JPH0785719B2 - 酵素活性作用物質の存在下に酵素活性を測定することによる微生物の同定 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野 本発明は、基質の酵素加水分解速度を、該酵素の活性を
抑制もしくは増大する作用物質（ａｆｆｅｃｔｉｎｇ
ａｇｅｎｔ）の存在下に測定し、これらの速度を種々の
同定された微生物についての酵素活性プロフィルと比較
することにより微生物を同定する方法に関する。

【０００２】関連技術背景 臨床または実験室環境で分離された微生物の迅速同定は
重要な目標である。大部分の実験室では、臨床分離物か
らの微生物を市販の細菌同定システムにより同定してい
る。これらは同定するために微生物の分離後１８−２４
時間またはそれ以上をも必要とする。ある種類の現在
の″迅速″システムは３−１３時間かかる。これらのシ
ステムは一般に一定期間の微生物の増殖後に産生され
る、糖またはアミノ酸代謝の酸性または塩基性副生物の
検出に依存する。これらの″増殖に基づく″市販の細菌
同定システム数種類は、細菌を特定するのに有用な情報
を得るために選ばれた抑制物質を使用する。

【０００３】これらの″増殖に基づく″市販の細菌同定
システムのうち最も注目すべきものは、オルガノン・テ
クニカ（ダーラム、ノースカロライナ州）により製造さ
れたオートバック（ＡＵＴＯＢＡＣ）ＩＤＸである。こ
のシステムはグラム陰性桿菌の同定に用いられる。シー
ラフ（Ｓｉｅｌａｆｆ）ら、″オートバックシステムを
用いる新規な細菌同定法″、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５，Ｎ
ｏ．６，１１０３−１１１０（１９８２）を参照された
い。増殖抑制プロフィルは微生物増殖培地に装入された
１８種類の識別用抑制物質を用いて作成され、増殖はオ
ートバックＩＤＸ器具を用いて比濁法により測定され
る。オートバックＩＤＸと共に配布される文献には、″
プロフィルは二段階二次識別分析により分析され、識別
が行われる″と述べられている。抑制物質は色素、重金
属イオン、抗生物質、および細菌代謝抑制物質からな
る。この試験は３時間のインキュベーションを必要と
し、これによって一般に数世代の細菌増殖が行われる。
抑制されたウェル内の増殖が、増殖培地を含むが増殖抑
制物質は含まれないウェル内の増殖と比較される。

【０００４】細菌の増殖は多くの条件に依存する：適切
なｐＨおよび温度範囲、エネルギーを供給するための適
正な栄養素、ならびに細胞の増殖および分裂に必要な細
胞蛋白質、核酸その他の細胞成分を形成するための酵素
依存性事象のカスケード。オートバックＩＤＸ試験に用
いられる抑制物質は、これらの主要な点のいずれかにお
いて増殖を抑制しうる。

【０００５】増殖に基づく他の細菌同定システムは選択
的増殖抑制物質を用いるが、オートバックＩＤＸのよう
全面的にではない。バイテック・システムズ（セントル
イス、ミズーリ州）により製造されるバイテックのオー
トマイクロビックシステム（ＡＵＴＯＭＩＣＲＯＢＩＣ
ＳＹＳＴＥＭ）はイルガサン（Ｉｒｇａｓａｎ）（Ｄ
Ｐ３００）を増殖培地および代謝活性指示薬と共に使用
する；アイセンバーグ（Ｉｓｅｎｂｅｒｇ）ら、″オー
トマイクロビックシステム腸内細菌用バイオケミカルカ
ードの共同研究″、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉ
ｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１１，Ｎｏ．６，
６９４−７０２（１９８０）を参照されたい。

【０００６】他の増殖抑制物質であるセトルイミド（Ｃ
ｅｔｒｉｍｉｄｅ）はセプター（ＳＣＥＰＴＯＲ）同定
システム（ベクトン・ディッキンソン、タウスン、マリ
ーランド州）に選択的抑制物質として、抑制されない緑
膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）と抑制される他のシ
ュードモナス属菌種を識別するために用いられる。

【０００７】これらの増殖に基づく同定システムはすべ
て同じ制限をもち、それらは結果を提供するのが遅い。
いわゆる″迅速″同定システムですら、それらの結果を
得るのに３−１３時間かかる。これらのシステムの速度
が制限される理由は、これらのシステムが少なくとも１
巡、しばしば数巡の微生物増殖および複製を必要とする
からである。

【０００８】多くの微生物群（ｃｌａｓｓ）において、
その群の幾つかまたはすべての員子に共通な酵素が見出
される。群とは機能的に有用ないずれかの微生物分類で
あると定義される。たとえば別個の微生物群を定める２
種類の機能的に有用な分類は、ラクトース発酵細菌に対
する非−ラクトース発酵細菌である。他の機能的に有用
な群は、インドール陰性細菌に対するインドール陽性細
菌である。微生物の群を定める他の分類は、オキシダー
ゼ陰性細菌に対するオキシダーゼ陽性細菌である。従っ
て、ある微生物が１種類または数種類の群の員子となる
可能性がある。腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉａｃｅａｅ）の員子が発現する酵素の例は、アラニン
アミノペプチダーゼ、アルカリホスファターゼおよびβ
−ガラクトシダーゼである。エステラーゼ酵素類はヒト
病原体として一般的に分離される細菌の多くに見出され
る。これら共通の酵素系に関して種々の基質および指示
薬系を用いる多種多様なアッセイ法が開発された。これ
らの酵素が著しく遍在性であることが、多数の微生物群
を構成する種間の識別のための従来のアッセイ法の有用
性を制限する。

【０００９】基質の酵素開裂を利用して特定の細菌種を
同定する１方法は米国特許第４，６０３，１０８号明細
書（バスコム）に記載されている。バスコムの明細書に
は２６種類の構成性酵素に関する試験法を含めたキット
が記載されている。各試験において酵素はそれが特定の
基質と相互作用する効力により測定される。テストカー
ドその他の器具は複数のウェルまたはコンパートメント
を備えており、これらは別個に各酵素試験のための特定
の基質溶液、ならびに試験のための他の試薬を収容す
る。細菌懸濁液を各コンパートメントに添加すると、比
較的短期間のインキュベーションののち検出可能な生成
物が生じる。次いで各試料中の対応する酵素の量を、比
色法または蛍光測定法を用いる分光測定法により測定す
る。この明細書に記載される他の方法においては、一般
的に遭遇する細菌群の迅速識別のために７種類の試験法
が採用される。バスコムはこれらの２６試験アッセイ法
または７試験アッセイ法によって菌種または１群の菌種
に関する独自のフィンガープリントが得られると述べて
いる。各群の菌種に関する酵素活性の定量を利用して、
以前に同定された細菌の活性プロフィルと比較すること
により、その群または菌種を同定することができる。上
記の特異的試験法はフローセル内で吸光度を検出するこ
とにより活性を測定する。個別試料分析および連続フロ
ー分析を採用しうる。しかしバスコムの方法は大量のバ
イオマスおよび高容量の流体、ならびに比較的長いイン
キュベーション時間を必要とする。

【００１０】蛍光原基質も酵素活性のアッセイに用いら
れている。これらの化合物は天然代謝産物の同族体であ
る。それらは一般に天然代謝産物に結合した蛍光性部分
を含む。基質の酵素開裂により蛍光性部分が離脱する。
この遊離部分の蛍光は結合部分のものよりはるかに強
い。従って蛍光原化合物は、それらを酵素活性に適した
生理的条件下で問題の試料と混和して蛍光の増大を監視
することにより、酵素活性のアッセイに用いられる。

【００１１】研究者らは微生物の同定にも蛍光原基質を
用いた。ウェストリー（Ｗｅｓｔｌｅｙ）らは″種々の
細菌のアミノペプチダーゼプロフィル″、Ａｐｐｌ．Ｍ
ｉｃｒｏ．，１５，８２２−８２５，（１９６７）に、
α−アミノ酸 β−ナフチルアミド基質を２４菌株の細
菌の同定に用いることにつき論じている。細菌を溶液中
に懸濁し、基質溶液と共にインキュベートする。４時間
のインキュベーションののち、放出されたβ−ナフチル
アミンの蛍光を測定した。他の刊行物においては、ピー
ターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）らが″アミノペプチダー
ゼプロフィルによる特定のグラム陰性菌の迅速検出″；
Ｊ．ＦｏｏｄＳｃｉ．，４３ １８５３−１８５６（１
９７８）に１９種類のＬ−アミノ酸 β−ナフチルアミ
ドの酵素加水分解を測定するために蛍光測定分析を用い
ることにつき述べている。各培養のプロフィルは４−６
時間で得られた。

【００１２】微生物の酵素活性プロフィルを作成するた
めに蛍光原基質を使用することに関する文献の総説が、
ゴッドセイ（Ｇｏｄｓｅｙ）ら、″微生物酵素活性プロ
フィルによる腸内細菌の迅速同定″，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍ
ｉｃｒｏ．，１３，４８３−４９０（１９８１）に含ま
れる。ゴッドセイらは腸内細菌群の５３９菌株の研究に
１８種類の蛍光原基質を用いることを報告している。２
ｍｌの緩衝剤含有基質中で３７℃において最初の３０分
間、加水分解速度が監視された。尿素以外のすべての基
質はβ−メチルウンベリフェロン、β−ナフチルアミン
または７−アミノ−４−メチルクマリンの誘導体であっ
た。

【００１３】米国特許第４，５９１，５５４号明細書
（クマラら）には、ウンベリフェロン誘導体を用いる蛍
光分析が、少数の微生物を検出し、その量を測定するた
めの方法として記載されている。この方法ではウンベリ
フェロン誘導体を試料溶液に添加し、次いでインキュベ
ートした。次いで不溶性残渣（たとえば細胞）を除去
し、通常の検出器により蛍光を読み取る。次いで蛍光量
と微生物数の関係を求める。若干の例では補酵素が用い
られている。他の例では、遊離酵素の量を増加させるた
めに細胞を破壊している。

【００１４】蛍光原基質は生存微生物中に存在する細胞
外酵素のアッセイにも有用であることが知られている。
シュナイダー（Ｓｎｙｄｅｒ）らは″微生物の検出およ
び同定におけるインビボ酵素−基質蛍光速度のパターン
認識分析″，Ａｐｐ．＆ Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒ
ｏ．，５１，９６９−９９７（１９８６）に、１５分以
下の反応時間を報告している。シュナイダーらの研究
は″誘発蛍光による可視微生物検出法″と題する国際特
許出願（出願人シンシナチ大学、国際特許出願公開第８
６／０５２０６号、１９８６年９月１２日付け）の基礎
にもなっている。

【００１５】細菌のフィンガープリントを作成するため
に用いられる他の方法は、チューポンパル（Ｃｈｕ−Ｐ
ｏｎｇ Ｐａｌ）らが″二次元蛍光データのパターン認
識を用いることによる細菌の′フィンガープリント作
成′のための迅速酵素法″、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３
２，９８７−９９１（１９８６）に述べたように、酵素
含量および活性の差に基づく。このシステムでは、それ
ぞれ異なる蛍光性部分を含む６種類の蛍光原基質の混合
物を用いている。蛍光の増大が３０分間にわたって監視
される。蛍光データのフーリエ変換により、それぞれの
被験微生物に特徴的な二次元アレイを得る。

【００１６】エドバーグ（Ｅｄｂｅｒｇ）らは″デオキ
シコール酸ナトリウムの存在下における活性な構成性β
−Ｄ−グルコシダーゼ（エスクリナーゼ）の測定″、Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．３，３６３−３６
５（１９８５）に、胆汁相当物（デオキシコール酸ナト
リウム）により酵素を抑制した状態で酵素β−Ｄ−グル
コシダーゼ（エスクリナーゼ）を測定することにより連
鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）菌種を識別す
る方法を示している。この方法では比色用基質ｐ−ニト
ロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドの加水分解によ
りβ−Ｄ−グルコシダーゼの存在を検出する。基質が加
水分解されると黄色部分ｐ−ニトロフェニルが無色の母
体化合物から放出され、試料中に黄色が存在することに
より検出される。デオキシコール酸ナトリウムの存在下
では、Ｄ群以外の大部分の連鎖球菌属菌種はβ−Ｄ−グ
ルコシダーゼ（エスクリナーゼ）の放出が抑制される。
胆汁感受性の肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ
ｅ）はデオキシコール酸ナトリウムにより自己溶解が誘
発されるため、この系により３０分以内に同定される。

【００１７】上記エドバーグらの方法の改良がパノシア
ン（Ｐａｎｏｓｉａｎ）およびエドバーグ（Ｅｄｂｅｒ
ｇ）により″組合わせ構成性酵素基質の加水分解による
ストレプトコッカス・ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）の迅速
同定″、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖ．２７，Ｎｏ．８，１７１
９−１７２２（１９８９年８月）に報告されている。こ
の方法は２種の加水分解性基質、ｐ−ニトロフェニル−
α−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＧＡＬ）および４−メ
チルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコシド（ＭＧＬ
Ｕ）を含有する試薬をデオキシコール酸ナトリウムの存
在下で用いる。この試験の利点は、これにより２種類の
構成性酵素、α−ガラクトシダーゼおよびβ−グルコシ
ダーゼを３０分の試験で同時に検出しうることである。
この試験によりストレプトコッカス・ボビスを同定し、
エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）菌
種、ビリダンス群連鎖球菌、ストレプトコッカス・イク
イヌス（Ｓ．ｅｑｕｉｎｕｓ）および肺炎連鎖球菌を識
別することができる。ＰＧＡＬの加水分解は黄色の発色
により証明され、蛍光原基質であるＭＧＬＵの加水分解
は試験管を携帯用４−Ｗ３６６−ｎｍ ＵＶライトで照
射することにより測定される。ＰＧＡＬ−ＭＧＬＵ混合
基質加水分解により４種類の結果、黄色および蛍光、無
色および蛍光、黄色および無蛍光、ならびに無色および
無蛍光の可能性がある。

【００１８】これらの試験法により種々の連鎖球菌種を
迅速に識別することができるが、この試験はごく限られ
ており、２種類の構成性酵素を測定するにすぎない。さ
らにこの試験法は基質の加水分解に関して陽性または陰
性の結果を与えるにすぎない。同一または類似の酵素を
異なる速度で産生する近縁の細菌群を識別するために加
水分解の速度または程度を測定することはできない。

【００１９】細菌および他の微生物をそれらの酵素によ
る蛍光原基質の加水分解によって迅速に同定するために
蛍光および速度を増強させるための装置、ならびにその
装置を使用する方法は米国特許出願第２０９，６７７号
明細書（サスマンら、１９８８年６月２０日出願）に記
載されている。この出願は本発明と同一の出願人に譲渡
されている。サスマンらの明細書には、少なくとも１種
類の速度および蛍光増強用支持体がその上または内部に
付与されたキャリヤーが記載されている。乾燥した蛍光
原基質をまず適切な溶剤に溶解し、次いでこの溶液を支
持体上に沈着させることにより、蛍光原基質を蛍光増強
用支持体に付着させる。溶剤は乾燥または真空乾燥によ
り除去される。生物検体に由来する微生物は、蛍光原基
質、蛍光体または両者を用いて、流体試料を複数の速度
および蛍光増強用支持体の１または２以上に添加するこ
とにより同定される。

【００２０】各支持体は下記の蛍光原基質または蛍光体
のうち１種類を含む：特にβ−ウンベリフェロン、７−
アミノ−４−メチルクマリン、β−ナフチルアミン、フ
ルオレセインおよびレゾルフィン。試料中に存在する酵
素が基質を加水分解する。基質が蛍光原である場合、加
水分解速度は蛍光物質の産生速度を測定することにより
判定される。基質が蛍光原でない場合、速度および蛍光
増強用支持体には酵素基質、および加水分解生成物の存
在下で増強または消光する乾燥状態の遊離蛍光体を沈着
させる。この方法で特定の基質を加水分解する酵素の存
在が検出され、所望により試料中の１種類または２種類
以上の酵素の反応速度プロフィルが作成される。次いで
この酵素反応速度プロフィルを分析し、未知微生物を同
定するために既知微生物の基準酵素反応速度プロフィル
と比較する。しかし菌株の変異のため、多くの微生物菌
種が米国特許出願第２０９，６７７号明細書に記載の装
置および方法によっては十分に同定されない。

【００２１】酵素機構の研究に際して、多くの化合物を
酵素反応速度の抑制または増強のために用いることがで
きる。これらの化合物は主として酵素の分子生物学およ
びその周辺を調べるための道具として用いられている。
これらの化合物には界面活性剤、キレート化剤、金属イ
オン系補助因子、抗生物質、水素イオン濃度調整剤およ
び緩衝剤、ならびにより特異的に酵素活性を阻害もしく
は増強する物質、例えば競合阻害物質が含まれる。

【００２２】従って本発明の目的は、迅速かつ正確に微
生物を同定する方法を提供することである。

【００２３】さらに本発明の目的は、極めて迅速かつ正
確な同定システムを提供するために、微生物の酵素活性
を抑制もしくは増大する特性を持つ化合物を有利に利用
することである。

【００２４】発明の要約 これらおよび他の目的は、未同定微生物の迅速同定法を
提供する本発明により達成される。この方法によれば、
複数の基質の酵素による開裂速度を、該酵素の開裂を抑
制もしくは増大する有効濃度の少なくとも１種類の作用
物質（ａｆｆｅｃｔｏｒ）の存在下に測定する。これら
の基質は蛍光原基質および色原基質から選ばれ、未同定
微生物が発現する少なくとも１種類の酵素による特徴的
な酵素開裂速度パターンが作成される。この特徴的な酵
素開裂速度パターンは、作用物質の存在下における未同
定微生物の”フィンガープリント”である。この未同定
微生物についての酵素開裂速度パターンを、同一作用物
質の存在下で１または２以上の同定された微生物群また
は亜群について得られた同一基質の酵素開裂速度パター
ンと比較する。そして、その作用物質の存在下における
酵素開裂速度パターンがもっとも密接に相関する特定の
既知微生物群または亜群に、この未同定微生物が属する
ものと同定する。

【００２５】本発明の１形態においては、未同定微生物
の同定法が提供される。この方法によれば、未同定微生
物が発現する少なくとも１種類の酵素による複数の基質
の酵素開裂速度を有効濃度の少なくとも１種類の作用物
質の存在下に測定する。基質には蛍光原基質および色原
基質よりなる群のうち１種類または２種類以上が含ま
れ、その開裂により作用物質の存在下において未同定微
生物に特徴的な酵素開裂速度パターンが作成される。次
いでこの未同定微生物に特徴的な酵素開裂速度パターン
を、有効濃度の上記作用物質の存在下で得られた、１ま
たは２以上の同定された微生物群または亜群に特徴的な
同一基質の酵素開裂速度パターンと比較する。次いでこ
の未同定微生物を、１種類または２種類以上の作用物質
の存在下における基質の酵素開裂速度パターンが未知微
生物について得られたパターンに最も密接に相関する既
知微生物群または亜群に属するものと同定する。

【００２６】適切には本発明はさらに、同定された微生
物群または亜群が発現する少なくとも１種類の酵素によ
る１種類または２種類以上の基質の酵素開裂速度を、未
同定微生物について試験した有効濃度の１種類または２
種類以上の作用物質の存在下に測定することを含む。こ
うして１種類または２種類以上の作用物質の存在下にお
ける、同定された微生物群または亜群のそれぞれに特徴
的な酵素開裂速度パターンが作成される。次いで未同定
微生物に特徴的な酵素開裂速度パターンを、上記作用物
質の存在下で得られた、同定された微生物群または亜群
に特徴的な同一基質についての酵素開裂速度パターンと
比較する。次いでこの未知微生物を、酵素開裂速度パタ
ーンが未知微生物について得られたパターンに最も密接
に相関する既知微生物群または亜群に属するものと同定
する。

【００２７】本発明の好ましい形態においては、未同定
微生物の同定法が提供される。この好ましい方法によれ
ば、未同定微生物が発現する少なくとも１種類の酵素に
よる複数の基質の酵素開裂速度を有効濃度の少なくとも
１種類の作用物質の存在下に測定する。基質には蛍光原
基質および色原基質よりなる群のうち１種類または２種
類以上が含まれ、その開裂により作用物質の存在下にお
いて未同定微生物に特徴的な酵素開裂速度パターンが作
成される。未同定微生物が発現する少なくとも１種類の
酵素による同一基質の酵素開裂速度は、有効濃度の作用
物質の不在下においても測定される。こうして作用物質
の不在下において未同定微生物に特徴的な酵素開裂速度
パターンが作成される。作用物質の存在下において未同
定微生物に特徴的な酵素開裂速度パターン、および作用
物質の不在下において未同定微生物に特徴的な酵素開裂
速度パターンの関数が求められる。この未知微生物につ
いて求めた関数の値を、１または２以上の同定された微
生物群について求めた関数の値と比較する。既知微生物
についての関数は、有効濃度の作用物質の存在下で得ら
れた基質の酵素開裂速度パターン、および有効濃度の作
用物質の不在下で得られた基質の酵素開裂速度パターン
から求められる。従って未同定微生物は、酵素開裂速度
パターンの関数の値が未知微生物について得られた酵素
開裂速度パターンから求めた関数の値に最も密接に相関
する既知微生物群または亜群に属するものと同定され
る。

【００２８】適切には、同定された微生物群についての
酵素開裂速度パターンは本発明に従って作用物質の存在
下および不在下の双方において作成される。従って、１
または２以上の同定された微生物群または亜群が発現す
る少なくとも１種類の酵素による基質の酵素開裂速度
を、有効濃度の少なくとも１種類の作用物質の存在下に
測定する。こうして作用物質の存在下における同定され
た微生物に特徴的な酵素開裂速度パターンが作成され
る。同様に、１または２以上の同定微生物群が発現する
少なくとも１種類の酵素による同一基質の酵素開裂速度
を、有効濃度の作用物質の不在下においても測定する。
こうして作用物質の不在下における同定された微生物に
特徴的な酵素開裂速度パターンが作成される。既知微生
物群または亜群に特徴的な酵素開裂速度パターンは上記
の節に記載されるように本発明方法に従って使用され
る。

【００２９】本発明に関して記載した各方法において、
酵素開裂速度は２以上の微生物群について測定すること
が好ましい。好ましくは開裂する基質は蛍光原である。
これらの蛍光原基質には下記の蛍光体により誘導体化さ
れた生物学的同族体が含まれる：たとえば７−ヒドロキ
シ−４−メチルクマリン、７−アミノ−４−メチルクマ
リン、β−ナフチルアミン、フルオレセイン、レゾルフ
ィン、ヒドロキシピレントリスルホネート。本方法に用
いられる作用物質には下記のものが含まれる：ドデシル
硫酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、塩化ナトリウム、
ナトリウムアジド、エチレンジアミン四酢酸、尿素、Ｃ
ＨＡＰＳ、セチルピリジニウムクロリド、クロルプロマ
ジン、２−フェノキシエタノール、塩化コバルト、ウア
ベイン、デオキシコール酸ナトリウム、塩化ベンザルコ
ニウム、シクロセリン、ｐ−アミノサリチル酸、レバミ
ソール、または金属イオン、たとえばＭｇ、Ｃａ、Ｚ
ｎ、Ｃｕ、Ｃｏ、ＡｕもしくはＨｇ。あるいはそれらに
はこれらの作用物質の組合わせまたは混合物も含まれ
る。好ましくは作用物質には約０．５−約２．０％の濃
度のドデシル硫酸ナトリウムが含まれる。他の好ましい
作用物質には約１−約１００ｍＭの濃度のエチレンジア
ミン四酢酸が含まれる。さらに好ましい作用物質には約
０．０１−約２％の濃度の塩化ベンザルコニウムが含ま
れる。他の好ましい作用物質混合物には、約０．０１−
約２％の濃度の塩化ベンザルコニウムおよび約１−約１
００ｍＭの濃度のエチレンジアミン四酢酸が含まれる。

【００３０】特に好ましい基質および作用物質の組合わ
せは下記のものである：４ＭＵ−α−Ｄ−ガラクトシド
０．１％塩化ベンザルコニウムおよび３０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ ４ＭＵ−α−Ｄ−グルコシド０．１％塩化ベンザルコニ
ウムおよび３０ｍＭ ＥＤＴＡ ４ＭＵ−β−Ｄ−グルクロニド０．１％塩化ベンザルコ
ニウムおよび３０ｍＭ ＥＤＴＡ ４ＭＵ−β−ガラクトシド１．２５％ドデシル硫酸ナト
リウム １．０％塩化ベンザルコニウム ０．７５％塩化ベンザルコニウム ０．１ｍＭクロロ金酸 ０．１％塩化ベンザルコニウムおよび３０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ ４ＭＵ−β−Ｄ−グルコシド３０ｍＭ ＥＤＴＡ ４ＭＵ−ホスフェート１０ｍＭ ＥＤＴＡ ５ｍＭ ＥＤＴＡ １０ｍＭ ＺｎＣｌ₂ ４ＭＵ−ノナノエート０．１％塩化ベンザルコニウム ４ＭＵ−パルミテート１％ドデシル硫酸ナトリウム ４ＭＵ−ステアレート１％ドデシル硫酸ナトリウム Ｌ−アルギニン−ＡＭＣ０．１％塩化ベンザルコニウム Ｌ−アラニン−ＡＭＣ０．７５％塩化ベンザルコニウム ２ｍＭ ＣｏＣｌ₂ ベスタチン（０．２ｍｇ／ｍｌ） ０．３３ｍＭクロロ金酸 ２．５ｍＭ塩化亜鉛 １０ｍＭ ＥＤＴＡ 多くの場合、未同定微生物が発現する酵素は接種物中に
最初から存在する。従って、これらの未同定微生物につ
いて作用物質の存在下および不在下双方における酵素開
裂速度を測定するための本発明方法は極めて迅速であ
り、未同定微生物が３０分以内に同定される。

【００３１】本発明をより良く理解するために、表およ
び添付の図面と関連付けた下記の記載および例が参照さ
れる。本発明の範囲は特許請求の範囲に記載される。

【００３２】発明の詳細な記述 本発明に従って酵素活性をアッセイするために蛍光原化
合物を使用する。これらの化合物は天然代謝産物の同族
体である。それらは一般に天然代謝産物に結合した蛍光
部分を含む。この蛍光部分は酵素開裂により離脱する。
この遊離部分の蛍光は結合部分の蛍光よりはるかに強
い。従ってこれらの化合物を酵素活性に適した生理学的
条件下で問題の試料と混和し、蛍光増大速度を監視する
ことにより、酵素活性をアッセイすることができる。

【００３３】本発明に有用な蛍光原開裂物質の例は下記
のものである：７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン
（β−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）とも呼ばれ
る）；７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）；β
−ナフチルアミン；フルオレセイン；レゾルフィン；ヒ
ドロキシピレン−トリスルホネート。あるいは、または
蛍光原開裂基質と組合わせて、他の指示用開裂基質も本
発明に使用しうる。これらには色原、放射測定用および
蛍光測定用基質が含まれるが、これらに限定されない。

【００３４】酵素機構の研究に際して多くの化合物を酵
素反応速度の抑制または増大に用いることができる。こ
れらの化合物は主として酵素の分子生物学およびその周
辺を調べるための道具として用いられている。これらの
化合物には界面活性剤、キレート化剤、金属イオン系補
助因子、抗生物質、水素イオン濃度調整剤および緩衝
剤、ならびに、より特異的に酵素活性を抑制または増大
する作用を有する物質（作用物質）、例えば、競合阻害
物質が含まれる。

【００３５】蛍光原基質を、酵素開裂に作用する物質
（作用物質）と組み合わせ、該作用物質の存在下での基
質の酵素加水分解速度を利用し、これらの速度を作用物
質不在下にて得られた情報と組み合わせて適宜なアルゴ
リズムによって操作し、得られた情報を微生物の種判定
の補助として用いることができる。例えば、特定の蛍光
原基質が２種の細菌と同程度に良好に反応するが、この
化合物は一方の細菌について他より強い効果を酵素開裂
速度に及ぼすという可能性がある。このような効果の例
は後記の例に見られる。

【００３６】細菌および他の微生物をそれらの酵素によ
る蛍光原基質の加水分解によって迅速に同定するために
蛍光および速度を増強させるための装置、ならびにその
装置を使用する方法は米国特許出願第２０９，６７７号
明細書（サスマンら、１９８８年６月２０日出願）に記
載されている。この出願は本発明と同一の出願人に譲渡
されている。サスマンらの明細書には、少なくとも１種
類の速度および蛍光増強用支持体がその上または内部に
付与されたキャリヤーが記載されている。乾燥した蛍光
原基質をまず適切な溶剤に溶解し、次いでこの溶液を支
持体上に沈着させることにより、蛍光原基質を蛍光増強
用支持体に付着させる。溶剤は乾燥または真空乾燥によ
り除去される。生物検体に由来する微生物は、蛍光原基
質、蛍光体または両者を用いて、流体試料を複数の速度
および蛍光増強用支持体の１または２以上に添加するこ
とにより同定される。

【００３７】各支持体は下記の蛍光体のいずれかを放出
しうる蛍光原基質を含む：特に７−ヒドロキシ−４−メ
チルクマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン、β−
ナフチルアミン、フルオレセインおよびレゾルフィン。
試料中に存在する酵素が基質を加水分解する。基質が蛍
光原である場合、加水分解速度は蛍光の増大を測定する
ことにより判定される。基質が蛍光原でない場合、速度
および蛍光増強用支持体には酵素基質、および加水分解
生成物の存在下で増強または消光する乾燥状態の遊離蛍
光体を沈着させる。この方法で特定の基質を加水分解す
る酵素の存在が検出され、所望により試料中の１種類ま
たは２種類以上の酵素の反応速度プロフィルが作成され
る。次いでこの酵素反応速度プロフィルを分析し、未知
微生物を同定するために既知微生物の基準酵素反応速度
プロフィルと比較する。しかし菌株の変異および菌種の
類似性のため、多くの微生物菌種が米国特許出願第２０
９，６７７号明細書に記載の装置および方法によっては
十分に同定されない。

【００３８】本発明の好ましい形態においては、米国特
許第２０９，６７７号明細書に記載の装置を使用する
が、その方法は酵素活性に作用する物質の存在下でアッ
セイを行うことにより改良される。後記の例に示すよう
に、これらの酵素活性に作用する物質は種々の菌株につ
いて、より明確な同定をもたらす。従って、本発明の好
ましい形態においては、酵素活性を測定するために蛍光
原基質を用いる。

【００３９】用いられる作用物質の例には下記のものが
含まれるが、これらに限定されない：ドデシル硫酸ナト
リウム（ＳＤＳ）；フッ化ナトリウム、塩化ナトリウ
ム、ナトリウムアジド、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤ
ＴＡ）；尿素；（３−［３−コラミドプロピル）−ジメ
チルアミニオ］−１−プロパンスルホネート）（ＣＨＡ
ＰＳ）；セチルピリジニウムクロリド；クロルプロマジ
ン；２−フェノキシエタノール；塩化コバルト；ウアベ
イン；デオキシコール酸ナトリウム；塩化ベンザルコニ
ウム；シクロセリン；ｐ−アミノサリチル酸；レバミソ
ール；ならびに金属イオン、たとえばＭｇ、Ｃａ、Ｚ
ｎ、Ｃｕ、Ｃｏ、ＡｕおよびＨｇ。これらの化合物の望
ましい濃度は１ｕＭから１００ｍＭの範囲、または好ま
しくは０．１−２％ｗ／ｖである。

【００４０】特に好ましい化合物は下記のものである：
ＳＤＳ ０．５−２．０％、好ましくは１．０％ｗ／ｖ
ＥＤＴＡ １−１００ｍＭ、好ましくは１０−３０ｍＭ
塩化ベンザルコニウム ０．０１−２％、好ましくは
０．１−０．７５％ｗ／ｖ塩化ベンザルコニウム／ＥＤ
ＴＡ混合物、０．０１−２％、好ましくは０．１−０．
７５％塩化ベンザルコニウム、および１−１００ｍＭ、
好ましくは１０−３０ｍＭ ＥＤＴＡ有用な基質および
作用物質の組合わせは下記のものである： ４ＭＵ−α−Ｄ−ガラクトシド−ＳＤＳまたは塩化ベン
ザルコニウム ４ＭＵ−ホスフェート−ＥＤＴＡ ４ＭＵ−パルミテート−ＳＤＳ ４ＭＵ−ステアレート−ＳＤＳ Ｌ−アラニン−ＡＭＣ−ＥＤＴＡまたは塩化ベンザルコ
ニウム 特に好ましい基質および作用物質の組合わせは下記のも
のである：４ＭＵ−α−Ｄ−ガラクトシド０．１％塩化
ベンザルコニウムおよび３０ｍＭ ＥＤＴＡ ４ＭＵ−α−Ｄ−グルコシド０．１％塩化ベンザルコニ
ウムおよび３０ｍＭ ＥＤＴＡ ４ＭＵ−β−Ｄ−グルクロニド０．１％塩化ベンザルコ
ニウムおよび３０ｍＭ ＥＤＴＡ ４ＭＵ−β−ガラクトシド１．２５％ドデシル硫酸ナト
リウム １．０％塩化ベンザルコニウム ０．７５％塩化ベンザルコニウム ０．１ｍＭクロロ金酸 ０．１％塩化ベンザルコニウムおよび３０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ ４ＭＵ−β−Ｄ−グルコシド３０ｍＭ ＥＤＴＡ ４ＭＵ−ホスフェート１０ｍＭ ＥＤＴＡ ５ｍＭ ＥＤＴＡ １０ｍＭ ＺｎＣｌ₂ ４ＭＵ−ノナノエート０．１％塩化ベンザルコニウム ４ＭＵ−パルミテート１％ドデシル硫酸ナトリウム ４ＭＵ−ステアレート１％ドデシル硫酸ナトリウム Ｌ−アルギニン−ＡＭＣ０．１％塩化ベンザルコニウム Ｌ−アラニン−ＡＭＣ０．７５％塩化ベンザルコニウム ２ｍＭ ＣｏＣｌ₂ ベスタチン（０．２ｍｇ／ｍｌ） ０．３３ｍＭクロロ金酸 ２．５ｍＭ塩化亜鉛 １０ｍＭ ＥＤＴＡ 特定の菌種の個々の菌株がしばしば特定の基質に集中す
る傾向のある速度を示すであろう。これに基づいてある
菌種を他から識別することができる。しかし、個々の菌
株が大幅に異なる速度をもつ場合、および多数の菌種の
速度がオーバーラップする場合もある。これらの場合、
基質のみについて得た速度を、化合物が添加された基質
について得た速度と、３種類の方法で比較する。

【００４１】第１に、各菌種の菌株が正常な速度より″
作用を受けた″速度に集中するか否かを判定するため
に、速度を直接に比較する。これによって１種類または
２種類以上の菌種の識別が可能であろう。

【００４２】第２に、抑制／増加率％を次式により計算
する：（（対照速度−″作用を受けた″速度）／対照速
度×１００％）この式は、″作用を受けた″速度が対照
速度の抑制を表す場合は正の値を示し、″作用を受け
た″速度が対照速度の増大を表す場合は負の値を示す。
しばしばこれらの結果は、加水分解速度のみで識別情報
が得られない場合に情報を与えることがある。ある化合
物は他の菌種に対して与える作用より何倍も大きな作用
をある菌種に与える場合がある。

【００４３】第３の比較法はアルゴリズムを用いるもの
であり、これについては参考例Ａに詳述されている。ア
ルゴリズムを用いる利点は、これによりノイズフィルタ
ーが得られることである（極めて大きな絶対値をもつ
が、有意ではない抑制／増加率％を与える、小さな対照
速度の変異について）。またアルゴリズム値は、同一出
願人による米国特許出願第２０９，６７７号明細書に記
載の速度データ分析用コンピュータープログラムに適し
た負でない値を与える。アルゴリズムを最適なものにす
るために、各種のパラメーターを調整することができ
る。アルゴリズムは化合物を添加した、または添加しな
い基質加水分解速度の双方を考慮し、これら２種類の加
水分解速度の比の関数を用いて、表示された中間値より
大きいか、それに等しいか、またはそれより小さい値を
与える。中間値より大きい値は作用物質による基質加水
分解速度の増大を表し、中間値より小さい値は作用物質
による基質加水分解速度の抑制を表し、中間値に等しい
値は有意の作用が無いことを表す。アルゴリズム値の対
数も使用しうる。

【００４４】下記の例は本発明の種々の形態をさらに説
明するためのものであり、特許請求の範囲に定められた
本発明の範囲を制限するものではない。

【００４５】実施例１ 種々の細菌のアラニンアミノペプチダーゼ加水分解速度
を下記の方法によりアッセイした。エタノールに溶解し
た６．２５ｕｇのＬ−アラニン−７−アミド−４−メチ
ル−クマリン（シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミ
ズーリ州６３１７８）を、プラスチック製支持体に付着
した直径６ｍＭの７４０Ｅペーパーディスク（シュライ
ヘル・アンド・シュル社、キーン、ニュウハンプシャー
州０３４３１）上にピペットで添加した。溶剤を蒸発に
より除去した。ディスクに２５ｕＬの１マクファーラン
ド微生物懸濁液を添加した。微生物懸濁液は、ｐＨ８．
０に調整された０．１Ｍトリス中に０．８５％ＮａＣ
ｌ、０．０２％トライトンＸ−１００を含有する希釈剤
中に調製された。蛍光をダイナテック・マイクロフルオ
ル読取り機（ダイナテック・ラボラトリーズ社、シャン
ティリー、バージニア州２２０２１）で定期的に監視し
た。１０分以内の蛍光の増大を減法により計算した。臨
床分離物から得た腸内細菌科４種の各３株につき相対的
酵素加水分解速度を測定した。アラニンアミノペプチダ
ーゼによる加水分解速度を図１にグラフで示す。図１
は、被験４菌種による相対的基質加水分解速度がオーバ
ーラップし、この加水分解速度情報によってはいずれの
菌種も互いに識別し得ないことを示す。

【００４６】上記と同様にして調製されたディスクに、
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（シグマ・ケミカ
ル社）を微生物懸濁液添加後に最終濃度４ｍＭ ＥＤＴ
Ａとなるように添加した。基質加水分解速度を測定し
た。これらの速度を、ＥＤＴＡ無しのアラニンアミノペ
プチダーゼ活性に関する対照値と比較した。ある菌種、
たとえば肺炎桿菌は中程度の酵素活性低下を示し、一方
エンテロバクター・クロアシエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔ
ｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）は増大を示した。加水分解速度
を増加率％として比較し、図２にプロットする（０％は
ＥＤＴＡ添加による作用が無いことである）図２は、エ
ンテロバクター・クロアシエの被験３菌株が５ｍＭ Ｅ
ＤＴＡの添加によって他の被験菌種のいずれの株の場合
よりはるかに高いアラニンアミノペプチダーゼ加水分解
速度増大を示すことを表す。従ってこの増加率の特色は
腸内細菌科のこれらの菌種を識別するために有用であ
る。

【００４７】実施例２ それぞれ２５マイクログラムの４−メチルウンベリフェ
リル−β−Ｄ−ガラクトシド（シグマ・ケミカル社）を
含む基質ディスクを実施例１の記載に従って調製した。
同様な１組のペーパーディスクにドデシル硫酸ナトリウ
ム（シグマ・ケミカル社）を１％の水準に添加した。実
施例１に記載の微生物懸濁液２５ｕＬで再構成した際、
最終濃度は０．８％ＳＤＳであった。

【００４８】図３は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテ
ロバクター・クロアシエ、肺炎桿菌およびシトロバクタ
ー・フロインディ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）の各３菌株
について１０分間にわたる蛍光の変化を示す。菌株間の
変異のため、これらの菌種のいずれもβ−ガラクトシダ
ーゼ加水分解速度により識別することができなかった。
しかし、これらの速度と４−ＭＵ−β−Ｄ−ガラクトシ
ドおよびＳＤＳの両方を含むディスクの加水分解速度と
の差を比較し、結果を増加率％として計算すると、図４
にプロットした結果により示されるように大腸菌を他の
被験３菌種から識別することができた。従ってＳＤＳが
β−ガラクトシダーゼ加水分解速度に及ぼす作用は加水
分解速度自体より識別性のものとなる。

【００４９】実施例３ 実施例１の場合と同様に、塩化ベンザルコニウム（シグ
マ・ケミカル社）を６．２５ｕｇのＬ−アラニン−７−
アミド−４−メチル−クマリン（ＬＡＬ）に添加して濃
度０．４％となした。塩化ベンザルコニウムを含む場
合、および含まない場合のＬＡＬ加水分解速度を図５に
おいて大腸菌、エンテロバクター・クロアシエ、エンテ
ロバクター・エロゲネス（Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、
肺炎桿菌、シトロバクター・フロインディ、プロテウス
・ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）およびモルガ
ネラ・モルガニ（Ｍ．ｍｏｒｇａｎｉｉ）の各２株につ
いて比較した。図５に示すように、プロテウスおよびモ
ルガネラの菌株を除いて、塩化ベンザルコニウムを含む
場合、および含まない場合の双方についてかなりのデー
タオーバーラップがある。図５は、エンテロバクター・
エロゲネスの被験２菌株が０．４％塩化ベンザルコニウ
ムの添加によって最大の加水分解速度増大を示すことを
も示す。従って塩化ベンザルコニウムの添加はエンテロ
バクター・エロゲネス菌種を他の腸内細菌属から識別す
るのに有用である。

【００５０】実施例４ ２５マイクログラムの４−メチルウンベリフェリル−β
−Ｄ−ガラクトシド（シグマ・ケミカル社、セントルイ
ス、ミズーリ州）を含む基質ディスクを上記各例の記載
に従って調製した。同様な１組のディスクに２０マイク
ロリットルの２％塩化ベンザルコニウム溶液を添加し
た。実施例１に記載の微生物懸濁液２５ｕＬで再構成し
た際、塩化ベンザルコニウムの最終濃度は１．６％であ
った。

【００５１】図６は、肺炎桿菌、エンテロバクター・エ
ロゲネス、エンテロバクター・クロアシエ、シトロバク
ター・フロインディおよび大腸菌の各３菌株について１
０分間にわたる蛍光の変化を示す。いずれの菌種もβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼ加水分解速度に基づいて識別する
ことは困難であろう。しかし、これらの速度が塩化ベン
ザルコニウムの存在下で増大する率を計算したのちに
は、図７に示すようにエンテロバクター・エロゲネスを
他の４菌種から識別することが可能となった。従って、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ加水分解速度増加率％は腸内
細菌科のこれら種々の菌種間の識別に有用である。

【００５２】実施例５ それぞれ２５マイクログラムの４−メチルウンベリフェ
リル−β−Ｄ−ガラクトシドを含む基質ディスクを上記
各例の記載に従って調製した。同様に調製された１組の
ディスクに２０マイクロリットルの１ｍＭクロロ金酸
（ＡｕＨＣｌ₄）を添加した。実施例１に記載の微生物
懸濁液２５マイクロリットルで再構成した際、クロロ金
酸の最終濃度は０．８ｍＭであった。

【００５３】図８は、大腸菌、エンテロバクター・クロ
アシエ、エンテロバクター・エロゲネス、シトロバクタ
ー・フロインディおよび肺炎桿菌の各３菌株について１
０分間にわたる蛍光の変化を示す。いずれの菌種もこれ
らの加水分解速度に基づいて識別することはできなかっ
た。しかし、これらの速度がクロロ金酸の存在下で抑制
される％を計算したのちには、図９に示すようにエンテ
ロバクター・エロゲネスの識別が可能となった。従っ
て、クロロ金酸による加水分解速度抑制率％は腸内細菌
科のこれら種々の菌種間の識別に有用である。

【００５４】実施例６ それぞれ６．２５マイクログラムのＬ−アラニン−７−
アミド−４−メチルクマリン（Ｌ−アラニン−ＡＭＣ）
を含むペーパーディスクを上記各例の記載に従って調製
した。塩化コバルトをさらに含む同様な１組を調製し
た。実施例１に記載の微生物懸濁液２５マイクロリット
ルの添加後に、塩化コバルトの最終濃度は０．８ｍＭで
あった。

【００５５】Ｌ−アラニン−ＡＭＣに関する蛍光の変化
を、大腸菌、エンテロバクター・クロアシエ、エンテロ
バクター・エロゲネス、シトロバクター・フロインデ
ィ、肺炎桿菌、モルガネラ・モルガニおよびプロテウス
・ミラビリスを含めた数種の微生物について１０分間に
わたって測定し、図１０に示す棒グラフにプロットし
た。図１０に示すように、いずれの菌種もこれらの加水
分解速度に基づいて識別することはできなかった。これ
らの加水分解速度を、Ｌ−アラニン−ＡＭＣに塩化コバ
ルトが添加された場合の加水分解速度と比較した。これ
らの速度は参考例Ａに記載されるアルゴリズムにより比
較された。このアルゴリズムはこれら２種類の速度の比
の関数を使用する。これらの比較の結果を図１１にプロ
ットする。これはアルゴリズムにより計算された値を示
す。大腸菌に関する値は一般に中間値ゼロの下側にある
が、他の大部分はそうでない。

【００５６】実施例７ それぞれ６．２５マイクログラムのＬ−アラニン−７−
アミド−４−メチルクマリン（Ｌ−アラニン−ＡＭＣ）
を含むペーパーディスクを上記各例の記載に従って調製
した。塩化コバルトをも含む同様な１組を調製した。実
施例１に記載の微生物懸濁液２５マイクロリットルの添
加後に、塩化コバルトの最終濃度は８ｍＭであった。

【００５７】Ｌ−アラニン−ＡＭＣに関する蛍光の変化
を、大腸菌、エンテロバクター・クロアシエ、エンテロ
バクター・エロゲネス、シトロバクター・フロインデ
ィ、肺炎桿菌、モルガネラ・モルガニおよびプロテウス
・ミラビリスを含めた数種の微生物について１０分間に
わたって測定し、図１２に示す棒グラフにプロットし
た。図１２に示す結果は、いずれの菌種もこれらの加水
分解速度のみに基づいて識別し得ないことを明らかに証
明する。しかし図１３に示すように、塩化コバルトが添
加された同一基質に関する加水分解速度は、プロテウス
・ミラビリスが他のすべての被験菌種から明白に識別さ
れることを示す。

【００５８】実施例８ 実施例１の記載に従って２０マイクロリットルの２０ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ溶液を添加し、蒸発により乾燥させること
によって、多数組（１組当たり２）のペーパーディスク
を調製した。次いで２０マイクロリットルの０．１％塩
化ベンザルコニウム溶液を各ディスクに添加し、蒸発に
より乾燥させた。次いでエタノール中１．２５ｍｇ／ｍ
ｌの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニ
ド（ＢＧＲ）（シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミ
ズーリ州）溶液２０マイクロリットルを両組のディス
ク、および塩化ベンザルコニウムまたはＥＤＴＡを含ま
ない、同様に調製された他の１組のディスクに添加し
た。良好なドラフトを備えた換気フード中でエタノール
を蒸発させた。両種類のディスクを微生物懸濁液２５ｕ
Ｌで再構成した際、最終濃度は１ｍｇ／ｍｌ ＢＧＲ；
または１ｍｇ／ｍｌ ＢＧＲ、０．０８％塩化ベンザル
コニウムおよび１６ｍＭ ＥＤＴＡであった。

【００５９】図１４は大腸菌の異なる８菌株の二重試験
に関して４−ＭＵ−β−Ｄ−グルクロニドの加水分解速
度（ナノグラム／分）を示す。大腸菌は通常の（増殖に
基づく）方法によればこの基質に対して９９％陽性であ
ると考えられている微生物である。これらの条件下では
大部分の菌株がほとんど酵素活性を示さないことに注目
されたい。図１５は大腸菌の上記と同じ菌株に関して、
塩化ベンザルコニウムおよびＥＤＴＡが上記濃度で存在
する場合の４−ＭＵ−β−Ｄ−グルクロニドの加水分解
速度を示す。８菌株すべてが塩化ベンザルコニウムおよ
びＥＤＴＡの存在下で酵素活性の増大を示す。

【００６０】実施例９ 実施例１の記載に従って、４−メチルウンベリフェリル
ホスフェート（１．２５ｍｇ／ｍｌ）を含む溶液２０マ
イクロリットル／ディスクをピペットにより添加し、真
空乾燥させることによって、ペーパーディスクを調製し
た。他の１組のペーパーディスクには、４−メチルウン
ベリフェリルホスフェート（１．２５ｍｇ／ｍｌ）およ
びエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、５ｍＭ）を含む
溶液２０マイクロリットル／ディスクをピペットにより
添加し、真空乾燥させた。実施例１に記載の微生物懸濁
液２５マイクロリットルを添加した際、ＥＤＴＡの最終
濃度は４ｍＭであった。

【００６１】２菌種、肺炎桿菌（ＫＰＮＥ）およびプロ
テウス・ミラビリス（ＰＭＩＲ）の各５株を二重試験し
た。加水分解速度の比の対数を、同一出願人による米国
特許出願第２０９，６７７号明細書の例７の記載に従っ
て求めた。これらの結果を図１６に棒グラフとして示
す。″Ｌ″および″Ｈ″はデータの分布に関してそれぞ
れ低い、および高いデータ点を表す。グラフは高いデー
タ点および低いデータ点を最小値および最大値（それぞ
れ最小および最大と表す）として用いて自動的に目盛ら
れる。″Ｍ″はその菌種に関するすべてのデータの平均
を表し、″Ｍ″の右側の″Ｓ″はプラス１標準偏差、″
Ｍ″の左側の″Ｓ″はマイナス１標準偏差を表す。

【００６２】図１６Ａは、４−ＭＵ−ホスフェート単独
について得た速度からは肺炎桿菌とプロテウス・ミラビ
リスを識別し得ないことを示す。図１６Ｂは、データが
より良く分離され、従って４−ＭＵ−ホスフェートを含
むディスク上にＥＤＴＡが存在すると肺炎桿菌の大部分
の菌株をプロテウス・ミラビリスの大部分の菌株から識
別しうることを明白に示す。図１６Ｃは、実施例６およ
び参考例Ａに記載されるように、１６Ａおよび１６Ｂに
示されたデータに関するアルゴリズム値の棒グラフを示
す。アルゴリズム値は肺炎桿菌とプロテウス・ミラビリ
ス間の１００％の識別を与える。従って４−ＭＵ−ホス
フェート単独とＥＤＴＡをも含むものについての速度を
比較すると、４−ＭＵ−ホスフェート、またはＥＤＴＡ
を含む４−ＭＵ−ホスフェートが別個に与えるより良好
な識別が得られる。

【００６３】実施例１０ 実施例１の記載に従って、４−メチルウンベリフェリル
パルミテート（１．２５ｍｇ／ｍｌ）および１．２５％
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む溶液２０マイ
クロリットル／ディスクをピペットにより添加し、同様
に真空乾燥させた。実施例１に記載の微生物懸濁液２５
マイクロリットルを添加した際、ＳＤＳの最終濃度は１
％であった。

【００６４】マイコバクテリウム・ゴルドネア（Ｍｙｃ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｏｒｄｏｎｅａｅ、ＭＧＯ
Ｒ）の１１株およびマイコバクテリウム・テレ（Ｍ．ｔ
ｅｒｒａｅ、ＭＴＥＲ）の１０株を試験した。加水分解
速度の比の対数を、同一出願人による米国特許出願第２
０９，６７７号明細書の例７の記載に従って求めた。こ
れらの結果を図１７に棒グラフとして示す。″Ｌ″およ
び″Ｈ″はこれらの菌種に関してそれぞれ低い、および
高いデータ点を表す。グラフは低いおよび高いデータ点
（それぞれ最小および最大と表す）につき自動的に目盛
られる。″Ｍ″はその菌種のすべてのデータに関する平
均を表し、″Ｓ″値はデータの分布を平均＋／−１標準
偏差として表す。

【００６５】マイコバクテリウム属のこれら２近縁種を
生化学的に識別するのは困難である。マイコバクテリウ
ム・テレの大部分の員子が４−メチルウンベリフェリル
パルミテートと酵素反応するが、マイコバクテリウム・
ゴルドネアの若干の員子も反応し、図１７Ａではデータ
のオーバーラップを生じる。図１７Ｂは、１％ＳＤＳを
添加した場合ＭＧＯＲの方がＭＴＥＲより酵素反応速度
増大が大きいことを示す。これらのデータをこの作用の
アルゴリズム表現により図１７Ｃに示す。

【００６６】さらに他の実験からＳＤＳは他のエステラ
ーゼ基質の速度に対する作用においても有用であること
が示された。エステラーゼ基質について他の作用物質も
使用しうる（たとえばＥＤＴＡ、塩化ベンザルコニウム
など）。

【００６７】以上、現在好ましいと考えられる本発明の
形態を述べたが、当業者は本発明の精神および範囲から
逸脱することなくさらに変更および修正を行うことがで
き、これらの変更および修正はすべて本発明に包含され
るものとする。

【００６８】参考例Ａ 下記のアルゴリズムは、基質のみの存在下で微生物によ
り行われる酵素加水分解速度を、酵素開裂を抑制もしく
は増大する作用物質の存在下での基質の酵素加水分解速
度と比較する。アルゴリズムはコンピューターにプログ
ラムし、速度データの比を下記により分析するために用
いることができる。 文字Ｒ＝上記作用物質の不在下での基質の酵素加水分解
速度（たとえば遊離蛍光体ナノグラム／分の単位） 文字Ｉ＝上記作用物質の存在下での基質の酵素加水分解
速度（たとえば遊離蛍光体ナノグラム／分の単位） 等しい条件下で速度ＲおよびＩを測定するための反復試
験の標準偏差の部分（Ｋ１と呼ぶ）は、計測器ベースラ
インのドリフト、増幅器のノイズなどの影響の結果であ
り、これらはすべて実際の結果とは無関係である。ほと
んどの場合、有意の測定値はそれらの標準偏差の追加成
分（Ｋ２と呼ぶ）を含み、それは個々の速度ＲまたはＩ
の平方根に比例する。従って関数Ｒ’およびＩ’は下記
のとおり予想標準偏差に対する個々の速度、それぞれＲ
またはＩの比と定義される： Ｒ’＝Ｘ／（Ｋ１＋Ｋ２×√Ｘ）； Ｉ’＝Ｙ／（Ｋ１＋Ｋ２×√Ｙ）。 下記の定数がアルゴリズム値を最適化するために選ば
れ、当業者により調整される。本発明のためには、下記
の定数が選ばれた： Ｋ１＝０．１０、 Ｋ２＝０．０４、 Ｗ１＝１．００、 Ｗ２＝１．００、および Ｗ３＝２０．０９。 Ｒ＞２×Ｋ１の場合、文字Ｘ＝Ｒであり、 Ｒ≦２×Ｋ１の場合、文字Ｘ＝２×Ｋ１。 また、Ｉ＞２×Ｋ１の場合、文字Ｙ＝Ｉであり、 Ｉ≦２×Ｋ１の場合、文字Ｙ＝２×Ｋ１である。 これらの条件は、極めて小さな酵素加水分解速度の差
（即ち、２×Ｋ１未満）がアルゴリズムの最終段階で有
意に見えるのを防ぐ。

【００６９】関数Ｆ１−Ｆ５は下記のとおり定義され
る： 文字Ｆ１＝┃Ｉ’−Ｒ’┃（Ｉ’−Ｒ’の絶対値を意味
する）であって、 その際、Ｆ１≧Ｗ１の場合、文字Ｆ２＝Ｆ１である。 Ｆ１≦または＝Ｗ１の場合、Ｆ２＝０である。 文字Ｆ３＝Ｆ２／（Ｆ２＋Ｗ２）、 Ｆ４＝Ｗ３×（１＋Ｆ３×（Ｙ−Ｘ）／Ｘ）、 Ｆ５＝Ｌｎ Ｆ４（ここで、Ｌｎは自然対数）である。 Ｆ１ないしＦ５により定義される値は下記の有意性をも
つ： Ｆ１：標準偏差に関して補正したのちの２種類の加水分
解速度間の差の大きさを調べる。それらの差が１以上で
ある場合、ＲからＩへの速度の変化は有意である。 Ｆ２：有意の速度差をアルゴリズムに導き、有意でない
速度差をふるい落とす。 Ｆ３：Ｆ２と同じ機能をもつが、有意差の値を有意でな
い値より大きくすることにより、有意差をより一層有意
にする。 Ｆ４：実際のアルゴリズムである。Ｆ４は対応する加水
分解速度の比（Ｙ−Ｘ）／Ｘの関数であることに留意さ
れたい。 Ｆ５：Ｆ４の自然対数（Ｌｎ）である。

【００７０】アルゴリズムの目的は、有意でない速度差
を中間値Ｗ３に集中させ、極めて高い加水分解速度間の
大きな差に対するフィルターとして作用することであ
る。

【００７１】表１はＲおよびＩに関して下記の仮定値を
与えたアルゴリズムを示す：

【００７２】

【００７３】

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１に記載したように、腸内細菌科の４菌
種：大腸菌、エンテロバクター・クロアシエ、肺炎桿菌
およびシトロバクター・フロインディに関して、アラニ
ンアミノペプチダーゼによる加水分解速度を示すグラフ
である。

【図２】実施例１に記載したように、図１に記載した細
菌に関して、５ｍＭ ＥＤＴＡの存在下におけるアラニ
ンアミノペプチダーゼによる加水分解速度の増加率％を
示すグラフである。

【図３】実施例２に記載したように、図１および２に記
載した腸内細菌科の４菌種の各３株に関して、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼによる加水分解速度を示すグラフであ
る。

【図４】実施例２に記載したように、図３に記載したも
のと同じ菌株に関して、１％ＳＤＳの存在下におけるβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼによる加水分解速度の増加率％
を示すグラフである。

【図５】実施例３に記載したように、下記の菌種：大腸
菌、エンテロバクター・クロアシエ、エンテロバクター
・エロゲネス、肺炎桿菌、シトロバクター・フロインデ
ィ、プロテウス・ミラビリスおよびモルガネラ・モルガ
ニの各２菌株に関して、塩化ベンザルコニウム（ＢＣ）
を含む場合および含まない場合双方のＬ−アラニン−７
−アミド−４−メチル−クマリン（ＬＡＬ）加水分解速
度を比較したグラフである。

【図６】実施例４に記載したように、下記の微生物：肺
炎桿菌、エンテロバクター・エロゲネス、エンテロバク
ター・クロアシエ、シトロバクター・フロインディおよ
び大腸菌の各３株に関して、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
による加水分解速度を示すグラフである。

【図７】実施例４に記載したように、図３に記載した微
生物に関して、１．６％塩化ベンザルコニウムの存在下
におけるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼによる加水分解速度
の増加率／抑制率％を示すグラフである。

【図８】実施例５に記載したように、図７および８に記
載したものと同じ微生物の各３株に関して、４−メチル
ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドの加水分解速
度を示すグラフである。

【図９】実施例５に記載したように、図８に記載したも
のと同じ微生物の各３菌株に関して、０．８ｍＭクロロ
金酸の存在下におけるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼによる
加水分解速度の増加率／抑制率％を示すグラフである。

【図１０】実施例６に記載したように、下記の微生物：
大腸菌、エンテロバクター・クロアシエ、エンテロバク
ター・エロゲネス、シトロバクター・フロインディ、肺
炎桿菌、モルガネラ・モルガニおよびプロテウス・ミラ
ビリスの各３菌株に関して二重に、Ｌ−アラニン−７−
アミド−４−メチル−クマリン（Ｌ−アラニン−ＡＭ
Ｃ）の酵素加水分解速度を示すグラフである。

【図１１】実施例６に記載したように、図１０に記載し
たものと同じ微生物に関して、０．８ｍＭ塩化コバルト
の存在下におけるＬ−アラニン−ＡＭＣの加水分解速度
を示すグラフである。

【図１２】実施例７に記載したように、図１０および１
１に記載したものと同じ微生物に関して、Ｌ−アラニン
−ＡＭＣの加水分解速度を示すグラフである。

【図１３】実施例７に記載したように、図１２に記載し
たものと同じ微生物の菌株に関して、８ｍＭ塩化亜鉛の
存在下におけるＬ−アラニン−ＡＭＣの加水分解速度の
増大／抑制を示すグラフである。

【図１４】実施例８に記載したように、大腸菌の８菌株
に関して、４ＭＵ−β−Ｄ−グルクロニドの加水分解速
度の増大／抑制を示すグラフである。

【図１５】実施例８に記載したように、大腸菌の８菌株
に関して、０．０８％塩化ベンザルコニウムおよび１６
ｍＭ ＥＤＴＡの存在下における４ＭＵ−β−Ｄ−グル
クロニドの加水分解速度の増大／抑制を示すグラフであ
る。

【図１６】ＡおよびＢは、実施例９に記載したようにそ
れぞれ４ＭＵ−ホスフェート、および５ｍＭ ＥＤＴＡ
を含む４ＭＵ−ホスフェートについて試験した数株の微
生物に関するデータ範囲を示す棒グラフであり；ＣはＡ
およびＢに示したデータ範囲のアルゴリズム値の棒グラ
フである。

【図１７】ＡおよびＢは、実施例１０に記載したように
それぞれ４ＭＵ−パルミテート、および１％ ＳＤＳを
含む４ＭＵ−パルミテートについて試験した数株の微生
物に関するデータ範囲を示す棒グラフであり；ＣはＡお
よびＢに示したデータ範囲のアルゴリズム値の棒グラフ
である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記よりなる未同定微生物の同定法： 未同定微生物が発現する少なくとも１種類の酵素による
   複数の基質の酵素開裂速度を、該酵素の活性を抑制もし
   くは増大する少なくとも１種類の作用物質の有効濃度存
   在下にて測定して、該作用物質の存在下における上記未
   同定微生物に特徴的な酵素開裂速度パターンを作成する
   が、その際、基質は蛍光原基質および色原基質よりなる
   群から選ばれ； 未同定微生物に特徴的な酵素開裂速度パターンを、該酵
   素の活性を抑制もしくは増大する少なくとも１種類の上
   記作用物質の有効濃度存在下で１または２以上の同定さ
   れた微生物群または亜群について得られた基質の酵素開
   裂速度パターンと比較し；そして、 既知の微生物群または亜群について得られた上記作用物
   質の有効濃度存在下における同一基質の酵素開裂速度パ
   ターンにもっとも密接に相関する特定の既知微生物群ま
   たは亜群に、上記未同定微生物が属するものと同定す
   る。
2. 【請求項２】 基質が蛍光原基質からなる、請求項１記
   載の方法。
3. 【請求項３】 下記よりなる未同定微生物の同定法： 未同定微生物が発現する少なくとも１種類の酵素による
   複数の基質の酵素開裂速度を、該酵素の活性を抑制もし
   くは増大する少なくとも１種類の作用物質の有効濃度存
   在下にて測定して、該作用物質の存在下における上記の
   未同定微生物に特徴的な酵素開裂速度パターンを作成す
   るが、その際、基質は蛍光原基質および色原基質よりな
   る群から選ばれ； １または２以上の上記の未同定微生物が発現する少なく
   とも１種類の酵素による上記基質の酵素開裂速度を、該
   酵素の活性を抑制もしくは増大する上記作用物質の有効
   濃度不在下にて測定して、該作用物質の有効濃度不在下
   における上記の未同定微生物に特徴的な酵素開裂速度パ
   ターンを作成し； 上記作用物質の有効濃度不在下における上記の未同定微
   生物に特徴的な酵素開裂速度パターンに対する、上記作
   用物質の存在下における上記の未同定微生物に特徴的な
   酵素開裂速度パターンの関数を１または２以上の同定さ
   れた微生物群または亜群について有効濃度の該作用物質
   の存在下で得られた上記基質の酵素開裂速度パターンの
   比率の関数と比較し；そして 酵素開裂速度パターンの関数が上記未知微生物について
   得られた酵素開裂速度パターンの関数に最も密接に相関
   する既知微生物群または亜群に、上記の未知微生物が属
   するものと同定する。
4. 【請求項４】 同定された微生物群または亜群について
   の酵素開裂速度パターンが、 １または２以上の同定された微生物群または亜群が発現
   する少なくとも１種類の酵素による上記基質の酵素開裂
   速度を、該酵素の活性を抑制もしくは増大する少なくと
   も１種類の上記作用物質の有効濃度存在下にて測定し
   て、該作用物質の存在下における上記の同定された微生
   物に特徴的な酵素開裂速度パターンを作成し；そして １または２以上の上記の同定された微生物が発現する少
   なくとも１種類の酵素による上記基質の酵素開裂速度
   を、該酵素の活性を抑制もしくは増大する上記作用物質
   の有効濃度不在下にて測定して、該作用物質の有効濃度
   不在下における上記の未同定微生物に特徴的な酵素開裂
   速度パターンを作成する； ことにより作成される、請求項３記載の未同定微生物の
   同定法。
5. 【請求項５】 基質が蛍光原基質からなる、請求項４記
   載の未同定微生物の同定法。