruments (te Crawley,

Engeland). Bacillus stearothermophilus ATCC 10149 sporensuspensie (catalogusnummer 1801-60-6), Bacto-PM positief blanco medium (vetvrij melkpoeder met 0,12 IE kaliumpenicilline; catalogusnummer 1802-33-9), Bacto-PM negatief blanco medium (inhibitor-vrij vetvrij melkpoeder, catalogusnummer 35 1803-63-1), Bacto-PM indicator-agar (catalogusnummer 1800-15-3) en Penicilline G waren van de Difco Laboratories (te Detroit, Ml). β-Lactamase (EC 3.5.2.6.: catalogusnummer P-0389) was een product van Sigma (te SI Louis, MO).

Optimalisering van de omstandigheden voor het meten van de geleidbaarheid 40 Een succesvolle conductometrische methode is afhankelijk van de kwaliteit van de krommen die beïnvloed worden door de specifieke omstandigheden van monster en medium. Een geleidbaarheidskromme van goede kwaliteit heeft een stabiele basislijn, gevolgd door een steil oplopende helling en een hoge piekwaarde. Zie R. Firstenberg-Eden en G. Eden (in ’’Impedance Microbiolog/’ (1984) (John Wiley & Sons Inc., New York, NY). Omdat sommige eindproducten vein metabolieten een sterker geleidbaarheidssignaal zullen 45 geven is de keuze van het geëigende medium erg belangrijk.

In dit voorbeeld werden veranderingen in geleidbaarheid, opgemeten in microsiemens (pS) automatisch gevolgd en grafisch weergegeven met de software van een Malthus 2000 microbiologische analyzer (Malthus Instruments Limited te Crawley, Engeland). Om een geleidbaarheidskromme van goede kwaliteit te krijgen (d.i. een kromme met een stabiele basislijn, een steile helling en een hoge geleidbaarheidswaarde) 50 werden vier verschillende media (trypticase-sojabouillon, trypticase-soja-agar, SPYE-bouillon en Bacto-PM indicatoragar) gebruikt voor het kweken van B. stearothermophilus. De media werden 15 minuten bij 121°C geautoclaveerd en met sporen beênt tot een concentratie van 1% (1 ml voorraadsuspensie toegevoegd aan 100 ml steriel medium; eindconcentratie ongeveer 106 sporen per ml). De media met de sporen werden dan in porties van 2 ml in geleidbaarheidscellen van 5 ml gebracht en in het waterbad van de microbiologische 55 analyzer Malthus 2000 van 55eC geïncubeerd. Van iedere cel werd de geleidbaarheid over 24 uur iedere 6 minuten gemeten. De uitkomsten waren of numeriek (geleidbaarheden) of grafisch (geleidbaarheids-krommen). De aantoningstijd (”DT”) in uren werd van ieder cel automatisch met de software vastgesteld 194335 4 als de geleidbaarheidswaarden in drie opeenvolgende metingen steeds 1 pS hoger uitvielen. De uitkomsten staan in figuur 1.

De vier krommen van verandering in geleidbaarheid van figuur 1 (A, B, C en D) werden verkregen met respectievelijk PM-indicatoragar, trypticase-sojabouillon, trypticase-soja-agar en SPYE-bouillon als media.

5 De letters A, B en C waren de aantoningstijden van respectievelijk krommen A, B en C; kromme D had geen meetbare aantoningstijd. Zoals figuur 1 laat zien voldoet PM-indicatoragar aan de kriteria van een kromme van goede kwaliteit. Bovendien was de amplitude van de in PM-indicatoragar gegenereerde geleidbaarheid ten minste tweemaal zo groot als in de drie andere media. Daarom werd voor de latere proeven PM-indicatoragar als medium gekozen.

10 Hoewel 1% sporensuspensie (ongeveer 106 sporen/ml) in het algemeen voor de bepaling met B. stearothermophilus aanbevolen wordt is deze concentratie niet geschikt voor de geleidbaarheidsmethode. Met het PM-indicatoragar werden drie verschillende beëntingspercentages gebruikt om de invloed van de ent op de geleidbaarheidskrommen na te gaan, en de uitkomsten daarvan ziet men in figuur 2. Krommen A, B en C van figuur 2 zijn voor de veranderende geleidbaarheden in PM-indicatoragar met drie verschillende 15 beëntingsconcentraties met Bacillus stearothermophilus: A 1% (106 sporen/ml), B 0,1% (105 sporen/ml) en C 0,01% (104 sporen/ml). De letters A, B en C geven de aantoningstijden met respectievelijk krommen A, B en C aan. Zoals figuur 2 laat zien had de sporenconcentratie weinig effect op de kwaliteit van de kromme, behalve dat de DT omgekeerd evenredig met de gebruikte sporenconcentratie was. De DTs bij sporenconcentraties van 1%, 0,1% en 0,01% waren respectievelijk 3,3 h, 3,9 h en 4,2 h. Maar de drie 20 geleidbaarheidskrommen vertoonden het zelfde verloop van de geleidbaarheid en die geleidbaarheden hadden dezelfde piekwaarde, ongeacht de aanvankelijke stoot sporen. Omdat tijd een belangrijke factor bij de kwaliteitscontrole van melk is werd in de daarna komende proeven steeds een sporenconcentratie van 1 % gebruikt

25 Verband tussen aantoningstijd en concentratie aan penicilline G

Er werden proeven uitgevoerd om het effect van penicilline G op de geleidbaarheidskrommen en op de gevoeligheid van de conductometrische methode na te gaan.

Het medium van de positieve blanco, dat 0,12 IE penicilline G (van Difco) bevatte werd in een serie van twee met het medium voor de negatieve blanco verdund, tot monsters met afnemende concentraties aan 30 antibioticum. Nadat van ieder verdund medium voor positieve blanco 1 ml in een geleidbaarheidscel gebracht was (in zesvoud) werden er 2 ml PM-indicatoragar van 50°C met 1% sporen aan toegevoegd; na grondig mengen werd er voor het verloop van de geleidbaarheid bij 55°C geïncubeerd. De gevoeligheid van de conductometrische bepaling werd gedefinieerd als de concentratie aan penicilline G die bij de t-test met een significantie <0,01 een hogere DT-waarde dan de negatieve blanco gaf. De uitkomsten hiervan staan in 35 figuur 3.

De geleidbaarheidskrommen A, B, C, D, E en F van figuur 3 behoren bij monsters met 0 lE/ml, 0,00008 lE/ml, 0,00016 lE/ml, 0,00031 lE/ml, 0,00062 lE/ml, 0,00125 lE/ml, 0,0025 ΙΕ/ml en 0,005 lE/ml penicilline G. De letters a, b, c, d, e en f geven de respectievelijke aantoningstijden van krommen A, B, C, D, E en F aan. Het is duidelijk dat naarmate de concentratie aan penicilline G hoger was de DT langer was. De 40 negatieve blanco had een DT van 3,1 h. Bij het stijgen van de concentratie aan antibioticum steeg de DT en werd de helling van de geleidbaarheidskromme minder steil. Toen de concentratie aan penicilline GS 0,0025 ΙΕ/ml was (figuur 3, krommen G en H) was de remming van de groei van B. stearothermophilus zo sterk dat er een vlakke groeilijn optrad. Onder die omstandigheid kon met een incubatie van 24 uur geen DT vastgesteld worden. Bij een concentratie aan penicilline G van 0,0012 ΙΕ/ml (kromme F van figuur. 3) was 45 de helling van de kromme al zo gering dat het moeilijk was een DT aan te wijzen. Onvermijdelijk zijn de DT van negatieve en positieve blanco's onderworpen aan wisselingen, omdat de fysiologische toestand en de concentratie van de sporensuspensie van verschillende porties moeilijk op een zelfde waarde in te stellen zijn. Maar bij verschillende proeven was de DT van de negatieve blanco altijd ergens tussen 2,6 en 3,2 h.

Bij het beproeven van in serie verdunde positieve blanco’s kon de DT van monsters met meer dan 0,005 50 ΙΕ/ml aan penicilline G met B-lactamase (30 minuten bij 37°C met een eindconcentratie van 15 E/ml) niet meer op de waarde van de negatieve blanco gebracht worden. Dat kan toe te schrijven zijn aan een onvolledige vertering van het penicilline G door het enzym onder de heersende omstandigheden. Maar het complete teniet doen kon bereikt worden bij een geëigende verdunning van monsters met concentraties aan penicilline G van >0,005 lE/ml.

55 De gevoeligheid van het penicilline G was 0,00016 ΙΕ/ml; bij die concentratie was de DT (gemiddelde van een bepaling in zesvoud) 3,38 h, wat significant hoger (a = 0,01) uitviel dan bij de negatieve blanco (DT = 3,11 h).

™! 5 194335

Zoals figuur 4 laat zien was er een lineaire regressie (r = 0,99) voor de DT (in uren, in zesvoud bepaaid) en de concentratie aan penicilline G (IE per ml): met 0,00008 ΙΕ/ml is er DT = 3,18 ± 0,07 h (A), met 0,00015 ΙΕ/ml was er DT = 3,38 ± 0,18 h (B), met 0,00031 ΙΕ/ml was er DT = 3,98 ± 0,38 h (C) en met 0,00062 ΙΕ/ml was er DT = 5,33 ± 0,44 h (D). Het voor kwantitatieve bepaling van penicilline G geschikte 5 traject lag tussen 0,00016 en 0,00062 ΙΕ/ml en de vergelijking voor de regressielijn luidde: DT = 4000 x (penicilline G) + 2,8. De precisie van de conductometrische bepaling (in zesvoud) was hoog; met concentraties aan penicilline G van 0,00008, 0,00016, 0,00031 en 0,00062 ΙΕ/ml waren er variantiecoêfficiënten van respectievelijk 2,2, 5,3, 9,5 en 8,3 %. De hogere variantiecoêfficiënten bij hogere antibioticum-concentraties zouden ten dele toe te schrijven zijn aan de veel kleinere hellingen van de geleidbaarheidskrommen 10 (krommen D, E en F van figuur 3). De kleine hellingen maakten het bepalen van een preciese DT moeilijker, wat tot grotere fouten leidde en dus tot hogere variantiecoêfficiënten. Maar bij aiie concentraties in het kwantitatieve gebied (0,00016 tot 0,00062 ΙΕ/ml) was de variantiecoëfficiënt <10 %, wat voor een sporenanalyse aanvaardbaar is. In ieder geval moeten, wegens de hoge gevoeligheid en het betrekkelijk nauwe traject voor kwanti-tatieve analyse met de conductometrische techniek (fig. 4), melkmonsters met hogere 15 concentraties aan penicilline G (>0,00062 ΙΕ/ml) voor kwantitatieve doeleinden in geëigende mate verdund worden.

Aantonen van de aanwezigheid van penicilline G in twaalf mellononsteis

Na het vaststellen van de omstandigheden voor de geleidbaarheidsmeting werd die techniek toegepast op 20 twaalf melkproducten van de markt, waaronder zes melkpoeders en zes formules voor kindervoeding.

Van elk product werd 10 g toegevoegd aan 90 ml gedeToniseerd water en in een serie van twee met negatief blanco medium (van Difco) verdund, leder verdund monster werd in twee porties onderverdeeld: één portie van 1 ml werd 3 minuten op 82°C verhit, direct met een ijsbad afgekoeld en 30 minuten bij 37°C met 165 E/ml 8-lactamase (in 0,1 ml) behandeld. Nadat 1 ml van ieder monster (positieve en negatieve 25 blanco, met enzym behandelde en onbehandelde monsters) in de geleidbaarheidscel werd 2 ml PM-indicatoragar met 1 % sporen van B. stearothermophilus er aan toegevoegd en werd het geheel grondig gemengd. De cellen werden bij 55°C geïncubeerd om daarna de geleidbaarheid te meten. In de melkproducten werd het penicilline G ook met de schijfproef met B. stearothermophilus bepaald (zie J.R. Bishop, G.F. Senyk en S.E. Duncan in "Detection of antibiotic/drug residues in milk and dairy products" in Standard 30 Methods for the Examination of Dairy Products, 16e druk (1992) onder red. van R.T. Marshall, door de Am.

Publ. Health Assoc, te Washington, VS.

Zoals tabel 1 laat zien waren zes monsters (drie melkpoeders, A, B en C, en drie kindervoedingen, A, D en E) met B-lactam-antibiotica besmet, met gehalten tussen 0,01 tot 0,08 ΙΕ/g (uitgedrukt als penicilline G) wat door behandeling met B-lactamase bevestigd werd. Drie andere monsters (melkpoeders E, F en 35 kindervoeding G) waren door andere remstoffen dan β-lactam-antibiotica besmet, omdat de DTs door behandeling met B-lactamase niet hersteld of bekort werden. Maar door de betrekkelijk ongevoelige bepaling met B. stearothermophilus op agarplaten (gevoeligheidsgrens 0,005 ΙΕ/ml, d.i. 0,05 ΙΕ/g melkpoeder) kreeg men met slechts één monster (kindervoeding E) een open remmlngszone. Het is duidelijk dat men met onderhavige conductometrische werkwijze lage concentraties aan penicilline G in melkproducten 40 kan aantonen die er met de gangbare methoden als "negatief ’ uit zouden komen.

TABEL 1

Aantonen van penicilline G in melkpoeders en kindervoeding 45 -

Product Aantoningstijd1 β-Lactam- antibiotica2 (h) (IE/g)

Melkpoeder 50 A >24 0,057 B >24 0,045 C >24 0,064 D 2,6 niets3 E >24 U4

55 F >24 U

I___

Claims

194335 6 TABEL 1 (vervolg) Aantonen van penicilline G in melkpoeders en kindervoeding 5 Product Aantoningstijd1 B-Lactam- antibiotica2 <h) (IE/g) Kindervoeding A >24 0,010 10 B 2,6 NB C 2,6 NB D >24 0,023 E5 >24 0,080 F >24 U 15 --

1. Werkwijze voor het bepalen van de concentratie van een anti-microbiële verbinding in een monster, omvattende het toevoegen van het monster aan een kweekmedium, het kweken van een micro-organisme waarvan de groei vatbaar is voor remming door die anti-microbiële verbinding, in het kweekmedium, het over een tijd meten van een elektrische parameter van het kweekmedium, het vaststellen van een eerste 35 tijdstip waarop een versnelling in het veranderen van die elektrische parameter optreedt, het maken van een ijklijn die het lineaire verband geeft tussen dat eerste tijdstip en de concentratie van die anti-microbiële verbinding door de hiervoor beschreven stappen te herhalen voor verschil ende bekende concentraties van de anti-microbiële verbinding, het bepalen van de concentratie van de anti-microbiële verbinding in het monster met behulp van de verkregen rechte ijklijn.

1 Monster 1:10 met gedeloniseerd water aangemaakt * Sterkte uitgedrukt in penicilline G

3 Geen remstoffen aangetoond

4 Bevatte niet geïdentificeerde remstoffen, anders dan B-lactamen

20. Behalve kindervoeding E; de andere monsters waren met de agarplaatbepaling met Bacillus stearothermophilus negatief. Andere uitvoeringsvormen Uit de voorafgetande beschrijving kan een deskundige gemakkelijk de wezenlijke kenmerken vein onderhavige uitvinding vaststellen, en zonder buiten de geest of het kader daarvan te treden kan hij diverse 25 veranderingen en modificaties in de uitvinding aanbrengen om het aan uiteenlopende toepassingen en omstandigheden aan te passen. Al die andere uitvoeringsvormen vallen dus ook onder de conclusies. 30

2. Werkwijze volgens de voorgaande conclusie, omvattende als verdere stap het vergelijken van dat eerste tijdstip met een tweede tijdstip dat op eenzelfde wijze wordt bepaald, behalve dat dan aan het kweekmedium een reagens wordt toegevoegd dat de anti-microbiële werking van de anti-microbiële verbinding kan opheffen.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, waarbij die anti-microbiële verbinding een B-lactam is en dat reagens 45 β-lactamase is. Hierbij 4 bladen tekening j