CN106554989A - 一种用于检测乳品中β-内酰胺酶的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测乳品中β-内酰胺酶的试剂盒及其检测方法。试剂盒由检测主体及检测试剂两部分组成，检测主体为包被好的含有检测菌体、酸碱指示剂及供菌体生长所需营养物质的96孔板，检测试剂为含β-内酰胺类抗生素的有机溶液。所述检测菌体为嗜热脂肪芽孢杆菌悬液；所述酸碱指示剂为溴甲酚紫；所述检测试剂为用乙腈溶解的哌拉西林。本发明基于微生物生长抑制因素解除法，以颜色的变化反映微生物的生长状态，从而间接地显示出牛奶中β-内酰胺酶的含量情况。本发明具有操作简便、快捷、高效、准确等特点，且对设备要求低、无需专业性操作、对结果判读明朗。

Description

一种用于检测乳品中β-内酰胺酶的试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种乳品中添加的β-内酰胺酶的试剂盒及其检测方法。

背景技术

近年来，随着我国畜牧养殖业的迅速发展，奶产量大幅度提高，新鲜牛奶和奶制品已经成为人民生活食品中的重要组成部分。然而，抗生素在现代畜牧业中的广泛应用，不可避免地造成牛奶中抗生素残留。β-内酰胺酶类抗生素是一类来源于微生物的光谱抗生素，大量的用于畜禽疾病的预防和治疗。为了提高动物性食品的产量，有一些还被作为饲料添加剂使用，从而大大增加了抗生素在食品和环境中残留的风险，引起随之而来的人过敏反应、微生物抗药性、发酵乳产品生产等多种问题。Korycka-Dahl M.等(1985)利用β-内酰胺酶降解牛奶中残留的抗生素，可降低至常规检测方法无法检测的水平。一些不法分子将β-内酰胺酶用作牛奶中抗生素的分解剂，以掩盖其抗生素残留超标的事实，从而使抗生素超标奶变成合格奶，这就造成了外源性β-内酰胺酶的违法添加。

2009年2月4日，根据卫生部等九部门《关于开展全国打击违法添加非使用物质和滥用食品添加剂专项整治的紧急通知》的规定，为配合全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治工作的深入开展，专项整治专家委员会提出《食品中可能违法添加的非食用物质名单》，其中就包括β-内酰胺酶。外源性β-内酰胺酶是我国不允许在食品中使用的化学物质，它的使用掩盖了牛奶中抗生素的残留的事实。

对于β-内酰胺酶，现有检测方法的原理多数基于酶联免疫法、理化法、微生物法及仪器检测，酶联免疫法的检测灵敏度取决于受体和配体的纯度及特异性且成本较高；理化法检测的结果一定程度上受制于人员的操作；仪器法需要特定的设备且检测成本昂贵；微生物法在对β-内酰胺酶的检测方面整体效果较佳，如美国NCCLS推荐的纸片扩散法，但微生物法对结果的判读均基于对抑菌圈的观察，在结果判读上不是很明朗，而且也会存在人为因素的判读误差。本发明基于微生物生长抑制因素解除法，将菌体生长的抑制情况与颜色的变化向结合，使得对结果的判读更为明朗；检测过程中只用到两种不同温度的保温设备，无需特定较精密的仪器；操作简便无需专业性操作且灵敏度较高，最低检出限可达4U。因此本发明可以实现对乳品中β-内酰胺酶简便、快捷、高效、准确的检测。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种简便、快捷、高效、准确的检测β-内酰胺酶的试剂盒及其检测方法。

一种β-内酰胺酶检测试剂盒，由检测主体及检测试剂两部分组成，检测主体为包被好的含有检测菌体、酸碱指示剂及供菌体生长所需营养物质的96孔板，检测试剂为含β-内酰胺类抗生素的有机溶液。

所述检测菌体为嗜热脂肪芽孢杆菌悬液；

所述酸碱指示剂为溴甲酚紫；

所述检测试剂为用乙腈溶解的哌拉西林，浓度为5-15μg/mL，于-20℃存放。进一步，芽孢菌悬液的制备过程可分为平皿法、菌体浓缩平皿法和摇菌法，具体步骤如下：

1.平皿法：

1)从已活化的嗜热脂肪芽孢杆菌的菌落群中取一菌落接种至含无菌液体培养基的试管中，并置于56-65℃环境下摇菌24h左右；

2)次日将菌液以一定接种量均匀涂布于含固体培养基的培养皿中，并置于56-65℃环境下培养2-3d；

3)将平皿置于37℃或70℃再次培养3-4d；

4)用PBS缓冲液将菌体从培养基上洗脱下来，置于离心管中并置于80-85℃条件下15-20min以得到较纯的芽孢菌悬液。

2.菌体浓缩平皿法：

1)从已活化的嗜热脂肪芽孢杆菌的菌落群中取一菌落接种至200ml液体培养基中并于56-65℃环境下摇菌24h左右；

2)次日将菌液离心，用PBS缓冲液将菌液浓缩为原体积的1/20-1/5；

3)将浓缩的菌液涂布接种至含固体培养基的平皿上，并置于56-65℃环境下培养1d左右；

4)用PBS缓冲液将菌体从培养基上洗脱下来，置于离心管中并置于80-85℃条件下15-20min以得到较纯的芽孢菌悬液。

3.摇菌法：

1)从已活化的嗜热脂肪芽孢杆菌的菌落群中取一菌落接种至200ml液体培养基中并于56-65℃环境下摇菌24h左右；

2)将菌液离心，用PBS缓冲液将菌液浓缩为原体积的1/20-1/5，并于64℃培养24-36h；

3)次日于80-85℃条件下15-20min以得到较纯的芽孢菌悬液(注：此法操作较为简单，但芽孢产出率较前两种方法要低)。

进一步，固体培养基的组成为蛋白胨8％-12％、酵母提取物2％-5％、氯化钠3％-10％、琼脂10％-17％、超纯水适量；液体培养基的组成为蛋白胨8％-11％、酵母提取物1％-8％、氯化钠2％-10％、超纯水适量。

进一步，检测主体的制备，具体步骤如下：将制备好的检测培养基在110-120℃条件下高温灭菌30min，待培养基温度降至60-70℃时，加入一定量的芽孢菌悬液使得芽孢在培养基中的总浓度在6*10⁵-4*10⁶CFU/ml范围内，均匀混合后将培养基加入96孔板的酶标板中，用热封铝膜进行热封，并置于4-8℃环境下存放；

进一步，检测培养基组分为：蛋白胨5％-15％、葡萄糖2％-10％、氯化钠2％-10％、琼脂2％-15％、羧甲基纤维素钠2％-10％、瓜尔胶2％-10％、溴甲酚紫1％-5％、乙醇溶液0.1％-1％。

使用上述试剂盒检测乳品中的β-内酰胺酶，具体步骤如下：

第一步，取一定量的检测试剂并加至一定体积的待测奶样中，均匀混合后至40℃的环境下预孵育1h；

第二步，将预处理的奶样加至检测主体的微孔中，用粘性胶膜密封并至64℃环境下再次孵育3h左右。若待测奶样中含有β-内酰胺酶且含量在检出限以上，则经过预处理阶段检测试剂中的有效成分被降解，微生物生长不受抑制，菌体产酸从而使微孔中指示剂呈现黄色及黄绿色；反之，若待测奶样中不含β-内酰胺酶或含量在检出限以下，则奶样整体仍具有抗菌性，微生物无法生长产酸，微孔中指示剂保持原有的紫色或蓝紫色。

具体实施方式

实施例1：β-内酰胺酶检测试剂盒制备

一种β-内酰胺酶检测试剂盒，由检测主体及检测试剂两部分组成，检测主体为包被好的含有检测菌体、酸碱指示剂及供菌体生长所需营养物质的96孔板，检测试剂为含β-内酰胺类抗生素的有机溶液。

所述检测菌体为嗜热脂肪芽孢杆菌悬液；

所述酸碱指示剂为溴甲酚紫；

所述检测试剂为用乙腈溶解的哌拉西林，浓度为10g/mL，并于-20℃存放。

1.检测主体的制备

芽孢菌悬液的制备

a.平皿法：

5)从已活化的嗜热脂肪芽孢杆菌的菌落群中取一菌落接种至含无菌液体培养基的试管中，并置于56-65℃环境下摇菌24h左右；

6)次日将菌液以一定接种量均匀涂布于含固体培养基的培养皿中，并置于56-65℃环境下培养2-3d；

7)将平皿置于37℃或70℃再次培养3-4d；

8)用PBS缓冲液将菌体从培养基上洗脱下来，置于离心管中并置于80-85℃条件下15-20min以得到较纯的芽孢菌悬液。

b.菌体浓缩平皿法：

5)从已活化的嗜热脂肪芽孢杆菌的菌落群中取一菌落接种至200ml液体培养基中并于56-65℃环境下摇菌24h左右；

6)次日将菌液离心，用PBS缓冲液将菌液浓缩为原体积的1/20-1/5；

7)将浓缩的菌液涂布接种至含固体培养基的平皿上，并置于56-65℃环境下培养1d左右；

8)用PBS缓冲液将菌体从培养基上洗脱下来，置于离心管中并置于80-85℃条件下15-20min以得到较纯的芽孢菌悬液。

c.摇菌法：

4)从已活化的嗜热脂肪芽孢杆菌的菌落群中取一菌落接种至200ml液体培养基中并于56-65℃环境下摇菌24h左右；

5)将菌液离心，用PBS缓冲液将菌液浓缩为原体积的1/20-1/5，并于64℃培养24-36h；

6)次日于80-85℃条件下15-20min以得到较纯的芽孢菌悬液(注：此法操作较为简单，但芽孢产出率较前两种方法要低)。

进一步，固体培养基的组成为蛋白胨8％-12％、酵母提取物2％-5％、氯化钠3％-10％、琼脂10％-17％、超纯水适量；液体培养基的组成为蛋白胨8％-11％、酵母提取物1％-8％、氯化钠2％-10％、超纯水适量。

检测主体制备：

将制备好的检测培养基在110-120℃条件下高温灭菌30min，待培养基温度降至60-70℃时，加入一定量的芽孢菌悬液使得芽孢在培养基中的总浓度在6*10⁵-4*10⁶CFU/ml范围内，均匀混合后将培养基加入96孔板的酶标板中，用热封铝膜进行热封，并置于4-8℃环境下存放；

进一步，检测培养基组分为：蛋白胨5％-15％、葡萄糖2％-10％、氯化钠2％-10％、琼脂2％-15％、羧甲基纤维素钠2％-10％、瓜尔胶2％-10％、溴甲酚紫1％-5％、乙醇溶液0.1％-1％。

2.检测试剂的制备

称取适量的哌拉西林，用乙腈溶解，使得终浓度为5-15μg/mL，并置于-20℃存放。

实施例2：样品检测

取1微升检测试剂并加至1毫升的待测奶样中，均匀混合后至40℃的环境下预孵育1h；将预处理的奶样加至检测主体的微孔中，用粘性胶膜密封并至64℃环境下再次孵育3h左右。若待测奶样中含有β-内酰胺酶且含量在检出限以上，则经过预处理阶段检测试剂中的有效成分被降解，微生物生长不受抑制，菌体产酸从而使微孔中指示剂呈现黄色及黄绿色；反之，若待测奶样中不含β-内酰胺酶或含量在检出限以下，则奶样整体仍具有抗菌性，微生物无法生长产酸，微孔中指示剂保持原有的紫色或蓝紫色。

实施例3：试剂盒最低检测线的测试

取1ml 446万IU/ml的β-内酰胺酶(从市场上买到的)；用阴性奶样稀释得到含4IU/ml的奶样；按照试剂盒的操作步骤进行操作；检测结果β-内酰胺酶为阳性。

Claims (4)

1.一种用于检测β-内酰胺酶的试剂盒，其特征在于，包括检测主体及检测试剂两部分，检测主体为包被好的含有检测菌体、酸碱指示剂及供菌体生长所需营养物质的96孔板，检测试剂为含β-内酰胺类抗生素的有机溶液；所述酸碱指示剂为溴甲酚紫；所述检测试剂为用乙腈溶解的哌拉西林，其浓度为6-15g/mL。

2.根据权利要求1所述的用于检测β-内酰胺酶的试剂盒，其特征在于，所述检测菌体为嗜热脂肪芽孢杆菌悬液；其芽孢菌悬液的制备方法为：

a.平皿法：

1)从已活化的嗜热脂肪芽孢杆菌的菌落群中取一菌落接种至含无菌液体培养基的试管中，并置于56-65℃环境下摇菌24h左右；

2)次日将菌液以一定接种量均匀涂布于含固体培养基的培养皿中，并置于56-65℃环境下培养2-3d；

3)将平皿置于37℃或70℃再次培养3-4d；

4)用PBS缓冲液将菌体从培养基上洗脱下来，置于离心管中并置于80-85℃条件下15-20min以得到较纯的芽孢菌悬液；

b.菌体浓缩平皿法：

1)从已活化的嗜热脂肪芽孢杆菌的菌落群中取一菌落接种至200ml液体培养基中并于56-65℃环境下摇菌24h左右；

2)次日将菌液离心，用PBS缓冲液将菌液浓缩为原体积的1/20-1/5；

3)将浓缩的菌液涂布接种至含固体培养基的平皿上，并置于56-65℃环境下培养1d左右；

4)用PBS缓冲液将菌体从培养基上洗脱下来，置于离心管中并置于80-85℃条件下15-20min以得到较纯的芽孢菌悬液；

c.摇菌法：

1)从已活化的嗜热脂肪芽孢杆菌的菌落群中取一菌落接种至200ml液体培养基中并于56-65℃环境下摇菌24h左右；

2)将菌液离心，用PBS缓冲液将菌液浓缩为原体积的1/20-1/5，并于64℃培养24-36h；

3)次日于80-85℃条件下15-20min以得到较纯的芽孢菌悬液；

其中，固体培养基的组成为：蛋白胨8％-12％、酵母提取物2％-5％、氯化钠3％-10％、琼脂10％-17％、超纯水适量；液体培养基的组成为：蛋白胨8％-11％、酵母提取物1％-8％、氯化钠2％-10％、超纯水适量。

3.根据权利要求1所述的用于检测β-内酰胺酶的试剂盒，其特征在于，检测主体的制备方法为：

将制备好的检测培养基在110-120℃条件下高温灭菌30min，待培养基温度降至60-70℃时，加入一定量的芽孢菌悬液使得芽孢在培养基中的总浓度在6*10⁵-4*10⁶CFU/ml范围内，均匀混合后将培养基加入96孔板的酶标板中，用热封铝膜进行热封，并置于4-8℃环境下存放；

其中检测培养基组分为：蛋白胨5％-15％、葡萄糖2％-10％、氯化钠2％-10％、琼脂2％-15％、羧甲基纤维素钠2％-10％、瓜尔胶2％-10％、溴甲酚紫1％-5％、乙醇溶液0.1％-1％。

4.一种使用权利要求1所述的试剂盒检测β-内酰胺酶的方法，具体步骤如下：

第一步，取一定量的检测试剂并加至一定体积的待测奶样中，均匀混合后至40℃的环境下预孵育1h；

第二步，将预处理的奶样加至检测主体的微孔中，用粘性胶膜密封并至64℃环境下再次孵育3h左右。若待测奶样中含有β-内酰胺酶且含量在检出限以上，则经过预处理阶段检测试剂中的有效成分被降解，微生物生长不受抑制，菌体产酸从而使微孔中指示剂呈现黄色及黄绿色；反之，若待测奶样中不含β-内酰胺酶或含量在检出限以下，则奶样整体仍具有抗菌性，微生物无法生长产酸，微孔中指示剂保持原有的紫色或蓝紫色。