DE69214931T2

DE69214931T2 - Verfahren und Kit zum Nachweis von mikrobiellem Metabolismus

Info

Publication number: DE69214931T2
Application number: DE69214931T
Authority: DE
Inventors: Ruth F Eden; Thomas E Thompson
Original assignee: Difco Laboratories Inc
Current assignee: Difco Laboratories Inc
Priority date: 1990-06-22
Filing date: 1992-03-03
Publication date: 1997-06-05
Anticipated expiration: 2012-03-04
Also published as: US5164301A; ES2093174T3; EP0558827B1; JP3095833B2; DE69214931D1; ATE144796T1; JPH05137594A; EP0558827A1

Description

TECHNISCHER BEREICH

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Kit zum Nachweis von Mikrobenmetabolismus in einer flüssigen Probe. Noch genauer, die vorliegende Erfindung verwendet den Nachweis von Mikrobenmetabolismus sowohl, um das Vorhandensein von Mikroorganismen in Körperflüssigkeiten, Nahrungsmitteln, Wasser, bei Bestimmungen der Biobeladung und Biobelastung zu bestimmen, wie auch zur antimikrobiellen Suszeptibilitäts-Prüfung und für die Mikroben-Identifizierungstechnologie.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Ermittlung der Anwesenheit von Mikroorganismen, ihre Auszählung, Identifizierung und Suszeptibilität gegenüber antimikrobiellen Mitteln sind die Hauptziele eines diagnostischen Mikrobiologen. Die vorliegende Erfindung verwendet ein Verfahren zum Nachweis von Mikrobenmetabolismus, das auf jeden dieser Bereiche angewandt werden kann.
Der frühe Nachweis von Bakterien in Körperflüssigkeiten (Blut, Urin, Rückenmarksflüssigkeit, Abszeß-Exsudaten) ist von höchster Wichtigkeit. Das übliche Verfahren zum Nachweis von Bakterien im Blut besteht darin, 5 ml der Flüssigkeit in ein Kulturmedium zu inokulieren und auf das Auftreten einer Trübung zu warten, was ein Hinweis auf Bakterienwachstum ist. Die Flaschen werden täglich auf Trübung oder andere Veränderungen untersucht, die ein Mikrobenwachstum aufzeigen. Obwohl dies Verfahren mühselig und langsam ist, ermöglicht es den Nachweis der meisten Organismen. Wenn ein Organismus festgestellt worden ist, wird eine kleine Aliquote des den Organismus enthaltenden Kulturmediums in eine Petrischale überführt, die geeignete Wachstunismedien enthält. Die anschließend isolierten Kolonien werden zur Identifizierung und zur Prüfung der antibiotischen Suszeptibilität verwendet.
Etwa Mitte der Siebzigerjahre dieses Jahrhunderts wurde eine radiometrische Methode zum Nachweis biologischer Aktivität in Blut entwickelt. Bei dem Verfahren wurden Blutproben in ein geeignetes Wachstumsmedium inokuliert, das einen ¹&sup4;C-haltigen Kohlenstoff und eine Energiequelle enthält. Das inokulierte Medium wird für einen geeigneten Zeitraum inkubiert, und ein Teil der Gasatmosphäre wird auf ¹&sup4;CO&sub2; untersucht ((U.S. Patent Nr. 3,676,679, erteilt Juli 1972). Ein kommerzielles Instrument, das diese Methode verwendet, ist von der Firma Becton Dickinson, Johnston Laboratories, 383 Hillen Road, Towson, Maryland 21204, erhältlich. Zu den Nachteilen des Systems gehören die damit verbundene Gefährdung aufgrund der Notwendigkeit, radioaktives Material zu handhaben, Umgebungsverschmutzung, die sich aus einem mehrfachen Eintritt einer Nadel durch ein Septum in den Kopfraum der Probe ergibt, und der Mangel der Automatisierung. Kürzlich wurde von Becton Dickinson ein nicht-radiometrisches Verfahren zum Nachweis von CO&sub2; in der Gasatmosphäre eingeführt, mit dem die Notwendigkeit, radioaktives Material zu handhaben, eliminiert wird.
Ein ideales System zum Nachweis von Organismen in Körperflüssigkeiten sollte vollständig automatisiert (ohne manuelle Betätigung) sein, schnell die Anwesenheit von Mikroorganismen detektieren und eine nicht-invasive Probennahme haben.
Der Nachweis und die Auszählung von Mikroorganismen in industriellen Proben (Nahrungsmitteln, Kosmetika, wässrigen und pharmazeutischen Proben, Wasser) ist einem unterschiedlichen Technologieweg gefolgt. Das Standardverfahren zur Analyse von Proben ist die Plattenzählmethodik der Standard Methods for the Examination of Water and Water Waste (185), 7. Ausg. APHA, AWWA, WPCF (S. 860-866). Bei diesem Verfahren wird eine Probe homogenisiert und mit sterilem Wasser verdünnt. Jede Dezimalverdünnung von 10-1 bis 10-4 des Homogenats wird in eine Petrischale zusammen mit einem Nährmedium gegossen. Die Schale wird 24 bis 48 Stunden inkubiert, und die Anzahl der Kolonien auf der Platte wird gezählt. Als Alternative verwenden einige Laboratorien jetzt automatisierte Kolonienzähler. Auf jeden Fall ist das Standard-Plattenzählverfahren (standard plate count, SPC) außerordentlich zeitaufwendig, kostspielig und mühselig. Außerdem korrelieren die kolonienbildenden Einheiten nicht immer mit den erwünschten Sicherheitsparametern, die geschätzt werden.
Es wurden eine große Vielzahl alternativer Methoden zum schnelleren Nachweis und zur schnelleren Auszählung von Mikroorganismen in industriellen Proben eingeführt, zu ihnen gehören beispielsweise: Impedanz, Konduktanz, Trübung, CO&sub2;, ATP-Bestimmung etc. Die Impedanz- und Konduktanz-Verfahren messen Änderungen der elektrischen Eigenschaften des Wachstumsmediums infolge von Bakterienmetabolismus. Sowohl Impedanz wie auch Konduktanz führen automatisch zu einer Vollautomatisierung und haben einen viel schnelleren Nachweis von Mikro- Organismen zur Folge, als er mit der Plattenzählmethodik möglich ist. Zu den Beschränkungen dieser Methoden gehören die Empfindlichkeit des Signals gegenüber elektrischen Streuungsstörungen, Empfindlichkeit gegenüber Temperaturschwankungen, keine sichtbare Vergleichsmöglichkeit, um sicherzustellen, daß die Daten richtig sind, und folglich können sich häufig falsche positive Befunde ergeben.
Bei dem Trübungsverfahren wird die benötigte Zeit gemessen, um eine bestimmte Absorption zu erhalten. Daraus werden Wachstumskurven abgeleitet. Zu den Nachteilen des Systems gehören Störungen aufgrund von trübem Material in den Proben, was die Notwendigkeit zu Verdünnungen zur Folge hat. Das Verfahren neigt dazu, langsamer zu sein als die Impedanz, aber schneller als SPC.
Das ideale System sollte vollautomatisiert sein, Mikroorganismen schnell nachweisen und auszählen und eine visuelle Vergleichsmöglichkeit besitzen.
Die gebräuchlichsten Methoden zur Identifizierung von Bakterien betreffen die biochemischen Eigenschaften der Organismen. Jeder Organismus besitzt einen spezifischen Satz von Enzymen. Wenn eine Reihe von chemischen Reaktionen in Wachstumsmedien durchgeführt werden, können Organismen durch eine Kombination negativer und positiver Reaktionen identifiziert werden, die wirkungsvoll einen biochemischen Fingerprint des Organismus zur Verfügung stellen.
Zu typischen Identifizierungsreaktionen gehören Kohlehydrat-Fermentation, Verwendung von Substraten, wie Citrat und Harnstoff, Herstellung von Hydrogensuifid, Indol, Lysin Decarboxylase etc., oder die Inhibierung, die sich durch Antibiotika ergibt. Ein Reaktionsergebnis wird durch eine sichtbare Farbänderung in dem Medium oder durch die Anwesenheit von Trübung bestimmt.
Das Farbreagens ist in den meisten Fällen ein pH-Wert Indikator, der die Alkalinität oder Acidität mißt, die sich aus den chemischen Reaktionen ergibt. Ein anderer Mechanismus für eine Farbentwicklung ist das enzymatische Spalten von Chromogenen. Eine Anzahl manueller Systeme, wie API20 (Analytab Products, Plain View, N.Y.), EnterotubeII (Roche Diagnostis, Nutly, NJ), Minitek (BBL Microbiological systems, Cockeysville, MD) basieren auf diesem Prinzip.
Die positiven und negativen Tests erzeugen eine Profilzahl, die unter Verwendung einer Systemdatenbank mit einer Organismusidentifizierung korreliert werden kann. Die Ergebnisse sind normalerweise in 12 bis 18 Stunden erhältlich, und es ist ein beträchtliches Maß an manueller Handhabung erforderlich.
Der Trend der letzten zehn Jahre ging zu einer Automatisierung dieser Tests, um die Handarbeit gegenüber der technischen Zeit zu verringern und um in einigen Fällen die Zeit zu vermindern, um Ergebnisse zu erhalten. Das Autobac IDS System (General Diagnostics, Morris Plains, NJ) ist ein halbautomatisches System und mißt Mikrobenwachstum durch Lichtstreuung unter einem festen Winkel von 35º (U.S. Pat. Nr. RE28,801). Das Automicrobic System (Vitek System, Inc., Hazelwood, MO) ist ein vollautomatisiertes System (Gibson et al., US. Pat. Nr. 3,957,583; Charles et al., U.S. Pat. Nr. 4,118,280; und Charles et al., U.S. Pat. Nr. 4,116,775).
Die Bakteriensuspension wird in kleine Vertiefungen einer Kartenküvette gezogen. Die Karten werden dann in die Maschine eingesetzt, die die Änderung bei der optischen Absorption überwacht. Die Karte wird automatisch in den Meßschlitz bewegt und wird alle 30 Minuten überwacht. Das Avantage Microbiology Center (Abbott Laboratories, Irving, TX) verwendet Änderungen der optischen Dichte und Trübung. American Microscan (Baxter Health Care Corp., West Sacramento, CA) hat ein automatisiertes System, das jede Vertiefung einer Mehrfachvertiefungs-Schale scannt, die viele Fluoreszenz- Assays aufflüssiger Basis enthält. Eine einzige Lichtquelle wird durch die Vertiefungen geführt. Die Fluoreszenz einer jeden Vertiefung wird nacheinander abgelesen. Die so erhaltene Information der Fluoreszenszintensität wird zu einem Rechner zur Interpretation unter Verwendung von Wahrscheinlichkeitsverfahren (U.S. Pat. Nr. 4,448,534) übertragen.
Das bevorzugte System zur Identifizierung von Mikro- Organismen sollte vollautomatisiert sein, schnell identifizieren (2 bis 3 Stunden), eine visuelle Farbvergleichsmöglichkeit haben und eine einfache Inokulation ermöglichen.
Das traditionelle Verfahren, das zur Prüfung auf antimikrobielle Suszeptibilität verwendet wird, ist das Standardplatten-Diffusionsverfahren, das von Kirby und Bauer (Bauer, Kirby et al. 1966, American J. Clinical Pathol., Bd. 45 (4), S. 493) beschrieben ist. Gemäß diesem Verfahren und nachfolgenden Modifikationen werden Kolonien aufgenommen und in einer Flüssigkeit suspendiert, um eine vorbestimmte Trübung zu ergeben, und auf ein Nähragar in einer Petrischale abgestrichen. Papierplatten, die mit verschiedenen antimikrobiellen Materialien imprägniert sind, werden auf die inokulierte Agaroberfläche gelegt, und der Droge wird es ermöglicht, durch das Agar zu diffundieren, so daß ein Gradienten um die Papierplatte gebildet wird. Wenn die Bakterien wachsen, bilden sie eine sichtbare Schicht auf der Agaroberfläche Um die antibiotisch imprägnierten Platten herum wird das Wachstum jedoch inhibiert, wenn der Organismus gegen das Mittel empfindlich ist. Die Inhibierungszone um die Platte herum ist dem Suszeptibilitätsgrad proportional. Die Nachteile des Verfahrens sind die erforderliche lange Inkubationszeit (18 Stunden), der Mangel an Standardisierung und der Mangel an Quantifizierung.
Ein gebräuchlicheres Verfahren für die antimikrobielle Suszeptibilität ist die minimale Hemmkonzentration (MHK). Die MHK wird bestimmt, indem Serienverdünnungen der Droge in einer Nährbrühe gemacht werden und indem jede Verdünnung mit einer Bakterien-Standardsuspension inokuliert wird. Nach der Inkubation werden die verschiedenen Verdünnungen auf Trübung untersucht. Die MHK ist definiert als die niedrigste antibiotische Konzentration, die ein makroskopisches Wachstum des Testorganismus inhibiert. Im Handel sind Tabletts mit Mikroröhrchen mit gefrorenen oder trockenen Lösungen verschiedener Antibiotika erhältlich, wie z.B. solche, die von Micro-Media Systems (Potomac, MD); Microscan (Baxter Healthcar, W. Sacramento, CA); Pasco Laboratories (Wheat Ridge, CO) und Sceptor (BBL, Houston, TX) angeboten werden. Diese Tabletts werden manuell inokuliert, 16 bis 18 Stunden inkubiert und häufig manuell abgelesen.
Die gleichen automatisierten Systeme, die für die Identifizierung von Mikroorganismen verwendet werden, werden auch für den MHK-Nachweis verwendet.
Die vorliegende Erfindung verwendet Fluoreszenzmethoden, um eine schnelle, effiziente und empfindliche Vorrichtung zum Nachweis der Anwesenheit von Mikroben, zum Auszählen und Identifizieren von Mikroben und zur Prüfung von antimikrobieller Suszeptibilität von Mikroben zu erreichen.
Die Fluoreszenz ist als Nachweisverfahren aufgrund der ihr innewohnenden Empfindlichkeit reizvoll. Die unteren Nachweisgrenzen sind im Bereich einiger tausendstel Teile bis zu einem zehntel Teil auf eine Million. Eine geringe Anzahl von Mikroorganismen kann mit der Fluoreszenzanalyse schnell nachgewiesen werden. Koumura et al., 1986 (U.S. Pat. Nr. 4,591,554) haben bestimmte Umbelliferon-Derivate, wie z.B. 4- Methylumbelliferylphosphat und 4-Methylumbelliferylgalactosid, verwendet, um die hygienische Qualität verschiedener Lebensmittelarten, Getränke, Wasser und Toilettenartikel zu bestimmen. Sensititer (Gibco Laboratories, Andover, MA) verwendet fluoreszierende Substrate (wie Umbelliferone und Cumarin-Derivate), die nichtfluoreszierend sind, bis Mikroorganismen auf sie einwirken. American Microscan (Baxter Helath Care Corp., West Sacramento, CA) verwendet eine Reihe fluorogener Substrate und Indikatoren, die aus 4-Methylumbelliferyl-Verbindungen und 7-Amido-4-methylcumarin-Verbindungen bestehen, um Mikroorganismen schnell (2 bis 4 Stunden) zu identifizieren und zum schnellen Nachweis ihrer antimikrobiellen Profile (6 bis 8 Stunden).
Das U.S. Patent 4,495,293 an Shaffar, erteilt am 22. Januar 1985, offenbart ein Verfahren zum fluorimetrischen Bestimmen eines Liganden in einer Probenlösung, bei dem die Intensität der durch die Probenlösung emittierten Fluoreszenz in Beziehung zur Änderung der Durchlässigkeitseigenschaften steht, die durch die Wechselwirkung des zu bestimmenden Liganden und einem Reagenssystem bewirkt wird, das in der Lage ist, eine Änderung der Durchlässigkeitseigenschaften der Probenlösung bei Anwesenheit des Liganden herzustellen. Dies ist ein Beispiel eines Zweifarbstoff-Systems, bei dem der eine Farbstoff in dem Reagenssystem mit einem bestimmten Liganden in Wechselwirkung tritt. Der wechselwirkende Farbstoff hat ein optisches Spektrum, das sich bei Wechselwirkung mit dem Liganden ändert und dadurch die Fluoreszenzemission von einem zweiten Farbstoff beeinflusst. Das Verfahren mißt dadurch die Anwesenheit und Konzentration des Liganden in der Probe mit Farbstoffkonzentrationen, die für Lebensformen toxisch sein können, aber für die Ligandenmessung wirkungsvoll sind.
Die vorliegende Erfindung verwendet ein Zweifarbstoff- Fluoreszenzemissionssystem, das keinen Liganden nachweist oder mißt, sondern vielmehr ein Mikrobenwachstum ermöglicht oder nachweist, und diese Information zum Nachweis, zur Auszählung, Identifizierung und Suszeptibilitätsprüfung der Mikroorganismen verwendet.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis von Mikrobenmetabolismus zur Verfügung gestellt, das die folgenden Schritte enthält: Zusammengeben des Wachstumsmediums, eines ersten Farbstoffs mit einem Absorptionsspektrum, das sich in Gegenwart von Mikroorganismen in Abhängigkeit vom Metabolismus der Mikroorganismen verändert, und eines zweiten Fluoreszenzfarbstoffs mit einem Anregungs- oder Emissionsspektrum, das mit einem der veränderten oder unveränderten Absorptionsspektren des ersten Farbstoffs überlappt, wobei das Wachstumsmedium eine Probenlösung enthält, die auf die darin enthaltenen metabolisierenden Mikroorganismen zu analysieren ist. Die Fluoreszenzemission des zweiten Farbstoff wird entweder auf eine Nichtänderung beobachtet, was die Abwesenheit metabolisierender Mikroorganismen in der Probe anzeigt, oder eine Änderung beobachtet&sub1; was die Anwesenheit metabolisierender Mikroorganismen in der Probe anzeigt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Kit zum Ermitteln von Mikrobenmetabolismus zur Verfügung, wobei der Kit ein Wachstumsmedium, einen ersten Farbstoff mit einem Absorptionsspektrum, das sich bei Anwesenheit von Mikroorganismen in Abhängigkeit vom Metabolismus der Mikroorganismen ändert, und einen zweiten Fluoreszenzfarbstoff mit einem Anregungs- oder Emissionsspektrum aufweist, das mit einem der unveränderten oder veränderten Absorptionsspektren des ersten Farbstoffs überlappt. Eine Zugabe der ersten und zweiten Farbstoffe zu dem Wachstumsmedium ohne metabolisierende Mikroorganismen bewirkt keine Änderung der beobachteten Fluoreszenzemission des zweiten Farbstoffs. Eine Zugabe des ersten und zweiten Farbstoffs zu dem Wachstumsmedium, das Mikroorganismen enthält, bewirkt Änderungen der beobachteten Fluoreszenzemission des zweiten Farbstoffs.

FIGUREN IN DEN ZEICHNUNGEN

Andere Vorteile der vorliegenden Erfindung sind leicht verständlich, wenn diese unter Bezugnahme auf die nachfolgende genaue Beschreibung näher erläutert wird, wobei sie in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen zu betrachten ist, wobei:
Figur 1 ein Absorptions- oder Fluoreszenzintensitäts- Diagramm gegenüber der Wellenlänge eines analytischen Fluoreszenzfarbstoffs ist, der durch die Anwesenheit eines metabolischen Farbstoffs mit einem Absorptionsspektrum, das mit dem Emissionsspektrum des analytischen Farbstoffs überlappt, gequencht wird;
Figur 2 ein Absorptions- oder Fluoreszenzintensitäts- Diagramm gegenüber der Wellenlänge eines Beispiels eines analytischen Farbstoffs ist, dessen Emissionsspektrum mit dem Absorptionsspektrum eines metabolischen Farbstoffs überlappt;
Figur 3 ein Absorptions- oder Fluoreszenzintensitäts- Diagramm gegenüber der Wellenlänge eines Beispiels eines analytischen Farbstoffs ist, dessen Anregungsspektrum mit dem des metabolischen Farbstoffs überlappt;
Figur 4 ein Absorptions- oder Fluoreszenzintensitäts- Diagramm gegenüber der Wellenlänge eines metabolischen Farbstoffs ist, dessen Spektrum nicht wesentlich mit dem Fluoreszenzspektrum des analytischen Farbstoffs überlappt;
Figur 5 ein Diagramm von Fluoreszenzeinheiten gegenüber der Zeit für Proben ist, die eine abnehmende Zahl von Bakterien im Wachstumsmedium enthalten und die einen analytischen Farbstoff und einen metabolischen Farbstoff gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten, wobei die Kulturen inkubiert und in Intervallen abgelesen wurden; die Bakterien sind dabei Pseudomonas aeruginosa;
Figur 6 ein Diagramm von Fluoreszenzeinheiten gegenüber der Zeit für Proben ist, die eine abnehmende Zahl von Bakterien im Wachstumsmedium enthalten und die einen analytischen Farbstoff und einen metabolischen Farbstoff gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten, wobei die Kulturen inkubiert und in Intervallen abgelesen wurden; die Bakterien sind dabei Escherichia coli;
Figur 7 ein Diagramm der Fluoreszenznachweiszeit in Stunden gegenüber dem log kolonienbildender Einheiten pro ml ist, die eine Kalibrierungskurve darstellen, die verwendet werden kann, um die Bakterienauszählung durchzuführen;
Figur 8 ein Diagramm von Fluoreszenzeinheiten gegenüber der Zeit ist, das den Nachweis und die Auszählung von Bakterien in einem Lebensmittel, nämlich Schwarzem Pfeffer, zeigt;
Figur 9 ein Diagramm von Fluoreszenzeinheiten gegenüber der Zeit ist, das den Nachweis und die Auszählung von Bakterien in einem Lebensmittel, nämlich einem Hamburger, zeigt;
Figur 10 zwei Diagramme von Fluoreszenzeinheiten gegenüber der Zeit zeigt, die den Nachweis von Bakterien in Blutproben zeigen;
Figur 11 ein Diagramm von Fluoreszenzeinheiten gegenüber der Zeit ist, das eine Prüfung der antimikrobiellen Suszeptibilität zeigt;
Figur 12 ein Diagramm von Fluoreszenzeinheiten gegenüber der Zeit ist, das die Verwendung der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung von Bakterien, nämlich Enterococcus faecalis, zeigt;
Figur 13 ein Diagramm von Fluoreszenzeinheiten gegenüber der Zeit ist, das die Verwendung der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung von Bakterien, nämlich Steptococcus agalactiae, zeigt; und
Figur 14 ein Diagramm von Fluoreszenzeinheiten, gegenüber der Zeit ist, das die Verwendung der vorliegenden Erfindung zur Identifizierung von Bakterien, nämlich Staphylococcus epidermidis, zeigt.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Ein Verfahren zum Nachweis von Mikrobenmetabolismus gemäß der vorliegenden Erfindung enthält im allgemeinen die Schritte des Zusammengebens von Wachstumsmedium, einem ersten Farbstoff (einem metabolischen Farbstoff) mit einem Absorptionsspektrum, das sich in Gegenwart von Mikroorganismen in Abhängigkeit vom Metabolismus der Mikroorganismen verändert, und einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff (einem analytischen Farbstoff) mit einem Anregungs- oder Emissionspektrum, das mit einem der veränderten oder unveränderten Absorptionsspektren des ersten Farbstoffs überlappt, wobei das Wachstumsmedium eine Probenlösung enthält, die auf die darin enthaltenen metabolisierenden Mikroorganismen zu analysieren ist. Die zusammengegebene Lösung wird beobachtet, ob sie entweder keine Veränderung der Fluoreszenzemission des analytischen Farbstoffs emittiert, was die Abwesenheit metabolisierender Mikroorganismen in der Probe anzeigt, oder eine Veränderung der Emission des analytischen Farbstoffs, was die Anwesenheit metabolisierender Mikroorganismen in der Probe anzeigt. Es sind diese Fähigkeit der vorliegenden Erfindung, metabolisierende Mikroorganismen in Proben zu ermitteln, und die direkten Relationen von Mikroorganismen-Metabolismus zu Wachstum, welche die vorliegende Erfindung für die Verwendung zum Nachweis, zur Auszählung, Identifizierung und antimikrobiellen Suszeptibilitätsprüfung von Mikroben geeignet machen. Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt allgemein die Fähigkeit zur Verfügung, die gesteigerte Genauigkeit beim Fluoreszenznachweis mit der gesteigerten Geschwindigkeit der Überwachung von Mikroorganismenwachstum durch Überwachung von Mikroorganismenmetabolismus zu kombinieren, was der vorliegenden Erfindung Vorteile gegenüber dem Stand der Technik verleiht.
Das Medium wird so ausgewählt, daß es das Wachstum der Mikroorganismen begünstigt, die untersucht werden. Das Medium kann einfach nur Kohlehydrate enthalten. Oder es kann zum Beispiel ein Wachstumsmedium zum Mikrobennachweis und für Auszählungstests verwendet werden, das in der Lage ist, das Wachstum eines weiten Spektrums von Mikroorganismen zu begünstigen, wenn eine flüssige Probe von einem Patienten erhalten wird und die Identität und die Anzahl der Mikroorganismen nicht bekannt ist. Auf der anderen Seite, wenn ein bekannter Mikroorganismus bekannter Identität untersucht wird, dann kann das Wachstumsmedium so ausgewählt werden, daß es das Wachstum des Mikroorganismus begünstigt. Das heißt, wenn die Mikroorganismen bestimmte Nährstoffe benötigen, um ihr Wachstum zu begünstigen, dann kann das Wachstumsmedium so ausgewählt werden, daß es diese Nährstoffe enthält. Beispiele von Wachstumsmedien, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Mueller-Hinton, Colombia-Brühe, Hirn-Herz-Medium, tryptische Sojabrühe und Schaedlers-Brühe.
Der metabolische Farbstoff wird so ausgewählt, daß seine Spektraleigenschaften auf biochemische Veränderungen seines physikalisch-chemischen Milieus ansprechen. Das heißt, Mikrobenmetabolismus kann das physikalisch-chemische Milieu des metabolischen Farbstoffs verändern, wenn die Mikroorganismen Nährstoffe aus dem Medium metabolisieren, und das Absorptionsspektrum des ersten Farbstoffs verschieben. Hieraus ergibt sich ein Quenchen oder Nicht-Quenchen des Emissionsspektrums des analytischen Farbstoffs. Der Untersucher wird dann das Quenchen oder Nicht-Quenchen der Fluoreszenzemission des analytischen Farbstoffs beobachten, was die Anwesenheit oder Abwesenheit metabolisierender Mikroorganismen anzeigt.
Wenn das Wachstumsmedium bestimmte Nährstoffe enthält, die die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Wachstumsmediums verändern, wenn es von einem bestimmten Mikroorganismus metabolisiert wird, dann kann die Veränderung des physikalisch-chemischen Milieus des metabolischen Farbstoffs das Metabolisieren einer bestimmten Art von Mikroorganismus anzeigen, und es ergeben sich die beobachtete Emissionsveränderung des verwendeten analytischen Farbstoffs und eine Identifizierung der bestimmten Art von Mikroorganismus. Alternativ können mehrere verschiedene Medien, die verschiedene bestimmte Nährstoffe enthalten, verwendet werden. Die zusammengegebenen Proben werden auf Veränderungen oder die Abwesenheit von Veränderungen der Emission des analytischen Farbstoffs beobachtet, und es kann ein Identifizierungs-Fingerprint bestimmter Mikro-Organismen auf der Basis von mehreren Beobachtungen erstellt werden.
Das physikalisch-chemische Milieu des metabolischen Farbstoffs kann durch die Veränderung des pH-Wertes der Medien verändert werden. Der metabolische Farbstoff wird so ausgewählt, daß er ein Absorptionsspektrum hat, das sich in Abhängigkeit von einer Veränderung des pH-Wertes des Milieus verändert. Bromthymolblau ist ein Beispiel eines Farbstoffs, der sein Absorptionsspektrum in Abhängigkeit vom pH-Wert verändert. Bromthymolblau hat sich bei bereits entwickelten und im Handel erhältlichen Identifizierungssystemen als wirkungsvoll erwiesen. Bromkresylpurpur kann auch verwendet werden. Beide Farbstoffe sind vollständig wasserlöslich, nichttoxisch in wirkungsvollen Konzentrationen, haben einen pKa-Wert, der fast neutral ist, haben einen hohen Extinktionskoeffizienten, sind preiswert, haben eine sichtbare Farbveränderung, haben eine gute Überlappung mit bevorzugten analytischen Farbstoffen, und es wurde gezeigt, daß sie gemäß der vorliegenden Erfindung für einen Schnellidentifizierungsnachweis funktionieren. Beispiele anderer pH-Indikatorverbindungen, die geeignet sind, sind Phenolrot und Chlorphenolrot.
Ein Beispiel von Mikroorganismenmetabolismus, der den pH-Wert verändert, ist die Zugabe bestimmter Kohlehydrate zum Wachstumsmedium, die durch bestimmte Mikroorganismen zu sauren Endprodukten fermentiert werden. Die sauren Endprodukte verändern den pH-Wert des Wachstumsmediums. Alternativ kann Harnstoff zu dem Wachstumsmedium gegeben werden, der durch Mikroorganismen, die Urease enthalten, enzymatisch zu Ammoniak umgewandelt wird. Das erzeugte Ammoniak erhöht den pH-Wert des Milieus.
Das physikalisch-chemische Milieu des metabolischen Farbstoffs kann auch durch Veränderung des Reduktions-Oxidations-Potentials des Milieus verändert werden, wobei der erste Farbstoff ein Absorptionsspektrum hat, das sich in Abhängigkeit von den Veränderungen des Reduktions-Oxidations-Potentials des Milieus verändert. Beispiele metabolischer Farbstoffe, die empfindliche Redoxpotential-Indikatoren sind, sind folgende: Resazurin, Thionin, Methylenblau, Dichlorphenolindophenol, Neutralrot, Indigokarmin und N,N-Dimethylindoanilin.
Resazurin kann verwendet werden, weil es kostengünstig, unempfindlich gegenüber thermischem und Lichtabbau und wasserlöslich ist, einen hohen Extinktionskoeffizienten hat, eine sichtbare, charakteristische Farbänderung bei Reduktion hat, von den meisten oder allen Mikroorganismen reduziert wird und eine gute spektrale Überlappung mit bevorzugten analytischen Farbstoffen hat, wie nachstehend besprochen wird. Resazurin scheint nicht die Funktion normaler Antibiotika zu beeinflussen, und es ist deshalb ausgezeichnet für die Verwendung von MHK-Bestimmungen.
Bestimmte metabolische Farbstoffe können als enzymatische Spaltsubstrate verwendet werden. Indoxyl- und Bromchlorindoyl-Verbindungen können zum Beispiel als enzymatische Spaltsubstrate aus den gleichen Gründen ausgewählt werden, wie sie für die Verwendung der metabolischen Farbstoffe als pH- Indikatoren beschrieben wurden. Diese Farbstoffe besitzen eher die Fähigkeit, farblos zu sein, wenn sie chemisch an eine Verbindung gebunden sind, und farbig zu sein, wenn sie abgespalten und frei in Lösung sind, als einen nützlichen pKa-Wert. Diese Eigenschaft ermöglicht es, daß diese metabolischen Farbstoffe von einem nicht-gequenchten Zustand bei Spaltung der Verbindung in einen gequenchten Zustand übergehen.
Der analytische Farbstoff wird aus einer großen Vielzahl von Fluoreszenzverbindungen ausgewählt. Beispiele von änalytischen Farbstoffen sind Sulforhodamin 101, Rhodamin B, Rhodamin 6, Fluorescein und Eosin Y.
Sulforhodamin (SR101) wird als Fluoreszenzfarbstoff bevorzugt, da er wasserlöslich ist, Anregungs- und Emissionswellenlängen hat, die von der Resazurin-Fluoreszenz verschieden sind (Resazurin ist einer der bevorzugten metabolischen Farbstoffe), er verhältnismäßig kostengünstig ist, und er ein Anregungs- und Emissionspektrum hat, das sich mit dem von Resazurin, Bromkresylpurpur, Bromthymolblau, Indoxyl und Bromchlorindoyl überlappt SR101 hat auch eine gute Quantenausbeute, ist nichttoxisch gegenüber Mikroorganismen in den gebräuchlichen Konzentrationen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, und ist gegenüber Temperatur- und Lichtanforderungen ziemlich stabil. Die Verbindung wurde bei 42 ºC ohne Verlust der Fluoreszenz bis zur vollständigen Trockenheit getrocknet. SR 101 hat auch eine annehmbare Stokes-Verschiebung. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen sind im sichtbaren Bereich, so daß die Verwendung kostengünstiger Glas- und Kunststoffbehälter zur Emissionsbeobachtung ermöglicht wird, anstelle von UV-durchlässigen Materialien für die Einmalküvetten des Systems und Instrumentenfenster.
Der analytische Farbstoff wird so ausgewählt, daß entweder die Anregungs-, Emissions-, oder sowohl die Anregungs- wie auch die Emissionswellenlängen Koinzidenz zeigen oder sich mit dem Absorptionsspektrum des metabolischen Farbstoffs überlappen. Die Überlappung kann entweder mit der metabolisierten oder nichtmetabolisierten Form des metabolischen Farbstoffs vorliegen, darf aber nicht beide überlappen. Es ist diese spezifische Kombination von Eigenschaften des metabolischen Farbstoffs und des analytischen Farbstoffs, die die vorliegende Erfindung kennzeichnet. Des weiteren, wie nachstehend besprochen, ist es die Fähigkeit dieser Farbstoffe, gemäß der vorliegenden Erfindung zusammenzuwirken, ohne gegenüber den zu analysierenden Mikroben toxisch zu sein, was die vorliegende Erfindung weiter kennzeichnet.
Die Spektrenüberlappung der zwei Farbstoffe kann entweder die von der metabolisierten oder der nichtmetabolisierten Form des metabolischen Farbstoffs sein, darf aber nicht beide überlappen.
Ein hypothetisches Beispiel eines analytischen Farbstoffs, dessen Emissionsspektrum sich mit den Absorptionen des metabolischen Farbstoffs überlappt, wird in Figur 2 gezeigt. Ein hypothetisches Beispiel eines analytischen Farbstoffs, dessen Anregungsspektrum sich mit dem des metabolischen Farbstoffs überlappt, wird in Figur 3 gezeigt. In jedem dieser zwei gezeigten Fälle wäre die gemessene Fluoreszenz des analytischen Farbstoffs geringer als bei Abwesenheit des metabolischen Farbstoffs, wie in Figur 1 gezeigt. Das heißt, die Fluoreszenz des analytischen Farbstoffs wird durch die Anwesenheit des metabolischen Farbstoffs im Überlappungszustand gequencht. Wenn sich das Spektrum des metabolischen Farbstoffs nicht beträchtlich mit dem analytischen Farbstoff überlappt, wie in Figur 4 gezeigt, ist die Fluoreszenz dieses Systems so hoch wie die des analytischen Farbstoffs. Dies ist die nichtgequenchte Situation.
Bei der praktischen Anwendung wird eine Testprobe, die Mikroorganismen enthält, in eine Vertiefung gegeben, die das geeignete Wachstumsmedium, wie vorstehend besprochen, zusammen mit einem analytischen Farbstoff und einem metabolischen Farbstoff enthält. Die Vertiefung, die das Gemisch enthält, wird in einen Inkubator bei einer Wachstumstemperatur (etwa 30 º bis 35 ºC bei menschlichen Krankheitserregern) gestellt, und die Fluoreszenz wird über einen Zeitraum von zwei bis acht Stunden überwacht.
Jedes der Diagramme, die einen Anstieg der Fluoreszenz über die Zeit in den Figuren der vorliegenden Anwendung zeigen, zeigen eine anfängliche Verzögerungszeit (eine flache Anfangsphase der Kurve), von der festgestellt wurde, daß sie von dem Pegel der Organismen in der Probe abhängt. Das heißt, die Länge des Verzögerungszeitraums ist der Anzahl der Organismen in der Probe direkt proportional, so daß, für bestimmte Organismen, eine Standard-Kennlinie erstellt werden kann. Die Zeitdauer des Verzögerungszeitraums wird als ein Hinweis auf die Anzahl der Mikroorganismen in dem Medium angesehen. Die vorliegende Erfindung kann somit verwendet werden, um Mikroorganismen in einer Testprobe auszuzählen.
Nach dem anfänglichen Verzögerungszeitraum, der von der Anzahl der Mikroorganismen in der Probe abhängt, wie vorstehend besprochen, steigt die Fluoreszenz schnell an, wenn Mikroorganismen vorhanden sind. Der Beginn der Beschleunigung wird hier als der Nachweispunkt bezeichnet. Wenn Bakterien in dem System nicht vorhanden sind, kann die Fluoreszenzkurve leicht driften, wird aber niemals beschleunigen und die hohen Fluoreszenz-Niveaus erreichen, die bei Anwesenheit von Bakterien erzielt werden. Deshalb ist die Beobachtung des Nachweispunktes ein sofortiger Hinweis auf die Anwesenheit von Mikroorganismen in der Probe. Man muß nicht auf die Anwesenheit von ausreichendem Wachstum der Mikroorganismen warten, was die Trübung der Probe bewirkt, um die Mikrobenanwesenheit anzuzeigen, wie bei Tests gemäß dem Stand der Technik, sondern man muß nur auf einen ausreichenden Metabolismus durch die Mikroben warten, damit das Milieu des metabolischen Farbstoffs beeinflusst wird, so daß eine Verschiebung des optischen Spektrums des metabolischen Farbstoffs bewirkt wird und dadurch ein Quenchen oder Nicht-Quenchen der Fluoreszenzemission des analytischen Farbstoffs, um die Anwesenheit von Bakterien in der Probe zu bestimmen. Dies kann in zwei bis acht Stunden erreicht werden, im Gegensatz zu beträchtlich längeren Zeiträumen, die bei Verfahren gemäß dem Stand der Technik benötigt werden.
Die Anfälligkeit oder Resistenz von Mikroben gegen unser Antibiotikum kann durch Zugabe steigender Konzentrationen eines Antibiotikums zu verschiedenen Proben von Wachstumsmedien, die Mikroorganismen enthalten, untersucht werden. Das erfindungsgemäße Verfahren wird gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt, und es wird die niedrigste Konzentration eines Antibiotikums, das in der Lage ist, eine Veränderung der Fluoreszenzemission der beobachteten analytischen Farbstoffe zu verhindern, als Anzeige der Empfindlichkeit der Mikroorganismen gegenüber dem Antibiotikum beobachtet. Bei einer anderen Ausführungsform können verschiedene Antibiotika zu verschiedenen Proben von Wachstumsmedien gegeben werden, die die Mikroorganismen enthalten. In dieser Situation können Antibiotika, die eine Veränderung der Fluoreszenzemission verhindern oder eine Veränderung der Fluoreszenzemission des analytischen Farbstoffs bewirken, als Anzeige der Empfindlichkeit der Mikroorganismen gegenüber einzelnen Antibiotika beobachtet werden.
Wie vorstehend erwähnt, müssen die Konzentrationen des metabolischen Farbstoffs, des analytischen Farbstoffs und jedes anderen Reagens, die bei der Untersuchung verwendet werden, für Mikroorganismen nichttoxisch sein und ihr Wachstum und ihren Metabolismus ermöglichen. Das U.S. Patent 4,743,561 an Shaffar, veröffentlicht 10. Mai 1988, offenbart zum Beispiel die Verwendung eines Zweifarbstoff-Systems zum Ermitteln der Konzentration eines Liganden in einer Testprobe. Alle ihre Untersuchungen enthalten toxische Reagenzien, die den Metabolismus und das Wachstum von Mikroorganismen verhindern. Sie verwenden zum Beispiel eine Vielzahl von Chemikalien, die starke Desinfektionsmittel und Germizide sind und von denen alle die meisten Mikroorganismen bei Kontakt abtöten, wie z.B.: Wasserstoffperoxid, Formaldehyd, Phenol, Kaliumcyanid, Kaliumhydroxid, Kaliumthiocyanat, 8-Chinolinolsulfat, Quecksilberchlorid, Thimersol etc. Ihre Untersuchungen verwenden starke Säuren (Schwefelsäure, Sulfaminsäure) oder Basen (Natriumhydroxid), so daß dadurch pH-Werte erhalten werden, die jeden Mikrobenmetabolismus verhindern. Andere Informationen nach dem Stand der Technik offenbaren ebenso Farbstoffsysteme, bei denen der Farbstoff per se die Mikroben abtötet oder inhibiert und dadurch die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung beseitigt. Der Anwender, der nicht die Anwesenheit eines Liganden mißt, sondern vielmehr den Metabolismus von Mikroorganismen, verwendet nur metabolische und analytische Farbstoffe, die das Mikroorganismuswachstum nicht inhibieren.
Es kann ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt werden zum Ermitteln von Mikrobenmetabolismus und, unter Verwendung dieses Verfahrens, zur Identifizierung, zum Nachweis, zur Auszählung und für Suszeptibilitäts- Prüfung von Mikroben. Der Kit enthält ein Wachstumsmedium, den ersten Farbstoff mit einem Absorptionsspektrum, das sich bei Anwesenheit von Mikroorganismen aufgrund des Metabolismus der Mikroorganismen verändert, und einen zweiten Fluoreszenzfarbstoff mit einem Anregungs- oder Emissionspektrum, das sich mit einem der unveränderten oder veränderten Absorptionsspektren des ersten Farbstoffs überlappt, wobei die Zugabe des ersten und zweiten Farbstoffs zu dem Wachstumsmedium ohne metabolisierende Mikroorganismen keine Veränderung der festgestellten Fluoreszenzemission des zweiten Farbstoffs bewirkt, aber mit metabolisierenden Mikroorganismen Veränderungen bei der beobachteten Fluoreszenz der Emission des zweiten Farbstoffs bewirkt.
Das Nachfolgende ist ein praktisches Beispiel des Quenchens/Nicht-Quenchens der Fluoreszenz des Farbstoff-Paarsystems, das gemäß der vorliegenden Erfindung ausgewählt wurde, wie es auf sein Milieu anspricht. Die Zugabe einer geringen Menge Natriumdithionit zur einer SR101/Resazurin-Lösung bewirkt, daß die Fluoreszenz deutlich ansteigt, wenn das qenchende blaue Resazurin zu der roten Resorufin- oder farblosen Dihydroresorufin-Verbindung reduziert wird. Diese Verbindungen quenchen die SR 101-Fluoreszenz nicht. Das gleiche Phänomen wird mit den pH-empfindlichen Indikatoren Bromthymolblau und Bromkresylpurpur gezeigt. Bei einem hohen pH-Wert (höher als 7,5) quencht der blaue Indikator die Fluoreszenz von SR 101. Bei einem niedrigeren pH-Wert (weniger als 6,5) quenchen die gelbgefärbten Farbstoff-Formen nicht. Somit kann gezeigt werden, daß das Milieu die Gesamtfluoreszenz beeinflusst, die von der Farbstoff-Paarlösung ermittelt wird.
Im Folgenden sind bestimmte Beispiele der vorliegenden Erfindung angegeben, wie sie zum Nachweis, zur Auszählung, Identifizierung und zur Sensitivitäts-Prüfung von Mikroben verwendet werden.

BEISPIELE

Beispiel 1:

Auswirkung des pH-Wertes und Redox-Potentials auf die Fluoreszenz mit dem Farbstoffpaar.
Es wurde ein Gemisch aus 10 µM Sulforhodamin 101 (SR101) und 20 µM Resazurin in 100 µl Wasser hergestellt. Die Anfangsfluoreszenz (Anregung = 586 nm, Emission = 607 nm) wurde in Mikrotiterplatten unter Verwendung eines Fluoroscan II-Fluorometers abgelesen. Es wurde eine geringe Menge Natriumdithionit zugegeben, um Resazurin von der anfänglich blauen Farbe zu rosa zu reduzieren. Die Fluoreszenz steigt drastisch an und zeigt eine Reaktion auf das unmittelbare Redox-Milieu. Ersetzen des Resazurin durch Bromthymolblau oder Bromkresylpurpur und Verändern des pH-Wertes der Lösung zeigt eine Reaktion des Farbstoff-Paarsystems auf den pH-Wert.

Beispiel 2:

Ermitteln der Anwesenheit von Mikroorganismen und Abschätzen ihrer Anzahl.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann das Wachstum von Bakterien ermitteln. SR101 (10 µM) und Resazurin (20 µM) werden zu Mueller-Hinton-Brühe (Difco) gegeben. Das Medium wird mit einem Inokulum mit abnehmender Anzahl von Bakterien angeimpft. 100 µl der angeimpften Kulturbrühen werden in Vertiefungen von Mikrotiterplatten gegeben, bei 35 ºC inkubiert und in Abständen mit der Apparatur, die in Beispiel 1 beschrieben wurde, abgelesen. Figur 5 und 6 sind Kurven, die erzeugt werden, wenn die Impfbakterien Pseudomonas aeruginosa bzw. Escherichia coli sind. Nach einem anfänglichen Verzögerungszeitraum, der abhängig ist von der Zellenanzahl des Inokulums, steigt die Fluoreszenz schnell auf ein Plateau an, wenn das Resazurin von Blau zu Rosa (Resorufin) oder Farblos durch den Metabolismus der wachsenden Bakterien reduziert wird. 10&sup7; E.coli-Zellen erzeugen unter diesen Bedingungen ein Signal in zwei Stunden, wobei 10 Zellen in nur 10 Stunden ermittelt werden können. Wenn keine Bakterien in dem System vorhanden sind, wird kein deutlicher Fluoreszenzanstieg beobachtet.
Die Bakterienauszählung kann erreicht werden, indem eine Kalibrierungskurve erstellt wird, ähnlich der, die in Figur 7 gezeigt ist. Die Nachweiszeit (die Zeit, die benötigt wird, um den Beschleunigungspunkt zu erreichen), wird mit der Anzahl der kolonienbildenden Einheiten pro ml korreliert, die mit einer Plattenzählmethodik erhalten werden. Aus dieser Kalibrierungskurve kann die Anzahl der Organismen in der Probe abgeleitet werden.

Beispiel 3:

Ermittlung und Auszählung von Bakterien in Lebensmitteln.
Einhundert Gramm Lebensmittel wurden zu Hirn-Herz- Infusionsbrühe (BHI-Brühe) (Difco) gegeben, mit etwa 10&sup7; CFU/ml Escherichia coli angeimpft und unter Verwendung eines Tekmar Nahrungsmittel-Verdauungsgerätes vermischt. Es wurden Schwarzer Pfeffer und roher Hamburger untersucht. 10 µM SR101 und 20 µM Resazurin wurden zu der BHI-Brühe vor der Verdauung gegeben. 100 µl Proben der so erhaltenen Suspension wurden verdünnt und in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten gegeben, und die Fluoreszenz erfolgte mit der Zeit. Nahrungsmittel haben ein beträchtliches Reduktionsvermögen, wie an dem verstärkten Anstieg des Hintergrundsignals zu sehen ist. Die weniger verdünnten Proben haben wiederum frühere Nachweiszeiten ergeben, wie durch den schnellen Anstieg der Fluoreszenz über den Hintergrundbereich gezeigt wird (Figur 8 und 9). Mikrobiell verunreinigte Nahrungsinittel können deshalb durch Verfolgen des Fluoreszenzanstiegs ermittelt werden, wobei das schnellere Erscheinen des Beschleunigungspunktes (kürzerer Verzögerungszeitraum) anzeigt, daß mehr Bakterien in dem System vorhanden sind.

Beispiel 4:

Ermittlung von Bakterien im Blut.
Es wurde ein Experiment durchgeführt, um festzustellen, ob das Farbstoff-Paarsystem verwendet werden kann, um die Anwesenheit von Bakterien in Blut (Bakteriämie) zu ermitteln. 10% sterile rote Blutzellen vom Schaf wurden in Columbia-Brühe (Difco) präpariert. Resazurin (20 µM) und SR101 (10 µM) wurden zugegeben, und die Brühe wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen Staphylococcus aureus angeimpft. 100 µl von jeder Suspension wurden in Mikrotiterplatten gegeben, und die Fluoreszenz erfolgte wie vorher. Interessanterweise bewirkt das Wachstum des Organismus eine Abnahme der Fluoreszenz, im Gegensatz zu den früheren Beispielen. 100 und 10 Bakterien pro ml wurden in etwa 10 bzw. 12 Stunden in diesem System ermittelt (Figur 10).

Beispiel 5:

Antimikrobielle Suszeptibilitäts-Prüfung.
Es wurde Mueller-Hinton-Brühe hergestellt, die 10 µM SR101 und 20 µM Resazurin enthält. Es wurden Zugaben von Verdoppelungsverdünnungen des antibiotischen Penicillin von 0,0625 bis 16 µg/ml gemacht. 100 µl Aliquote dieser Lösungen wurden in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gegeben und mit Enterococcus faecalis zu 106 CFU/ml inokuliert. Parallele Kontrollversuche mit den gleichen Antibiotika und Organismen, aber nicht mit SR101 oder Resazurin, wurden auch angesetzt. Die Versuche, die Farbstoff enthielten, wurden über die Fluoreszenz verfolgt (Figur 11). Die anderen Versuche wurden unter Verwendung sichtbarer Trübung als Maßstab für Wachstum nach 18 Stunden abgelesen. Es wurde gefunden, daß die minimale Hemmkonzentration, oder MHK, von Penicillin 2 iµg/ml sowohl für das Farbstoffpaar wie auch für die turbidometrischen Systeme war. Die MHK ist die niedrigste Antibiotikum-Konzentration, die ein makroskopisches Wachstum des Testorganismus verhindert, und ist ein Maß für die Empfindlichkeit des Stammes gegen bestimmte Antibiotika. Bei der fluorometrischen Bestimmung (Figur 10) wuchs die Fluoreszenz in Vertiefungen parallel der der Penicillin nicht-positiven Kontrolle, während inhibierte Vertiefungen keinen wesentlichen Fluoreszenzanstieg über den Testzeitraum zeigten. Die Penicillin-MHK für diesen Organismus konnte bereits nach drei Stunden unter Verwendung der Farbstoff-Paarmethodik bestimmt werden.

Beispiel 6:

Identifizierung von Bakterien.
Es wurde die Verwendung des Farbstoff-Paarsystems bei der Identifizierung unbekannter Bakterien untersucht. Herz- Infusionsbrühe (Difco) (pH-Wert 7,4) wurde mit 1% Gew./Vol. einer der drei Kohlehydrate, Trehalose, Mannitol oder Mannose, ergänzt. Das Medium enthielt auch 10 µM SR101 und 24 µM Bromkresylpurpur. Die Kohlehydrat-Brühen wurden in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten pipettiert (100 µl/Vertiefung), mit 106 CFU/ml reinen Bakterienkulturen inokuliert, und die Fluoreszenz wurde über die Zeit verfolgt. Die Fermentierung der Kohlehydrate führte zur Bildung von Säure in dem Medium. Der Aciditätsanstieg der Brühe zusammen mit der Kohlehydrat-Verwertung bewirkte, daß der blaue pH-Indikator gelb wurde. Dies führte zu einem Nicht-Quenchen und zu einem drastischen Anstieg der Fluoreszenz von SR101 (Figur 12 und 13, Mannose- Kurven). Der Mangel an Verwertung der Kohlehydrate durch den Organismus im Test ergab keine Farb- oder Fluoreszenzänderung (Figur 13 Trehalose und Mannitol und Figur 14). Diese unterschiedliche Verwertung der Kohlehydrate durch die 3 geprüften Spezies würde die Grundlage des ID-Systems bilden, um die Organismen zu unterscheiden. Deshalb kann eine Testserie eingerichtet werden, bei der das Wachstumsmedium Schlüsselbestandteile enthält, die entweder von einer bestimmten Art von Bakterien verwendet werden können oder auch nicht. Die Kombination dieser positiven oder negativen Ergebnisse kann als Grundlage für ein einfaches Identifizierungsschema dienen, mit Ergebnissen, die in einem schnellen Zeitrahmen erhältlich sind (etwa sieben Stunden bei diesen Inokulum-Gehalten). In ähnlicher Weise können Inhibitoren zu dem Medium gegeben werden, die das Wachstum bestimmter Bakterien verhindern, aber nicht das von anderen. Es kann zum Beispiel Salz (NaCl) zu dem Medium gegeben werden und das Wachstum bestimmter Bakterien bewirken.
Die vorstehenden Beispiele veranschaulichen die Brauchbarkeit der vorliegenden Erfindung, wenn sie für die Ermittlung, Auszählung, Identifizierung und die antimikrobielle Suszeptibilitäts-Prüfung von Mikroben verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter Vorteile gegenüber kolorimetrischen Untersuchungen nach dem Stand der Technik zur Verfügung. Die vorliegende Erfindung kann ein einziges optisches Fenster verwenden, ohne Bedarf für ein zweites (Epifluoreszenz), einfache Instrumentierung (eine Lampe und einen Lichtdetektor und möglicherweise Filter, um die Sensitivität zu verbessern), Vertrautheit des Verbrauchers mit und Akzeptanz des Verbrauchers von Fluoreszenzverfahren, und eine erwiesene Brauchbarkeit. Fluoreszenzmessungen können, per Definition, schnell gemacht werden, im Zeitrahmen von Millisekunden.
Fluoreszenz ist des weiteren in seiner Art nichtinvasiv, so daß es keine Notwendigkeit gibt, physisch bei jeder Ablesung in eine Vertiefung einzudringen, die eine Testprobe enthält. Dies eliminiert Verunreinigungen des Instruments und der Küvette, die die Testprobe enthält.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Farbstoff-Paartechnologie ermöglicht die Verwendung von Reduktions-Oxidations-Potentialen, pH-Werten und Spaltungsreaktionen, wie auch anderer Reaktionen, die durch verschiedene Enzymsysteme bewirkt werden, mit einem einfachen Instrument mit einer einzigen Wellenlänge. Es gibt keine Notwendigkeit, Filter oder Wellenlängen zu wechseln, um diese Reaktionen zu verfolgen, solange sie das Quenchen des analytischen Farbstoffs erzeugen oder verringern.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Schnellidentifizierungs- und Suszeptibilitäts-Prüfung für Mikroben zur Verfügung. Antimikrobielle Suszeptibilitätsmuster können schon nach 2,5 Stunden, noch typischer nach 4 bis 9 Stunden, unter Verwendung von 106 CFU/ml Inokulum festgestellt werden. Unter Verwendung eines Inokulum-Gehaltes von 107 CFU/ml, können einige Identifizierungsreaktionen nach 1 bis 2 Stunden nach der Inokulation abgelesen werden. Dies ist ein deutlicher Vorteil gegenüber viel langsameren Systemen nach dem Stand der Technik.
Die vorliegende Technologie, die gemäß der vorliegenden Erfindung abläuft und durchgeführt wird, ist automatisierbar. Allein durch automatisches Ablesen der Küvette mit einem Instrument in Zeitabständen, anstatt ein Gerät manuell zu be laden, kann eine Vollautomatisierung der Analyse erreicht werden. Ein Rechner kann programmiert werden, um die Identifizierungs- und antimikrobiellen Suszeptibilitätsergebnisse, die aus den Reaktionsfortschrittskurven abgeleitet werden, vorherzusagen.
Dadurch, daß eine Farbreaktion bei einer sichtbaren Wellenlänge als integraler Bestandteil der Analyse vorhanden ist, kann der Anwender einen manuellen Vergleich des Systems im Fall von Instrumentenausfall durchführen. Gemäß diesem Gesichtspunkt der Erfindung würde der Anwender nur die offensichtlichen Farbänderungen ablesen, anstelle der Fluoreszenz durch das Gerät, und die Ergebnisse interpretieren, wie in einem geschriebenen Kode-Buch beschrieben.
Die Erfindung wurde in einer veranschaulichenden Art beschrieben, und es ist selbstverständlich, daß die Terminologie, die verwendet worden ist, mehr im Sinne einer Beschreibung in Worten zu verstehen ist anstatt als Einschränkung.
Es ist offensichtlich, daß im Licht der vorstehenden Beschreibungen viele Modifikationen und Veränderungen der vorliegenden Erfindung möglich sind. Es ist deshalb selbstverständlich, daß die Erfindung im Rahmen der beiliegenden Patentansprüche auch anders als spezifisch beschrieben in der Praxis ausgeübt werden kann.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Mikrobenmetabolismus, wobei das Verfahren die folgenden Schritte enthält:

Zusammengeben des Mediums, eines ersten Farbstoffs mit einem Absorptionsspektrum, das sich in Gegenwart von Mikroorganismen in Abhängigkeit vom Metabolismus der Mikroorganismen verändert, und eines zweiten Farbstoffs mit einem Anregungs- oder Emissionsspektrum, das mit einem der veränderten oder unveränderten Absorptionsspektren des ersten Farbstoffs überlappt, wobei das Medium eine Probenlösung enthält, die auf die darin enthaltenen metabolisierenden Mikroorganismen zu analysieren ist; und Beobachten von entweder keiner Veränderung der Fluoreszenzemission des zweiten Farbstoffs, was die Abwesenheit metabolisierender Mikroorganismen in der Probe anzeigt, oder einer Veränderung, was die Anwesenheit metabolisierender Mikroorganismen in der Probe anzeigt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Zusammengebens weiter definiert ist als Veränderung des physikalisch-chemischen Milieus des ersten Farbstoffs, wenn die Mikroorganismen Nährstoffe aus dem Medium metabolisieren, und Verschieben des Absorptionsspektrums des ersten Farbstoffs, und Quenchen oder Nicht-Quenchen des Emissionsspektrums des zweiten Farbstoffs, wobei der Beobachtungsschritt weiter definiert ist als das Beobachten des Quenchens oder Nicht-Quenchens des zweiten Farbstoffs, was die Anwesenheit oder Abwesenheit metabolisierender Mikroorganismen anzeigt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Wachstumsmedium bestimmte Nährstoffe enthält, die die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Mediums verändern, wenn sie von bestimmten Mikroorganismen metabolisiert werden; wobei der Veränderungsschritt weiter definiert ist als eine Veränderung des physikalisch-chemischen Milieus des ersten Farbstoffs, da nur eine bestimmte Art von Mikroorganismen den bestimmten Nährstoff in dem Medium metabolisiert, und Beobachten der Emissionsveränderung des zweiten Farbstoffs als Identifizierung der bestimmten Art von Mikroorganismen.

4. Verfahren nach Anspruch 3, das weiter die Schritte der Wiederholung des Schrittes des Zusammengebens mehrerer verschiedener Medien, die verschiedene bestimmte Nährstoffe enthalten, des Beobachtens der Veränderungen oder der Abwesenheit von Veränderungen des Emissionsspektrums des zweiten Farbstoffs, und des Erstellens eines Identifizierungs-Fingerprints bestimmter Mikroorganismen auf der Basis dieser mehreren Beobachtungen aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Veränderungsschritt weiter definiert ist als eine Veränderung des pH-Wertes der Lösung, wobei der erste Farbstoff ein Absorptionsspektrum hat, das sich in Abhängigkeit von der Veränderung des pH-Wertes des Milieus verändert.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Veränderungsschritt weiter definiert ist als Zugabe bestimmter Kohlehydrate, die durch bestimmte Mikroorganismen zu sauren Endprodukten fermentiert werden und den pH-Wert des Mediums verändern.

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Veränderungsschritt weiter definiert ist als die Zugabe von Harnstoff, der durch Mikroorganismen, die Urease enthalten, enzymatisch umgewandelt und zu Ammoniak und Kohlendioxid gespalten wird und dadurch den pH-Wert des Milieus verändert.

8. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Veränderungsschritt weiter definiert ist als das Züchten der Mikroorganismen und Veränderung des Reduktions-Oxidations-Potentials des Milieus, wobei der erste Farbstoff ein Absorptionsspektrum hat, das sich in Abhängigkeit von den Veränderungen der Reduktions-Oxidations- Potentiale verändert.

9. Verfahren nach Anspruch 5 oder 8, wobei das Milieu intrazellulär ist.

10. Verfahren nach Anspruch 5 oder 8, wobei das Milieu extrazellulär ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, das weiter die Schritte der Erzeugung eines Verzögerungszeitraums, in dem keine Veränderung der Fluoreszenzemission des zweiten Farbstoffs vor einer Beschleunigung der Veränderung der Fluoreszenzemission erfolgt, wenn Mikroorganismen zu dem Medium zugegeben werden, und Beobachten des Zeitraums des Verzögerungszeitraums als Angabe für die Anzahl der Mikroorganismen in dem Medium enthält.

12. Verfahren nach Anspruch 11, das weiter die Schritte der Erzeugung einer Standard-Kennlinie der Anzahl der Mikroorganismen in dem Medium unter Verwendung der Zeitdauer des Verzögerungszeitraums und Korrelation des Verzögerungszeitraums des Wachstumsmediums, das eine unbekannte Anzahl an Mikroorganismen enthält, mit der Standard-Kennlinie enthält, was die Anzahl der Mikroorganismen in dem Medium anzeigt

13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Zusammengebens weiter definiert ist als ein direktes Metabolisieren des ersten Farbstoffs durch die Mikroorganismen und Verschieben des Absorptionsspektrums des ersten Farbstoffs.

14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Zusammengebens weiter definiert ist als die Zugabe steigender Konzentrationen eines Antibiotikums zu verschiedenen Proben des Mediums, die die Mikro- Organismen enthalten, wobei der Schritt des Beobachtens weiter definiert ist als das Beobachten der niedrigsten Antibiotikum-Konzentration, die in der Lage ist, eine Veränderung der Fluoreszenzemission des zweiten Farbstoffs zu verhindern, was die Empfindlichkeit der Mikroorganismen gegenüber dem Antibiotikum anzeigt.

15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Zusammengebens weiter definiert ist als die Zugabe verschiedener Anibibiotika und/oder Wachstumsinhibitoren zu verschiedenen Proben des Mediums, die die Mikroorganismen enthalten, wobei der Schritt des Beobachtens weiter definiert ist als das Beobachten, welche Antibiotika und/oder Inhibitoren eine Veränderung der Fluoreszenzemission des zweiten Farbstoffs verhindern, was die Empfindlichkeit oder die Resistenz eines Mikroorganismus gegenüber verschiedenen Antibiotika und/oder Inhibitoren anzeigt.

16. Verfahren nach Anspruch 1, das weiter den Schritt des Inkubierens des zusammengegebenen Mediums und der Farbstoffe bei 30 ºC bis 35 ºC für 2 bis 8 Stunden enthält, während die Fluoreszenzänderungen überwacht werden.

17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Zusammengebens weiter definiert ist als die Zugabe einer 5 bis 30 mikromolaren Konzentration des ersten Farbstoffs und einer 2 bis 20 mikromolaren Konzentration des zweiten Farbstoffs.

18. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Beobachtens weiter definiert ist als das Detektieren des anfänglichen Einsetzens eines vorbestimmten Wertes einer Beschleunigung bei der Fluoreszenzemissions-Veränderung des zweiten Farbstoffs als Indikator für die Anwesenheit von Mikroorganismen in dem Medium.

19. Kit zum Ermitteln von Mikrobenmetabolismus, wobei der Kit folgendes aufweist:

ein Wachstumsmedium;

einen ersten Farbstoff mit einem Absorptionsspektrum, das sich bei Anwesenheit von Mikroorganismen aufgrund des Metabolismus der Mikroorganismen verändert;

einen zweiten Farbstoff mit einem Anregungs- oder Emissionsspektrum, das mit einem der unveränderten oder veränderten Absorptionsspektren des ersten Farbstoffs überlappt, wobei die Zugabe des ersten und zweiten Farbstoffs zu dem Medium ohne metabolisierende Mikroorganismen keine Veränderung der festgestellten Fluoreszenzemission des zweiten Farbstoffs bewirkt, und mit metabolisierenden Mikroorganismen Veränderungen bei der beobachteten Fluoreszenzemission des zweiten Farbstoffs bewirkt.

20. Kit nach Anspruch 19, wobei der erste Farbstoff ein Absorptionsspektrum hat, das sich in Abhängigkeit von den physikalisch-chemischen Veränderungen des Milieus verändert.

21. Kit nach Anspruch 20, wobei der erste Farbstoff ein Absorptionsspektrum hat, das sich in Abhängigkeit von den Veränderungen des pH-Wertes des Milieus verändert.

22. Kit nach Anspruch 20, wobei der erste Farbstoff ein Absorptionsspektrum hat, das sich in Abhängigkeit von dem Reduktions-Oxidations-Potential des Milieus verändert.

23. Kit nach Anspruch 19, wobei der erste Farbstoff ein Absorptionsspektrum hat, das sich verändert, wenn der erste Farbstoff von bestimmten Mikroorganismen metabolisiert wird.