NL9400872A - Werkwijze voor het aantonen van antimicrobiële stoffen. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het aantonen van antimicrobiële stoffen.

Achtergrond van de uitvinding

Antimicrobiële stoffen, zoals antibiotica en geneesmiddelen, zijn al tientallen jaren gebruikt als deel van het veevoer, heelal kunnen bij die behandeling antimicrobiële stoffen in de melk terecht komen. Als ze eenmaal in de melk zitten zijn ze er moeilijk uit te halen en hun aanwezigheid is een punt van zorg voor de volksgezondheid.

Naar schatting zijn 5 tot 10 % der Amerikaanse volwassenen overgevoelig voor antibiotica. Na opname van slechts 0,003 IE penicilline G kunnen er allergische reacties optreden. Ook kunnen de antibiotica-residuen een milieu scheppen dat gunstig is voor het optreden van resistente bacteriestammen. De aanwezigheid van antibiotica in melk heeft ook problemen in de zuivelindustrie gegeven, waaronder een onvoldoende stremmen van de melk, het niet op de juiste wijze rijpen van de kaas en een geringere produk-tie van zuur of smaak. Er is 50 % remming van de startcul-tures van kaas en joghurt opgegeven met slechts 0,2 IE/ml penicilline. De FDA vindt dat er met de melk geknoeid is als er antibiotica in zitten. Daarom is een proefje voor het vinden van antimicrobiële stoffen, zoals antibiotica, in melk belangrijk voor de zuivelindustrie.

Enkele thans gangbare werkwijzen voor het aantonen van penicilline G in melk en de gevoeligheden daarvan zijn: die van de cilindrische plaat met Sarcinia lutea: 0,02 IE/ml, de Penzyme-test met 0,01 IE/ml; de schijfproef met Bacillus stearothermophilus met 0,005 IE/ml, de Charm-proef met 0,005 IE/ml en de Delvotest-P met 0,005 IE/ml. Voor het aantonen van resten (<0,005 IE/ml) penicilline G in melk is een nog gevoeliger en bij voorkeur automatische werkwijze nodig.

Bij het maken van Cheddar-kaas zijn veranderingen in elektrische eigenschappen van het kweekmedium gebruikt voor het snel uitvoeren van snelle tellingen en voor het tellen van mesofielen, psychotrofen, colivormen en salmo-nellae en voor het aantonen van abnormale melk en bacterio-fagen. Elektrische veranderingen zijn ook gebruikt als groei-index van melkzuurbacteriën in melk.

Okigbo en Richardson vermeldden een impedantieme-thode met behulp van een instrument "Bactometer 123” voor het aantonen van streptomycine of penicilline G in steriel melk, die met 5 % werkzame of 5 % onwerkzame melkzuurcultu-re beënt was. Zie O.N. Okigbo en G.H. Richardson in "Detection of penicillin and streptomycin in milk by impedance microbiology" in J. Food Protection 48 (1985) 979. Hoewel de proef gevoeliger is (0,001 IE/ml) dan de eerder genoemde proeven zijn er geen kwantitatieve uitkomsten mee verkregen.

Samenvatting van de uitvinding

Een aspect van deze uitvinding betreft een werkwijze voor het bepalen van de mogelijke aanwezigheid van een antimicrobiële stof in een monster. Met "antimicrobiële stof" wordt iedere verbinding (antibioticum of anders) bedoeld die de groei van een bacterie of schimmel kan remmen.

De werkwijze bestaat uit de stappen: (i) het toevoegen van het monster aan een kweekmedium, (ii) het kweken van een microörganisme, bijv. een bacterie of schimmel (sporen of cellen) in het kweekmedium, waarbij de groei van het microörganisme vatbaar is voor remming door die verbinding, (iii) het over een zekere tijd opmeten van een elektrische parameter, bijv. de geleidbaarheid, de impedantie of de capaciteit van het kweekmedium, (iv) het vaststellen van een eerste tijdstip waarop een versnelling in het veranderen van die elektrische parameter optreedt (aantoningstijd of ,,DT")/ welke verandering een afspiegeling is van de groei van dat microörganisme, en (v) het vergelijken van dat eerste tijdstip met meerdere tijdstippen om de mogelijke aanwezigheid van de verbinding aan te tonen. Elk van die meerdere tijdstippen wordt op een zelfde wijze bepaald als dat eerste tijdstip, behalve dat de verbinding tot een bekende concentratie in het kweekmedium aanwezig is, en er verder een verband bestaat tussen dat tijdstip en de concentratie.

Bij een bevoorkeurde uitvoeringsvorm van deze werkwijze wordt dat eerste tijdstip verder vergeleken met een tweede tijdstip dat op een zelfde wijze bepaald wordt als dat eerste tijdstip, behalve dat een reagens toegevoegd wordt dat de antimicrobiële werking van die stof aan het kweekmedium te niet doet, waarbij de aanwezigheid van die stof aangetoond wordt. Als de aan te tonen stof bijvoorbeeld een lactam-antibioticum (bijv. penicilline G) is kan 0-lactamase gebruikt worden om een eventueel in het kweekmedium aanwezig lactam-antibioticum te inactiveren voordat dat tweede tijdstip opgemeten wordt.

Een ander aspect van deze uitvinding is een werkwijze voor het beproeven van een microörganisme (bijv. bacterie) op resistentie tegen een antimicrobiële verbinding, welke werkwijze bestaat uit de stappen: (i) het kweken van een te onderzoeken microörganisme in een kweekmedium dat de verbinding tot een bepaalde concentratie bevat, (ii) het over een zekere tijd opmeten van een elektrische parameter van het kweekmedium, bijv. de geleidbaarheid, (iii) het vaststellen van een eerste tijdstip waarop een versnelling in het veranderen van die elektrische parameter ten gevolge van de groei van het onderzochte microörganisme optreedt (aantoningstijd of "DT") en (iv) het vergelijken van dat eerste tijdstip met een tweede tijdstip dat op een zelfde wijze bepaald wordt als dat eerste tijdstip, behalve dat de verbinding in het kweekmedium afwezig is. Het onderzochte microörganisme wordt tegen de verbinding "resistent" genoemd als de eerste tijd bij een bepaalde concentratie aan die verbinding gelijk is aan de tweede tijd, en wordt "niet resistent" genoemd als die eerste tijd groter is dan de tweede tijd.

De werkwijze voor het aantonen van de antimicro-biële stof kan gebruikt worden om lactam-antibiotica in concentraties van slechts 0,00016 IE/ml aan te tonen, wat 30 maal gevoeliger is dan meerdere thans gangbare methoden. Bovendien gaat het opmeten van de elektrische parameter volledig automatisch en kan een groot aantal monsters (bijv. 120 of 240) tegelijkertijd onderzocht worden.

Andere aspecten en voordelen van deze uitvinding zullen duidelijk zijn uit de hierbij behorende tekeningen en de beschrijving van de bevoorkeurde uitvoeringsvormen, en ook uit de volgconclusies.

Korte beschrijving van de tekening

Eerst worden de tekeningen beschreven.

Fig. 1 is een grafiek die vier geleidbaarheids-krommen laat zien, van vier verschillende media die met sporen van Bacillus stearothermophilus beënt waren.

Fig. 2 is een grafiek die drie geleidbaarheids-krommen met PM-indicator-agar laat zien bij drie verschillende entconcentraties aan sporen Bacillus stearothermophilus .

Fig. 3 is een grafiek die geleidbaarheidskrommen laat zien van weer met water aangemaakte monsters ondermelk met verschillende concentraties aan penicilline G.

Fig. 4 is een grafiek die het lineaire verband laat zien tussen de aantoningstijd ("DT") en de concentratie aan penicilline G van monsters ondermelk.

Beschrijving van de bevoorkeurde uitvoeringsvormen

De werkwijze volgens deze uitvinding voor het aantonen van antimicrobiële stoffen berust op de remming van de groei van een microörganisme door een antimicrobiële stof. De verandering van een elektrische parameter in het kweekmedium dat zowel het monster als het microörganisme bevatte werd continu in een microbiologische analyzer opgenomen en de aantoningstijd (d.i. het buigpunt van de kromme bij het uitzetten van de elektrische parameter tegen de tijd) komt later als een antimicrobiële stof in het monster aanwezig is. De DT kan zowel automatisch bepaald worden, met een geëigend programma van de autoanalyzer, als met de hand uit een kromme van elektrische parameter tegen de tijd. In het algemeen is de aantoningstijd langer naarmate de concentratie aan antimicrobiële stof hoger is. Binnen een bepaald traject is er inderdaad een lineair verband tussen de DT en de concentratie aan antimicrobiële stof.

Deze methode is zeer gevoelig. Maar het is mogelijk de gevoeligheid van die methode wat te beperken door de proefomstandigheden wat te veranderen (bijv. het medium, de concentratie aan microörganisme, de incubatieteroperatuur of zelfs het proeforganisme) zodat men voor praktisch gebruik in de zuivelindustrie een lagere gevoeligheid bereikt. Die methode kan ook gebruikt worden als snelle test voor een eerste aftasten door een geschikte DT in te stellen voor negatieve monsters; monsters met een kortere DT dan die eerste zullen dan opgevat worden als monsters met antimicrobiële stof daarin. Natuurlijk moet er een zekere marge zijn in die DT om enige onnauwkeurigheid bij het proeven doen op te vangen.

Een andere werkwijze volgens deze uitvinding kan gebruikt worden om vast te stellen of een microörganisme tegen een bepaalde antimicrobiële stof resistent is door de DT's van dat microörganisme in aanwezigheid en afwezigheid van die antimicrobiële stof op te meten.

In het volgende voorbeeld werd de geleidbaarheid gemeten voor het aantonen van penicilline G in melk met een microbiologische analyzer Malthus 2000 (van de Malthus Instruments Limited te Crawley, Engeland), met B. stearot-hermophilus als proeforganisme. Maar het opmeten van de impedantie of de capaciteit in plaats van van de geleidbaarheid is ook mogelijk. Bijvoorbeeld kan een bij de Vitek Systems (te Hazelwood, MS, V.S.A.) verkrijgbare bactometer gebruikt worden voor het opmeten van de geleidbaarheid, de capaciteit en de impedantie. Evenzo is het mogelijk in plaats van B.stearothermophilus andere microörganisroen te gebruiken. Bijvoorbeeld is het bekend dat Sarcinia lutea voor antibiotica van de lactam-familie (bijv. cephaprine, cloxicilline en penicilline) gevoelig is en daarom gebruikt kan worden worden om penicilline G of analoga daarvan aan te tonen. Om het precies te zeggen, met de bepaling volgens deze uitvinding kan men alle soorten antimicrobiële stoffen aantonen zolang men daarvoor ook de juiste proeforganismen en proefomstandigheden kan vinden.

In dit verband moet er, daar B. stearothermophilus ook voor andere families van antimicrobiële stoffen gevoelig is, waaronder de tetracycline-familie (bijv. tetracycline, chloortetracycline en oxytetracycline) , de erythro-micine-familie (bijv. erythromycine, lincomycine en clinda-mycine), de aminoglycoside-familie (bijv. streptomycine), de novobiocine-familie (bijv. novobiocine), de chlooramfe-nicol-familie (bijv. chlooramfenicol) en de sulfonamide-familie (bijv. sulfamethazine, sulfamethoxazool en sul-fisoxazool) [zie S.E. Charm en R. Chi in "Microbial receptor assay for rapid detection and identification of seven families of antimicrobial drugs in milk: collaborative study" in J. Assoc. Off. Anal. Chem. 71 (1988) 304} op gewezen worden dat de bepaling volgens deze uitvinding ook gebruikt kan worden om deze verbindingen in monsters aan te tonen, met B. stearothermophilus als proeforganisme.

Ook zonder dit hier nader uit te werken gelooft men dat een deskundige op basis van de beschrijving hier de uitvinding volledig kan toepassen. De in het volgende voorbeeld beschreven specifieke uitvoeringsvorm moet daarom alleen maar als toelichtend opgevat worden, en niet als beperkend voor de rest van wat nu onthuld wordt, op wat voor wijze dan ook.

Materiaal

Trypticase soja-agar en trypticase soja-bouillon waren van BBL (Becton Dickinson te Cockeysville, MD). SPYE-bouillon (catalogusnummer 490-001) was een produkt van Malthus Instruments (te Crawley, Engeland). Bacillus stearothermophilus ATCC 10149 sporensuspensie (catalogusnummer 1801-60-6), Bacto-PM positief blanco medium (vetvrij melkpoeder met 0,12 IE kaliumpenicilline; catalogusnummer 1802-33-9), Bacto-PM negatief blanco medium (inhibitor-vrij vetvrij melkpoeder, catalogusnummer 1803-63-1), Bacto-PM indicator-agar (catalogusnummer 1800-15-3) en Penicilline G waren van de Difco Laboratories (te Detroit, MI) . /9-Lacta-mase (EC 3.5.2.6.; catalogusnummer P-0389) was een produkt van Sigma (te St. Louis, MO).

Optimalisering van de omstandigheden voor het meten van de geleidbaarheid

Een succesvolle conductometrische methode is afhankelijk van de kwaliteit van de krommen die beïnvloed worden door de specifieke omstandigheden van monster en medium. Een geleidbaarheidskromme van goede kwaliteit heeft een stabiele basislijn, gevolgd door een steil oplopende helling en een hoge piekwaarde. Zie R. Firstenberg-Eden en G. Eden (in "Impedance Microbiology" (1984) (John Wiley & Sons Inc., New York, NY) . Omdat sommige eindprodukten van metabolieten een sterker geleidbaarheidssignaal zullen geven is de keuze van het geëigende medium erg belangrijk.

In dit voorbeeld werden veranderingen in geleidbaarheid, opgemeten in microsiemens (/iS) automatisch gevolgd en grafisch weergegeven met de software van een Malthus 2000 microbiologische analyzer (Malthus Instruments Limited te Crawley, Engeland). Om een geleidbaarheidskromme van goede kwaliteit te krijgen (d.i. een kromme met een stabiele basislijn, een steile helling en een hoge geleid-baarheidswaarde) werden vier verschillende media (tryptica-se-sojabouillon, trypticase-soja-agar, SPYE-bouillon en Bacto-PM indicatoragar) gebruikt voor het kweken van B. stearothermophilus. De media werden 15 minuten bij 121°C geautoclaveerd en met sporen beënt tot een concentratie van 1 % (1 ml voorraadsuspensie toegevoegd aan 100 ml steriel medium; eindconcentratie ongeveer 106 sporen per ml). De media met de sporen werden dan in porties van 2 ml in geleidbaarheidscellen van 5 ml gebracht en in het waterbad van de microbiologische analyzer Malthus 2000 van 55eC geïncubeerd. Van iedere cel werd de geleidbaarheid over 24 uur iedere 6 minuten gemeten. De uitkomsten waren of numeriek (geleidbaarheden) of grafisch (geleidbaarheids-krommen) . De aantoningstijd ("DT") in uren werd van ieder cel automatisch met de software vastgesteld als de geleid-baarheidswaarden in drie opeenvolgende metingen steeds 1 μβ hoger uitvielen. De uitkomsten staan in fig. l.

De vier krommen van wisselende vergeleidbaarheid van figuur 1 (A, B, C en D) werden verkregen met respectievelijk PM-indicatoragar, trypticase-sojabouillon, tryptica-se-soja-agar en SPYE-bouillon als media. De letters A, B en C waren de aantoningstijden van respectievelijk krommen A, B en C; kromme D had geen meetbare aantoningstijd. Zoals figuur 1 laat zien voldoet PM-indicatoragar aan de kriteria van een kromme van goede kwaliteit. Bovendien was de amplitude van de in PM-indicatoragar gegenereerde geleidbaarheid ten minste tweemaal zo groot als in de drie andere media. Daarom werd voor de latere proeven PM-indicatoragar als medium gekozen.

Hoewel 1 % sporensuspensie (ongeveer 106 spo-ren/ml) in het algemeen voor de bepaling met B. stearother-mophilus aanbevolen wordt is deze concentratie niet geschikt voor de geleidbaarheidsmethode. Met het PM-indicatoragar werden drie verschillende beëntingspercentages gebruikt om de invloed van de ent op de geleidbaarheids-krommen na te gaan, en de uitkomsten daarvan ziet men in fig. 2. Krommen A, B en C van figuur 2 zijn voor de veranderende geleidbaarheden in PM-indicatoragar met drie verschillende beëntingsconcentraties met Bacillus stearo-thermophilus: A 1 % (106 sporen/ml) , B 0,1 % (105 spo-ren/ml) en C 0,01 % (104 sporen/ml). De letters A, B en C geven de aantoningstijden met respectievelijk krommen A, B en C aan. Zoals figuur 2 laat zien had de sporenconcentratie weinig effect op de kwaliteit van de kromme, behalve dat de DT omgekeerd evenredig met de gebruikte sporenconcentratie was. De DT's bij sporenconcentraties van 1 %, 0,1 % en 0,01 % waren respectievelijk 3,3 h, 3,9 h en 4,2 h. Maar de drie geleidbaarheidskrommen vertoonden het zelfde verloop van de geleidbaarheid en die geleidbaarheden hadden dezelfde piekwaarde, ongeacht de aanvankelijke stoot sporen. Omdat tijd een belangrijke factor bij de kwali teitscontrole van melk is werd in de daarna komende proeven steeds een sporenconcentratie van 1 % gebruikt.

Verband tussen aantoninastiid en concentratie aan penicilline G

Er werden proeven uitgevoerd om het effect van penicilline G op de geleidbaarheidskrommen en op de gevoeligheid van de conductometrische methode na te gaan.

Het medium van de positieve blanco, dat 0,12 IE penicilline G (van Difco) bevatte werd in een serie van twee roet het medium voor de negatieve blanco verdund, tot monsters met afnemende concentraties aan antibioticum. Nadat van ieder verdund medium voor positieve blanco 1 ml in een geleidbaarheidscel gebracht was (in zesvoud) werden er 2 ml PM-indicatoragar van 50 °C met 1 % sporen aan toegevoegd; na grondig mengen werd er voor het verloop van de geleidbaarheid bij 55°C geïncubeerd. De gevoeligheid van de conductometrische bepaling werd gedefinieerd als de concentratie aan penicilline G die bij de t-test met een significantie <0,01 een hogere DT-waarde dan de negatieve blanco gaf. De uitkomsten hiervan staan in fig. 3.

De geleidbaarheidskrommen A, B, C, D, E en F van fig. 3 behoren bij monsters met 0 IE/ml, 0,00008 IE/ml, 0,00016 IE/ml, 0,00031 IE/ml, 0,00062 IE/ml, 0,00125 IE/ml, 0,0025 IE/ml en 0,005 IE/ml penicilline G. De letters a, b, c, d, e en f geven de respectievelijke aantoningstijden van krommen A, B, C, D, E en F aan. Het is duidelijk dat naarmate de concentratie aan penicilline G hoger was de DT langer was. De negatieve blanco had een DT van 3,1 h. Bij het stijgen van de concentratie aan antibioticum steeg de DT en werd de helling van de geleidbaarheidskromme minder steil. Toen de concentratie aan penicilline G >0,0025 IE/ml was (fig. 3, krommen G en H) was de remming van de groei van B. stearothermophilus zo sterk dat er een vlakke groeilijn optrad. Onder die omstandigheid kon met een incubatie van 24 uur geen DT vastgesteld worden. Bij een concentratie aan penicilline G van 0,0012 IE/ml (kromme F van fig. 3) was de helling van de kromme al zo gering dat het moeilijk was een DT aan te wijzen. Onvermijdelijk zijn de DT van negatieve en positieve blanco's onderworpen aan wisselingen, omdat de fysiologische toestand en de concentratie van de sporensuspensie van verschillende porties moeilijk op een zelfde waarde in te stellen zijn. Maar bij verschillende proeven was de DT van de negatieve blanco altijd ergens tussen 2,6 en 3,2 h.

Bij het beproeven van in serie verdunde positieve blanco's kon de DT van monsters met meer dan 0,005 IE/ml aan penicilline G met /3-lactamase (30 minuten bij 37°C met een eindconcentratie van 15 E/ml) niet meer op de waarde van de negatieve blanco gebracht worden. Dat kan toe te schrijven zijn aan een onvolledige vertering van het penicilline G door het enzym onder de heersende omstandigheden. Maar het complete teniet doen kon bereikt worden bij een geëigende verdunning van monsters met concentraties aan penicilline G van >0,005 IE/ml.

De gevoeligheid van het penicilline G was 0,00016 IE/ml; bij die concentratie was de DT (gemiddelde van een bepaling in zesvoud) 3,38 h, wat significant hoger (a = 0,01) uitviel dan bij de negatieve blanco (DT = 3,11 h).

Zoals fig. 4 laat zien was er een lineaire regressie (r = 0,99) voor de DT (in uren, in zesvoud bepaald) en de concentratie aan penicilline G (IE per ml): met 0,00008 IE/ml is er DT = 3,18 ± 0,07 h (A) , met 0,00015 IE/ml was er DT = 3,38 ± 0,18 h (B) , met 0,00031 IE/ml was er DT -3,98 ± 0,38 h (C) en met 0,00062 IE/ml was er DT = 5,33 ± 0,44 h (D). Het voor kwantitatieve bepaling van penicilline G geschikte traject lag tussen 0,00016 en 0,00062 IE/ml en de vergelijking voor de regressielijn luidde: DT = 4000 x (penicilline G) + 2,8. De precisie van de conductometrische bepaling (in zesvoud) was hoog; met concentraties aan penicilline G van 0,00008, 0,00016, 0,00031 en 0,00062 IE/ml waren er variantiecoëfficiënten van respectievelijk 2,2, 5,3, 9,5 en 8,3 %. De hogere variantiecoëf f iciënten bij hogere antibioticum-concentraties zouden ten dele toe te schrijven zijn aan de veel kleinere hellingen van de geleidbaarheidskrommen (krommen D, E en F van fig. 3) . De kleine hellingen maakten het bepalen van een preciese DT moeilijker, wat tot grotere fouten leidde en dus tot hogere variantiecoëfficiënten. Maar bij alle concentraties in het kwantitatieve gebied (0,00016 tot 0,00062 IE/xnl) was de variantiecoëfficiënt <10 %, wat voor een sporenanalyse aanvaardbaar is. In ieder geval moeten, wegens de hoge gevoeligheid en het betrekkelijk nauwe traject voor kwantitatieve analyse met de conductometrische techniek (fig. 4), melkmonsters met hogere concentraties aan penicilline G (>0,00062 IE/ml) voor kwantitatieve doeleinden in geëigende mate verdund worden.

Aantonen van de aanwezigheid van penicilline G in twaalf melkmonsters

Na het vaststellen van de omstandigheden voor de geleidbaarheidsmeting werd die techniek toegepast op twaalf melkprodukten van de markt, waaronder zes melkpoeders en zes formules voor kindervoeding.

Van elk produkt werd 10 g toegevoegd aan 90 ml gedeïoniseerd water en in een serie van twee met negatief blanco medium (van Difco) verdund. Ieder verdund monster werd in twee porties onderverdeeld: één portie van 1 ml werd 3 minuten op 82 °C verhit, direct met een ijsbad afgekoeld en 30 minuten bij 37°C met 165 E/ml /3-lactamase (in 0,1 ml) behandeld. Nadat 1 ml van ieder monster (positieve en negatieve blanco, met enzym behandelde en onbehandelde monsters) in de geleidbaarheidscel werd 2 ml PM-indicatoragar met 1 % sporen van B. stearothermophilus er aan toegevoegd en werd het geheel grondig gemengd. De cellen werden bij 55°C geïncubeerd om daarna de geleidbaarheid te meten. In de melkprodukten werd het penicilline G ook met de schijfproef met B. stearothermophilus bepaald (zie J.R. Bishop, G.F. Senyk en S.E. Duncan in "Detection of antibiotic/drug residues in milk and dairy products" in Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 16e druk (1992) onder red. van R.T. Marshall, door de Am. Publ. Health Assoc, te Washington, VS.

Zoals tabel 1 laat zien waren zes monsters (drie melkpoeders, A, B en C, en drie kindervoedingen, A, D en E) met /9-lactara-antibiotica besmet, met gehalten tussen 0,01 tot 0,08 IE/g (uitgedrukt als penicilline G) wat door behandeling met /9-lactamase bevestigd werd. Drie andere monsters (melkpoeders E, F en kindervoeding G) waren door andere remstoffen dan /3-lactam-antibiotica besmet, omdat de DT's door behandeling met /3-lactamase niet hersteld of bekort werden. Maar door de betrekkelijk ongevoelige bepaling met B. stearothermophilus op agarplaten (gevoelig-heidsgrens 0,005 IE/ml, d.i. 0,05 IE/g melkpoeder) kreeg men met slechts één monster (kindervoeding E) een open remmingszone. Het is duidelijk dat men met onderhavige conductometrische werkwijze lage concentraties aan penicilline G in melkprodukten kan aantonen die er met de gangbare methoden als "negatief" uit zouden komen.

Tabel 1

Aantonen van penicilline G in melkpoeders en

1 Monster 1:10 roet gedeïoniseerd water aangemaakt

2 Sterkte uitgedrukt in penicilline G

3 Geen remstoffen aangetoond 4 Bevatte niet geïdentificeerde remstoffen, anders dan /S-lactamen 5 Behalve kindervoeding E; de andere monsters waren met de agarplaatbepaling met Bacillus stearothermophilus negatief .

Andere uitvoeringsvormen

Uit de voorafgaande beschrijving kan een deskundige gemakkelijk de wezenlijke kenmerken van onderhavige uitvinding vaststellen, en zonder buiten de geest of het kader daarvan te treden kan hij diverse veranderingen en modificaties in de uitvinding aanbrengen om het aan uiteenlopende toepassingen en omstandigheden aan te passen. Al die andere uitvoeringsvormen vallen dus ook onder de conclusies.

Claims (20)

1. Werkwijze voor het aantonen van de eventuele aanwezigheid van een antimicrobiële verbinding in een monster, welke bestaat uit het toevoegen van het monster aan een kweekmedium, het kweken van een microörganisme in het kweekmedium waarbij het opgroeien van dat microörganisme voor remming door die verbinding vatbaar is, het over een tijd meten van een elektrische parameter van dat kweekmedium, het vaststellen van een eerste tijdstip waarop een versnelling in het veranderen van die elektrische parameter optreedt, welke verandering een afspiegeling van de groei van dat microörganisme is, en het met meerdere tijdstippen vergelijken van dat eerste tijdstip om de mogelijke aanwezigheid van de verbinding vast te stellen, waarbij elk van die meerdere tijdstippen op een zelfde wijze gemeten wordt als dat eerste tijdstip, behalve dat die verbinding in een bekende concentratie in dat kweekmedium aanwezig is en er verder een verband bestaat tussen dat tijdstip en de concentratie.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij dat microörganisme een bacterie is.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, waarbij die bacterie Bacillus stearothermophilus is.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, waarbij die verbinding tot de /9-lactam-familie, de tetracycline-fami-lie, de erythromycine-familie, de aminoglycoside-familie, de novobiocine-familie, de chlooramfenicol-farailie of de sulfonamide-familie behoort.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, waarbij die verbinding tot de /3-lactam-familie behoort.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, waarbij die verbinding penicilline G is.

7. Werkwijze volgens conclusie 5, met ook nog de stap dat eerste tijdstip te vergelijken met een tweede tijdstip dat op een zelfde wijze bepaald wordt als dat eerste tijdstip, behalve dat dan aan het kweekmedium β- lactamase toegevoegd wordt waardoor de aanwezigheid van een lactam-antibioticum bevestigd wordt.

8. Werkwijze volgens conclusie 5, waarbij de gevoeligheid van die werkwijze 0,00016 IE/ml is.

9. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij die elektrische parameter de geleidbaarheid is.

10. Werkwijze volgens conclusie 2, waarbij die elektrische parameter de geleidbaarheid is.

11. Werkwijze volgens conclusie 3, waarbij die elektrische parameter de geleidbaarheid is.

12. Werkwijze volgens conclusie 5, waarbij die elektrische parameter de geleidbaarheid is.

13. Werkwijze volgens conclusie 8, waarbij die elektrische parameter de geleidbaarheid is.

14. Werkwijze volgens conclusie 1, met ook nog de stap van het vergelijken van dat eerste tijdstip met een tweede tijdstip dat op een zelfde wijze bepaald wordt als dat eerste tijdstip, behalve dat aan dat kweekmedium een reagens toegevoegd wordt dat de antimicrobiële werking van die verbinding kan opheffen, waardoor de aanwezigheid van die verbinding bevestigd wordt.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, waarbij dat microörganisme een bacterie is.

16. Werkwijze volgens conclusie 15, waarbij die elektrische parameter de geleidbaarheid is.

17. Werkwijze voor het beproeven van een micro-organisme op resistentie tegen een antimicrobiële stof, welke werkwijze bestaat uit de stappen: het kweken van het microörganisme in een medium dat de stof bevat, het over een tijd meten van een elektrische parameter van dat kweekmedium, het vaststellen van een eerste tijdstip waarop een versnelling in het veranderen van die elektrische parameter optreedt, welke verandering een afspiegeling van de groei van dat microörganisme is en het vergelijken van dat eerste tijdstip met een tweede tijdstip dat op een zelfde wijze bepaald wordt als dat eerste tijdstip, behalve dat die verbinding dan in dat kweekmedium afwezig is, waarbij dat onderzochte microörga-nisme "resistent" tegen die verbinding genoemd wordt als die eerste tijdsduur gelijk is aan die tweede tijdsduur en "niet resistent" tegen die verbinding genoemd wordt als die eerste tijdsduur langer dan die tweede tijdsduur is.

18. Werkwijze volgens conclusie 17, waarbij dat onderzochte microörganisme een bacterie is.

19. Werkwijze volgens conclusie 17, waarbij die elektrische parameter de geleidbaarheid is.

20. Werkwijze volgens conclusie 18 waarbij die elektrische parameter de geleidbaarheid is.