DE69110658T2

DE69110658T2 - Messung von farbreaktionen durch überwachung einer fluoreszenzänderung.

Info

Publication number: DE69110658T2
Application number: DE69110658T
Authority: DE
Inventors: Shoshana Bascomb; Roger Morris; Carolyn Olson
Original assignee: Baxter Diagnostics Inc
Current assignee: Baxter Healthcare Corp
Priority date: 1990-11-05
Filing date: 1991-10-30
Publication date: 1996-03-21
Anticipated expiration: 2011-10-31
Also published as: EP0507930A1; BR9106202A; CA2070806A1; AU652592B2; WO1992008123A1; MX9101919A; DE69110658D1; US5173434A; JPH05503365A; AU8937191A; ES2076556T3; KR920704126A; EP0507930B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtastung oder zum Bestimmen der Anwesenheit, oder zum Bestimmen der Konzentration, eines Chromophors in Lösung durch seine Regulierung von Licht, das ein Fluorophor erreicht, das in einer chemisch inerten, lichtdurchlässigen Matrix eingebettet ist.

Hintergrund der Erfindung

Chemische und enzymatische Reaktionen werden zur Abtastung oder zur quantitativen Bestimmung der Anwesenheit bestimmter Substanzen in mikrobiologischen oder anderen Untersuchungen verwendet. Viele dieser Prüfungen verlassen sich auf eine Farbentwicklung oder -änderung oder auf die Fluoreszenz, um die Anwesenheit oder Menge der interessierenden Substanz anzuzeigen.
Es gibt viele Beispiele von Reaktionen, die in der Mikrobiologie verwendet werden, die auf einer Farbänderung beruhen. Bascomb, Enzyme Tests in Bacterial Identification, Meth. Microbiol. 19 (1987), 105. Eine Vielzahl von Organismen kann zum Beispiel zu einem großen Teil nach dem Verlauf ihrer Fermentation, Oxidation oder ihrer Assimilation von Kohlenstoffquellen unterteilt werden. Die Fermentation von Kohlehydraten erzeugt Säure, die eine Erniedrigung des pH-Wertes bewirkt. Dieser Abfall des pH-Wertes kann leicht festgestellt werden, wenn ein pH-Indikator, wie z.B. Bromthymolblau oder Phenolrot, enthalten ist. Mit beiden Indikatoren ergeben die sauren Bedingungen, die die Fermentation eines bestimmten Kohlehydrats wiedergeben, eine gelbe Farbe (für Bromthymolblau eine Änderung von blaugrün und für Phenolrot eine Änderung von rosa/rot). Für eine Vielzahl von Kohlehydraten, von Monosacchariden, wie z.B. Glukose, bis zu Polysacchariden, wie z.B. Inulin, kann die gleiche Methode angewandt werden.
In einer analogen Art kann auch die Zunahme des pH-Wertes verfolgt werden. Untersuchungen zum Abtasten der Anwesenheit von Decarboxylase und Urease, und die Fähigkeit, Malonat zu verwenden, basieren auf der Zunahme des pH-Wertes, angezeigt durch eine Farbänderung eines Indikators.
Eine andere Methode, um zu bestimmen, ob ein Organismus ein bestimmtes Substrat abbauen kann, besteht darin, ein Reagenz zu verwenden, das mit einem oder mehreren der Zwischen- oder Endprodukte reagieren kann, zum Beispiel die Abtastung der Reduktion von Nitrat zu Nitrit. Wenn Nitrit gebildet wird, ergibt sich eine rosa bis dunkelrote Farbe, wenn Sulfanilsäure und Alpha-Naphthylamin zu dem Reaktionsgemisch gegeben werden.
Im Gegensatz zu der indirekten Messung einer enzymatischen Reaktion, die durch den Nitrat/Nitrit-Test veranschaulicht ist, ist es möglich, ein synthetisches Analogon eines natürlichen Substrates zu verwenden, um die Anwesenheit eines Enzyms direkt anzuzeigen. Methylenblau kann zum Beispiel unter bestimmten Bedingungen durch die Wirkung von Reduktase reduziert werden, so daß sich eine Verschiebung von blau nach farblos ergibt. Bei einem anderen Test verläßt sich die Oxidase-Untersuchung auf die Wechselwirkung von Cytochromoxidase mit N,N,N',N'-Tetramethyl-p-phenylendiamin, so daß sich eine blaue Farbe ergibt.
Ein weiteres Beispiel ist die Fähigkeit von Mikroorganismen, Schwefelhaltige Aminosäuren abzubauen, was durch die Erzeugung von H&sub2;S angezeigt wird. Üblicherweise wird der Organismus mit einer hohen Konzentration eines Schwefelhaltigen Substrats (z.B. Cystein, Cystin) unter sauren Bedingungen inkubiert. Die Erzeugung von H&sub2;S wird bei Anwesenheit von Eisen(III)-ammoniumcitrat durch die Bildung eines schwarzen Niederschlages angezeigt.
Enzyme können normalerweise auf mehr als nur ein Substrat einwirken. Aus diesem Grund können synthetische Enzymsubstrate für die Messung von Enzymaktivitäten verwendet werden. Synthetische Substrate enthalten eine Stoffwechseleinheit, die mit einer chromatischen oder fluoreszierenden Einheit konjugiert ist. Das konjugierte Molekül hat normalerweise ein anderes Absorptions- und/oder Emissions-Spektrum als die nichtkonjugierte Form. Außerdem zeigt die nichtkonjugierte chromatische oder fluoreszierende Einheit einen erheblich höheren Absorptions- oder Fluoreszenzkoeffizienten wie die des konjugierten Moleküls. Hierdurch können geringen Mengen von Produkten aus Enzymaktivitäten in Anwesenheit großer Mengen eines konjugierten Substrats, das für eine maximale Enzymaktivität benötigt wird, gemessen werden. Ein Beispiel eines synthetischen Enzymsubstrats ist o-Nitrophenol-β- galactopyranosid, das für die Messung der Aktivität des Enzyms β-Galactosidase verwendet wird. Das konjugierte Substrat ist farblos. Das β-Galactosidase-Enzym hydrolysiert das Substrat und ergibt β-Galactosidase und o-Nitrophenol. o-Nitrophenol absorbiert stark bei 405 nm, und seine Freisetzung kann durch die Zunahme der Absorption bei dieser Wellenlänge gemessen werden. Bascomb hat in Enzyme Tests in Bacterial Identification, Meth. Microbiol. 19 (1987),105, die synthetischen Einheiten, die als Enzymsubstrate verwendet werden, und die enzymatischen Aktivitäten, die unter Anwendung dieses Wirkungsprinzips messbar sind, in einer Übersicht zusammengefasst.
Zur Zeit wird die Farbe oder das farbige Endprodukt von chemischen oder mikrobiellen Reaktionen normalerweise nach einer von zwei Arten kontrolliert: (1) die Abtastung der Farbe oder des farbigen Endproduktes können durch visuelle Beobachtung erhalten oder qualitativ abgeschätzt werden, oder (2) die Abtastung der farbigen Endprodukte oder des Farbverlustes können durch instrumentelles Messen der Farbintensität erreicht werden. Spektralphotometer, die die Lichtabsorption messen, werden gewöhnlich für diesen Zweck verwendet. Zum Messen der Konzentration von mehreren Substanzen ist es vorteilhaft, ein Instrument oder ein Meßprinzip zu verwenden, da sonst die Kosten erhöht werden.
Obwohl die Verwendung kolorimetrischer Reaktionen weit verbreitet ist, gibt es doch Beschränkungen, insbesondere bei der Nachweisempfindlichkeit. Um die Empfindlichkeit zu verbessern und, für den Fall der Identifizierung von Mikroorganismen, dadurch die Zeit zu verringern, die benötigt wird, ein Ergebnis zu erhalten, werden häufig Verfahren auf Basis von Fluoreszenz verwendet. Unglücklicherweise ist es nicht möglich, ein Fluoreszenzmittel zu entwickeln, das für jede Untersuchung gleichermaßen geeignet ist. Zusätzlich können die Fluoreszenz-Reagentien selbst hochtoxisch und deshalb schwierig zu vermarkten sein.
In solchen Fällen kann es erforderlich sein, die Aktivitäten einiger Enzyme fluorometrisch, die der anderen kolorimetrisch zu messen. Die meisten Instrumente sind jedoch entweder geeignet, die Absorption oder die Fluoreszenz zu messen, und nur sehr wenige können verwendet werden, beides zu messen.
Das allgemeine Prinzip der Fluoreszenzdämpfung wird als eine Art anerkannt, enzymatische oder chemische Reaktionen abzutasten oder zu bestimmen. Zum Beispiel haben Fleminger et al. intramolekular gedämpfte fluorogene Substrate zur Untersuchung bakterieller Aminopeptidase P synthetisiert, vgl. Fleminger et al., Fluorogenic Substrates für Bacterial Aminopeptidase P and its Analogs Detected in human Serum and Calf Lung, Eur. J. Biochem., 125 (1982), 609. In diesem Fall wird die Fluoreszenz der Aminobenzoylgruppe durch die Anwesenheit einer Nitrophenylalanylgruppe gelöscht. Bei Anwesenheit des Enzyms wird die Nitrophenylalanylgruppe, bei einem gleichzeitigen Ansteigen der Fluoreszenz der Probe, abgespalten. Eine Vielzahl von Enzymen wurden nach dieser Verfahrensart untersucht, einschließlich hydrolytischer Enzyme, anderer Amino- und Carboxypeptidasen und einer Endopeptidase. Yaron et al., Intramolecularly Quenched Fluorogenic Substrates for Hydrolytic Enzymes, Anal. Biochem. 95 (1979), 228; Carmel et al., Intramolecularly Quenched Fluorescent Peptides as Fluorogenic Substrates of Leucine Aminopeptidase and Inhibitors of Clostridial Aminopeptidase, Eur. J. Biochem. 73 (1977), 617; Carmel et al., An Intramolecularly Quenched Fluorescent Tripeptide as a Fluorogenic Substrate of Angiotensin-I-Converting Enzyme and of Bacterial Dipeptidyl Carboxypeptidase, Eur. J. Biochem. 87 (1978), 265; Florentin et al., A Highly Sensitive Fluorometric Assay for "Enkephalinase", a Neutral Metalloendopeptidase that Releases Tyrosine-Glycine-Glycine from Enkephalins, Anal. Biochem. 141 (1984), 62. Bei jeder der vorstehenden Methoden wurde ein synthetisches Substrat erzeugt, das eine dämpfende und eine fluoreszierende Gruppe enthält, um die Aktivität des Enzyms zu messen.
Eine Alternative zu dieser Methode wäre die Synthese eines Paares fluoreszierender Gruppen, die die Resonanzenergie an ein Substratmolekül übertragen. Bei dieser Methode würde die Abspaltung von einer der Gruppen durch das Enzym eine Abnahme der Fluoreszenz bedeuten, da der kritische Abstand überschritten würde, so daß die Energieübertragung unmöglich gemacht würde. Die vorstehend besprochenen Methoden sind jedoch auf speziell konzipierte Substrate begrenzt.
Noch eine andere Methode betrifft die Abschätzung eines Chromophors durch Fluoreszenzmessung. Siehe W. Blumberg et al., Hemoglobin Determined in Whole Blood "Front Face" Fluorometry, Clin. Hemo. 26 (1980), 409. Blumberg hat eine Untersuchung auf der Basis der Fluoreszenzschwächung eines Farbstoffs, dessen Anregungswellenlängen sich mit den Absorptionswellenlängen des Chromophors überlappen, offenbart.
Später hat M. Shaffer, U.S. Patent Nr. 4 495 293, (nachstehend Shaffer genannt) eine Patentanmeldung eingereicht, in der ein Verfahren zur fluorometrischen Messung eines Liganden in einer Untersuchungslösung unter Anwendung herkömmlicher fluorometrischer Verfahren offenbart wird. Bei Shaffer wird die Intensität der durch die Untersuchungslösung emittierten Fluoreszenz mit der Änderung der Lichtdurchlässigkeits-Eigenschaften der Untersuchungslösung, die durch die Wechselwirkung des zu bestimmenden Liganden mit dem Reagenzsystem hervorgerufen wird, das in der Lage ist, eine Änderung der Lichtdurchlässigkeits-Eigenschaften der Untersuchungslösung bei Anwesenheit des Liganden zu bewirken, in Verbindung gebracht. Shaffer offenbart insbesondere ein Verfahren, das spektrale Absorptionsmaß unter Verwendung eines Fluorophors, das in Lösung mit dem Chromophor ist, zu überwachen. Bei diesem Verfahren kann das Fluorophor mit dem Untersuchungs-Cocktail in Wechselwirkung treten und Änderungen der Fluoreszenz-Intensität hervorrufen, die nicht mit der gemessenen Änderung in Beziehung stehen. Die Auswahl der Fluorophore ist auch insofern begrenzt, als Fluorophore, die vom pH-Wert abhängig oder milieuempfindlich sind, nicht verwendet werden können. Außerdem kann eine alles andere als genaue Messung des spektralen Absorptionsmaßes erhalten werden, wenn das Fluorophor in Lösung ist, da Licht exponentiell durch die Chromophor-Probe absorbiert wird.
Ähnlich haben Beggs & Sand, EPA 91,837, ein Verfahren auf der Basis einer Lösung zum Bestimmen von Tryptophan- Deaminase-Aktivität durch Messung der Fluoreszenz-Verringerung bei Anwesenheit eines Chromophors offenbart, das hergestellt wird durch die Wechselwirkung zwischen Indolbrenztraubensäure und Metallionen unter Verwendung eines Fluorophors, "dessen Fluoreszenz durch den Indolpyruvat-Metallionen- Komplex gelöscht werden kann, wobei die Ionen des Fluorophors während der ganzen Inkubationszeit anwesend sind".
Sands, U.S. Patent Nr. 4 798 788, offenbart auch ein Verfahren, einen Nitrat-reduzierenden Mikroorganismus durch Messen der Fluoreszenz-Verringerung in Lösung durch Diazotierung des Fluorophors abzutasten. In allen Fällen muß ein bestimmtes Fluorophor für jeden Test ausgewählt werden, um sicherzustellen, daß es unter den Testbedingungen fluoresziert, z.B. fluoreszieren nur wenige Fluorophore bei einem pH-Wert von weniger als 2,0.
Folglich besteht Bedarf, ein allgemeines Verfahren zu entwickeln, die Konzentration einer beliebigen Substanz abzutasten oder zu bestimmen, so daß jedes Fluorophor mit den entsprechenden spektralen Kennlinien verwendet werden kann. Außerdem besteht Bedarf, ein Verfahren zu entwickeln, um die bei einer fluorometrischen Untersuchung gemessene Lichtmenge zu maximieren, so daß die Untersuchungsempfindlichkeit erhöht werden kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, um die Konzentration einer Substanz abzutasten oder zu bestimmen, die die Lichtdurchlässigkeits- Eigenschaften einer Lösung ändert.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Abb. 1A zeigt die Regulierung für das Anregungsund/oder Emissionslicht eines chromogenen Reaktionsproduktes durch Stirnflächen-Fluorometrie.
Abb. 1B zeigt die Absorptionsmessung auf der Basis der Emission.
Abb. 2. zeigt die Absorptionsmessung auf der Basis der Anregung.
Abb. 3 zeigt das Absoptionsspektrum für den Farbstoff Xylenolblau, gemessen bei verschiedenen pH-Werten und am isosbestischen Punkt.
Abb. 4. zeigt die Daten der Ergebnisse der Kurvenanpassung nach der Methode der kleinsten Quadrate für die Absorptionsdaten.
Abb. 5 zeigt die Daten der Ergebnisse der Kurvenanpassung nach der Methode der kleinsten Quadrate für die Absorptionsdaten auf der Basis der Fluoreszenz.
Abb.6 zeigt die Daten der Ergebnisse der Kurvenanpassung nach der Methode der kleinsten Quadrate für die Absorptionsdaten auf der Basis der Fluoreszenz gegen die Absorptionsdaten.
Abb. 7 zeigt die Fluoreszenz-Intensität gegen die Xylenolblau-Konzentration.
Abb. 8 zeigt einen Vergleich von indirekter und direkter Absorptionsmessung.

Genaue Beschreibung - Beste verfahrensweise

Bei dieser Methode wird die Fluoreszenz eines Fluoro- phors, das in eine chemisch inerte, lichtdurchlässige Matrix eingeschlossen oder eingebettet ist, durch ein chromogenes Reaktionsprodukt, das durch die Wechselwirkung eines chromogenen Reagenz und der interessierenden Substanz oder einer anderen Verbindung, die mit der Substanz in Beziehung steht, moduliert. Die Untersuchung wird in einer Reaktionskammer durchgeführt, in der vorher ein Fluorophor positioniert worden ist, um den Lichtausbreitungweg zu kreuzen. Die Reaktionskammer kann eine Küvette, eine Vertiefung eines Mikroverdünners oder einer Mikrotüpfelplatte oder eine Blutkulturflasche sein.
Bei einer kolorimetrischen Untersuchung auf der Basis der Fluorometrie wird die Fluoreszenzintensität durch Änderungen des spektralen Absorptionsmaßes eines störenden Chromophors gesteuert. Wenn eine Farbänderung stattfindet, ändert das chromophore Material die Lichtmenge, die das Fluorophor erreicht, und/oder die Menge des emittierten Lichtes, das den Detektor erreicht. Eine Konzentrationsbestimmung und/oder die Anwesenheit des chromophoren Materials hängen von der Wechselwirkung des Reagenz und der zu messenden Substanz, oder von der Wechselwirkung des chromogenen Reagenz und einer anderen Verbindung ab, die mit der interessierenden Substanz in Verbindung steht. Wenn die zu messende Substanz in der Lösung vorhanden ist, dann absorbiert das Chromophor Licht bei einer bestimmten Wellenlänge.
In ähnlicher Weise kann bei Untersuchungssystemen, die kein Chromophor enthalten, die Fluoreszenzänderung durch eine turbidimetrische oder nephelometrische Änderung in der Lösung beeinflußt werden.
Die Voraussetzungen für eine kolorimetrische Untersuchung auf der Basis der Fluorometrie basieren auf der Notwendigkeit der spektralen Überlappung des Absorptionsspektrums des chromogenen Reaktionsproduktes und des Anregungsund/oder Emissionsspetrums des ausgewählten Fluorophors. Durch sandwichartiges Einbringen des Chromophors (normalerweise 8 mm) zwischen die Anregungslichtquelle und die Fluorophormatrix (normalerweise 2 mm Weg), wird eine vollständige Abfrage des chromogenen Reaktionsproduktes auf der gesamten Weglänge sichergestellt. Dies liefert eine genaue, proportionale quantitative Bestimmung der Absorption. Monochromatische Anregungs- und Nachweiswellenlängen werden so ausgewahlt, daß maximale Änderungen des spektralen Absorptionsmaßes angewandt werden, um gleichzeitige Änderungen der Fluoreszenzintensität zu erreichen.
Es ist wichtig anzumerken, daß das Fluorophor, das gleichmäßig in der Matrix verteilt ist, vollständig von dem normalerweise wässrigen Untersuchungs-Cocktail getrennt ist und an keiner Reaktion teilnimmt. Das immobilisierte Fluorophor wirkt nur als Photonenquelle, die durch das spektralaktive Chromophor abgeschwächt oder verstärkt wird. Die Matrix kann eine beliebige inerte Trägersubstanz sein, die bei der interessierenden Wellenlänge transparent ist, z.B Liposome, Harzperlen, Epoxid etc. Entsprechend kann auch ein Fluoreszenzfilter in der Reaktionskammer verwendet werden.
Die Fluoreszenz kann auf verschiedene Arten überwacht werden. Absorptionsmessung auf der Basis von Anregung und/oder Absorption, d.h. Stirnflächen-Fluorometrie, Abb. 1A, durch Absorptionsmessung auf der Basis von Emission, d.h. herkömmliche Fluorometrie, Abb. 1B, und Absorptionsmessung auf der Basis von Anregung, d.h mit herkömmlicher Fluorometrie, Abb. 2. Wie in Abb. 1B, Absorptionsmessungen auf der Basis von Emission, gezeigt wird, macht das Licht bei einem Transmissions-Lichtausbreitungsweg einen einzigen Durchgang durch das chromogene Reaktionsprodukt, das ausschließlich das Licht beeinflußt; nur die Überlappung von Absorption/Fluoreszenzemission ist wichtig. Wie in Abb. 2 gezeigt wird, erlaubt die Positionierung des chromogenen Reaktionsproduktes in dem Lichtweg vor der Fluoreszenzmatrix eine Anregungskontrolle; in diesem Fall ist nur die Überlappung von Absorption/Fluoreszenzanregung wichtig. Die Stirnflächen-Fluoreszenzmessung erfordert einen zweimaligen Durchgang durch das chromogene Reaktionsprodukt; sowohl das Anregungslicht als auch die Fluoreszenzemission können jetzt gleichzeitig durch das absorbierende Chromophor beeinflußt werden und können damit zu einer Delta-Änderung beitragen, was eine äußerst günstige Sachlage bieten kann. Siehe Abb. 1A, Absorptionsmessung auf der Basis von Anregung und/oder Emission. Unter diesen Umständen wirken die spektralen Änderungen von zwei bestimmten Bereichen, entsprechend Fluorophoranregung und -emission, ein.
Bei einer anderen Ausführungsform können Mikroorganismen, die CO&sub2; erzeugen, durch Einkapselung des pH-empfindlichen Chromophors in eine gasdurchlässige, aber für Protonen undurchlässige Matrix nachgewiesen werden, wenn die Schicht spektral an eine chemisch inerte, lichtdurchlässige Matrix, die ein pH-unempfindlichen Fluorophor enthält, gekoppelt ist. Die Änderungen der Fluoreszenzemission können mit der Anwesenheit des Mikroorganismus in Lösung korreliert werden. In diesem Fall kann der Fluoreszenzdetektor unterhalb des eingebetteten Fluorophors angebracht werden.
Insbesondere gehören zu den Komponenten, die für die Entwicklung einer Untersuchung, die Absorptionsmessung auf der Basis von Fluoreszenz verwendet, benötigt werden, folgende:
a) Auswahl der lichtdurchlässigen Matrix und des Fluorophors. Obwohl nicht für alle Anwendungen unbedingt erforderlich, müssen eine Anzahl Kriterien berücksichtigt werden, um die Materialvorbereitung zu vereinfachen und um die Stabilität und Verwendbarkeit zu verbessern. Hierzu gehören:
1. Die spektrale Transparenz des interessierenden Bereiches, normalerweise 250 nm - 700 nm.
2. Die chemische Reaktionsträgheit und Stabilität bei extremen pH-Werten.
3. Die Abwesenheit einer Destabilisierungs-Wechselwirkung zwischen dem immobilisierten Fluorophor und der Matrixumgebung über einen langen Zeitraum.
Insbesondere für Systeme auf der Basis von Epoxid gibt es weitere charakteristische Merkmale, die zusätzlich zu den vorstehend erwähnten erforderlich sind. Zu diesen gehören:
1. Niedrige Viskosität, um die Materialverteilung zu erleichtern.
2. Aushärtung bei Raumtemperatur 25 ºC (8 Stunden), oder Aushärtung bei 65 ºC Hochtemperatur (1 Stunde).
3. Das Vorhandensein von Klebeeigenschaften, um sich mit dem Reaktionsgefäß zu verbinden, normalerweise dem Boden.
Um die vorstehenden Kriterien zu erfüllen, können sowohl UV-härtende als auch Klebstoffe auf der Basis von Epoxid verwendet werden. Das optimale Material, das alle vorstehenden charakteristischen Merkmale zeigte, war Epotek 301 (Epoxy Technology Incorporated Inc., Billerica, MA.).
Die Verwendung eines Fluorophors, um Änderungen bei chromogenen Untersuchungen anzuzeigen, erfordert, daß sich das Anregungs- und/oder Emissions-Spektrum des Fluorophors mit dem Absorptions-Spektrum des Chromophors oder des chromogenen Reaktionsproduktes überlappt. Es wurde gefunden, daß 7- Diethylamino-4-methylcumarin, DM Coumarin (Molecular Probes), ein sehr stabiler Fluoreszenzfarbstoff ist. Dies Material hat geeignete spektrale Voraussetzungen (Anregung bei 365 nm, Emission bei 450 nm) und eine hohe Quantenausbeute, die es sehr geeignet für die nachstehend beschriebenen chromophoren Tests machen.
Bei der nachstehend beschriebenen besonderen Anwendungsart wird der Stirnflächen-Fluoreszenz-Nachweis durch Überprüfung einer Reaktionsvertiefung auf einer Tüpfelplatte von oben verwendet. Bei diesem Verfahren kann eine weiße oder eine andere Art einer reflektierenden Platte verwendet werden, um die eingefangene Fluoreszenzmenge zu vergrößern.
Bei dem Fluorometer, das verwendet wurde, diese Tests zu entwickeln, konnten einzelne Wellenlängen mit begrenzter spektraler Bandenanregung bei (365 nm) und -emission (450 nm) eingesetzt werden. Dies Licht sorgt für die ausschließliche Abfrage spektraler Bereiche, die bei jedem Test den größten Änderungsgrad der Absorption bieten.
Es können eine Reihe spektral überlappender Fluorophore in einer einzigen Matrix hergestellt werden, die einen weiten Spektralbereich abdecken, wenn sie optisch zusammengefaßt werden. Hierdurch würde ein generisches Material, das im UV-, im sichtbaren oder im infraroten Spektralbereich bei jedem Chromophortest verwendet werden könnte, zur Verfügung gestellt. Fluorophore im Sichtbaren und im Infraroten, wo es eine große Menge Licht von preisgünstigen Glühlicht-Quellen gibt, sollten in der Tat eine deutliche Verbesserung der Qualität der Daten bieten, da sich der Rauschabstand bei mehr Licht verbessert. Wo es jedoch möglich ist, wird die Verwendung des isosbestischen Punktes eines Chromophors, d.h. eine spektrale Stelle im Spektralprofil eines Chromophors, das während der ganzen Reaktion konstant ist, als Absorptions- Wellenlänge des Chromophors ausgewählt, und sie wird als interne Referenz fuhr Messungen der Delta-Änderung ausgewählt. Siehe Abb. 3.
Die quantitative Bestimmung der Konzentration eines Chromophors durch eine Absorptionsmessung auf der Basis von Fluoreszenz wird mit dem nachstehenden Verfahren erhalten:
Dies Verfahren stellt in groben Zügen eine allgemeine methode zur Konzentrationsmessung eines Produktes eines Reaktionsgemisches in Lösung (die Lösung enthält die interessierende Substanz und das chromogene Mittel) dar, indem das chromogene Reaktionsprodukt zwischen einer Lichtquelle und einer inerten fluoreszierenden Matrix positioniert wird. Ein Stirnflächen-Anregungs-/Emissions-Nachweis-Fluorometer, wie in Abb. 1A, erlaubt eine genaue Abschätzung des Chromophors, die auffolgendem basiert:
I) Abschwächung des frontalen, monochromatischen, oder des begrenzt spektralen Bandendurchganges, Anregungslichtes, welches das Fluorophor durch spektrale Überlappung des Absorptionsspektrums des chromogenen Reaktionsproduktes und des Anregungsspektrums des Fluorophors erreicht.
II) Abschwächung der emittierten Fluoreszenz, die den monochromatischen oder den spektral begrenzten Bandendurchgangs-Detektor auf der Vorderseite durch spektrale Überlappung des Absorptionsspektrum des Chromophors und des Emissionsspektrum des Fluorophors erreicht.
Das tatsächliche berechnete spektrale Absorptionsmaß enthält Absorptionsanteile von beiden der vorstehenden Komponenten. Es folgt nun eine vollständige Beschreibung der speziellen Beispiele, einschließlich der damit verbundenen Kurven und Berechnungen, die die experimentelle Gültigkeit dieses einzigartigen Verfahrens beweisen.

1) Erstellung der Kurve eines Nachweisstandards unter Verwendung eines Spektralphotometers

Es wird eine Konzentrationsreihe eines herkömmlichen, wasserlöslichen Farbstoffs hergestellt, um einen Absorptionsbereich von 0,1 bis 1,0 auf Basis der zusammengefaßten bzw. kombinierten Absorptionen bei der interessierenden Wellenlänge zu erhalten. Für Xylenolblau erfolgt die spektrale Lichtregulierung (Absorption) zwischen 400 und 600 nm. Um das nachstehend besprochene Fluorophor aufzunehmen, wurden Absorptionsmessungen gegen eine Wasser-Referenz gemacht. Wellenlängen, die den Anregungs- und Emissionsbereichen innerhalb der 400-500 nm entsprachen, wurden willkürlich ausgewählt, nämlich bei 530 nm bzw. 590 nm. Die Absorptionswerte dieser Wellenlängen wurden aufsummiert, so daß eine Standardkurve der zusammengefaßten Absorption gegen die Konzentration, d.h. Absorption bei 530 nm + Absorption bei 590 nm = Absorptionssumme, möglich wurde.
Eine Kurve von Absorption gegen Konzentration, d.h. eine Beer-Lambert-Kurve, bei verhältnismäßig niedrigen Konzentrationen ergibt eine Gerade, die durch Null geht. Eine Anpassung der Daten nach der Methode der kleinsten Quadrate ergibt eine genaue Abschätzung von Absorptionseinheiten pro Einheit der Konzentration. Sollte eine der beiden Absorptionswellenlängen der unbekannten Konzentration des Farbstoffs besonders benötigt werden, so kann das konstante Verhältnis der Anregungs- und Emissionswellenlängen verwendet werden, die spektralphotometrisch bestimmt wurden.
Bei jeder Fluoreszenzmessung ist es entscheidend, daß das Fluorometer zwischen den Anregungs- und Emissionswellenlängen des Lichtes (mit hinreichender Stokesscher Verschiebung) unterscheiden kann, um sicherzustellen, daß keine Reflexions- und Streuprobleme bei dieser Messung stören.
Die Abbildungen 4, 5 und 6 zeigen die Daten der Ergebnissen der Anpassungsverfahren nach der Methode der kleinsten Quadrate von a) den Absorptionsdaten, b) den Absorptionsdaten auf der Basis der Fluoreszenz und c) die Absorptionsdaten auf der Basis der Fluoreszenz gegen die Absorptionsdaten.
Unter Verwendung von Abs (Summe) = E * c * d
wobei E = die zusammengefassten Extinktionskoeffizienten bei beiden Wellenlängen
c = Konzentration
d = Weglänge (1 cm)
kann E, ein neuer Extinktionskoeffizient berechnet und mit der Fluoreszenzmessung auf der Basis der Absorption, die nachfolgend beschrieben wird, verglichen werden.

2) Erstellung einer Fluoreszenzmessung auf der Basis von Absorption unter Verwendung eines Fluorometers

Ein geeignetes Fluorophor, mit spektralen Anregungs- und Emissionsbanden im Bereich von 400 bis 600 nm, wird in einer transparenten Schicht einer Acrylmatrix eingebettet. Ein Flächenkörper dieser Matrix bildet eine Seite einer 1 cm Küvette, die so in einem Stirnflächen-Fluorometer positioniert wird, daß das Anregungslicht den gesamten 1 cm Küvettenweg durchqueren muß, bevor es das Fluorophor erreicht; in ähnlicher Weise muß auch die ausgestrahlte Fluoreszenz die 1 cm Strecke durchlaufen, bevor es von dem Fluorometer gemessen wird.
Anfangs wird Wasser in die vorgefertigte Küvette gegeben, und eine Abschätzung der Fluoreszenzintensität des Fluorophors (willkürliche Einheiten) wird erhalten. Als nächstes wird die Konzentrationsreihe der Farbstofflösungen getrennt in die Küvette gegeben, und die Fluoreszenz wird gemessen. Die Fluoreszenzintensität kann jetzt zum Bestimmen der zusammengefaßten Wellenlängenabsorption verwendet werden, wobei folgendes verwendet wird:
log 10 (Iref/Iprob) = Absorption (530 nm + 590 nm),
wobei IRef = Fluoreszenzintensität der Wasser-Referenz
IProb = Fluoreszenzintensität der Probe (siehe Abb. 7)
s = Ausgleich für 30º-Winkel der Anregung/Emission, der die Weglänge tatsächlich verlängert, d.h. cos Θ = adj/hyp = 1,1
Eine Auftragung der Absorption gegen die Konzentration sollte eine Gerade sein und die Spektrophotometer-Daten überlagern, so daß eine direkte Bestätigung der mathematischen Beschreibung der Methode gegeben ist.
Hieraus ergibt sich, daß jede unbekannte Konzentration des gleichen Farbstoffs unter Verwendung von entweder der Kurve oder durch direkte Berechnung unter Verwendung des Extinktions-Koeffizienten erhalten werden kann, wenn erst einmal die vorstehenden Bestimmungen gemacht worden sind. Siehe Abb.8.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung. Die Konzentration der Reagentien und andere variable Parameter werden nur gezeigt, um die Verfahren der vorliegenden Erfindung beispielhaft zu verdeutlichen, und dürfen nicht als deren Einschränkung angesehen werden.

Beispiel 1 Beta-Lactamase Untersuchung

Beta-Lactamase ist ein Enzym, das eine Bindung im Lactamring von Penicillin spaltet. Bei der Spaltung des Lactamringes wird eine Carboxylgruppe gebildet. Die Spaltung zerstört die Wirksamkeit des Antibiotikums. Ein Verfahren, die Aktivität von beta-Lactamase nachzuweisen, basiert auf der Konkurrenz des offenen Lactamrings und Stärke um I&sub2;- Moleküle (Iodometrie). Bei dieser Untersuchung ist I&sub2; das chromogene Reagenz. Der offene Lactamring von Penicillin ist ein Produkt der beta-Lactamase-Aktivität, das mit der Verbindung in Beziehung steht. Bei dem iodometrischen Verfahren bindet sich I&sub2; nicht-kovalent an Stärke, so daß sich eine intensive blau-purpurne Farbe ergibt. Wenn ein eingebettetes Fluorophor vorhanden ist, dann wird seine Fluoreszenz verringert werden. Penicillin G wird bei Anwesenheit von beta-Lactamase verändert, und I&sub2; bindet sich an den offenen Lactamring, so daß sich eine Farbaufhellung in der Kammer ergibt. Wenn sich die Farbe der Kammer aufhellt, nimmt die Fluoreszenz zu.
Der Test wurde wie folgt durchgeführt:

1. Herstellung des eingebetteten Fluorophors

Zwölf ml Epoxid-Harz wurden über 5 bis 10 Minuten vorsichtig mit zwei ml Härter vermischt, wobei darauf geachtet wurde, keine Hohlraumbildung zu verursachen, vier ml des Gemisches wurden dann entfernt und verworfen. 7-Diethylamino- 4-methylcumarin, DM Coumarin (Molecular Probes), wurde zu einer Konzentration von 1,0x10&supmin;²M in 100% absolutem Methanol aufgelöst, und 40 ul wurden zu den 10 ml Epoxid-Gemisch zugegeben. Die Masse wurde eine weitere Stunde vermischt, und dann wurden 50 ul in die Vertiefungen einer weißen Platte mit 96 Vertiefungen gegeben. Dies ergibt eine vertikale Weglänge von 2 mm. Dem steht eine Weglänge von etwa 8 mm bei der Wasseruntersuchung gegenüber.

2. Untersuchung für beta-Lactamase

Eine Inokulierungssuspension eines Bakterienisolates in Kochsalzlösung/Pluronic, in der Trübung einem 0,5 McFarland Trübungsstandard entsprechend, wurde hergestellt, und 300 ul der Bakterien-Inokulierung wurden zu 25 ml der Pos Inoculum Broth (Baxter Diagnostics Inc., MicroScan Division) gegeben. Einhundertfünfzehn ul dieser Inokulierung wurden in eine Reaktionsvertiefung, die 0,8 mg/ml Penicillin G (Wyeth Laboratories), 0,2% Stärke (J.T. Baker) und ein Fluorophor enthielt, das in Epoxid eingebettet war, gegeben. Als nächstes wurden 50 ul der unverdünnten Inokulierung des Bakterienisolates zugegeben. Das Gemisch wurde 5½ Stunden bei 37ºC inkubiert. Zum Schluß wurden 50 ul einer 2%igen Iodlösung (Scientific Products) zugegeben, und das Gemisch wurde 10 Minuten inkubiert.
Wenn beta-Lactamase vorhanden ist, wird die blaue Farbe bis zur Durchsichtigkeit verblassen, und die Fluoreszenz wird zünehmen. TABELLE 1 Immobilisiertes Fluorophor Positiv Referenz Negativ Gesamt Positiv Negativ Gesamt % Übereinstimmung Empfindlichkeit Spezifizität
Empfindlichkeit: Prozentuale Richtigkeit für die Fälle, die ein positives Ergebnis nach dem Referenz- Verfahren zeigen.
Spezifizität: Prozentuale Richtigkeit für die Fälle, die ein negatives Ergebnis nach dem Referenz-Verfahren zeigen.
Das Referenz-Verfahren für den beta-Lactamase Test besteht darin, die herkömmlichen Ansätze MicroScan POS (Scientific Products) zu verwenden, die entsprechend der Packungsbeilage beimpft und inkubiert werden. Diese herkömmlichen Übernacht-Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen verglichen, die in fünfeinhalb Stunden nach dem Verfahren erhalten wurden, das in Beispiel 1 angegeben wurde.

Beispiel 2 Indol-Untersuchung

Indol bildet einen grünblau gefärbten Komplex, wenn es bei niedrigen pH-Werten mit Dimethylaminozimtaldehyd umgesetzt wird. Bei der Bildung dieses Chinoid-Komplexes gibt es eine Delta-Absorptionszunahme bei 365 nm und 450 nm (entsprechend den Anregungs- und Emissions-Wellenlängen des Fluorophors). Die Absoptionszunahme bei beiden Wellenlängen vergrößert die gemessene effektive Gesamtänderung der Fluoreszenz deutlich; das Anregungs-Durchgangslicht des chromogenen Reaktionsproduktes und die gemessene Emission nehmen ab. Siehe Abb. 1A, Absorptionsmessungen auf der Basis von Anregung und/oder Emission. Die so erhaltenen Abnahme der gemessenen Fluoreszenz steht in Beziehung zu der vorhandenen Indolmenge. Der Test wurde wie folgt durchgeführt:

1. Herstellung des einbebetteten Fluorophors

Sechs ml Epoxid-Harz wurden über 5 bis 10 Minuten vorsichtig mit einem ml Härter vermischt, wobei darauf geachtet wurde, keine Hohlraumbildung zu verursachen. Es muß angemerkt werden, daß dies nicht das vom Hersteller empfohlene Harz/Härter-Verhältnis ist, da durch zahlreiche Experimente nachgewiesen wurde, daß der Härter im Überschuß war. Der überschüssige Härter verblieb an der Oberfläche der Vertiefung und trat in Wechselwirkung mit dem Reaktionsgemisch, wodurch falsche positive Werte erzeugt wurden.
7-Diethylamino-4-methylcumarin, DM Coumarin (Molecular Probes), wurde zu einer Konzentration von 1,8 x 10&supmin;³M in 100% absolutem Methanol gelöst, und 65 ul wurden zu dem aushärtenden Epoxid-Gemisch gegeben. Die Masse wurde eine weitere Stunde vermischt, und dann wurden 50 ul in die Vertiefungen einer weißen Mikrotiter-Platte mit 96 Vertiefungen gegeben. Dies ergibt eine effektive vertikale Weglänge von 2 mm. Dem steht eine Weglänge von etwa 8 mm des Wasseruntersuchung gegenüber.

2. Versuch mit Indol

Eine Inokulierungssuspension eines Bakterienisolates in Kochsalzlösung/Pluronic, in der Trübung einem 0,5 McFarland Trübungsstandard entsprechend, wurde hergestellt, und 115 ul der Inokulierung wurden in eine Reaktionsvertiefung, die 0,3% Tryptophan (Sigma), 0,1% Bactopepton (Difco) und 0,5% KPO&sub4;-Puffer mit einem pH-Wert von 7,6 enthielt, zusätzlich zu dem in Epoxid eingebetteten Fluorophor gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde zwei Stunden bei 35 ºC inkubiert. Zum Schluß wurden 75 ul des chromogenen Mittels, Dimethylaminozimtaldehyd in 1,2M HCl, zugegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten reagieren gelassen.
Wenn Indol durch das Isolat erzeugt wird, wird das Reaktionsgemisch grün. Die Messung der Fluoreszenz zeigt eine deutliche Abnahme in Bezug auf die Ausgangsmessung; diese Änderung kann dann in Bezug zu der in dem Reaktionsgemisch vorhandenen Indolkonzentration gesetzt werden. Die vorliegende Methodik ist eine Verbesserung gegenüber der herkömmlichen Methodik der Indoluntersuchung, da der erforderliche Inkubations-Zeitraum etwa zwei Stunden beträgt, dem steht eine Inkubations-Zeit von etwa 24 Stunden gegenüber, die nach dem herkömmlichen Indoltest erforderlich ist. TABELLE 2 Herkömmliches Verfahren Immobilisiertes Fluorophor Positiv Negativ Gesamt % Übereinstimmung Empfindlichkeit Spezifizität
Empfindlichkeit: Prozentuale Richtigkeit für die Fälle, die ein positives Ergebnis nach dem Referenz- Verfahren zeigen.
Spezifizität: Prozentuale Richtigkeit für die Fälle, die ein negatives Ergebnis nach dem Referenz-Verfahren zeigen.
Der Indoltest nach dem herkömmlichen Verfahren wurde, wie in der Packungsbeilage beschrieben, nur für den MicroScan GN ID-Test (Scientific Products) beschrieben durchgeführt. Der Inkubations-Zeitraum war über Nacht.

Beispiel 3 Oxidase-Untersuchung

Das Prinzip kann bei einer weiteren Ausführungsform zur Abtastung des Enzyms Oxidase angewandt werden. Die Anoder Abwesenheit dieses Enzyms wird zur Identifizierung sowohl von fermentativen als auch von nicht-fermentativen Bakterien verwendet. Dieser Test mißt die Fähigkeit von Organismen, den Redox-Farbstoff N,N,N',N'-Tetramethyl-p-phenylendiamin in Gegenwart atmosphärischen Sauerstoffs durch Beobachtung einer Änderung des Reaktionsgemisches von farblos nach blau zu oxidieren. Wenn ein Fluorophor, wie z.B. 7-Methyl-amino-cumarin oder 7-Diethylamino-4-methyl-cumarin, in einer Matrix am Boden des Testgefäßes immobilisiert ist, wird seine Fluoreszenz durch die Bildung einer blauen Farbe gedämpft, wenn das Enzym vorhanden ist. Je stärker die Farbintensität, desto größer ist die Fluoreszenzabschwächung von 7-Methyl-amino-cumarin oder Diethylamino-4-methyl-cumarin.

Verfahren

1) Mache eine Inokulierung eines Bakterienisolats in Kochsalzlösung/Pluronic, in der Trübung einem 0,5 McFarland Trübungsstandard entsprechend.
2) Gib 50 ul der Inokulierung in eine Kammer, die ein in Epoxid eingebettetes Fluorophor an ihrem Boden und Trockensubstanz entsprechend 2,5 mM N,N,N',N'-Tetramethyl-p- phenylendiamin (Sigma), 0,5 mM N-Acetylcystein, 50 mM Bernsteinsäure und 50 mM NaOH bei einem pH-Wert von 6,0 hat. Gib 50 ul Kochsalzlösung in eine Kontrollkammer, die die vorstehenden Bestandteile und in Epoxid eingebettetes Fluorophor auf ihrem Boden enthält.
3) Inkubiere zwei Stunden bei 35 ºC. Miß unter Verwendung von Stirnflächen-Fluorometrie, siehe Abb. 1A, Absorptionsmessung auf der Basis von Anregung und/oder Emission.
4) Bei Oxidasepositiven Organismen zeigt die Messung der Fluoreszenz eine deutliche Abnahme relativ zur Kontrolle und in Bezug zu dem oxidierten N,N,N',N'-Tetramethyl-p-phenylendiamin.
Anders ausgedrückt, die Fluoreszenzabnahme im Vergleich zum Zeitpunkt Null könnte Oxidase-Aktivität aufzeigen.

Beispiel 4 Phenylalanin-Ammoniak-Lyase Untersuchung

Bei einer weiteren Ausführungsform kann das Prinzip zur Abtastung des Enzyms Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (L-Aminosäure Oxidase, Phenylalanintest, Deaminase Test) verwendet werden. Die Anwesenheit dieses Enzyms ist für die spezifische Erkennung der Proteae-Klasse und zur Identifizierung von Moraxella phenylpyruvica verwendet worden. Dieser Test mißt die Fähigkeit der Organismen, eine L-Aminosäure zu deaminieren, um eine Alpha-Ketosäure + Ammoniak zu bilden. Wenn die synthetische Verbindung p-Nitrophenylalanin als Substratenzym verwendet wird, hat die Aktivität p-Nitrophenylbrenztraubensäure zur Folge, die nach Zugabe von NaOH durch das Sichtbarwerden einer bräunlichen Farbe gemessen werden kann. Wenn ein Fluorophor, wie 7-Methyl-amino-cumarin oder 7-Diethylamino-4-methyl-cumarin (DMC), verwendet wird, dann tritt eine Dämpfung der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Menge an p-Nitro-phenylbrenztraubensäure ein.
Der Test wird wie nachfolgend beschrieben durchgeführt:

Verfahren:

1) Mache eine Inokulierung eines Bakterienisolats in Kochsalzlösung/Pluronic, in der Trübung einem 0,5 McFarland Trübungsstandard entsprechend.
2) Gib 50 ul der Inokulierung in eine Kammer, die das Fluorophor Dimethylcumarin, das immobilisiert in der Wand ist, und Trockensubstanz entsprechend 5 mM DL-β-(p-Nitrophenyl-alanin (Koch Light Laboratories), 0,1 M
Tris(hydroxymethyl)methylamin, 0,1 M KH&sub2;PO&sub4; bei einem pH-Wert von 8,0 enthält. Gib 50 ul Kochsalzlösung in eine Kontrollkammer, die die obenstehenden Bestandteile und das Fluorophor, das in den Boden der Kammer immobilisiert wurde, enthält.
3) Inkubiere zwei Stunden bei 35 ºC.
4) Nach der Inkubation gib 25 ul 0,2M NaOH in die Test- und Kontrollkammer. Wenn p-Nitrophenylbrenztraubensäure vorhanden ist, wird das Reaktionsgemisch gelbbraun. Die Messung der Fluoreszenz zeigt eine deutliche Abnahme relativ zu der Kontrolle und in Bezug zu der vorhandenen p-Nitrophenylbrenztraubensäure.

Beispiel 5 Voges-Proskauer Test

Bei einer weitere Ausführungsform kann das Prinzip für den Nachweis von Voges-Proskauer (V-P) positiven Organismen verwendet werden. Durch die V-P-Reaktion, Voges, O. und Proskauer, B. Beitrag zur Ernährungsphysiologie und der Diffentialdiagnose der Bakterien der hämorrhagischen Septicamie, Z. Hyg. Infekt. Kr. 28 (1898), 20, wird die Erzeugung von Acetoin (Acetyl-methyl-carbinol) und/oder Diacetyl (Butandion) aus Glukose oder Brenztraubensäure erkannt. Dieser Test ist bei der Trennung von Mitgliedern der Gattungen Citrobacter, Escherichia und Salmonella von denen der Gattungen Enterobacter, Klebsiella und Serratia wichtig. Der Test besteht aus einem Fluorophor, wie Esculin, 7-Methylaminocumarin oder 7-Dimethylamino-4-cumarin, das am Boden einer Kammer, die Trockensubstanz entsprechend Na-Pyrurat (0,1 M), Kreatin (0,07%), Thiaminpyrophosphat (0,26 mM) und Phthalatpuffer (0,05 M) bei einem pH-Wert von 4,8 enthält, immobilisiert ist.

Verfahren

Eine 50 ul Aliquote einer Bakterien-Inokulierung, in seiner Trübung einem 0,5 McFarland Trübungsstandard entsprechend, wird in die Prüfzelle gegeben. Eine 50 ul Aliquote Kochsalzlösung wird in eine Kontrollzelle gegeben.
Nach zwei Stunden Inkubation bei 35 ºC, werden 25 ul Aliquote einer Lösung aus 2,5% Naphthol in 1 M NaOH sowohl in die Prüf- als auch in die Kontrollkammern gegeben. Eine positive Reaktion wird durch das Sichtbarwerden einer roten Farbe und einer gleichzeitigen Abnahme der Fluoreszenz, die mit Stirnflächen-Fluorometrie gemessen wird, angezeigt, siehe Abb. 1 Absorptionsmessung auf der Basis von Anregung und/oder Emission.
Weitere Ausführungsformen dieses Prinzips können bei Immunassay-Verfahren, z.B. Aktivitätsmessungen von mit Antikörpern konjugierter Peroxidase in einer direkten oder Sandwich-ELISA-Untersuchung, verwendet werden. Die Fluoreszenzdämpfung des Fluorophors, das in der Reaktionskammer immobilisiert ist, kann verwendet werden, Farbänderungen aufgrund von Enzymreaktionen mit dem 2,2-Azino-di-(3-ethylbenzothiazolinsulfon-6)diammoniumsalz-Substrat abzutasten.
Eine ähnliche Ausführungsform könnte für die Messung der Bindung einer Nucleinsäureprobe, mit dem ein Enzymmolekül konjugiert ist, angewandt werden. Die Aktivität des Enzyms wird durch die Einwirkung auf ein chromogenes Substrat angezeigt, das ein Produkt freisetzt, das die Fluoreszenz eines immobilisierten Fluorophors reguliert.
Es sollte für den Fachmann selbstverständlich sein, daß die Spezifikationen und Beispiele der vorliegenden Erfindung und anderer Ausführungsformen nur veranschaulichender Natur, aber nicht einschränkend innerhalb des Schutzumfanges der Erfindung sind, die durch die Patentansprüche definiert ist.

Claims

1. Verfahren zur Abtastung der Anwesenheit einer Substanz in Lösung, das folgende Schritte umfaßt:

- Vorsehen einer Lichtquelle, die einen Strahl emittiert, der einen Lichtausbreitungsweg bildet;

- Positionieren einer Lösung, welche die Substanz und ein chromogenes Mittel enthält, in dem Lichtweg;

- sandwichartiges Einbringen der Lösung zwischen die Lichtquelle und ein isoliertes Fluorophor, das in eine chemisch inerte, lichtdurchlässige Matrix eingebettet ist, so daß sie den Lichtweg kreuzt, wobei das Fluorophor ein Anregungsspektrum besitzt, welches das Absorptionsspektrum eines Chromophors überlappt, der durch die Reaktion des chromogenen Mittels mit der abzutastenden Substanz gebildet wird; und

- Messen einer Änderung der Emission des Fluorophors, die daraus resultiert, daß Licht durch den Chromophor geschwächt oder verstärkt wird.

2. Verfahren zum Bestimmen der Konzentration einer Substanz in Lösung, das folgende Schritte umfaßt:

3. Verfahren zur Abtastung der Anwesenheit einer Substanz in Lösung, das folgende Schritte umfaßt:

- Messen einer Änderung bei dem abgetasteten emittierten Licht von dem Fluorophor, die daraus resultiert, daß Licht von dem Chromophor geschwächt oder verstärkt wird.

4. Verfahren zur Bestimmung der Konzentration einer Substanz in Lösung, das folgende Schritte umfaßt: