DE69106419T2

DE69106419T2 - Identifizierung von Mikroorganismen durch Messung der enzymatischen Aktivität in Gegenwart von die enzymatische Aktivität beeinflussenden Agenzien.

Info

Publication number: DE69106419T2
Application number: DE69106419T
Authority: DE
Inventors: Dolores M Berger; Mark L Sussman
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1990-04-12
Filing date: 1991-04-09
Publication date: 1995-06-01
Anticipated expiration: 2011-04-10
Also published as: CA2038406A1; FI911758A0; FI98831B; AU7360791A; AU630549B2; EP0451775B1; IE910880A1; CA2038406C; NZ237539A; JPH04222596A; NO911426L; MY111158A; IE65282B1; JPH0785719B2; FI98831C; FI911758A; EP0451775A1; NO911426D0; DE69106419D1; ATE116688T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren von Mikroorganismen durch das Bestimmen der Geschwindigkeit der enzymatischen Hydrolyse von Substraten in Gegenwart von Mitteln, die die Enzymaktivität beeinflussen, und durch Vergleichen dieser Geschwindigkeiten mit einem Enzym-Aktivitätsprofil einer Vielzahl von identifizierten Mikroorganismen.

2. Hintergrund des Standes der Technik

Die schnelle Identifizierung von Mikroorganismen, die im klinischen oder Laborrahmen isoliert werden, ist ein wichtiges Ziel. Die meisten Laboratorien identifizieren Mikroorganismen aus klinischen Isolierungen unter Verwendung von kommerziellen Systemen zur bakteriellen Identifikation, die bis zu 18 bis 24 Stunden oder länger nach Isolierung der Organismen benötigen, um die Identifizierung auszuführen. Einige der aktuellen "schnellen" Systeme benötigen zwischen 3 und 13 Stunden. Diese Systeme beruhen im allgemeinen auf dem Nachweis der sauren oder basischen Nebenprodukte von Zucker- oder Aminosäure-Metabolismen, die einer Wachstumsperiode des Organismus folgen. Mehrere dieser "wachstumsbezogenen" kommerziellen Systeme zur Identifizierung von Bakterien verwenden ausgewählte Inhibitoren, um zur Spezifizierung von Bakterien nützliche Informationen zu erzielen.
Am hervorragendsten von diesen handelsüblichen "wachstumsbezogenen" Systemen ist das von Organon Teknika, Durham, N.C., hergestellte AUTOBAC IDX. Dieses System wird für die Identifizierung von gramnegativen Bakterien verwendet, siehe Sielaff et al., "Novel Approach to Bacterial Identification That Uses the Autobac System", Journal of Clinical Microbiology, 15, Nr. 6, 1103 - 1110 (1982). Profile der Wachstums-Inhibition werden durch Verwendung von 18 differentiellen inhibierenden chemischen Mitteln erzeugt, die in einem mikrobiellen Wachstumsmedium angeordnet werden, wobei das Wachstum nephelometrisch durch das AUTOBAC IDX-instrument gemessen wird. Die zusammen mit dem AUTOBAC IDX-Instrument ausgelieferte Literatur stellt fest, daß "die Profile mit einer zweistufigen quadratischen Diskriminanten-Analyse analysiert werden, um die Identifizierung zu erreichen". Die Inhibitoren bestehen aus Farbstoffen, Schwermetallionen, Antibiotika und Inhibitoren bakterieller Metabolismen. Dieser Test erfordert eine Inkubation von drei Stunden, die im allgemeinen mehrere Generationen an Bakterien- Vervielfachung ermöglicht. Das Wachstum in den gehemmten Vertiefungen wird mit dem Wachstum in einer Vertiefung verglichen, die das Wachstumsmedium, aber keine Wachstums-Inhibitoren enthält.
Bakterielles Wachstum hängt von vielen Bedingungen ab: Richtige pH- und Temperaturbereiche, ausreichende Ernährung zur Erzeugung von Energie und eine Kaskade von enzymabhängigen Ereignissen, wodurch Zellproteine, Nukleinsäuren und andere Zellbestandteile aufgebaut werden, die zum Wachsen und Teilen der Zelle notwendig sind. Die für den AUTOBAC IDX-Test verwendeten Inhibitoren können das Wachstum an einem beliebigen dieser Schlüsselpunkte stören.
Andere wachstumsbezogene Systeme zur Identifizierung von Bakterien verwenden selektive Wachstums-Inhibitoren, aber nicht so vorherrschend wie das AUTOBAC IDX. Das AUTOMICROBIC SYSTEM von Vitek, hergestellt von Vitek Systems, St. Louis, Mo., verwendet Irgasan (DP300) zusammen mit einem Wachstumsmedium und einem Indikator für metabolische Aktivität; siehe Isenberg et al., "Collaborative Investigation of the AutoMicrobic System Enterobacteriaceae Biochemical Card", Journal of Clinical Microbiology, 11 Nr. 6, 694 - 702 (1980).
Cetrimide, ein weiterer Wachstums-Inhibitor, wird im SCEPTOR- Identifikationssystem (Becton Dickinson, Towsen, MD) als ein selektiver Inhibitor zur Unterscheidung zwischen P. Aeruginosa, die nicht gehemmt wird, und anderen Pseudomonas-Spezies, die gehemmt werden, verwendet.
Alle diese wachstumsbezogenen Identifikations-Systeme erfahren dieselbe Begrenzung, sie sind langsam bei der Verfügbarmachung von Ergebnissen. Sogar die sogenannten "schnellen" Identifikations-Systeme benötigen zwischen 3 und 13 Stunden, um ihre Ergebnisse zu erhalten. Die Ursache dafür, warum diese Systeme in der Geschwindigkeit begrenzt sind, liegt darin, daß alle diese Systeme wenigstens eine und oft mehrere Runden an Wachstum und Replikation von Mikroorganismen benötigen.
In vielen mikrobiellen Klassen werden Enzyme gefunden, die einigen oder allen Elementen dieser Klasse gemeinsam sind. Eine Klasse wird als eine beliebige in funktioneller Hinsicht nützliche Gruppierung von Mikroorganismen definiert. Zum Beispiel sind zwei funktionell nützliche Gruppierungen, die getrennte Klassen von Mikroorganismen definieren, die ohne Lactose fermentierenden Bakterien im Vergleich zu den mit Lactose fermentierenden Bakterien. Andere funktionell nützliche Gruppen sind die indolpositiven im Vergleich zu den indolnegativen Bakterien. Eine andere Gruppierung, die Klassen von Mikroorganismen definiert, sind die oxidasepositiven im Vergleich zu den oxidasenegativen Bakterien. Folglich kann ein bestimmter Mikroorganismus ein Element einer oder mehrerer mikrobieller Klassen sein. Beispiele für Enzyme, die durch Elemente der Gattung Enterobacteriaceae ausgedrückt werden, sind Alaninaminopeptidase, alkalische Phosphatase und β-Galactosidase. Esteraseenzyme werden bei vielen der Bakterien gefunden, die normalerweise als menschliche Pathogene isoliert werden. Verschiedene Assays, die verschiedene Substrate und Indikator-Systeme verwenden, sind für diese gewöhnlichen Enzymsysteme entwickelt worden. Die ganz allgegenwärtige Natur dieser Enzyme begrenzt den Nutzen bisheriger Assays zur Differenzierung zwischen den Spezies, die viele der mikrobiellen Klassen ausmachen.
Ein Verfahren zur Identifizierung spezifischer bakterieller Spezies durch Verwendung der enzymatischen Spaltung von Substraten wird im U.S.-Patent Nr. 4 603 108 an Bascomb beschrieben. Das Bascomb-Patent beschreibt einen Kit, der Tests für sechsundzwanzig (26) wesentliche Enzyme umfaßt. In jedem Test wird das Enzym durch seine Fähigkeit bestimmt, mit einem spezifischen Substrat wechselzuwirken. Eine Testkarte oder ein anderer Apparat weist eine Vielzahl von Vertiefungen oder Kammern auf, die getrennt voneinander spezifische Substratlösungen für jeden der Enzymtests zusammen mit anderen Reagenzien für den Test enthalten. Zu jeder Kammer wird eine bakterielle Suspension hinzugefügt und nach einer relativ kurzen Inkubationszeit wird ein nachweisbares Produkt entwickelt. Die Menge an entsprechendem Enzym in jeder Probe wird dann durch spektrometrische Analyse bestimmt, wobei entweder Kolorimetrie oder Fluorimetrie verwendet werden. In einem anderen in diesem Patent beschriebenen Verfahren werden sieben (7) Tests zur schnellen Differenzierung zwischen normalerweise auftretenden Bakteriengruppen verwendet. Bascomb offenbart ferner, daß entweder die 26 Testassays oder die 7 Testassays einen einmaligen Fingerabdruck für die Spezies oder die Gruppe von Spezies abgeben. Für jede Gruppe von Spezies kann eine quantitative Bestimmung der Enzym-Aktivität verwendet werden, um die Gruppe oder die Spezies durch Vergleichen mit Aktivitäts-Profilen von zuvor identifizierten Bakterien zu identifizieren. Der spezifisch beschriebene Test bestimmt die Aktivität durch das Nachweisen von Extinktion in einer Fließzelle. Es kann eine Einzelproben-Analyse und eine kontinuierliche Durchflußanalyse eingesetzt werden. Das Verfahren von Bascomb erfordert jedoch eine große Biomasse und ein großes Flüssigkeitsvolumen sowie eine relativ lange Inkubationszeit.
Fluorogene Substrate sind ebenfalls verwendet worden, um eine Enzymaktivität zu untersuchen. Diese Verbindungen sind Analoga von natürlich auftretenden Metaboliten. Sie weisen normalerweise einen fluoreszierenden Teil auf, der an den natürlichen Metaboliten gebunden ist. Die enzymatische Spaltung der Substrate setzt den fluoreszierenden Teil frei. Die Fluoreszenz des freien Teils ist viel größer als die des gebundenen Teils. Fluorogene Verbindungen können daher verwendet werden, um eine Enzymaktivität durch ihre Kombination mit der fraglichen Probe unter geeigneten physiologischen Bedingungen zur Enzymaktivität zu untersuchen und um ein Anwachsen der Fluoreszenz zu überwachen.
Forscher haben darüber hinaus fluorogene Substrate verwendet, um Mikroorganismen zu identifizieren. Westley et al. diskutierten in "Aminopeptidase Profiles of Various Bacteria", Appl. Micro., 15, 822 - 825, (1967), die Verwendung von alpha-Aminosäure-β-Naphtylamid-Substraten zur Identifizierung von 24 Bakterienstämmen. Die Bakterien wurden in Lösung suspendiert und mit Substratlösungen inkubiert. Die Fluoreszenz des freigesetzten β-Naphtylamids wurde nach 4 Stunden Inkubation gemessen. In einer anderen Publikation beschrieben Peterson et al. in "Rapid Detection of Selected Gram-Negative bacteria by amino-peptidase profiles"; J. Food Sci., 43 1853 - 1856 (1978), die Verwendung von fluorometrischer Analytik zur Messung der Enzym-Hydrolyse von neunzehn (19) L-Aminosäure-β-napthylamiden. Für jede Kultur wurde innerhalb von 4 bis 6 Stunden ein Profil erhalten.
Eine Übersicht über die Literatur, die die Verwendung von fluorogenen Substraten zur Profilierung einer mikrobiellen Enzymaktivität betrifft, ist in Godsey et al., "Rapid Identification of Enterobacteriaceae With Microbial Enzyme Activity Profiles", J. Clin. Micro., 13, 483 - 490 (1981), enthalten. Die Godsey- Gruppe berichtete über die Verwendung von 18 fluorogenen Substraten in einer Studie von 539 Stämmen der Klasse Enterobacteriaceae. Für die ersten dreißig Minuten wurden die Hydrolyse- Geschwindigkeiten bei 37 ºC von 2 ml, Puffer enthaltenen Substraten aufgezeichnet. Alle Substrate außer Harnstoff waren Derivate von β-Methyl-Umbelliferon, β-Naphtylamin oder 7-Amino- 4-methylcumarin.
Im U.S.-Patent Nr. 4 591 554 an Koumara et al. wird eine Fluoreszenzanalyse, bei der Umbelliferon-Derivate verwendet werden, als ein Verfahren zum Nachweisen und Bestimmen des Anteils einer kleinen Anzahl von Mikroorganismen beschrieben. Bei diesem Verfahren wurde ein Umbelliferon-Derivat zu einer Probenlösung gegeben und anschließend inkubiert. Danach wurden unlösliche Reste (z.B. Zellen) entfernt und die Fluoreszenz unter Verwendung eines konventionellen Detektors abgelesen. Der Fluoreszenzgrad wird dann auf die Anzahl der Mikroorganismen bezogen. Bei einigen der Beispiele werden Coenzyme verwendet. In anderen Beispielen werden die Zellen zerstört, um die Menge an freigesetzten Enzymen zu vergrößern.
Von fluorogenen Substraten ist auch bekannt, daß sie bei der Untersuchung von in lebenden Organismen vorhandenen extrazellulären Enzymen nützlich sind. Snyder et al. beschrieben in "Pattern Recognition Analysis of In-Vivo Enzyme-Substrate Fluorescence Velocities In Micro-organism Detection and Identification", App. & Environ. Micro., M, 969-997 (1986) Reaktionszeiten von 15 Minuten oder weniger. Die Arbeit von Snyder's Gruppe bildet auch die Grundlage für eine internationale Patent-Anmeldung mit dem Titel "Viable Microorganism Detection by Induced Fluorescence" mit der University of Cincinnati als Anmelder, Intern. Pub. Nr. WO 86/05206, datiert vom 12. September 1986.
Ein anderes Fingerprint-Verfahren für Bakterien basiert auf dem Unterschied an Gehalt und Aktivität von Enzymen, wie beschrieben von Chu-Pong Pal et al. in "A Rapid Enzymatic Procedure for 'Fingerprinting' bacteria by using pattern recognition of 2-dimensional fluorescence data", Clin. Chem., 32, 987-991 (1986). In diesem System wurde eine Mischung von 6 fluorogenen Substraten verwendet, jedes mit einem unterschiedlichen Fluoreszenzrest. Das Anwachsen der Fluoreszenz wurde über einen Zeitraum von 30 Minuten überwacht. Um eine zweidimensionale, für jeden Prüforganismus charakteristische Matrix zu erzeugen, wurde eine Fourier-Transformation der Fluoreszenzdaten verwendet.
Edberg et al. offenbaren in "Measurement of Active Constitutive β-D-Glucosidase (Esculinase) in the Presence of Sodium Deoxycholate", Journal of Clinical Microbiology, Vol. 21, Nr. 3, 363 - 365 (1985) ein Verfahren zum Differenzieren von Arten der Gattung Streptococcus durch das Messen der β-D-Glucosidase (Esculinase) mit der Repression des Enzyms durch ein Gallenequivalent (Natriumdeoxycholat). Das Verfahren weist die Anwesenheit von β-D-Glucosidase durch die Hydrolyse von p-Nitrophenyl-β-D- Glucopyranosid, einem colorimetrischen Substrat, nach. Wenn das Substrat hydrolysiert ist, wird p-Nitrophenyl, eine gelbe Gruppe, von der farblosen Ausgangsverbindung abgegeben und kann durch das Vorliegen der gelben Farbe in der Probe nachgewiesen werden. In der Anwesenheit von Natriumdeoxycholat werden die meisten von Gruppe D verschiedenen Streptococci-Arten durch das Freiwerden von β-D-Glucosidase (Esculinase) gehemmt. Gallensensitive Streptococcus pneumoniae können mit diesem System aufgrund dessen autolytischer Induktion innerhalb von 30 Minuten identifiziert werden.
Eine Verbesserung des Verfahrens von Edberg et al. wurde von Panosian und Edberg in "Rapid Identification of Streptococcus bovis by Using Combination Constitutive Enzyme Substrate Hydrolyses", Journal of Clinical Microbiology, V. 27, Nr. 8, 1719 - 1722 (Aug. 1989) berichtet. Dieses Verfahren verwendet ein Reagenz, das zwei hydrolsierbare Substrate, p-Nitrophenyl-α-D- galactopyranosid (PGAL) und 4-Methylumbilliferyl-β-D-glucosid (MGLU) in Anwesenheit von Natriumdeoxycholat verwendet. Der Vorteil dieses Tests besteht darin, daß es den gleichzeitigen Nachweis von 2 wesentlichen Enzymen, α-Galactosidase und β- Glucosidase, in einem Test von 30 Minuten Dauer ermöglicht. Dieser Test kann S. bovis identifizieren und Enterococcus spp., Streptococcen der Gruppe viridans, S. equinus und Streptococcus pneumoniae unterscheiden. Die Hydrolyse von PGAL wird durch die Bildung der gelben Farbe gezeigt und die Hydrolyse von MGLU, einem fluorogenen Substrat, wird durch das Belichten eines Rohres durch eine in der Hand gehaltene 4-W 366-nm-UV-Lampe bestimmt. Für den Hydrolysetest des gemischten PGAL-MGLU-Substrates sind vier Ergebnisse möglich, gelb und fluoreszierend, farblos und fluoreszierend, gelb und nicht-fluoreszierend und farblos und nicht-fluoreszierend.
Obwohl diese Tests die schnelle Unterscheidung zwischen verschiedenen Streptococcenarten ermöglichen, ist der Test sehr begrenzt, da nur für zwei wesentliche Enzyme Messungen vorgenommen werden. Außerdem kann der Test nur ein positives oder negatives Ergebnis für die Hydrolyse von Substraten liefern. Es gibt keine Messungen von Hydrolyse-Geschwindigkeiten oder -Graden, die eine Differenzierung von nahe verwandten Bakterienklassen ermöglichen, die dieselben oder ähnliche Enzyme mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten erzeugen.
Eine Vorrichtung zur Erhöhung von Fluoreszenz und Kinetik zur schnellen Identifizierung von Bakterien und anderen Organismen durch ihre enzymatische Hydrolyse von fluorogenen Substraten und Verfahren zur Verwendung der Vorrichtung werden in EP- A-0 347 771 beschrieben. Die Anmeldung ist auf dieselben Firmen wie die vorliegende Erfindung übertragen. Die Patent-Anmeldung von Sussman et al. beschreibt einen Carrier, der auf sich oder in sich angebracht wenigstens einen die Kinetik und die Fluoreszenz verstärkenden Träger aufweist. Das getrocknete fluorogene Substrat wird auf dem die Fluoreszenz verstärkenden Träger aufgezogen, indem es zuerst in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst wird und anschließend die Lösung auf dem Träger abgeschieden wird. Das Lösungsmittel wird durch Trocknen oder Vakuumtrockung entfernt. Von biologischen Proben stammende Mikroorganismen werden durch Verwenden von fluorogenen Substraten oder freien Fluophoren oder von beiden identifiziert, indem eine flüssige Probe zu einer oder mehreren einer Vielzahl von Trägern zur Verstärkung von Kinetik und Fluoreszenz zugegeben wird.
Jeder dieser Träger umfaßt einen der folgenden fluorogenen Träger oder Fluophore: β-Umbelliferon, 7-Amino-4-methylcumarin, β-Napthylamin, Fluorescein und Resorufin und andere. Die in der Probe vorhandenen Enzyme hydrolisieren die Substrate. Falls die Substrate fluorogen sind, werden die Hydrolyse-Geschwindigkeiten durch das Messen der Geschwindigkeiten der Produktion an fluoreszierendem Produkt gemessen. Falls die Substrate nicht fluorogen sind, weist der die Kinetik und die Fluoreszenz verstärkende Träger auf sich abgeschieden ein Enzym-Substrat und ein trockenes freies Fluophor auf, das in Gegenwart des Hydrolyseproduktes verstärkt oder gelöscht wird. Auf diese Weise wird die Anwesenheit des Enzyms, das das jeweilige Substrat hydrolisiert, nachgewiesen und es wird, falls erwünscht, das Profil der Reaktionsgeschwindigkeit eines oder mehrerer Enzyme in der Probe aufgestellt. Das Profil der Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms wird dann analysiert und mit Referenzprofilen für Enzym-Reaktionsgeschwindigkeiten von bekannten Mikroorganismen verglichen, um die nicht identifizierten Mikroorganismen zu identifizieren. Aufgrund der Stamm-Variation können jedoch viele Arten von Mikroorganismen mit Hilfe der Vorrichtung und des Verfahrens nach EP-A-0 347 771 nicht ausreichend identifiziert werden.
Beim Untersuchen von Enzym-Mechanismen können viele Verbindungen verwendet werden, um die Reaktionsgeschwindigkeiten von Enzymen entweder zu hemmen oder zu erhöhen. Diese Verbindungen sind primär als Werkzeuge zur Sondierung der molekularen Biologie der Enzyme und ihrer Umgebungen verwendet worden. Diese Verbindungen umfassen Detergenzien, chelatisierende Substanzen, Metallion-Cofaktoren, Antibiotika, Wasserstoff-Ionenkonzentrations- und Puffersubstanzen und spezielle Affektoren enzymatischer Aktivität wie konkurrierende Inhibitoren.
Folglich besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren für das schnelle und genaue Identifizieren von Mikroorganismen bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Eigenschaften von Verbindungen, die die Enzymaktivität von Mikroorganismen beeinflussen, vorteilhaft auszunutzen, um ein extrem schnelles und genaues Identifikations-System bereitzustellen.

KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Diese und andere Ziele werden durch die vorliegende Erfindung erreicht, die ein Verfahren zur schnellen Identifizierung nicht identifizierter Mikroorganismen verfügbar macht. Nach diesem Verfahren können die Geschwindigkeiten der enzymatischen Spaltung einer Vielzahl von Substraten in Gegenwart einer wirksamen Konzentration wenigstens eines die Enzymspaltung beeinflussenden Mittels, das als "Affektor" bezeichnet wird, bestimmt werden. Diese Substrate werden aus fluorogenen und chromogenen Substraten ausgewählt, wodurch ein charakteristisches Muster enzymatischer Spaltungs-Geschwindigkeiten durch vom nicht identifizierten Mikroorganismus exprimierte Enzyme gebildet wird. Dieses charakteristische Muster enzymatischer Spaltungs-Geschwindigkeiten ist ein "Fingerabdruck" für den nicht identifizierten Mikroorganismus in Gegenwart des Affektors. Das Muster der enzymatischen Spaltungs-Geschwindigkeiten für den nicht identifizierten Mikroorganismus wird mit einem Muster der enzymatischen Spaltungs-Geschwindigkeit desselben Substrats in Gegenwart desselben Affektors für eine oder mehrere identifizierte Klassen oder Unterklassen von Mikroorganismen verglichen. Der nicht identifizierte Mikroorganismus wird dann als zugehörig zu einer bestimmten Klasse oder Unterklasse der bekannten Mikroorganismen identifiziert, die am nächsten an das Muster der enzymatischen Spaltungs-Geschwindigkeit in Gegenwart des Affektors angepaßt ist.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Identifizierung eines nicht identifizierten Mikroorganismus verfügbar gemacht. Nach diesem Verfahren wird die Geschwindigkeit der enzymatischen Spaltung einer Vielzahl von Substraten durch wenigstens ein von einen nicht identifizierten Mikroorganismus exprimiertes Enzym in Gegenwart einer wirksamen Konzentration wenigstens eines Affektors bestimmt. Die Substrate können eine oder mehrere der Gruppen fluorogener oder chromogener Substrate umfassen, wobei dessen Spaltung ein Muster enzymatischer Spaltungs-Geschwindigkeiten erzeugt, die für den nicht identifizierten Mikroorganismus in Gegenwart des Affektors charakteristisch sind. Das für den nicht identifizierten Mikroorganismus charakteristische Muster der enzymatischen Spaltungs-Geschwindigkeiten wird dann mit einem in Gegenwart einer wirksamen Konzentration des Affektors erhaltenen Muster enzymatischer Spaltungs-Geschwindigkeiten verglichen, das für eine oder mehrere Klassen oder Unterklassen von Mikroorganismen für dieselben Substrate charakteristisch ist. Der unbekannte Mikroorganismus wird dann als zugehörig zu der Klasse oder Unterklasse bekannter Mikroorganismen identifiziert, deren Muster der enzymatischen Spaltungs-Geschwindigkeit der Substrate in Gegenwart des Affektors oder der Affektoren am stärksten mit dem für den unbekannten Mikroorganismus erhaltenen Muster korreliert.
Zweckmäßigerweise beinhaltet das Verfahren weiterhin das Bestimmen der Geschwindigkeit der enzymatischen Spaltung von einem oder mehreren der Substrate durch wenigstens ein von einer oder mehreren der identifizierten Klassen oder Unterklassen von Mikroorganismen exprimiertes Enzym in Gegenwart einer wirksamen Konzentration des Affektors oder der Affektoren, die für den nicht identifizierten Mikroorganismus geprüft werden. Auf diese Weise wird ein Muster enzymatischer Spaltungs-Geschwindigkeiten in Gegenwart des Affektors oder der Affektoren gebildet, das für jede der identifizierten Klassen und Unterklassen von Mikroorganismen charakteristisch ist. Das Muster der für den nicht identifizierten Mikroorganismus charakteristischen enzymatischen Spaltungs-Geschwindigkeiten wird dann mit den Mustern für die Spaltungs-Geschwindigkeiten verglichen, die für die identifizierten Klassen und Unterklassen von Mikroorganismen für dieselben Substrate charakteristisch sind, erhalten in Gegenwart des Affektors. Der unbekannte Mikroorganismus wird dann als zugehörig zu der Klasse oder Unterklasse von bekannten Mikroorganismen identifiziert, die das Muster der enzymatischen Spaltungs-Geschwindigkeit aufweist, das am stärksten mit dem für den unbekannten Mikroorganismus erhaltenen Muster korreliert.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung macht ein Verfahren zur Identifizierung eines nicht identifizierten Mikroorganismus zugänglich. Nach diesem bevorzugten Verfahren werden die Geschwindigkeiten der enzymatischen Spaltung einer Vielzahl von Substraten durch wenigstens ein von einem nicht identifizierten Mikroorganismus exprimiertes Enzym in Gegenwart einer wirksamen Konzentration wenigstens eines Affektors bestimmt. Die Substrate können eine oder mehrere der Gruppe der fluorogenen oder chromogenen Substrate umfassen, deren Spaltung ein Muster enzymatischer Spaltungs-Geschwindigkeiten bildet, die für den nicht identifizierten Mikroorganismus in Anwesenheit des Affektors charakteristisch sind. Die Geschwindigkeit der enzymatischen Spaltung derselben Substrate durch wenigstens ein von einem nicht identifizierten Mikroorganismus exprimiertes Enzym wird auch in Abwesenheit einer wirksamen Konzentration des Affektors bestimmt. Auf diese Weise wird ein Muster enzymatischer Spaltungs-Geschwindigkeiten gebildet, das für den nicht identifizierten Mikroorganismus in Abwesenheit des Affektors charakteristisch ist. Es wird eine Funktion des Musters der für den nicht identifizierten Mikroorganismus in Anwesenheit des Affektors charakteristischen enzymatischen Spaltungs-Geschwindigkeiten und das Muster der in Anwesenheit des Affektors charakteristischen enzymatischen Spaltungs-Geschwindigkeiten bestimmt. Der Wert der für den unbekannten Mikroorganismus bestimmten Funktion wird mit einem Wert einer für eine oder mehrere bekannte Klassen von Mikroorganismen bestimmten Funktion verglichen. Die Funktion für die bekannten Mikroorganismen wird aus einem Muster enzymatischer Spaltungsgeschwindigkeiten von den Substraten bestimmt, das in Gegenwart einer wirksamen Konzentration des Affektors erhalten wurde und aus einem Muster enzymatischer Spaltungsgeschwindigkeiten von den Substraten bestimmt, das in Abwesenheit einer wirksamen Konzentration des Affektors erhalten wurde. Folglich wird der unbekannte Mikroorganismus als zu der Klasse oder Unterklasse bekannter Mikroorganismen gehörig identifiziert, für die der Wert der Funktion des Musters der enzymatischen Spaltungs-Geschwindigkeiten am stärksten mit dem Wert der Funktion aus dem für die unbekannten Mikroorganismen erhaltenen Muster der enzymatischen Spaltungsgeschwindigkeiten korreliert.
Auf geeignete Weise können die Muster der enzymatischen Spaltungs-Geschwindigkeiten für die identifizierten Klassen von Mikroorganismen nach der vorliegenden Erfindung sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit des Affektors gebildet werden. Folglich wird die Geschwindigkeit der enzymatischen Spaltung der Substrate durch wenigstens ein durch eine oder mehrere identifizierte Klassen und Unterklassen von Mikroorganismen ausgedrücktes Enzym in Anwesenheit einer wirksamen Konzentration wenigstens eines Affektors bestimmt. Auf diese Weise wird ein Muster von enzymatischen Spaltungs-Geschwindigkeiten gebildet, die für die identifizierten Mikroorganismen in Anwesenheit des Affektors charakteristisch sind. Darüber hinaus wird die Geschwindigkeit der enzymatischen Spaltung desselben Substrats durch wenigstens ein durch eine oder mehrere der identifizierten Klassen von Mikroorganismen exprimiertes Enzym in Abwesenheit einer effektiven Konzentration des Affektors bestimmt. Auf diese Weise wird ein Muster von enzymatischen Spaltungs-Geschwindigkeiten gebildet, die für die identifizierten Mikroorganismen in Abwesenheit des Affektors charakteristisch sind. Die charakteristischen Muster für enzymatische Spaltungs- Geschwindigkeiten für die bekannten Klassen und Unterklassen von Mikroorganismen können wie im vorstehenden Abschnitt beschrieben im Verfahren dieser Erfindung verwendet werden.
In jedem der für die vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren wird bevorzugt, daß die enzymatische Spaltungsgeschwindigkeiten für zwei oder mehrere Klassen von Mikroorganismen bestimmt werden. Bevorzugt sind die gespaltenen Substrate fluorogen. Diese fluorogenen Substrate können ein biologisches Analogon mit einem Fluophor wie 7-Hydroxy-4-methylcumarin, 7-Amino- 4-methylcumarin, β-Napthylamin, Fluorescein, Resorufin, Hydroxypyrentrisulfonat umfassen. Der in diesem Verfahren verwendete Affektor kann Natriumdodecylsulfat, Natriumfluorid, Natriumchlorid, Natriumazid, Ethylendiamintetraessigsäure, Harnstoff, CHAPS, Cetylpyridinchlorid, Chlorpromazin, 2-Phenoxyethanol, Kobaltchlorid, Ouabain, Natriumdeoxycholat, Benzalkoniumchlorid, Cycloserin, p-Aminosalicylsäure, Levamisol oder Metallionen einschließlich Mg, Ca, Zn, Cu, Co, Au oder Hg umfassen. Alternativ können sie eine Kombination oder Mischung dieser Affektoren umfassen. Bevorzugt kann der Affektor Natriumdodecylsulfat in einer Konzentration von ungefähr 0,5 bis ungefähr 2,0 % umfassen. Ein anderer bevorzugter Affektor kann Ethylendiamintetraessigsäure mit einer Konzentration von ungefähr 1 bis ungefähr 100 mM umfassen. Ein weiterer bevorzugter Affektor kann Benzalkoniumchlorid mit einer Konzentration von ungefähr 0,01 bis ungefähr 2 % umfassen. Eine andere bevorzugte Mischung von Affektoren kann Benzalkoniumchlorid mit einer Konzentration von 0,01 bis ungefähr 2 % und Ethylendiamintetraessigsäure mit einer Konzentration von ungefähr 1 bis ungefähr 100 mM umfassen.
Besonders bevorzugte Substrat- und Affektor-Kombinationen sind:
4 MU-α-D-Galactosid
0,1 % Benzalkoniumchlorid mit 30 mM EDTA
4 MU-α-D-Glucosid
0,1 % Benzalkoniumchlorid mit 30 mM EDTA
4 MU-β-D-Glucuronid
0,1 % Benzalkoniumchlorid mit 30 mM EDTA
4 MU-β-Galactosid
1,25 % Natriumdodecylsulfat
1,0 % Benzalkoniumchlorid
0,75 % Benzalkoniumchlorid
0,1 mM Chlorgoldsäure
0,1 % Benzalkoniumchlorid mit 30 mM EDTA
4 MU-β-D-Glucosid
30 mM EDTA
4 MU-Phosphat
10 mM EDTA
5 mM EDTA
10 mM ZnCl&sub2;
4 MU-Nonanoat
0,1 % Benzalkoniumchlorid
4 MU-Palmitat
1 % Natriumdodecylsulfat
4 MU-Stearat
1 % Natriumdodecylsulfat
L-Arginin-AMC
0,1 % Benzalkoniumchlorid
L-Alanin-AMC
0,75 % Benzalkoniumchlorid
2 mM CoCl&sub2;
Bestatin (0,2 mg/ml)
0,33 mM Chlorgoldsäure
2,5 mM Zinkchlorid
10 mM EDTA
In vielen Fällen sind die durch die nicht identifizierten Mikroorganismen exprimierten Enzyme zu Beginn im Inokulum vorhanden. Folglich ist das Verfahren dieser Erfindung zur Bestimmung der Geschwindigkeit der enzymatischen Spaltung sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit des Affektors für diese nicht identifizierten Mikroorganismen sehr schnell und die nicht identifizierten Mikroorganismen können innerhalb von dreißig Minuten oder weniger identifiziert werden.
Für ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung wird auf die folgende Beschreibung und die folgenden Beispiele verwiesen, die in Verbindung mit den zugehörigen Tabellen und Abbildungen zu verstehen sind.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Abbildung 1 ist eine graphische Darstellung, die die Geschwindigkeiten der Hydrolyse durch Alanin-Aminopeptidase für vier (4) Arten von Enterobacteriaceae darstellt: E. coli, E. cloacae, K. pneumoniae und C. freundii, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Abbildung 2 ist eine graphische Darstellung, die die prozentuale Verstärkung der Hydrolyse-Geschwindigkeiten durch Alanin- Aminopeptidase für die in Abbildung 1 beschriebenen Bakterien in Gegenwart von 5 mM EDTA, wie in Beispiel 1 beschrieben, darstellt.
Abbildung 3 ist eine graphische Darstellung , die die Geschwindigkeiten der Hydrolyse durch β-d-Galactosidase für drei (3) Stämme jeweils der mit Bezug auf die Abbildungen 1 und 2 beschriebenen vier (4) Arten von Enterobacteriaceae, wie in Beispiel 2 beschrieben, darstellt.
Abbildung 4 ist eine graphische Darstellung, die die prozentuale Verstärkung der Hydrolyse-Geschwindigkeiten von β-d-Galactosidase in Gegenwart von einem (1 %) Prozent SDS für dieselben in Abbildung 3 beschriebenen Bakterienstämme, wie in Beispiel 2 beschrieben, darstellt.
Abbildung 5 ist eine graphische Darstellung, die die Hydrolyse- Geschwindigkeiten von L-Alanin-7-amido-4-methylcumarin (LAL) sowohl mit als auch ohne Benzalkoniumchlorid für zwei Stämme jedes der zwei folgenden Bakterienstämme vergleicht: E. coli, E. cloacae, E. aerogenes, K. pneumoniae, C. freundii, P. mirabilis und M. morganii, wie in Beispiel 3 beschrieben.
Abbildung 6 ist eine graphische Darstellung, die die Geschwindigkeiten der Hydrolyse durch β-D-Galactosidase für drei (3) Stämme jedes der folgenden Mikroorganismen zeigt: K. pneumoniae, E. aerogenes, E. cloacae, C. freundii und E. coli, wie in Beispiel 4 beschrieben.
Abbildung 7 ist eine graphische Darstellung, die die prozentuale Verstärkung/Suppression der für Abbildung 6 beschriebenen Mikroorganismen auf die Hydrolyse-Geschwindigkeiten von β-D- Galactosidase in Anwesenheit von 1,6 % Benzalkoniumchlorid, wie in Beispiel 4 beschrieben, darstellt.
Abbildung 8 ist eine graphische Darstellung, die die Geschwindigkeiten der Hydrolyse von 4-Methylumbelliferyl-β-d-Galactosid für drei (3) Stämme jeweils derselben mit Bezug auf die Abbildungen 7 und 8 beschriebenen Mikroorganismen, wie in Beispiel 5 beschrieben, darstellt.
Abbildung 9 ist eine graphische Darstellung, die die prozentuale Verstärkung/Suppression der Hydrolyse-Geschwindigkeit von β-d-Galactosidase in Anwesenheit von 0,8 mM Chlorgoldsäure für drei (3) Stämme jedes der in Abbildung 8 beschriebenen Mikroorganismen, wie in Beispiel 5 beschrieben, darstellt.
Abbildung 10 ist eine graphische Darstellung, die die Geschwindigkeiten der enzymatischen Hydrolyse von L-Alanin-7-amido-4- methylcumarin (L-Alanin-AMC) für drei (3) Stämme, jeweils in zwei Exemplaren, folgender Mikroorganismen darstellt: E. coli, E. cloacae, E. aerogenes, C. freundii, K. pneumoniae, M. morganii und P. mirabilis, wie in Beispiel 6 beschrieben.
Abbildung 11 ist eine graphische Darstellung, die die Geschwindigkeiten der Hydrolyse von L-Alanin-AMC in Anwesenheit von 0,8 mM Kobaltchlorid für dieselben Organismen, wie sie für Abbildung 10 beschrieben wurden, wie in Beispiel 6 beschrieben darstellt.
Abbildung 12 ist eine graphische Darstellung, die die Hydrolyse-Geschwindigkeiten von L-Alanin-AMC für dieselben Mikroorganismen, wie sie mit Bezug auf die Abbildungen 10 und 11 beschrieben wurden, wie in Abbildung 7 beschrieben darstellt.
Abbildung 13 ist eine graphische Darstellung, die die Verstärkung/Suppression der Hydrolyse-Geschwindigkeiten von L- Alanin-AMC in Anwesenheit von 8 mM Zinkchlorid für dieselben Stämme von Mikroorganismen, wie sie für Abbildung 12 beschrieben wurden, wie in Beispiel 7 beschrieben darstellt.
Abbildung 14 ist eine graphische Darstellung, die die Verstärkung/Suppression der Hydrolyse-Geschwindigkeiten von 4 MU- β-d-Glucuronid für acht (8) Stämme von E. coli wie in Beispiel 8 beschrieben darstellt.
Abbildung 15 ist eine graphische Darstellung, die die Verstärkung/Suppression der Hydrolyse-Geschwindigkeiten von 4 MU-β-d- Glucuronid in Gegenwart von 0,08 % Benzalkoniumchlorid und 16 mM EDTA für acht (8) Stämme von E. Coli wie in Beispiel 8 beschrieben darstellt.
Die Abbildungen 16A und B sind Balkendiagramme, die Datenbereiche für verschiedene Stämme von Mikroorganismen darstellen, die an 4 MU-Phosphat bzw. an 4 MU-Phosphat mit 5 mM EDTA getestet wurden; wogegen Abbildung 16C ein Balkendiagramm der Algorithmuswerte der in den Abbildungen 16A und B dargestellten Datenbereiche, wie in Beispiel 9 beschrieben, darstellt.
Die Abbildungen 17A, B sind Balkendiagramme, die Datenbereiche für verschiedene Stämme von Mikroorganismen darstellen, die an 4 MU-Palmitat bzw. an 4MU-Palmitat mit 1 % SDS getestet wurden; während Abbildung 17C ein Balkendiagramm der Algorithmuswerte der in den Abbildungen 17A und B dargestellten Datenbereiche, wie in Beispiel 10 beschrieben, darstellt.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Fluorogene Verbindungen werden gemäß der vorliegenden Erfindung zur Untersuchung von Enzymaktivität verwendet. Diese Verbindungen sind Analoga von natürlich vorkommenden Metaboliten. Sie weisen normalerweise einen fluoreszierenden Rest auf, der an den natürlichen Metaboliten gebunden ist. Enzymatische Spaltung setzt diesen fluoreszierenden Rest frei. Die Fluoreszenz des freien Restes ist viel größer als die des gebundenen Restes. Diese Verbindungen können daher zur Untersuchung von Enzymaktivität verwendet werden, indem sie mit der vorliegenden Probe unter geeigneten physiologischen Bedingungen zur Enzymaktivität kombiniert werden und die Geschwindigkeit des Anwachsens der Fluoreszenz überwacht wird.
Beispiele für fluorogene Spaltungs-Produkte, die für die vorliegende Erfindung nützlich sind, sind: 7-Hydroxy-4-methylcumarin, auch bezeichnet als β-Methylumbelliferon (4 MU); 7-Amino- 4-methylcumarin (AMC); β-Napthylamin; Fluorescein; Resorufin; Hydroxypyroltrisulfonat. Wahlweise oder in Kombination mit fluorogenen Spaltungs-Substraten können andere Indikator-Spaltungs-Substrate in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, einschließlich, aber nicht begrenzt auf chromogene, radiometrische und fluorometrische Substrate.
Bei der Untersuchung von Enzym-Mechanismen können viele Verbindungen verwendet werden, um die Reaktionsgeschwindigkeiten von Enzymen entweder zu hemmen oder zu erhöhen. Diese Verbindungen sind primär als Werkzeuge verwendet worden, um die Molekularbiologie der Enzyme und ihrer Umgebungen zu untersuchen. Diese Verbindungen umfassen Detergenzien, chelatisierende Substanzen, Metallionen-Cofaktoren, Antibiotika, Wasserstoffionen-Konzentrations- und Puffer-Substanzen und spezielle Affektoren der enzymatischen Aktivität wie Konkurrenz-Inhibitoren.
Durch das Kombinieren von fluorogenen Substraten mit Verbindungen, die die enzymatische Spaltung beeinflussen, und durch das Verwenden der Geschwindigkeiten der enzymatischen Hydrolyse von Substraten in Anwesenheit der sogenannten Affektor-Verbindungen und durch das Manipulieren dieser Geschwindigkeiten in Kombination mit anderen Informationen zu Enzym-Geschwindigkeiten von nicht beeinflußten Enzymen können unter Verwendung der geeigneten Algorithmen die resultierenden Informationen verwendet werden, um die Spezifizierung von Mikroben zu unterstützen. Zum Beispiel kann ein bestimmtes fluorogenes Substrat gleich gut mit zwei Bakterienarten reagieren, die Verbindung kann aber einen viel größeren Einfluß auf die enzymatische Spaltungs-Geschwindigkeit der einen Bakterienart als auf die der anderen haben. Beispiele für solche Einflüsse können in den nachfolgenden Beispielen gefunden werden.
Eine Vorrichtung zur Verstärkung von Fluoreszenz und Kinetik zur schnellen Identifikation von Bakterien und anderen Organismen durch ihre enzymatische Hydrolyse fluorogener Substrate und Verfahren zur Verwendung der Vorrichtung sind in EP-A-0 347 771 beschrieben. Die Anmeldung ist auf dieselbe Firma übertragen wie die vorliegenden Erfindung. Die Patentanmeldung von Sussman et al. beschreibt einen Carrier mit wenigstens einem auf ihm oder in ihm aufgebrachten Träger zur Verstärkung von Kinetik und Fluoreszenz. Das getrocknete fluorogene Substrat wird auf den die Fluoreszenz verstärkenden Träger aufgezogen, indem es zuerst in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst wird und anschließend die Lösung auf dem Träger abgeschieden wird. Das Lösungsmittel wird durch ein trocknendes Trocknen oder Vakuum- Trocknen entfernt. Von biologischen Proben abstammende Mikroorganismen werden durch Verwendung fluorogener Substrate identifiziert, die frei von Fluophoren oder von beiden sind, indem eine flüssige Probe zu einer oder mehreren einer Vielzahl von Trägern hinzugefügt wird, die die Kinetik und die Fluoreszenz verstärken.
Jeder dieser Träger umfaßt ein fluorogenes Substrat, das einen der folgenden Fluophore freisetzen kann: 7-Hydroxy-4-methylcumarin, 7-Amino-4-methylcumarin, β-Napthylamin, Fluorescein und Resorufin unter anderen. Die in der Probe enthaltenen Enzyme hydrolisieren die Substrate. Wenn die Substrate fluorogen sind, werden die Hydrolyse-Geschwindigkeiten bestimmt, indem die Geschwindigkeit des Anwachsens der Fluoreszenz gemessen wird. Falls das Substrat nicht fluorogen ist, sind auf dem die Kinetik und die Fluoreszenz verstärkenden Träger ein Enzym-Substrat und ein trockenens freies Fluophor abgeschieden, das in Gegenwart des Hydrolyseproduktes verstärkt oder gelöscht wird. Auf diese Weise wird die Anwesenheit des das betreffende Substrat hydrolisierenden Enzyms nachgewiesen und, falls erwünscht, das Profil der Reaktionsgeschwindigkeit von einem oder mehreren Enzymen in der Probe aufgestellt. Anschließend wird das Profil der Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms analysiert und mit Reaktionsgeschwindigkeiten von Vergleichs-Enzymen bekannter Mikroorganismen verglichen, um die unbekannten Mikroorganismen zu identifizieren. Aufgrund der Stamm-Variation und Ähnlichkeiten von Spezies können jedoch viele Arten von Mikroorganismen durch Verwendung der Vorrichtung und des Verfahrens nach EP-A-0 347 771 nicht ausreichend identifiziert werden.
In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Vorrichtung aus EP-A-0 347 771 verwendet, das Verfahren aber durch die Durchführung des Assays in Gegenwart von Mitteln, die die Aktivität von Enzymen beeinflussen, verbessert. Wie in den nachfolgenden Beispielen erläutert, machen diese die Enzym-Aktivität beeinflussenden Mittel eine positivere Identifikation verschiedener Bakterienstämme verfügbar. Folglich werden in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung flurogene Verbindungen verwendet, um die Enzym-Aktivität zu untersuchen.
Beispiele für nützliche Affektor-Verbindungen umfassen, ohne auf das folgende beschränkt zu sein: Natriumdodecylsulfat (SDS); Natriumfluorid; Natriumchlorid; Natriumazid; Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Harnstoff, (3-[3-Cholamidopropyl)dimethylamminio]1-propansulfonat) (CHAPS), Cetylpyridinchlorid, Chlorpromazin, 2-Phenoxyethanol, Kobaltchlorid, Ouabain, Natriumdeoxycholat, Benzalkoniumchlorid, Cycloserin, p-Aminosalicylsäure, Levamisol; sowie Metallionen von Mg, Ca, Zn, Cu, Co, Au und Hg. Erwünschte Konzentrationen für diese Verbindungen liegen im Bereich von 1 uM bis 100 mM oder bevorzugt von 0,1 % bis 2 Gew./Vol.-%.
Insbesondere bevorzugte Verbindungen sind:
SDS 0,5 bis 2,0 %, bevorzugt 1,0 Gew./Vol. %.
EDTA 1 bis 100 mM, bevorzugt 10 mM bis 30 mM.
Benzalkoniumchlorid 0,01 bis 2 %, bevorzugt 0,1 bis 0,75 Gew./Vol.-%.
Mischung Benzalkoniumchlorid /EDTA 0,01 bis 2 %, bevorzugt 0,1 bis 0,75 % Benzalkoniumchlorid und 1 bis 100 mM, bevorzugt 10 mM bis 30 mM EDTA.
Geeignete Kombinationen von Substrat- und Affektor-Verbindungen sind:
4 MU-β-D-Galactosid - SDS oder Benzalkoniumchlorid
4 MU-Phosphat - EDTA
4 MU-Palmitat - SDS
4 MU-Stearat - SDS
L-Alanin-AMC - EDTA oder Benzalkoniumchlorid
Besonders bevorzugte Kombinationen von Substrat- und Affektor- Verbindungen sind:
4 MU-α-D-Galactosid
0,1 % Benzalkoniumchlorid mit 30 mM EDTA
4 MU-α-D-Glucosid
0,1 % Benzalkoniumchlorid mit 30 mM EDTA
4 MU-β-D-Glucuronid
0,1 % Benzalkoniumchlorid mit 30 mM EDTA
4 MU-β-Galactosid
1,25 % Natriumdodecylsulfat
1,0 % Benzalkoniumchlorid
0,75 % Benzalkoniumchlorid
0,1 mM Chlorgoldsäure
0,1 % Benzalkoniumchlorid mit 30 mM EDTA
4 MU-β-D-Glucosid
30 mM EDTA
4 MU-Phosphat
10 mM EDTA
5 mM EDTA
10 mM ZnCl&sub2;
4 MU-Nonanoat
0,1 % Benzalkoniumchlorid
4 MU-Palmitat
1 % Natriumdodecylsulfat
4 MU-Stearat
1 % Natriumdodecylsulfat
L-Arginin-AMC
0,1 % Benzalkoniumchlorid
L-Alanin-AMC
0,75 % Benzalkoniumchlorid
2 mM CoCl&sub2;
Bestatin (0,2 mg/ml)
0,33 mM Chlorgoldsäure
2,5 mM Zinkchlorid
10 mM EDTA
Oft weisen einzelne Stämme einer gegebenenen Art Geschwindigkeiten auf, die für ein bestimmtes Substrat in einem engen Bereich liegen. Auf dieser Grundlage kann eine Art von einer anderen unterschieden werden. Es gibt jedoch auch Fälle, in denen die individuellen Stämme weit unterschiedliche Geschwindigkeiten aufweisen und die Geschwindigkeiten vieler Organismenarten überlappen. In diesen Fällen können die ausschließlich mit den Substraten erhaltenen Geschwindigkeiten mit Geschwindigkeiten, die mit Substraten mit zugefügten Verbindungen erhalten wurden, auf drei Arten verglichen werden.
Erstens werden Geschwindigkeiten direkt verglichen, um zu bestimmen, ob Stämme jeder Art mit "beinflußten" Geschwindigkeiten in einem engeren Bereich liegen als solche mit normalen Geschwindigkeiten. Dies kann die Differenzierung zwischen einer oder mehreren Arten ermöglichen.
Zweitens wird eine prozentuale Inhibierung/Verstärkung unter Verwendung der Formel berechnet:
((Kontroll-Geschwindigkeit - "beeinflußte" Geschwindigkeit) / Kontroll-Geschwindigkeit x 100 %).
Diese Formel ergibt einen positiven Wert, falls die "beeinflußte" Geschwindigkeit eine Inhibierung der Kontroll-Geschwindigkeit darstellt, und einen negativen Wert, falls die "beeinflußte" Geschwindigkeit eine Verstärkung der Kontroll-Geschwindigkeit darstellt. Oft können diese Ergebnisse eine differentielle Information da verfügbar machen, wo die Hydrolyse-Geschwindigkeiten allein dies nicht können. Eine Verbindung kann einen Einfluß auf die Geschwindigkeiten einer Art haben, der viele Male größer sein kann als der Einfluß, den sie auf eine andere Art hat.
Das dritte Vergleichs-Verfahren betrifft die Verwendung eines Algorithmus, der detailliert in Anhang A beschrieben ist. Der Vorteil der Verwendung des Algorithmus liegt darin, daß er einen Rauschfilter bildet (für Änderungen von kleinen Kontroll- Geschwindigkeiten, die eine große prozentuale Inhibierung/Verstärkung mit einem sehr großen Absolutwert erzeugen würden, der aber keine Bedeutung hat). Der Algorithmus erzeugt auch einen nicht negativen Wert, der zur Anwendung in zur Analyse der Rohdaten verwendeten Computerprogrammen wie in EP-A-0 347 771 beschrieben geeignet ist. Es können verschiedene Parameter angepaßt werden, um den Algorithmus zu optimieren. Der Algorithmus betrachtet die Hydrolyse-Geschwindigkeit des Substrats sowohl mit als auch ohne die hinzugefügte Verbindung und verwendet eine Funktion des Verhältnisses der beiden Hydrolyse-Geschwindigkeiten zur Erzeugung eines Wertes, der größer als, gleich oder kleiner als ein festgelegter Neutralwert ist Werte, die größer als der Neutralwert sind, stellen die Verstärkung der Hydrolyse-Geschwindigkeiten der Substrate durch Affektor-Verbindungen dar, Werte, die kleiner als der Neutralwert sind, stellen die Inhibierung der Hydrolyse-Geschwindigkeiten der Substrate durch Affektor-Verbindungen dar und Werte, die gleich dem Neutralwert sind, stellen keinen signifikanten Effekt dar. Es kann auch der Logarithmus der Algorithmus-Werte eingesetzt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die verschiedenen Merkmale der Erfindung weiter und sind nicht dazu gedacht, auf irgendeine Weise den Umfang dieser Erfindung einzuschränken, der in den angefügten Patentansprüchen definiert wird.

BEISPIEL 1

Durch das folgende Verfahren wurden die Alaninaminopeptidase- Hydrolyse-Geschwindigkeiten verschiedener Bakterien untersucht. 6,25 ug in Ethanol gelöstes L-Alanin-7-amido-4-methyl-cumarin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo. 63178) wurde auf eine 740E- Papierscheibe mit 6 mM Durchmesser pipettiert (Schleicher und Schüll Inc., Keene, NH 03431), die auf einen Kunststoff-Träger geklebt war. Das Lösungsmittel wurde durch Verdampfen entfernt. Der Scheibe wurden 25 ul einer McFarland Organismus-Suspension 1 zugegeben. Eine Organismus-Suspension wurde in einem Verdünnungsmittel, enthaltend 0,1 M auf einen pH von 8,0 eingestelltes Tris, 0,85 % NaCl, 0,02 Triton X-100, hergestellt. Die Fluoreszenz wurde periodisch mit einem MicroFLUOR- Leser von Dynatech (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA 22021) überwacht. Das Anwachsen der Fluoreszenz innerhalb von zehn Minuten wurde durch Subtraktion berechnet. Es wurden relative enzymatische Hydrolyse-Geschwindigkeiten für (3) drei Stämme von jeweils vier (4) Arten von Enterobacteriaceae, erhalten aus klinischen Isolierungen, bestimmt. Die Geschwindigkeiten der Hydrolyse durch Alaninaminopeptidase sind in Abbildung 1 graphisch dargestellt. Abbildung 1 zeigt die relativen Geschwindigkeiten der Hydrolyse des Substrates durch die vier (4) überlappt getesteten Arten und daß keine der Arten durch Verwendung dieser Information der Hydrolyse-Geschwindigkeit von einer anderen unterschieden werden kann.
Zu Scheiben, die auf vergleichbare Weise zu den oben beschriebenen hergestellt wurden, wurde Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (Sigma Chemical Co.) gegeben, so daß nach Zugabe einer Organismus-Suspension eine endgültige Konzentration von 4 mM EDTA erreicht wurde. Es wurden Geschwindigkeiten der Substrat- Hydrolyse gemessen. Diese Geschwindigkeiten wurden mit den Kontroll-Geschwindigkeiten für die Aktivität von Alaninaminopeptidase ohne EDTA verglichen. Einige Spezies wie Klebsiella pneumoniae zeigten eine geringe Abnahme der enzymatischen Aktivität, während Enterobacter cloacae ein Anwachsen zeigte. Die Hydrolyse-Geschwindigkeiten wurden als prozentuale Verstärkung verglichen und in Abbildung 2 (0 % entspricht keinem Effekt durch Zugabe von EDTA). Abbildung 2 zeigt, daß die getesteten drei (3) Stämme von E. cloacae eine weit größere Verstärkung der Hydrolyse-Geschwindigkeiten von Alanin-Aminopeptidase aufgrund der Zugabe von 5 mM EDTA als einer der Stämme der anderen geprüften Arten zeigen. Daher ist die Eigenschaft der prozentualen Verstärkung zur Differenzierung zwischen diesen Arten von Enterobacteriaceae nützlich.

BEISPIEL 2

Substrat-Scheiben, die jeweils 25 Mikrogramm 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactosid (Sigma Chemical Company) enthielten, wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Zu einem derartigen Satz von Papierscheiben wurde Natriumdodecylsulfat (Sigma Chemical Company) bis zu einem Gehalt von 1 % gegeben Die endgültige Konzentration betrug 0,8 % SDS, wenn mit 25 ul einer in Beispiel 1 beschriebenen Suspension eines Organismus verdunnt wurde.
Abbildung 3 zeigt für drei Stämme jeweils von E. coli, E. cloacae, K. pneumoniae und C. freundii den Wechsel der Fluoreszenz nach zehn Minuten. Aufgrund der Stamm-Variation konnte keine dieser Arten durch die Hydrolyse-Geschwindigkeiten von β- Galactosidase unterschieden werden. Wenn jedoch der Unterschied zwischen diesen Geschwindigkeiten und die Geschwindigkeiten der Hydrolyse der Scheiben, die sowohl 4 MU-β-D-Galactosid als auch SDS enthielten, verglichen wurde und die Ergebnisse als prozentuale Verstärkung berechnet wurden, konnte E. coli von den Stämmen der anderen drei getesteten Arten unterschieden werden, wie durch die in Abbildung 4 dargestellten Ergebnisse gezeigt wird. Daher wird der Effekt von SDS auf die Geschwindigkeiten der Hydrolyse von β-Galactosidase anstelle der Hydrolyse-Geschwindigkeiten selbst die unterscheidende Eigenschaft.

BEISPIEL 3

Wie in Beispiel 1 wurde Benzalkoniumchlorid (Sigma Chemical Co.) zu 6,25 ug von L-alanin-7-amido-4-methylcumarin (LAL) gegeben, um eine Konzentration von 0,4 % zu erhalten. Die Geschwindigkeiten der Hydrolyse von LAL mit und ohne Benzalkoniumchlorid wurden in Abbildung 5 für zwei (2) Stämme jeweils von E. coli, E. cloacae, E. aerogenes, K. pneumoniae, C. freundii, P. mirabilis und M. morganii verglichen. Wie in Abbildung 5 dargestellt, besteht mit Ausnahme der Proteus- und Morganella-Stämme ein beträchtliches Überlappen der Daten für die Geschwindigkeiten der Alaninaminopeptidase sowohl mit als auch ohne Benzalkoniumchlorid. Abbildung 5 zeigt auch, daß die beiden (2) getesteten Stämme von Enterobacter aerogenes die größte Verstärkung der Hydrolyse-Geschwindigkeiten aufgrund der Zugabe von 0, 4 % Benzalkoniumchlorid zeigen. Folglich ist die Zugabe von Benzalkoniumchlord zur Unterscheidung der E. aerogenes-Arten von anderen Angehörigen der Gattung Enterobacteriaceae nützlich.

BEISPIEL 4

Substrat-Scheiben, die jeweils 25 Mikrogramm 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactosid (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) enthielten, wurden wie in den vorherigen Beispielen beschrieben hergestellt. Zu einem vergleichbaren Satz von Papierscheiben wurde zwanzig Mikroliter einer 2 %igen Lösung von Benzalkoniumchlorid gegeben. Die endgültige Konzentration an Benzalkoniumchlorid betrug 1,6 %, wenn mit 25 ul einer in Beispiel 1 beschriebenen Suspension eines Organismus verdünnt wurde.
Abbildung 6 zeigt den Wechsel der Fluoreszenz für drei Stämme jeweils von K. pneumoniae, E. aerogenes, E. cloacae, C. freundii und E. coli nach zehn Minuten. Die Unterscheidung einer der Arten auf der Basis der Geschwindigkeiten der Hydrolyse von β-D-Galactosid wäre schwierig. Nach Berechnung der prozentualen Werte, durch die diese Geschwindigkeiten in Gegenwart von Benzalkoniumchlord verstärkt werden, wird die Unterscheidung von E. aerogenes von den anderen vier Stämmen jedoch möglich, wie in Abbildung 7 gezeigt wird. Folglich ist für die prozentualen Werte die Verstärkung der Hydrolyse-Geschwindigkeit von β-D-Galactosidase zur Unterscheidung zwischen diesen verschiedenen Arten von Enterobacteriaceae nützlich.

BEISPIEL 5

Substrat-Scheiben, die jeweils 25 Mikrogramm 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactosid (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) enthielten, wurden wie in den vorherigen Beispielen beschrieben hergestellt. Zu einem auf vergleichbare Weise hergestellten Satz von Scheiben wurden zwanzig Mikroliter einer 1 mM Lösung von Chlorgoldsäure (AuHCl&sub4;) gegeben. Die endgültige Konzentration an Chlorgoldsäure betrug 0,8 mM, wenn mit 25 ul einer in Beispiel 1 beschriebenen Suspension eines Organismus verdünnt wurde.
Abbildung 8 zeigt den Wechsel der Fluoreszenz für drei Stämme jeweils von E. coli, E. cloacae, E. aerogenes, C. freundii und K. pneumoniae nach zehn Minuten. Eine Unterscheidung einer der Arten aufgrund dieser Hydrolyse-Geschwindigkeiten konnte nicht gemacht werden. Nach Berechnung der prozentualen Werte, durch die diese Geschwindigkeiten in Gegenwart von Chlorgoldsäure gehemmt werden, wird die Unterscheidung von E. aerogenes jedoch möglich, wie in Abbildung 9 gezeigt wird. Folglich wird die prozentuale Inhibition der Hydrolyse-Geschwindigkeit durch Chlorgoldsäure zur Unterscheidung zwischen diesen verschiedenen Arten von Enterobacteriaceae nützlich.

BEISPIEL 6

Papierscheiben, die jeweils 6,25 Mikrogramm L-Alanin-7-amido-4- methylcumarin (L-Alanin-AMC) enthielten, wurden wie in den vorherigen Beispielen beschrieben hergestellt. Es wurde ein vergleichbarer Satz hergestellt, der zusätzlich Kobaltchlorid enthielt. Die endgültige Konzentration an Kobaltchlorid betrug 0,8 mM, nachdem 25 ul einer in Beispiel 1 beschriebenen Suspension eines Organismus zugegeben wurde.
Der Wechsel der Fluoreszenz für L-Alanin-AMC wurde für verschiedene Organismen, umfassend E. coli, E. cloacae, E. aerogenes, C. freundii, K. pneumoniae, M. morganii und P. mirabilis, nach zehn Minuten gemessen und in den in Abbildung 10 dargestellten Balkendiagrammen ausgedruckt. Wie in Abbildung 10 dargestellt, konnte keine einzige Art auf der Basis ausschließlich dieser Hydrolyse-Geschwindigkeiten unterschieden werden. Diese Hydrolyse-Geschwindigkeiten wurden mit den Hydrolyse- Geschwindigkeiten verglichen, bei denen Kobaltchlorid zum L- Alanin-AMC hinzugefügt wurde. Die Geschwindigkeiten wurden unter Verwendung des in Anhang A beschriebenen Algorithmus verglichen. Dieser Algorithmus verwendet eine Funktion des Verhältnisses der beiden Geschwindigkeiten. Die Ergebnisse dieser Vergleiche sind in Abbildung 11 angegeben, wo die unter Verwendung des Algorithmus berechneten Werte dargestellt sind. Die für E. coli im allgemeinen berechneten Werte fallen unter den Neutralwert von Null, wogegen die meisten anderen dies nicht tun.

BEISPIEL 7

Papierscheiben, die jeweils 6,25 Mikrogramm L-Alanin-7-amido-4- methylcumarin (L-Alanin-AMC) enthielten, wurden wie in den vorherigen Beispielen beschrieben hergestellt. Es wurde ein vergleichbarer Satz hergestellt, der zusätzlich Zinkchlorid enthielt. Die endgültige Konzentration an Zinkchlorid betrug 8 mM, nachdem 25 ul einer in Beispiel 1 beschriebenen Suspension eines Organismus zugegeben wurde.
Die Änderung der Fluoreszenz für L-Alanin-AMC wurde für mehrere Organismen einschließlich E. coli, E. cloacae, E. aerogenes, C. freundii. K. pneumoniae, M. Morganii und P. mirabilis nach zehn Minuten gemessen und in den in Abbildung 12 dargestellten Balkendiagrammen dargestellt. Die in Abbildung 12 dargestellten Ergebnisse zeigen klar, daß auf der Grundlage ausschließlich dieser Hydrolyse-Geschwindigkeiten keine einzige Art unterschieden werden kann. Bei zugegebenem Zinkchlorid zeigen die Hydrolyse-Geschwindigkeiten für dieselben Substrate jedoch, wie in Abbildung 13 dargestellt, eine deutliche Unterscheidung von P. mirabilis von allen anderen getesteten Arten.

BEISPIEL 8

Mehrfachsätze (2 pro Satz) von Papierscheiben wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durch Hinzufügen von 20 Mikrolitern einer 20 mM EDTA-Lösung und durch Trocknen durch Verdampfung hergestellt. Als nächstes wurden zwanzig (20) Mikroliter einer 0,1 %igen Benzalkoniumchloridlösung zu jeder der Scheiben zugegeben und durch Verdampfen getrocknet. Zu beiden Scheiben- Sätzen und zu einem weiteren Scheiben-Satz vergleichsweise hergestellter, kein Benzalkoniumchlorid oder EDTA enthaltender Scheiben wurden zwanzig (20) Mikroliter einer 1,25 mg/ml Lösung von 4-Methylumbelliferyl β-d-Glucuronid (BGR) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) in Ethanol gegeben. Das Ethanol wurde in einem gut ziehenden Abzug verdampft. Nach Verdünnung beider Scheibenarten mit 25 ul einer organischen Suspension betrug die endgültige Konzentration entweder 1 mg/ml BGR oder 1 mg/ml BGR, 0,08 % Benzalkoniumchlorid und 16 mM EDTA.
Abbildung 14 zeigt die Hydrolyse-Geschwindigkeiten von 4 MU-β- d-Glucuronid in Nanogramm freien Fluophors pro Minute für doppelte Tests von acht verschiedenen Stämmen von E. Coli. E. Coli ist ein Organismus, der für dieses Substrat durch konventionelle (wachstumsbezogene) Verfahren als zu 99 % positiv betrachtet wird. Es ist zu beachten, daß die meisten Stämme unter diesen Bedingungen eine sehr geringe Enzym-Aktivität zeigen. Abbildung 15 zeigt die Hydrolyse-Geschwindigkeiten von 4 MU-β- d-Glucuronid für dieselben Stämme von E. Coli, wenn Benzalkoniumchlorid und EDTA in den oben beschriebenen Konzentrationen vorhanden sind. Alle acht Stämme zeigen in Gegenwart von Benzalkoniumchlorid und EDTA eine verstärkte Enzym-Aktivität.

BEISPIEL 9

Papierscheiben wurden wie in Beispiel 1 durch das Pipettieren von 20 Mikrolitern einer 4-Methylumbelliferylphosphat (1,25 mg/ml) enthaltenden Lösung pro Scheibe und durch Trocknen im Vakuum hergestellt. Ein weiterer Satz von Papierscheiben wurde durch das Pipettieren von 20 Mikrolitern einer 4- Methylumbelliferylphosphat (1,25 mg/ml) und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, 5 mM) enthaltenden Lösung pro Scheibe und durch Trocknen im Vakuum hergestellt. Nach der Zugabe von 25 Mikrolitern einer organischen Suspension, wie in Beispiel 1 beschrieben, betrug die endgültige EDTA-Konzentration 4 mM.
Es wurden fünf Stämme jeweils der beiden Arten K. pneumonia und P. mirabilis in zweifacher Ausfertigung getestet. Der Logarithmus des Verhältnisses der Hydrolyse-Geschwindigkeiten wurde wie in Beispiel 7 von EP-A-0 347 771 beschrieben erhalten. Diese Ergebnisse sind als Balkendiagramme in Abbildung 16 dargestellt. Die "L's" und "H's" stellen die niedrigen bzw. hohen Datenpunkte für die Datenverteilung dar. Die graphische Darstellung wird automatisch maßstabsgetreu dargestellt, indem die hohen und niedrigen Datenpunkte als kleinste und größte Werte (bezeichnet als Min bzw. Max) verwendet werden. "M" bezeichnet den Mittelwert aller Daten für diese Art, "S" rechts von "M" bezeichnet plus eine Standard-Abweichung und "S" links von "M" bezeichnet minus eine Standard-Abweichung.
Abbildung 16A zeigt, daß keine Unterscheidung zwischen K. pneumoniae und P. mirabilis mit den ausschließlich für 4 MU-Phosphat erhaltenen Geschwindigkeiten gemacht werden konnte. Abbildung 16B zeigt klar eine bessere Trennung der Daten, so daß die meisten Stämme von K. pneumoniae von den meisten Stämmen von P. mirabilis unterschieden werden können, wenn EDTA auf der Scheibe mit 4 MU-Phosphat vorhanden ist. Abbildung 16C zeigt ein Balkendiagramm der Algorithmuswerte, wie in Beispiel 6 und in Anhang A beschrieben, für die in 16A und 16B dargestellten Daten. Die Algorithmuswerte ermöglichen eine 100 %ige Unterscheidung zwischen K. pneumoniae und P. mirabilis. Folglich ermöglicht der Vergleich der Geschwindigkeiten für 4 MU-Phosphat oder 4 MU-Phosphat mit EDTA eine bessere Differenzierung, als dies 4 MU-Phosphat oder 4 MU-Phosphat mit EDTA getrennt voneinander ermöglichen könnten.

BEISPIEL 10

Papierscheiben wurden wie in Beispiel 1 durch Pipettieren von 20 Mikrolitern einer 4-Methylumbelliferylpalmitat (1,25 mg/ml) und 1,25 % Natriumdodecylsulfat (SDS) enthaltenden Lösung pro Scheibe und ebenfalls durch Trocknen im Vakuum hergestellt. Nach Zugabe von 25 Mikrolitern einer Organismussuspension, wie in Beispiel 1 beschrieben, betrug die endgültige Konzentration von SDS 1 %.
Es wurden elf Stämme von Mycobacterium gordoneae (MGOR) und 10 Stämme von M. terrae (MTER) getestet. Der Logarithmus des Verhältnisses der Hydrolyse-Geschwindigkeiten wurde erhalten wie in Beispiel 7 der gewöhnlich übertragenen U.S.-Patentanmeldung mit der Seriennr. 209 677 beschrieben. Diese Ergebnisse sind als Balkendiagramme in Abbildung 17 dargestellt. Die "L's" und "H's" stellen die niedrigen bzw. hohen Datenpunkte für die Datenverteilung dar. Die graphische Darstellung wird automatisch maßstabsgetreu für die großen und kleinen Datenpunkte (bezeichnet als Min bzw. Max) dargestellt. Das "M" bezeichnet den Mittelwert aller Daten für diese Art, und die "S"-Werte bezeichnen die Verteilung der Daten als die mittlere +/- 1-Standard-Abweichung.
Diese beiden nahe verwandten Mycobacteria-Arten sind biochemisch schwer zu trennen. Während die meisten Angehörigen von M. terrae enzymatisch mit dem 4-Methylumbelliferylpalmitat reagieren, reagieren einige Angehörigen der Art M. gordoneae ebenfalls, wodurch ein überlappen der Daten in Abbildung 17A verursacht wird. Abbildung 17B zeigt bei Zugabe von 1 % SDS für MGOR eine stärkere Verstärkung der enzymatischen Geschwindigkeit als für MTER und diese Daten werden durch den algorithmischen Ausdruck dieses Effekts in Abbildung 17C dargestellt.
Zusätzliches Experimentieren hat gezeigt, daß SDS zur Beeinflussung der Geschwindigkeiten anderer Esterase-Substrate geeignet ist. Mit den Esterase-Substraten können andere Affektor- Verbindungen genauso verwendet werden (z.B. EDTA, Benzalkoniumchlorid etc.).

ANHANG A

Der nachfolgende Algorithmus vergleicht die Geschwindigkeiten der durch Mikroorganismen verursachten enzymatischen Hydrolyse in Gegenwart eines Substrates allein mit der Geschwindigkeit der enzymatischen Hydrolyse des Substrates in Gegenwart einer die Enzymspaltung beeinflussenden Verbindung. Der Algorithmus kann in einem Computer programmiert werden und zum Analysieren des Verhältnisses von Geschwindigkeits-Daten wie folgt verwendet werden:
Sei R = Geschwindigkeit der enzymatischen Hydrolyse eines Substrates in Abwesenheit eines die Enzymspaltung beeinflussenden Mittels (zum Beispiel in Einheiten von Nanogramm freien Fluophors pro Minute).
Sei I = Geschwindigkeit der enzymatischen Hydrolyse eines Substrates in Anwesenheit eines die Enzymspaltung beeinflussenden Mittels (zum Beispiel in Einheiten von Nanogramm freien Fluophors pro Minute).
Ein Teil der Standard-Abweichung von wiederholten Versuchen, die Geschwindigkeiten R oder I unter identischen Bedingungen zu bestimmen, K1 genannt, ist das Ergebnis einer Basislinien- Verschiebung, Verstärkerrauschen und derartigen Effekten des Instruments, von denen alle von der tatsächlichen Geschwindigkeit unabhängig sind. Aller Wahrscheinlichkeit nach enthalten die signifikanten gemessenen Geschwindigkeiten eine zusätzliche Komponente ihrer Standardabweichung, K2 genannt, die proportional zur Quadratwurzel der betreffenden Geschwindigkeit R oder I ist. Daher werden die Funktionen R' und I' als das Verhältnis der betreffenden Geschwindigkeiten R bzw. I zu ihren erwarteten Standard-Abweichungen wie folgt definiert:
R' = X/(K1 + K2 x X>
I' = Y/(K1 + K2 x Y>
Die nachfolgenden Konstanten sind ausgewählt, um die Algorithmuswerte zu optimieren und können von normalen Fachleuten eingestellt werden. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung sind die Konstanten wie folgt ausgewählt worden:
K1 = 0,10
K2 = 0,04
W1 = 1,00
W2 = 1,00 und
W3 = 20,09
Falls R > 2 x K1, dann sei X = R
Falls R ≤ 2 x K1, dann sei X = 2 x K1
Falls darüber hinaus I > 2 x KI, dann sei Y = I
Falls I ≤ 2 x K1, dann sei Y = 2 x K1
Diese Bedingungen verhindern, daß Unterschiede zwischen sehr kleinen enzymatischen Hydrolyse-Geschwindigkeiten (d.h. kleiner als 2 x K1) in den letzten Schritten des Algorithmus signifikant erscheinen.
Die Funktionen F1 bis F5 sind wie folgt definiert:
Sei F1 = I' - R' (bedeutet die Absolutwerte von I' - R')
dann, falls F1 ≥ W1 dann sei F2 = F1.
Falls F1 ≤ oder = W1 ist, dann sei F2 = 0.
Sei F3 = F2/(F2 + W2)
F4 = W3 x (1 + F3 x (Y - X) / X)
FS = Ln F4 (wobei Ln der natürliche Logarithmus ist).
Die durch F1 bis F5 bestimmten Werte haben folgende Bedeutung:
F1 - Prüft die Größe des Unterschiedes zwischen den beiden Hydrolyse-Geschwindigkeiten nach dem Kompensieren aufgrund der Standard-Abweichung. Falls die Größe ihrer Unterschiede eins oder mehr ist, dann ist die Änderung der Geschwindigkeit von R zu I signifikant.
F2 - Ermöglicht, daß ein signifikanter Geschwindigkeits-Unterschied durch den Algorithmus gelangt und filtert nicht signifikante Geschwindigkeits-Unterschiede heraus.
F3 - Hat dieselbe Funktion wie F2, läßt aber signifikante Unterschiede sogar noch signifikanter erscheinen, indem ihre Werte größer als die nicht signifikanten Werte gemacht werden.
F4 - Ist der aktuelle Algorithmus. Zu beachten ist, daß F4 eine Funktion des Verhältnisses der entsprechenden Hydrolyse-Geschwindigkeiten (Y - X)/X ist.
F5 - Ist der natürliche Logarithmus (Ln) von F4.
Der Zweck des Algorithmus besteht darin, nicht signifikante Geschwindigkeits-Unterschiede wie den Neutralwert W3 in einen engen Bereich zu bringen und um als Filter für große Unterschiede zwischen sehr hohen Hydrolyse-Geschwindigkeiten zu wirken.
Tabelle 1 zeigt den Algorithmus, in den für R und I hypothetische Werte wie folgt eingesetzt wurden: TABELLE 1. Organismus TABELLE 1 - Fortsetzung Organismus

Claims

1. Verfahren zum Identifizieren eines nicht identifizierten Mikroorganismus, umfassend:

Bestimmen der Geschwindigkeit der enzymatischen Spaltung einer Vielzahl von Substraten durch wenigstens ein von einem nicht identifizierten Mikroorganismus exprimiertes Enzym in Gegenwart einer wirksamen Konzentration wenigstens eines die Enzymspaltung beeinflussenden Mittels (Affektor), wobei die Substrate aus der aus fluorogenen und chromogenen Substraten bestehenden Gruppe ausgewählt sind, wodurch ein Muster enzymatischer Spaltungs-Geschwindigkeiten erzeugt wird, die für die nicht identifizierten Mikroorganismen in Gegenwart des beeinflussenden Mittels charakteristisch sind; und

Identifizieren der nicht identifizierten Mikroorganismen als zu der Klasse der identifizierten Mikroorganismen gehörend, für die das Muster der enzymatischen Spaltungs- Geschwindigkeiten der Substrate in Gegenwart des Affektors am stärksten mit einem Muster korreliert, das für den nicht identifizierten Mikroorganismus erhalten wurde.

2. Verfahren zum Identifizieren eines nicht identifizierten Mikroorganismus nach Anspruch 1, weiterhin umfassend das Vergleichen des Musters der für den nicht identifizierten Mikroorganismus charakteristischen enzymatischen Spaltungs-Geschwindigkeiten mit einem Muster enzymatischer Spaltungs-Geschwindigkeiten der Substrate, das in Gegenwart einer effektiven Konzentration des beeinflussenden Mittels für eine oder mehrere identifizierte Klassen von Mikroorganismen erhalten wurde.

3. Verfahren zum Identifizieren eines nicht identifizierten Mikroorganismus nach Anspruch 1, wobei das Substrat fluorogene Substrate umfaßt.

4. Verfahren zum Identifizieren eines nicht identifizierten Mikroorganismus, umfassend:

Bestimmen der Geschwindigkeit der enzymatischen Spaltung einer Vielzahl von Substraten durch wenigstens ein von einem nicht identifizierten Mikroorganismus exprimiertes Enzym in Gegenwart einer wirksamen Konzentration wenigstens eines die Enzymspaltung beeinflussenden Mittels (Affektor), wobei die Substrate aus der aus fluorogenen und chromogenen Substraten bestehenden Gruppe ausgewählt sind, wodurch ein Muster enzymatischer Spaltungs- Geschwindigkeiten erzeugt wird, die für die nicht identifizierten Mikroorganismen in Gegenwart des beeinflussenden Mittels charakteristisch sind;

Bestimmen der Geschwindigkeit der enzymatischen Spaltung der Substrate durch wenigstens ein von einer oder mehrerer identifizierter Klassen oder Unterklassen von Mikroorganismen exprimiertes Enzym in Gegenwart einer wirksamen Konzentration wenigstens eines Affektors, wodurch ein Muster enzymatischer Spaltungs-Geschwindigkeiten der identifizierten Mikroorganismen in Gegenwart des Affektors erzeugt wird;

Vergleichen des Musters der für den nicht identifizierten Mikroorganismus typischen enzymatischen Spaltungs- Geschwindigkeiten mit den Mustern der enzymatischen Spaltungs-Geschwindigkeiten der Substrate in Gegenwart des Affektors, die am stärksten mit dem für den unbekannten Mikroorganismus erhaltenen Muster korrelieren.

5. Verfahren zum Identifizieren eines unbekannten Mikroorganismus nach Anspruch 4, wobei die Substrate fluorogene Substrate umfassen.

6. Verfahren zum Identifizieren eines unbekannten Mikroorganismus, umfassend:

Bestimmen der Geschwindigkeit der enzymatischen Spaltung einer Vielzahl von Substraten durch wenigstens ein von einem nicht identifizierten Mikroorganismus exprimiertes Enzym in Gegenwart einer wirksamen Konzentration wenigstens eines die enzymatischen Spaltung beeinflussenden Mittels (Affektor), wobei das Substrat aus der aus fluorogenen und chromogenen Substraten bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wodurch ein Muster enzymatischer Spaltungs- Geschwindigkeiten gebildet wird, die charakteristisch für die nicht identifizierten Mikroorganismen in Anwesenheit des beeinflussenden Mittels sind;

Bestimmen der Geschwindigkeit der enzymatischen Spaltung der Substrate durch wenigstens ein von einem oder mehreren der nicht identifizierten Mikroorganismen exprimiertes Enzym in Abwesenheit einer wirksamen Konzentration des Affektors, wodurch ein Muster enzymatischer Spaltungs- Geschwindigkeiten erzeugt wird, die für die nicht identifizierten Mikroorganismen in Abwesenheit des beeinflussenden Mittels charakteristisch sind;

Vergleichen einer Funktion des Musters der für den nicht identifizierten Mikroorganismus in Gegenwart des Affektors charakteristischen enzymatischen Spaltungs-Geschwindigkeiten mit dem Muster der für den nicht identifizierten Mikroorganismus in Abwesenheit des Affektors für den Mikroorganismus charakteristischen enzymatischen Spaltungs-Geschwindigkeiten mit einer Funktion eines Verhältnisses eines Musters enzymatischer Spaltungs- Geschwindigkeiten der Substrate, erhalten in Gegenwart einer effektiven Konzentration des Affektors für eines oder mehrere identifizierte Klassen oder Unterklassen von Mikroorganismen; und

Identifizieren des unbekannten Mikroorganismus als zu der Klasse oder Unterklasse von bekannten Mikroorganismen gehörend, für die die Funktion des Musters der enzymatischen Spaltungs-Geschwindigkeiten am engsten mit der Funktion des Musters der enzymatischen Spaltungs-Geschwindigkeiten, wie sie für den unbekannten Mikroorganismus erhalten wurde, korreliert.

7. Verfahren zum Identifizieren eines nicht identifizierten Mikroorganismus nach Verfahren 6, wobei die Muster der enzymatischen Spaltungs-Geschwindigkeiten für die identifizierten Klassen der Mikroorganismen erzeugt werden durch:

Bestimmen der Geschwindigkeit der enzymatischen Spaltung der Substrate durch wenigstens ein von einer oder mehreren identifizierten Klassen oder Unterklassen von Mikroorganismen exprimiertes Enzym in Gegenwart einer wirksamen Konzentration des wenigstens einen Affektors, wodurch ein Muster enzymatischer Spaltungs-Geschwindigkeiten erzeugt wird, das für die identifizierten Mikroorganismen in Gegenwart des Affektors charakteristisch ist, und

Bestimmen der Geschwindigkeit der enzymatischen Spaltung der Substrate durch wenigstens ein von einer oder mehreren der identifizierten Klassen oder Unterklassen von Mikroorganismen exprimiertes Enzym in Abwesenheit einer wirksamen Konzentration des Affektors, wodurch ein Muster enzymatischer Spaltungs-Geschwindigkeiten erzeugt wird, das für die identifizierten Mikroorganismen in Abwesenheit des Affektors charakteristisch ist.

8. Verfahren zum Identifizieren eines nicht identifizierten Mikroorganismus nach Anspruch 7, wobei das Substrat ein fluorogenes Substrat umfaßt.

9. Verfahren zum Identifizieren eines nicht identifizierten Mikroorganismus nach Anspruch 7, weiterhin umfassend das Identifizieren des unbekannten Mikroorganismus als zu einer bekannten Unterklasse der Klasse von Mikroorganismen gehörend, für die das Muster der enzymatischen Spaltungs- Geschwindigkeiten der Substrate in Gegenwart des Affektors am stärksten mit dem für den unbekannten Mikroorganismus erhaltenen Muster korreliert.