ITNA20090042A1 - Un nuovo metodo ottico per una determinazione rapida e semplice di analiti - Google Patents
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Description
DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE INDUSTRIALE AVENTE PER TITOLO: “Un nuovo metodo ottico per una determinazione rapida e semplice di analiti”
Il campo dei sensori chimici e biologici rappresenta un’area in grande espansione che riveste notevole interesse sia nell’ambito della ricerca di base sia di quella applicata [Borisov S.M., Wolfbeis O.S.; Chem. Rev. 108, 2, 423-461, 2008]. Allo scopo di definire la parola sensore sono state date innumerevoli definizioni. In ogni caso, tutte prevedono l’utilizzo di una componente chimica o biologica che sia in grado di riconoscere 1' analita d’interesse e di trasformare la risposta chimica o biologica in un segnale fisicamente misurabile.
La ricerca, industriale e non, si è concentrata sullo sviluppo di metodi chimico-fisici di rilevazione e di opportuni sensori sempre più precisi, per l’analisi, ad esempio, della qualità degli alimenti in ambito agroindustriale e per determinare analiti importanti per la salute umana [D'Auria S, Lakowicz JR Curr Opin Biotechnol. 2001 Feb;12(l):99-104],
I sensori ottici, in particolare, offrono una serie di vantaggi rispetto ai sistemi di determinazione tradizionali, quali dimensioni ridotte, tempi di vita lunghi, specificità nella risposta, elevata sensibilità, costi ridotti e semplicità di esecuzione della misura, non necessitando di personale specializzato [Borisov S.M., Wolfbeis O.S.; Chem. Rev. 108, 2, 423-461, 2008],
La metodologia oggetto di tale brevetto si basa sulla possibilità di modulare l’intensità di eccitazione di una sostanza fluorescente mediante l’utilizzo di molecole come sonde che variano le proprie proprietà di assorbimento della luce in seguito ad interazione con uno specifico analita. Tale metodologia prevede l’impiego di una cuvetta, e non limitato ad essa, funzionalizzata sulla parete esterna opposta al raggio di eccitazione con composti fluorescenti. Le condizioni richieste per la funzionalità della metodologia oggetto del presente brevetto sono: 1) la specie deputata al riconoscimento subisce una variazione sostanziale dello spettro di assorbimento in seguito al legame con l’analita e/o all’evento molecolare che si vuole seguire. In altre parole, il numero dei fotoni assorbiti dalla molecola-sonda che deve effettuare il riconoscimento dell’ analita varia in maniera sostanziale in seguito all’ interazione; 2) sovrapposizione anche parziale della banda di assorbimento della molecola fluorescente, utilizzata per la funzionalizzazione della superfìcie esterna della cuvetta, con almeno una banda di assorbimento della molecola-sonda che varia in seguito alla specifica interazione con T analita di interesse e/o all’evento che si desidera monitorare.
La metodologia oggetto del presente brevetto è altamente innovativa e risulta quindi molto più vantaggiosa rispetto alle metodologie attualmente presenti sul mercato per quanto riguarda la semplicità di costruzione del dispositivo e la rapidità di utilizzo.
Inoltre, l’alta sensibilità della spettroscopia di fluorescenza e la selettività della molecola-sonda, rendono la metodologia oggetto del presente brevetto uno strumento di estrema versatilità per una rapida e semplice determinazione di analiti nonché per monitorare un qualsivoglia evento fisico-chimico e/o biologico.
La metodologia oggetto del seguente brevetto è di applicabilità del tutto generale, in quanto dipendente esclusivamente dalla scelta del fluoroforo con cui viene funzionalizzata la parete esterna della cuvetta e tale scelta è dettata dalla variazione dello spettro di assorbimento della molecola deputata al riconoscimento dell’analita e/o del processo che si vuole monitorare. E’ evidente che le combinazioni fluoroforo/molecola-sonda possibili sono infinite. Regolando opportunamente la lunghezza del cammino ottico è possibile, altresì, modulare l’intensità di fluorescenza della sonda fluorescente utilizzata per la funzionalizzazione della cuvette, in base alle esigenze della specifica misura, espandendo l'intervallo dinamico di sensibilità della metodologia oggetto del presente brevetto.
L’elemento innovativo del seguente brevetto è rappresentato dall’utilizzo di una cuvetta commerciale, e non limitato ad essa, funzionalizzata con composti fluorescenti eccitabili nell’intervallo di lunghezze d’onda, che variano dall’ultravioletto al vicino infrarosso, mediante loro semplice deposizione anche litografica. Negli esempi di seguito descritti, e non limitati ad essi, la metodologia oggetto del presente brevetto è stata applicata per la determinazione di monossido di azoto, ossigeno, D-serina e per lo stato ossido-riduttivo di metallo/proteine utilizzando le seguenti combinazioni fluoroforo/sonda: 1) Atto620/Citocromo c perossidasi per la determinazione del monossido di azoto; 2) Lumen/Mioglobina per la determinazione dell’ossigeno o dello stato di ossidazione della mioglobina; 3) Fluoresceina/D-serina deidratasi per la determinazione di D-serina.
Esempio 1
Determinazione dell NO mediante Citocromo c Perossidasi ( CcP) L’NO, è un radicale libero altamente reattivo che regola innumerevoli processi biologici in maniera dipendente dalla sua concentrazione. A basse concentrazioni, ad esempio, ΓΝΟ regola la vasodilatazione nel sistema circolatorio ed agisce come messaggero nel sistema immunitario ed in quello nervoso. D’altro canto, concentrazioni micromolari di NO possono portare a carcinomi maligni nonché a disordini di tipo neurodegenerativo [Lim M. H., Lippard S. J., Acc.Chem.Res. 2007, 4041-51].
Inoltre, ΓΝΟ è uno dei gas di scarico più pericolosi generati dagli autoveicoli. E’ ben noto dalla letteratura che emissioni di NO causano problemi ambientali, quali ad esempio piogge acide e distruzione dello strato di ozono [Dooly G., Fitzpatrick C., Lewis E., Energy 2007, 33 657-666].
A causa di un interesse così ampio verso tale molecola, nell’ultimo ventennio innumerevoli gruppi di ricerca hanno concentrato i loro studi sullo sviluppo di tecniche che ne consentissero una determinazione accurata, rapida e soprattutto semplice.
Chemiluminescenza, amperometria, spettroscopia EPR, elettrodi porfirinici sono le tecnologie comunemente utilizzate per determinare l’eventuale presenza di NO, sia quando disciolto in soluzioni acquose sia in forma gassosa. Il fatto che tali tecnologie prevedano l’impiego di apparecchiature costose e altamente specializzate, in aggiunta alla bassa sensitività della maggior parte di esse, rendono tali metodi poco idonei allo studio della reattività biochimica dell’NO [Boon E.M., Marletta M.A. J.Am. Chem. Soc., 2006, 128, 10022-10023], Recentemente è stato trovato che la citocromo c perossidasi (CcP), funzionalizzata con un’ opportuna sonda fluorescente, rappresenta un metodo performante per la determinazione di NO [comunicazione personale da parte di uno dei coautori del presente brevetto ]. La CcP, purificata secondo procedure riportate in letteratura [Worrall J. A., Kolczak U., Cantere G. W., Ubbink M., Biochemistry 2001, 40 7069-7076] è una eme proteina solubile che si trova nello spazio intermembrana dei mitocondri del lievito. Nella sua forma naturale la CcP contiene un gruppo eme in cui l’atomo di ferro centrale è pentacoordinato e ad alto spin (S = 5/2). La sesta posizione di coordinazione del ferro è libera, consentendo ai leganti di coordinarsi. Quando ΓΝΟ si coordina al ferro del gruppo eme, lo spettro di assorbimento della CcP cambia visibilmente. In particolare, ci sono due variazioni sostanziali: 1) la banda di Soret si sposta da 409 a 420 nm e subisce un incremento dell’intensità; 2) la banda a 645 nm, caratteristica del ferro in uno stato di alto spin [Pond A. E., Sono M., Elenkova E. A., McRee D. E., Goodin D. B., English A. M., Dawson J. H., J. Inorg. Biochem. 1999, 75165-174], in seguito alla coordinazione dell’NO ed al passaggio quindi del ferro ad uno stato di basso spin, scompare. Funzionalizzando la cuvetta con un fluoroforo che assorbe a 450 nm (lumen, UTIC) è possibile monitorare la presenza dell’NO traducendo in fluorescenza il cambiamento osservato alla banda di Sor et.
L’emissione di fluorescenza del lumen viene attenuata del 30% quando in cuvetta si introduce 5 μΜ di CcP e consistentemente viene attenuata ulteriormente del 15% quando si aggiunge 200 μΜ di NO. Facendo fluire azoto, ΓΝΟ viene spiazzato, lo spettro di assorbimento della CcP ritorna nella sua forma iniziale, l’intensità di fluorescenza del lumen toma al valore precedente (prima dell’aggiunta di NO). In altre parole, l’intensità di fluorescenza del lumen è modulata dalla quantità di luce (o del numero di fotoni) che viene assorbita dalla CcP nei suoi due stati : libera da NO o con l’NO coordinato.
Funzionalizzando la cuvette con una molecola fluorescente che assorbe a circa 620 nm (quale ad esempio l’Atto620) è possibile monitorare la presenza di NO seguendo le variazioni della banda caratteristica del ferro nello stato di alto spin. Coerentemente l’intensità di fluorescenza dell’Atto 620 si attenua quando in cuvetta viene introdotto 5μΜ di CcP. Tale intensità di fluorescenza ritorna al valore iniziale dopo l’aggiunta di 200μΜ di NO, consistentemente con la scomparsa della banda a 645nm nello spettro di assorbimento della CcP. Facendo fluire azoto, l’NO viene allontanato dal ferro della CcP, lo spettro di assorbimento della CcP ritorna alla sua forma iniziale, l’intensità di fluorescenza dell’Atto620 toma al valore precedente (prima dell’aggiunta di NO).
Esempio 2
Determinazione dello stato di ossidazione di una metallovroteina Reazioni di tipo ossido-riduttivo svolgono un ruolo chiave nel ciclo vitale. In natura tali reazioni sono catalizzate da un’ampia gamma di enzimi che guidano i processi metabolici. Tali processi comprendono, solo per citare alcuni esempi, la riduzione di ossigeno ad acqua nella respirazione, l’ossidazione degli zuccheri, l’assimilazione di farmaci ed innumerevoli altre reazioni. Pertanto l’importanza di reazioni di ossido-riduzione da un punto di vista medico è enorme [Willner I., Science 2002, 298 2407-2408]. Enzimi di tipo ossido-riduttivo rappresentano, fra l’altro, una classe importante di “drug targets". Recentemente, inoltre, è stato riportato che tali enzimi sono coinvolti nel processo di invecchiamento, in malattie quali cancro, disfunzioni cardiovascolari e nel morbo di Alzheimer [M. T. Lin, M. F. Beai, Nature 2006, 443 787-795], Risulta quindi evidente che la capacità di monitorare l’attività di tali enzimi ed in particolare di definire a priori il loro stato di ossidazione è di estrema importanza sia da un punto di vista teorico che applicativo [Kuznetsova S., Zauner G., Schmauder R., Mayboroda O. A., Deelder A. M., Aartsma T. J., Canters G. W., Anal. Biochem. 2006, 35052-60]. Il sistema oggetto di questo brevetto è in grado di determinare lo stato di ossidazione di una proteina. Come esperimento esemplificativo si è deciso di utilizzare mioglobina da scheletro di cavallo, dal momento che lo spettro di assorbimento di tale proteina varia visibilmente a seconda dello stato di ossidazione in cui si trova.
La mioglobina da scheletro di cavallo (Sigma- Aldrich) è una proteina monomerica con un peso molecolare di 17600 Da ed un’unica catena peptidica composta da 153 residui amminoacidici. E’ disponibile commercialmente e la sua funzione principale è quella di coordinare ossigeno e facilitarne la diffusione nel tessuto muscolare. La proteina commerciale è nella forma met-mioglobina, in cui il ferro del gruppo eme è pentacoordinato, alto spin (S=5/2) e nello stato di ossidazione 3. Quando la met-mioglobina (met-Mb(Fe<3+>)) viene fatta reagire con un eccesso (3mM) di sodio ditionito (Na2S204) viene trasformata in deossi-Mb(Fe<2+>) ed il suo spettro di assorbimento varia visibilmente. In particolare la banda di Soret si sposta da 409 a 434 nm. Funzionalizzando la cuvette con un fluoroforo che assorbe a 450 nm (Lumen-UTIC) è possibile monitorare lo stato di ossidazione della Mb traducendo in variazioni di fluorescenza il cambiamento osservato alla banda di Soret. L’emissione di fluorescenza del lumen viene attenuata del 35% quando in cuvette si introduce 10μΜ di Mb e consistentemente viene attenuata ulteriormente del 30% quando si aggiunge 3mM di Na2S204. Aggiungendo un eccesso (3-4mM) di potassio ferricianuro (K3Fe(CN)6) lo spettro di assorbimento della Mb ritorna nella sua forma iniziale (met-Mb(Fe<3+>)) e l’intensità di fluorescenza del lumen toma al valore precedente (prima della riduzione).
Esempio 3
Determinazione della quantità di ossigeno
L’ ossigeno è una specie chimica essenziale per la vita. Α1Γ interno dei sistemi viventi infatti svolge differenti funzioni, tra cui quella di accettore finale della respirazione cellulare con la conseguente formazione di energia. Al tempo stesso è tossico ad elevate concentrazioni, perché la riduzione dell’ossigeno molecolare genera specie reattive dell’ossigeno (ROS), quali lo ione superossido, perossido e il radicale idrossilico [Fenchel, T. et al Biol Rev Camb Philos Soc. 2008 ]. La determinazione dei livelli di ossigeno risulta essere fondamentale in differenti settori. In ambito medico, il livello di ossigeno inalato attraverso la respirazione o presente nel sangue dei pazienti è un parametro chiave e necessita di essere monitorato in continuo. La determinazione della quantità di ossigeno è fondamentale per determinare il contenuto di ROS, che si originano ad opera di enzimi ossidativi presenti all’interno della cellula, e che rappresentano un indicatore naturale dello stato fisiologico del tessuto e della cellula presa in esame. Alti livelli di ROS sono indicativi di uno stato patologico dovuto a stress ossidativo. La respirazione da parte dell’organismo di elevate concentrazioni di ossigeno generano uno stato patologico definito iperossia che si manifesta con un elevato contenuto di ossigeno nei tessuti. A seconda del tipo e del tempo di esposizione, l’organismo va incontro a diverse complicazioni. In particolare, un’ elevata concentrazione di ossigeno, ad un pressione maggiore di quella atmosferica risulta essere tossica per il sistema nervoso centrale (CNS), invece una prolungata esposizione con ossigeno a pressione atmosferica provoca danni a polmoni e al sistema oftalmico. I sintomi che ne derivano sono disorientamento, problemi di respirazione, miopia. Una più prolungata esposizione causa danni ossidativi alle membrane cellulari, il collasso degli alveoli polmonari, il distacco della retina e epilessia. Inoltre la determinazione di questo analita trova impiego anche in altri settori quali quello ambientale (ad esempio analisi 02nelle acque) e industriale (ad esempio nella produzione di antibiotici e antitumorali) .
Il sistema oggetto di questo brevetto è in grado di determinare l’eventuale presenza di 02e non limitato a questo utilizzo, traducendo il cambiamento dello spettro di assorbimento della Mb, in seguito alla coordinazione dell’02, nell’intensità di fluorescenza della molecola fluorescente utilizzata per la marcatura della cuvetta. Introducendo in cuvetta una soluzione di mioglobina (10 μΜ) isolata da scheletro di cavallo, come negli esempio 2, Γ emissione di fluorescenza del lumen viene attenuata del 35% (si riduce il numero di fotoni che giungono al fluoroforo poiché parte di essi vengono assorbiti dalla mioglobina). Dopo riduzione del ferro allo stato di ossidazione Fe<2+>, grazie all’aggiunta di 3mM di Na2S204, si osserva una riduzione del massimo di fluorescenza del lumen (consistente con lo shift della banda di Soret a 434nm) [Chung K. E., Lan E. H., Davidrron M.S., Dumi B. S., Valentine J. S. and Zinkt J. I. Anal. Chem. 1995, 67, 1505- 1509]. A questo punto, insufflando ossigeno in cuvette si genera la ossimioglobina. La formazione della ossi-mioglobina comporta una riduzione dell’intensità della banda di Soret rispetto alla met-Mb (spettro di assorbimento), variazione che è tradotta in un conseguente aumento dell’ emissione di fluorescenza del Lumen del 40%. Aggiungendo 0.1 mM di potassio ferricianuro (K3Fe(CN)6) lo spettro di assorbimento della Mb ritorna nella sua forma iniziale (met-Mb(Fe<3+>)) e l’intensità di fluorescenza del lumen toma al valore precedente (prima della formazione dell 'addotto ossi-mioglobina). Esempio 4
Determinazione della D-serina nel siero dì pazienti affetti da neuropatolozie
La D-serina viene considerata un importante indicatore di sintomatologia in numerose patologie neurodegenerative. Una strategia messa recentemente a punto per misurare i livelli serici di D-serina prevede l'impiego di un sistema binario costituito dalla fluoresceina e dall'enzima D-serina deidratasi (DSD) di Saccharomyces cerevisiae. L'enzima DSD lega il cofattore piridossal fosfato (PLP) mediante un legame covalente con uno specifico residuo di lisina. Le proprietà spettroscopiche del PLP sono tali che, nella forma legata alla proteina, esso presenta due bande di assorbimento a circa 310 e 420 nm. L'interazione con la D-serina, substrato naturale dell'enzima, induce nel cofattore alterazioni strutturali risultanti nella diminuzione della banda di assorbimento a 420 nm. Il sistema oggetto di questo brevetto è in grado di determinare l’eventuale presenza di D-serina traducendo il cambiamento dello spettro di assorbimento della DSD, in seguito alla coordinazione della D-serina, nell’intensità di fluorescenza della sonda fluorescente utilizzata per la marcatura della cuvette. L’intensità di fluorescenza aumenta del 50% dopo l’aggiunta di 2 mM di D-Serina, coerentemente con la diminuzione della banda di assorbimento a 420 nm dello spettro di assorbimento della DSD. L'entità di tale variazione è riproducibile, e da essa è possibile risalire, costruendo una curva di calibrazione, alla concentrazione di D-serina presente nel mezzo.
Claims (10)
- RIVENDICAZIONI DELL’INVENZIONE INDUSTRIALE AVENTE PER TITOLO: “Un nuovo metodo ottico per una determinazione rapida e semplice di analiti” 1. Si rivendica l’utilizzo della metodologia oggetto del presente brevetto per la determinazione ed il monitoraggio di analiti e processi chimico-fisici e biologici. In particolare tale metodologia prevede l’impiego di una comune cuvetta (in tutte le sue forme e in tutti i tipi di materiali), e non limitato ad essa, la cui parete esterna opposta al raggio di eccitazione è funzionalizzata con una molecola fluorescente che si eccita alla lunghezza d’onda a cui si verifica il cambio spettrale della molecola-sonda (proteine, acidi nucleici, peptidi, molecole organiche e inorganiche ecc. ecc. di origine naturale e sintetica), contenuta nella cuvetta, in seguito all’interazione con Tanalita di interesse o più in generale in seguito ad un qualsiasi evento che modifichi lo spettro di assorbimento della molecola-sonda.
- 2. Si rivendica quanto riportato nella rivendicazione 1 con l’estensione all’utilizzo di composti fluorescenti anche all’interno della cuvetta e/o alla funzionalizzazione fluorescente di pareti della cuvetta differenti da quelle descritte nella rivendicazione 1.
- 3. Si rivendica l’utilizzo della citocromo C perossidasi, mioglobina, emoglobina, guanilato ciclasi solubile, enzimi sulfito-ossidasi da fonte animale e batterica come tali o prodotti e/o modificati mediante la tecnologia del DNA ricombinante, derivatizzate con sequenze tag o cromogeni, e di altre proteine, enzimi, sequenze di acidi nucleici, peptidi, metallo-peptidi che variano il loro stato elettronico in seguito all’interazione con ossigeno, ossido nitrico e monossido di carbonio per la determinazione di tali analiti.
- 4. Si rivendica l’utilizzo di proteine, enzimi, sequenze di acidi nucleici, peptidi, metallo-peptidi come tali o prodotti e/o modificati mediante la tecnologia del DNA ricombinante, derivatizzati con sequenze tag o cromogeni, che legano l’anidride carbonica e che variano il loro stato elettronico in seguito all’interazione con l’anidride carbonica per la determinazione di C02.
- 5. Si rivendica l’utilizzo della metodologia oggetto del presente brevetto come da rivendicazione 1-3 per un’ accurata quantizzazione dell’ossigeno e dei suoi derivati molecolari, nelle acque potabili e reflue, in piscine, in vasche per il trattamento di fanghi attivi, in acquari, nei processi dell’industria biotecnologica (processi fermentativi) e non, nelle stazioni di monitoraggio ambientale, per la diagnosi e il “ follow-up ” di pazienti affetti da iperossia, per la determinazione tissutale e cellulare di tale analita e non limitato a tali utilizzi. Inoltre, si rivendica l’utilizzo della metodologia oggetto del presente brevetto per determinare la presenza di monossido di azoto in sistemi biologici animali e vegetali, in cellule e tessuti, in condizioni fisiologiche e patologiche quali cancro, malattie neurodegenerative, malattie cardiovascolari e non limitate a tale utilizzo, in gas di scarico di autoveicoli, motoveicoli, macchine industriali e non, caldaie domestiche e industriali, stufe, forni e non limitati a tali utilizzi.
- 6. Si rivendica l’utilizzo della citocromo C perossidasi, della mioglobina, dell’ emoglobina e di altre biomolecole e molecole di sintesi chimica, come tale o prodotti e/o modificati mediante la tecnologia del DNA ricombinante, derivatizzati con sequenze tag o cromogeni, per dosare in modo specifico e/o indiretto la quantità di monossido di carbonio in cellule e tessuti, nei gas di scarico di autoveicoli, motoveicoli, macchine industriali e non, caldaie e stufe domestiche e industriali, ed in ambienti chiusi o aperti al pubblico e non limitato a tale utilizzi. Inoltre, si rivendica l’utilizzo della metodologia oggetto del presente brevetto per la determinazione dello stato di ossido-riduzione cellulare e tissutale in condizioni fisiologiche e patologie quali malattie cardiovascolari, Alzheimer, nei processi d’invecchiamento e non limitato a questo utilizzo.
- 7. Si rivendica l’utilizzo della metodologia oggetto del presente brevetto come da rivendicazione 1 per la determinazione di D-amminoacidi, incluso la D-serina per dosare in modo specifico la quantità di D-serina in pazienti affetti da malattie neurogenerative, quali Alzheimer e schizofrenia in tutti i fluidi biologici e non limitato a tale utilizzo, e la presenza di D-amminoacidi come indice di contaminazioni batteriche in campo alimentare e sanitario.
- 8. Si rivendica l’utilizzo della metodologia oggetto del presente brevetto come da rivendicazione 1, avente come molecola-sonda i fotosistema I e/o fotosistema II di piante, alghe e batteri fotosintetici per la determinazione di pesticidi e/o molecole inquinanti, neH’aria, nelle acque, nel terreno, in tutti i tipi di alimenti crudi e cotti, freschi, congelati, liofilizzati, essiccati ed in loro derivati e non limitato a tale utilizzo.
- 9. Si rivendica l’utilizzo della nuova metodologia come da rivendicazione 1 per la determinazione della presenza di cianuro (CN<">) e di solfuro d’idrogeno (H2S) in cellule e tessuti e non limitato a tale utilizzo. Inoltre, si rivendica l’utilizzo della metodologia oggetto del presente brevetto per la determinazione di zinco (Zn), mercurio (Hg), cobalto (Co) e piombo (Pb) in tutti i fluidi biologici, nelle acque potabili, nei cibi destinati all’alimentazione umana ed animale mediante l’utilizzo di peptidi sintetici e/o naturali e di aptameri e o sequenze nucleotidiche in grado di variare il loro stato elettronico in seguito all’ interazione con gli analiti di interesse.
- 10. Si rivendica l’utilizzo della metodologia oggetto del presente brevetto per la determinazione di DNA a doppio e singolo filamento ed RNA (mRNA, tRNA, ecc) interi e/o frammenti, di differenti dimensioni per la determinazione di agenti patogeni presenti nelle acque, nell’aria, nei fluidi biologici, in ambienti sotto il controllo viro/batteriologico quali ad esempio sale operatorie di ospedali e non limitato a tale utilizzo e per la determinazione in continuo di crescite di cellule batteriche ed eucaristiche.
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992012413A1 (en) * | 1991-01-04 | 1992-07-23 | Baxter Diagnostics Inc. | Measurement of bacterial co2 production in an isolated fluorophore by monitoring an absorbance regulated change of fluorescence |
| US5173434A (en) * | 1990-11-05 | 1992-12-22 | Baxter Diagnostics Inc. | Measurement of color reactions by monitoring a change of fluorescence |
| US6096268A (en) * | 1997-10-31 | 2000-08-01 | Dade Behring Inc. | Chromogenic and turbidimetric assay device |
-
2009
- 2009-07-02 IT IT000042A patent/ITNA20090042A1/it unknown
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