KR20140072480A

KR20140072480A - 플로르퀴놀론 항생제에 대한 민감도 보유 미생물이용 색소환원법의 개발 및 이를 이용한 진단법

Info

Publication number: KR20140072480A
Application number: KR1020120140027A
Authority: KR
Inventors: 황규춘; 황주예; 황진선; 윤성훈; 최우영; 박경훈; 김현욱; 오미화
Original assignee: 아이알랩 주식회사
Priority date: 2012-12-05
Filing date: 2012-12-05
Publication date: 2014-06-13

Abstract

본 발명은 플로르퀴놀론항생제에 대한 민감성미생물을 이용하여, 생장조건 최적화, 배지 개발, 지시약 개발 등을 통해, 우유등의 축산물내의 잔류 플로르퀴놀론항생제의 검사킷 개발에 관한 것으로서, 기존의 항체 유래 진단킷 보다 플로르퀴놀론항생제 계열 내 다수 항생제에 대한 검출 민감도의 편차가 최소화 되어 스크리닝 검사에 최적화되었으며, 이를 이용한 진단 방법을 제시함으로써 우유 등의 축산물내의 잔류 플로르퀴놀론항생제를 진단하고 식품내 오염을 예방하는데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

플로르퀴놀론 항생제에 대한 민감도 보유 미생물이용 색소환원법의 개발 및 이를 이용한 진단법{development of a microbial inhibition test with indicator to detect residual fluoroquinolones in food}

본 발명은 플로르퀴놀론항생제에 대해 민감한 세균을 이용하여 최적화된 배지와 생장조건하에서 pH 지시약을 포함한 상태에서 균의 생장유무에 따른 색깔변화를 유도하여 저해제로써의 항생제의 잔류 여부를 판단할 수 있는 검사킷 개발을 목적한다.완성된 검출 킷은 엔로플록사신 등의 플로르퀴놀론항생제 계열 항생제등에 대해 종합적인 검출을 할 수 있는 검사킷을 제시하여, 축산물 등의 식품내의 플로르퀴놀론항생제 계열 항생제의 잔류여부를 정확하게 파악할 수 있는 도구를 제공한다.

식품을 생산하는 동물의 질병 예방, 치료, 성장촉진 및 사료효율을 개선하고 양질의 동물성 식품을 공급하기 위하여 항생물질, 합성항균제, 성장홀몬제 등 여러 다양한 동물용의약품이 사용되고 있다. 페니실린 등의 항생제란 곰팡이나 세균들이 자신의 생존을 위해 다른 세균을 죽이거나 발육을 억제하기 위해 분비하는 물질을 말한다. 즉 세균(박테리아)을 억제하는 물질이다. 따라서 동물 사육에서의 항생제는 세균성 질병을 예방하거나 치료하려는 목적으로 사용하는 것이 기본이다. 그러나 1940년대 테트라싸이클린 계열의 항생제의 제조 부산물을 닭에게 급여했을 때 성장이 촉진되는 것이 발견된 이후 성장촉진의 목적으로 꾸준히 쓰여 왔다. 이러한 성장촉진용 항생제를 에이지피(AGP, Antibiotics Growth Promoter)라 부르기도 한다. 그러나, 아직까지 항생제가 돼지 성장을 촉진하는 정확한 원리는 밝혀지지 않았다. 단지, 유해 미생물의 성장을 억제하고 미생물에 의한 단백질 및 아미노산의 이용을 방지하여 사료의 단백질을 절약하고, 장벽을 얇아지게 하여 영양소가 쉽게 흡수되도록 도와주는 등의 기전을 통해 성장을 촉진하는 것으로 추정되고 있다.

더불어, 다양한 치료용 항생물질의 추가적인 개발과 증가된 사용으로, 각종 세균들이 항생제에 적응하고 저항하는 이른 바 내성균 문제가 발생하고, 현존하는 대부분의 항생제에 저항하는 슈퍼박테리아의 출현이나, 항생제 잔류문제 등이 대두되면서 축산에서의 항생제 사용 규제에 대한 논의가 이루어져 왔으며, 1980~1990년대부터 성장촉진용 항생제 사용을 일부 유럽국가가 사용을 금지하기 시작하였고, 2006년에는 유럽연합(EU) 전체 국가에서 사료에 성장촉진용 항생제 첨가를 금지하였다. 우리나라도 국제적인 추세를 따라 2011년 하반기부터 사료 내 성장촉진용 항생제 첨가를 전면 금지하고 있으나, 무항생제 사육을 위해 성장촉진용 항생제의 사료첨가가 금지됨에 따라, 처방용 항생제의 사용이 급증하는 결과가 일부 나타나고 있다.

플로르퀴놀론 항생제는 광법위한 범주의 병원균에 대한 치료효과를 보유한 관계로 병원용 및 수의용으로 사용되고 있으나, 증가된 사용량에 기인하여 저항성 세균의 빈도 증가가 문제시 되어 왔다. 따라서 플로르퀴놀론 항생제에 대해 축산물 및 수산물에 잔류허용기준을 설정하여 법정기준을 정하여 잔류여부를 관리하고 있으며, 국제식품규격(Codex), 일본, 미국 및 유럽연합(EU)에서도 동 물질에 대해 잔류허용기준을 설정하여 관리하고 있다. 최근에는 국내에서도 노르플록사신, 페플록사신, 오플록사신, 오비플록사신 등에 대한 허가 반려가 이루어진 바 있다.

동물성 식품 중 플로르퀴놀론 항생물질의 잔류물질시험 법으로는 생물학적 방법인 정성시험법과 화학적 방법인 정량분석을 위한 기기분석법으로 구분되며, 정성시험법에는 미생물분석법, 면역분석법, 면역크로마토그라피 법 등이 있느며, 이중 몇개의 서로 다른 미생물균주로 만든 평판에 시료를 직접 배양하거나 디스크 또는 면봉을 이용하여 배양 후 억제대 폭이 일정수준 이상인 것을 양성으로 판정하여 항생물질의 계통을 추정하는 방법인 이이씨법(EEC 5 Plate Test), 캐스트(CAST, California Antibiotic and Sulfa Test), 7 plate 법 등이 이용되고 있다. 이러한 방법들은 E coli ATCC11303 균주를 이용하여 평판배지위에 시료액을 흡수시킨 디스크를 놓아, 억제대의 환 크기를 측정하여 플로르퀴놀론 항생제의 잔류여부를 판단하는 방법이며, 면역분석법 및 면역크로마토그라피 법은 플로르퀴놀론 항생제에 대해 결합력이 있는 항체를 이용하여 유사 항생제등에 대한 결합 및 경쟁반응을 이용하여 결합반응의 저해 정도를 측정하는 방법이다. 종류에 따라 화학적 구조차이에 기인하여, 결합력의 차이가 발생되며, 따라서, 검출능에 있어 편향되는 문제점이 나타난다.

화학적 분석방법으로는 고속액체크로마토그라피 (HPLC) 등을 이용한 기기분석법이 사용되며, C18 카트리지나 에이치엘비(HLB, hydrophilic lipophilic balance) 컬럼 등으로 정제하는 방법이 주로 사용되고 있으며, 시료를 C18 분말과 혼합하여 시린지 컬럼에 채우고 수산함유 메탄올로 용출하는방법을 이용한다. 검출은 유도체화를 통해 형광(FL) 검출을 하거나 질량분석기(mass detector) 를 이용한 분석이 이루어지고 있다.

동물성 식품내에 잔류할 가능성이 있는 플로르퀴놀론항생제에 대한 적정한 검출능을 보유한 미생물학적 검사킷의 활용은 식품안전에 크게 기여할 것으로 판단되나, 현재까지 보급된 premi test(DSM, 네덜란드), kis test (charm sciences, 미국) 등의 미생물학적 제품은 베타락탐계, 테트라싸이클린계, 썰폰아마이드계 등의 주요 항생제의 검출은 부분적으로 MRL 이내 농도에서 가능하나, 플로르퀴놀론항생제에 대해서는 검출능을 보유하지 못한다. 더불어 지역별 수의위생 검사소 등에서 공전법으로 사용되는 평판배지 기반 디스크 억제환 측정법 등은 배양시간이 16시간 정도로 길고, 신선배지 사용에 따른 시험결과의 편차 등에 따라 검사에 애로사항이 존재한다. 따라서, 미생물기반 검사킷은 빠른시간내에 저렴한 비용으로 안정적인 검사진행이 가능하며, 검사결과의 재현성 또한 증가될 것이다. 본 발명에서는, 이러한 문제점을 해결하고자 플로르퀴놀론항생제에 대해 민감성을 보유한 미생물을 이용하여, 미생물 생장억제 여부를 pH지시약이 존재하는 최적화 배지를 키트화 하여, 축산물내의 플로르퀴놀론 항생제의 안정적 잔류검사가 가능한 방법을 제안하고자 하는 것이다.

본 발명은 플로르퀴놀론항생제에 대해 민감성을 보유한 미생물을 이용하여, 미생물 생장/억제 여부를 pH 지시약의 색깔변화를 이용하여 확인할 수 있는 최적화 배지를 키트화하여 플로르퀴놀론 전반에 대해 MRL 수준의 잔류검사가 가능한 검사킷을 개발하는 것이다.

본 발명에 의한 미생물이용 생장억제법 잔류 검사 킷은 기존의 상업화 검사킷의 검출능을 보완하여 플로르퀴놀론항생제에 대한 검사가 가능할 뿐 아니라, 이를 이용하여, 기존 EEC-5 plate 법 등의 시행을 대체할 수 있게 되어 필요한 노동력의 절약이 가능하게 될 것이다.

도 1은 균주에 대한 플로르퀴놀론 항생제 최소발육억제농도(MIC, minimal inhibition concentration)를 측정한 것이다.
도 2는 플로르퀴놀론 항생제 8종에 대한 최소발육억제농도(MIC, minimal inhibition concentration)를 측정한 것이다
도 3은 enrofloxain에 대한 검출능 보유 생장억제 킷 개발 조건을 확인한 것이다.
도 4는 플로르퀴놀론 8종의 항생제에 대해 개별적으로 검출능여부를 확인한 것이다. 각각 10 - 50 ppb 범위에서 pH 지시약의 색변화를 통한 음/양성 판정이 가능함을 확인하였다.

본 발명은 신규한 균주인 ATCC 11303 Escerchia coli (대장균) 를 비롯한 플로르퀴놀론항생제에 대한 감수성을 보유한 균주를 확보하고, 이를 이용하여 균주의 보관성과 열안정성을 증진시킬 수 있는 보존제가 첨가된 배지조건 설정, 배양 시 가열 및 배지 내 영양원에 의한 생장 개시 및 잔류 플로르퀴놀론 항생제에 의해 생장 지체 또는 생장억제 현상의 최적화를 통한 플로르퀴놀론 항생제 잔류 여부를 검사할 수 있는 킷 개발에 관한 것이다.

<실시 예 1> ATCC 11303 Escerchia coli (대장균) 등에 대한 플로르퀴놀론 항생제 최소발육억제농도(MIC, minimal inhibition concentration) 측정

M. luteus(Kocuria rhizophila) ATCC 9341, Escherichia coli ATCC 11303 균주를 시험일 하루 전 tryptic soy broth 20 mL에 직경 2mm 백금이로 1 loopful 을 접종하여 M. luteus(Kocuria rhizophila) ATCC 9341는 32℃에서 E. coli ATCC 11303는 37℃ 항온수조에서 16시간 진탕 배양하였다. 이 균액 1mL를 19 mL의 멸균증류수에 희석하여 사용(균 농도는 약 2×10⁷CFU/mL)하였으며, 이희석 균액은 냉장 보관하면서 약 1주일간 사용하였다. 균액을 이용하여 각 균주는 M media에서 36-55℃로 배양 후 분광광도계 600nm으로 균 농도가 약 1*10⁶CFU/mL가 되도록 하였다. 이 균액을 다시 test용 medium을 이용하여 1:3으로 희석하고, 96well 마이크로플레이트에 100uL씩 분주를 한다. 최종 200uL가 되게 균주가 들어있는 100uL를 제외한 나머지 100uL에 항생제를 처리하고 대조 well로써는 항생제가 처리되지 않은 배지 100uL만 분주 한다. 균 접종이 끝난 마이크로 플레이트는 35-55℃에서 6-16시간 동안 생장분석기 상에서 배양한 후 결과 내재된 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정한다. [도 1]에 제시된 바와 같이 Escerchia coli 균주에 의한 enrofloxacin의 MIC 값이 가장 민감한 것으로 판정되었으며 다른 균주들에 대한 MIC 값은 10 배 이상 높게 나타났다. 더불어 플로르퀴놀론계 항생제 8 종에 대한 각각의 MIC 값을 측정하여 [도 2]에 제시되었으며, 8종의 항생제에 대해 10-100 ppb 농도에 균일한 MIC 값을 나타내어 이를 이용한 생장억제 킷 개발이 가능함을 제시하였다.

<실시 예 2> 미생물 생장억제 킷 조건 설정

미생물 생장 억제 킷은 미생물의 생장과정에서 배출되는 산의 증가에 따른 pH 지시약의 색 변화의 의하므로, 변색에 필요한 산의 증가는 균의 생장속도에 의해 영향을 받는다. 따라서, 동일한 균을 사용하는 경우에도 배지조성에 의해 산의 생성정도가 다를 수 있으므로 검출감도에 영향을 줄 수 있다. 주요영양소 중의 탄소원과 질소원 등의 농도변화에 따른 변색시간 및 검출감도의 영향을 관찰하였다.

대수기 생장상태의 균을 이용하여, 균의 수에 따른 enrofloxacin 항생제의 검출능에 대한 평가를 수행하였다. 문헌에 보고된 바와 같이 10⁵ CFU/mL 내외의 농도에서 검출능과 변색시간이 양호한 것으로 [도 3]에 제시 하였다. 동일 균주의 경우에도 배지의 조성에 따른 감도에 큰 차이가 있는 것을 확인하였으며, 배지조성변화를 통해 최적화 하였다.

<실시 예 3> 개발된 생장억제 킷을 이용한 플로르퀴놀론 항생제에 대한 검출능 확인

확보된 조건으로 quinolone 항생제 전반에 대한 검출능 확보를 확인코자 8종의 항생제에 대한 검출킷 개발을 시도하였다. 8종의 플로르퀴놀론 항생제를 10~100 ppb 농도로 목장에서 수집된 가공처리 전 단계의 원유에 첨가하여 시료를 준비하였다. 배지, pH 지시약, 균주가 첨가된 미생물 생장억제 킷을 제조하여, 각각의 우유 시료를 50 ul 첨가한 후, 37℃ 블록 배양기에서 배양한 후, 2-5 시간 동안 색변화를 관찰하였다. [도 4]에서 8종 모두에서 10~50 ppb 범위에서 검출능을 확인할 수 있었으며, 국내의 잔류법규농도 내외에서 검출이 가능한 킷 개발이 이루어졌음을 확인하였다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 새로운 플로르퀴놀론에 민감한 미생물과 이를 포함하는 미생물생장억제 킷 조성물은 기존의 식품공전 등의 법정 시험법에 비해 편의성과 감도 재현성이 우수하여 이를 포함하는 진단킷트 및 진단방법은 우유 등의 축수산물내에 존재하는 플로르퀴놀론을 안정적으로 4-5시간 이내에 신속하게 진단하게 하여 플로르퀴놀론의 식품내 잔류 예방을 위한 신속한 대응이 가능하리라 기대된다

Claims

플로르퀴놀론 계열 항생제에 민감한 미생물 균주를 이용하여, 배지, pH 지시약이 첨가된 미생물 생장억제 킷을 제조하고, 우유 등의 축수산물의 용액 시료를 제조된 킷에 첨가한 후 생장에 따른 pH 지시약의 색깔 변화여부에 따라 플로르퀴놀론 항생제의 존재여부를 파악하는 진단방법으로,
1) 플로르퀴놀론 계열 항생제에 민감도를 보유한 세균 균주를 확보하는 단계;
2) 확보된 민감성 세균균주를 킷 제조에 사용하기 위해 배양 및 안정화를 통해 준비하는 단계;
3) 상기 2)의 민감성 세균균주를 이용하여, 영양배지, pH 지시약 등이 포함된 생장억제 킷 을 제조하는 단계; 및
4) 제조된 킷을 이용하여 생물학적 액체 시료를 첨가한 후, 적정온도에서 배양하고 색변화 관찰을 통해 생장여부를 확인하고 플로르퀴놀론 항생제의 잔류여부를 파악하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 플로르퀴놀론 계열 항생제 잔류 진단방법.
제 1 항에 있어서, 상기 4) 생물학적 액체 시료는 우유, 꿀, 혈액, 혈청, 소변 또는 동물조직으로 부터 분쇄 추출한 액체인 것을 특징으로 하는 진단방법.
제 1 항에 있어서, 상기 1)민감성 세균은 Escherichia coli ATCC 11303 및 이와 유사한 Escherichia coli 균주 및 Moraxella sp. 균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
제 1 항에 있어서, 상기 3)의 생장억제 킷은 질소원, 탄소원 무기염류 및 bromocresol purple 등의 pH 지시약 등을 포함하고 40-50 도 내외에서 활성화된 세균균주를 포함하는 미생물 배양 배지 형태의 킷을 포함하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
제 1 항에 있어서, 플로르퀴놀론 항생제의 종류는 국내외 동물에 사용되는 처방 및 판매 허가된 항생제 및 동물의 체내에 흡수/주입된 후 대사에 의해 변형된 항생제를 포함하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 진단방법.