FI98831C - Mikro-organismien tunnistaminen mittaamalla entsymaattinen aktiivisuus entsyymiaktiivisuuteen vaikuttavien aineiden läsnäollessa - Google Patents

Description

98831

Mikro-organismien tunnistaminen mittaamalla entsymaattinen aktiivisuus entsyymiaktiivisuuteen vaikuttavien aineiden läsnäollessa - Identifiering av mikroorganismer genom mätning av enzymatisk aktivitet i närvaro av ämnen som 5 päverkar enzymaktiviteten Tämä keksintö koskee menetelmää, jolla tunnistetaan mikro-organismit mittaamalla substraattien entsymaattisen hydro-lyysin nopeudet entsyymiaktiivisuuteen vaikuttavien ainei-10 den läsnäollessa ja vertaamalla näitä nopeuksia entsyymiak-tiivisuusprofiiliin erilaisilla tunnistetuilla mikro-organismeilla .

Mikro-organismien, jotka on eristetty kliinisistä tai 15 laboratorioalustoista, nopea tunnistaminen on tärkeä päämäärä. Useimmat laboratoriot tunnistavat mikro-organismit kliinisistä eristyksistä käyttämällä kaupallisia bakteerien tunnistamissysteemejä, jotka vaativat 18-24 h tai pidempään organismin eristyksen jälkeen tunnistamisen aikaansaamisek-20 si. Jotkut nykyiset "nopeat" systeemit kestävät 3-13 h. Y-. , leensä nämä systeemit ovat riippuvaisia sokerin tai amino- ; hapon metabolismin happamista tai emäksisistä sivutuotteis- '· ta, joita tuotetaan organismin kasvujakson seurauksena. U- : ' seat näistä "kasvuun-perustuvista" kaupallisista bakteeri- ' 25 en tunnistamissysteemeistä käyttävät selektoituja inhibiit- toreita, jolloin saadaan hyödyllistä informaatiota baktee-rien la jittelemiseksi .

Merkittävin näistä kaupallisista "kasvuun perustuvista" 30 systeemeistä on AUTOBAC IDX, Organon Teknikan valmistama, • · ·

Durham, N.C. Tätä systeemiä on käytetty gram-negatiivisten basillien tunnistamiseen, katso Sielaff et ai., "Novel • · · ·...* Approach to Bacterial Identification That Uses the Autobac ....: System", Journal of Clinical Microbiology, 15, nr. 6, 1103- 35 1110 (1982). Kasvua inhiboivat profiilit luodaan käyttämäl lä 18 tunnusmerkillistä kemiallista inhibiittoriainetta, jotka on laitettu mikrobin kasvualustaan, kasvua mitattu 2 - 98831 nesteen sameudella AUTOBAC IDX-instrumentilla. AUTOBAC IDX:n mukana annettu kirjallisuus ilmoittaa, että "profiilit analysoidaan kaksi-vaiheisella kvadraattisella erotusa-nalyysillä tunnistamiseen päätymiseksi". Inhibiittorit 5 koostuvat väreistä, raskasmetalli-ioneista, antibiooteista ja bakteerimetabolian inhibiittoreista. Testi vaatii 3 h inkubaation, minä aikana yleensä tuotetaan useita bakteeri-jakautumisia. Kasvua inhiboiduissa kaivoissa verrataan kasvuun kaivossa, jossa on kasvualustaa mutta ei kasvuinhi-10 biittoreita.

Bakteerin kasvu riippuu monista olosuhteista: oikeat pH- ja lämpötila-alueet, riittävä ravinnonsaanti energian saamiseksi ja peräkkäisiä entsyymistä riippuvaisia tapahtumia 15 soluproteiinien, nukleiinihappojen ja muiden solun kasvulle ja jakautumiselle tarpeellisten ainesosien rakentamiseksi. AUTOBAC IDX-testissä käytetyt inhibiittorit voivat sekaantua kasvuun missä tahansa näissä avainkohdissa.

20 Muut kasvuun perustuvat bakteerien tunnistamissyteemit käyttävät selektiivisiä kasvuinhibiittoreita, mutta eivät niin vallitsevasti kuin AUTOBAC IDX. Vitekin AUTOMICROBIC SYSTEM, jonka on valmistanut Vitek Systems, St. Louis, Mo, käyttää Irgasania (DP300) yhdessä kasvualustan ja metaboli-25 sen aktiivisuuden indikaattorin kanssa; katso Isenberg et ai., "Collaborative Investigation of the AutoMicrobic • ·

System Enterobacteriaceae Biochemical Card", Journal of Clinical Microbiology, 11, nr. 6, 694-702 (1980).

• · « « - 30 Cetrimidiä, toinen kasvuinhibiittori, käytetään SCEPTOR- • « * ♦ · · *·* ’ tunnistussysteemissä (Becton Dickinson, Towsen, MD) selek- ··· tiivisenä inhibiittorina erottamaan P. aeruginosa, joka ei • · · · inhiboidu, ja muut Pseudomonas-lajit, jotka inhiboituvat.

35 Kaikki nämä kasvuun perustuvat tunnistussysteemit kärsivät ‘ ' samasta rajoituksesta, niistä saadaan hitaasti tuloksia.

Jopa niin kutsutut "nopeat" tunnistussysteemit kestävät 3- 98831 3 13 h niiden tulosten saamiseksi. Syy, miksi näiden systeemien nopeus on rajoitettu, on että kaikki sellaiset systeemit vaativat ainakin yhden tai usein useita mikro-organismien kasvun ja replikaation kierroksia.

5

Monissa mikrobiluokissa löydetään entsyymejä, jotka ovat yhteisiä useille tai kaikille tuon luokan jäsenille. Luokka kuvataan miksi tahansa toiminnallisesti hyödylliseksi mikro-organismien ryhmittymäksi. Esimerkiksi kaksi toiminnalle) lisesti hyödyllistä ryhmittymää, jotka kuvaavat mikro-organismien erillisiä luokkia, ovat ei-laktoosia fermentoi-vat bakteerit vs. laktoosia fermentoivat bakteerit. Muita toiminnallisesti hyödyllisiä ryhmittymiä ovat indoli-posi-tiiviset vs. indoli-negatiiviset bakteerit. Toinen ryhmit-15 tymä, joka kuvaa mikro-organismien luokkia, ovat oksidaasi-positiiviset vs. oksidaasi-negatiiviset bakteerit. Sen mukaisesti erityinen mikro-organismi voi olla yhden tai u-seamman mikrobiluokan jäsen. Esimerkkejä entsyymeistä, joita Enterobacteriaceae-suvun jäsenet ilmentävät, ovat 20 alaniiniaminopeptidaasi, alkaalinen fosfataasi ja β-galak-tosidaasi. Esteraasientsyymejä löydetään monista bakteereista, jotka on eristetty tyypillisinä ihmisen patogeeneinä. Näille yleisille entsyymisysteemeille on kehitetty erilaisia määrityksiä, joissa käytetään erilaisia substraat-25 teja ja indikaattorisysteemeitä. Näiden entsyymien hyvin kaikkialla läsnä oleva luonne rajoittaa ensisijaisten mää- • · ritysten käyttöä erottamaan lajeja, jotka muodostavat monia • · · mikrobiluokkia.

ψ «4 li 30 Bascomb kuvaa U.S. patentissa nr. 4503108 erästä menetel- • · · *·' ‘ mää, jolla tunnistetaan erityinen bakteerilaji käyttämällä ··· substraattien entsymaattista pilkkomista. Bascomb-patentti

MM

kuvaa pakkauksen, jossa on testit 25 konstitutiiviselle , entsyymille. Jokaisessa testissä entsyymi määritetään sen 35 kyvystä olla vuorovaikutuksessa spesifisen substraatin kanssa. Testikortistossa tai muussa laitteessa on joukko kaivoja tai lokeroja, joissa on erikseen spesifisiä subst- - 98831 4 raattiliuoksia jokaiselle entsyymitestille yhdessä muiden testireagenssien kanssa. Jokaiseen lokeroon lisätään bak-teerisuspensiota ja todettavissa oleva tuote kehittyy suhteellisen lyhyen inkubaatiojakson kuluttua. Jokaisessa 5 näytteessä oleva vastaava entsyymimäärä määritetään spekt-rometrisellä analyysillä käyttämällä joko kolorimetriä tai fluorimetriä. Eräässä toisessa tässä patentissa kuvatussa menetelmässä käytetään 7 testiä yleisesti tavattujen bak-teeriryhmien nopeaan erottelemiseen. Bascomb esittää, että 10 joko 26 testimääritys tai 7 testimääritys antaa ainutlaatuisen sormenjäljen lajille tai lajin ryhmälle. Entsyymiaktiivisuuden kvantitatiivista määritystä jokaiselle lajin ryhmälle voidaan käyttää tunnistamaan ryhmä tai laji vertaamalla aikaisemmin tunnistettujen bakteerien aktiivisuus-15 profiileihin. Nimenomainen kuvattu testi määrittää aktiivisuuden ilmaisemalla absorbanssin virtauskammiossa. Erillistä näyteanalyysiä ja jatkuvaa virtausanalyysiä voidaan käyttää. Bascombin menetelmä vaatii kuitenkin suuren biomassan ja suuren nestetilavuuden, samoin kuin suhteellisen 20 pitkän inkubaatioajan.

Fluorogeenisiä substraatteja on myös käytetty määrittämään entsyymiaktiivisuutta. Nämä yhdisteet ovat luonnossa esiintyvien metaboliittien analogeja. Niissä on tyypillisesti 25 fluoresoiva osa sidottuna luonnon metaboliittiin. Substraattien entsymaattinen pilkkominen vapauttaa fluoresoivan osan. Vapaan osan fluoresenssi on paljon suurempi kuin si- • · ... dotun osan fluoresenssi. Fluorogeenisiä yhdisteitä voidaan • · « *·* * täten käyttää määrittämään entsyymiaktiivisuutta yhdistä- 30 mällä ne kyseessä olevan näytteen kanssa entsyymiaktiivi- * * suudelle sopivissa fysiologisissa olosuhteissa ja tarkaste- • · · ·.· · lemalla fluoresenssin kasvua.

« • « » .··. Tutkijat ovat käyttäneet myös fluorogeenisiä substraatteja 35 tunnistamaan mikro-organismeja. Westley et ai. keskusteli- • vat "Aminopeptidase Profiles of Various Bacteria", Appi.

' ' Micro., 15, 822-825, (1967), alfa-aminohappo-p-naftyyliami- ! li 98831 5 disubstraattien käytöstä tunnistamaan 24 bakteerikantaa. Bakteerit suspendoitiin liuokseen ja inkuboitiin substraat-tiliuosten kanssa. Vapautuneen β-naftyyliamiinin fluoresenssi mitattiin 4 h inkubaation jälkeen. Toisessa julkai-5 sussa Peterson et ai., "Rapid Detection of Selected Gramnegative bacteria by amino-peptidase profiles"; J. Food Sci., 43 1853-1856 (1978) kuvasivat fluorometrisen analyysin käytön mittaamaan 19 L-aminohappo-3~naftyyliamidin ent-syymihydrolyysin. Jokaisen viljelmän profiili saatiin 4-6 10 h:ssa.

Katsaus kirjallisuudesta, joka kuuluu fluorogeenisten substraattien käyttöön kuvaamaan mikrobien entsyymiaktiivisuutta, on Godsey et ai. artikkelissa, "Rapid Identificati-15 on of Enterobacteriaceae With Microbial Enzyme Activity profiles", J. Clin. Micro., 13, 433-490 (1981). Godsey-ryhmä ilmoitti 18 fluorogeenisen substraatin käytöstä tutkittaessa 539 Enterobacteriaceae-luokan kantaa. Hydro-lyysinopeudet rekisteröitiin ensimmäisille 30 minuutille 2 20 ml:ssa puskuria sisältävässä substraateissa 37'C:ssa. Kaikki substraatit, paitsi urea, olivat β-metyyliumbelliferonin, β-naftyyliamiinin tai 7-amino-4-metyylikumariinin johdannaisia.

25 Kumara et ai. U.S. patentissa nr. 4591554 kuvataan fluore-senssianalyysi, jossa käytetään umbelliferonijohdannaisia, menetelmänä havaita ja määrittää pienten mikro-organismi- • · ... määrien määrä. Tässä menetelmässä umbellif eroni-johdannai- • · ·

• I I

nen lisättiin näyteliuokseen ja sitten inkuboitiin. Sen 30 jälkeen poistettiin liukenemattomat jäännökset (esim. so- • · · · lut) ja fluoresenssi luetaan käyttämällä tavanomaista de- • · · « · t *.1 1 tektoria. Fluoresenssi tasoa saatetaan sitten suhteisiin ··· mikro-organismien lukumäärän kanssa. Joissakin esimerkeissä käytetään co-entsyymejä. Muissa esimerkeissä solut hajote-• ^ 35 taan vapautuneiden entsyymien määrän lisäämiseksi.

1 Fluorogeenisten substraattien tiedetään olevan myös hyödyl- 98831 6 lisiä määritettäessä ekstrasellulaarisia entsyymejä, joita on elävissä organismeissa. Snyder et ai., "Pattern Recognition Analysis of In-Vivo Enzyme-Substrate Fluorescence Velocities In Micro-organism Detection and Identification", 5 App & Environ. Micro., 51, 969-997 (1986) ilmoittivat reak-tioajoista, jotka olivat 15 min tai vähemmän. Snyrein ryhmän työ muodostaa myös perustan kansainväliselle patenttihakemukselle, jonka otsake on "Viable Microorganism detection by Induced Fluorescence" Cincinnatin yliopiston olles-10 sa hakija, kansainv. julk. nr. WO 86/05206, päivätty 12. syyskuuta 1986.

Eräs toinen menetelmä, jota käytetään tekemään sormenjälkiä bakteereista, perustuu erilaisuuteen entsyymisisällössä ja 15 aktiivisuudessa, kuten Chu-Pong Pal et ai. ovat kuvanneet, "A rapid Enzymatic Procedure for ’Fingerprinting' bacteria by using pattern recognition of 2-dimensior.al fluorescence data", Clin. Chem. , 32, 987-991 (1986). Tässä systeemissä käytettiin 6 fluorogeenisen substraatin seosta, joista jo-20 kaisella oli erilainen fluoresoiva sisältö. Fluoresenssi-kasvuja tarkaillaan yli 30 min jakson ajan. Fourierin fluoresenssin tiedon muuttamista käytetään tuottamaan kak-si-dimensionaalinen järjestelmä, joka on luonteenomainen jokaiselle testi-organismille.

25

Edberg et ai., "Measurement of Active Constitutive β-D- ....: Glukosidase (Esculinase) in the Presence of Sodium Deoxy- • · .·;·. cholate", Journal of Clinical Microbiology, Voi. 21, nr. 3, • · « 363-365 (1985) esittää menetelmän, jolla erotellaan Strep-30 tococcus-suvun lajeja mittaamalla entsyymiä β-D-glukosidaa-si (eskulinaasi) entsyymin repression tapahtuessa sappiek- • ♦ ♦ • · · *.‘ * vivalentin toimesta (natriumdeoksikolaatti) . Menetelmä o- ··· soittaa β-D-glukosidaasin p-nitrofenyyli^-D-glukopyrano- sidaasin, kolorimetrinen substraatti, hydrolyysillä. Jos • _ 35 substraatti hydrolysoidaan, niin p-nitrofenyyli, keltainen osa, vapautetaan värittömästä emoyhdisteestä ja se voidaan ’ * osoittaa keltaisen värin läsnäololla näytteessä. Natriumde-

II

7 - 98831 oksikolaatin läsnäollessa useimmat Streptococci-lajit, muut kuin ryhmä D, inhiboituvat vapauttamasta β-D-glukosidaasia (eskulinaasi). Säppi-herkkä Streptococcus pneumoniae voidaan tunnistaa tällä systeemillä 30 minuutissa, koska nat-5 riumdeoksikolaatti indusoi sen autolyyttisesti.

Panosian ja Edberg raportoivat parantuneesta Edberg et ai. menetelmästä, "Rapid Identification of Streptococcus bovis by Using Combination Constitutive Enzyme Substrate Hydroly-10 ses", Journal of Clinical Microbiology, V. 27 nr. 8, 1719-1722 (elokuu 1989). Tässä menetelmässä käytetään reagenssi-ä, jossa on 2 hydrolysoitavaa substraattia p-nitrofenyyli-α-D-galaktopyranosidi (PGAL) ja 4-metyyliumbilliferyyli-β-D-glukosidi (MGLU) natriumdeoksikolaatin läsnäollessa. Tä-15 män testin etu on, että se sallii 2 konstitutiivisen entsyymin samanaikaisen osoittamisen, α-galaktosidaasin ja β-glukosidaasin 30 minuutin testissä. Tämä testi voi tunnistaa boviksen ja erottaa Enterococcus-lajit, viri- dans-ryhmän streptokokin, S.^ equinuksen ja Streptococcus 20 pneumoniaen. PGAL:n hydrolyysi osoitetaan keltaisen värin tuotolla ja MGLU:n hydrolyysillä, joka on fluorogeeninen substraatti, ja määritetään asettamalla putki kädellä pidettävään 4 W:n 366 nm:n UV-valoon. Neljä tulesta PGAL-' ; : MGLU sekoitetusta substraattihydrolyysistestistä on mahdol- : 25 lista, keltainen ja fluoresoiva, väritön ja fluoresoiva, ·;·; keltainen ja ei-f luoresoiva ja väritön ja ei-f luoresoiva.

Vaikka nämä testit sallivat erilaisten Streptococcus-lajien • · · nopean erottelun, testi on hyvin rajoitettu, sillä se mit-30 taa vain kahta konstitutiivistä entsyymiä. Lisäksi testistä « ·«« saadaan vain positiivinen tai negatiivinen tulos substraat- • · · *·* tien hydrolyysille. Hydrolyysin asteille tai nopeuksille ei ··· ole mitään mittauksia, joka sallisi läheistä sukua olevien bakteeriluokkien, jotka tuottavat samaa tai samanlaisia • . 35 entsyymejä eri nopeuksilla, erottelun.

Keksintöä, jolla lisätään fluoresenssiä ja kinetiikkaa . 98831 8 bakteerien ja muiden organismien nopeaksi tunnistamiseksi niiden fluorogeenisten substraattien entsymaattisesta hydrolyysistä ja menetelmiä, joissa käytetään keksintöä, kuvataan U.S. patenttihakemuksessa sarjanr. 209677, Sussman 5 et ai., jätetty 20. kesäkuuta, 1988. Hakemus on siirretty samalle siirron saajalle kuin tämä keksintö. Sussman et ai. patenttihakemus kuvaa kantajan, jolla on ainakin yksi kinetiikkaa ja fluoresenssiä lisäävä kannattaja kiinnitettynä sen päälle tai sisään. Kuivunut fluorogeeninen substraatti 10 liuotetaan fluoresenssiä lisäävään kantajaan ensin liuottamalla se sopivaan liuottimeen ja sitten antamalla liuoksen laskeutua kannattajaan. Liuotin poistetaan kuivaamalla tai tyhjöeksikaattorissa. Mikro-organismit, jotka saadaan biologisista näytteistä, tunnistetaan käyttämällä fluorogee-15 nisiä substraatteja, vapaata fluoria tai molempia, lisäämällä nestenäyte yhteen tai useampaan moninaisista kinetiikoista ja fluoresenssia lisäävistä kannattajista.

Jokaisessa kannattajassa on yksi seuraavista fluorogeeni- 20 sistä substraateista tai fluoreista: β-umbelliferoni, 7- amino-4-metyylikumariini, β-naftyyliamiini, fluoreskeiini ja resorufiini, muiden muassa. Näytteessä läsnäolevat entsyymit hydrolysoivat substraatit. Jos substraatit ovat : fluorogeenisiä, määritetään hydrolyysinopeudet mittaamalla 25 fluoresoivan tuotteen tuottamisnopeudet. Jos substraatti on ( i ei-fluorogeeninen, kinettiikkaa ja fluoresenssiä lisäävä • · . kannattaja on antanut laskeutua sen päälle entsyymisubst- • · ... raatin ja kuivan vapaan fluorin, joka lisääntyy tai tukah- i · r tuu hydrolyysituotteen läsnäollessa. Tällä tavalla entsyy- 30 min läsnäolo, joka hydrolysoi tiettyä substraattia, havai- ** ’ taan, ja jos toivottua, saadaan aikaan yhden tai useamman • « * : entsyymin reaktionopeusprofiili näytteessä. Entsyymin reaktionopeusprof iili analysoidaan sitten ja verrataan ·.· tunnettujen mikro-organismien referenssientsyymin reaktio- 35 nopeusprofiilin kanssa, jotta tunnistettaisiin tuntematon ’·"· mikro-organismi. Johtuen kantamuuntelusta ei monia mikro- '·' : organismilajeja voida kuitenkaan tunnistaa tarpeeksi käyt- I; 9 - 98831 tämällä patenttihakemuksen sarjanr. 209677 keksintöä ja menetelmää.

Tutkittaessa entsyymimekanismeja voidaan käyttää useita 5 yhdisteitä inhiboimaan tai lisäämään entsyymireaktioiden nopeuksia. Näitä yhdisteitä on pääasiallisesti käytetty välineinä koettamaan entsyymien molekyylibiologiaa ja niiden ympäristöä. Näihin yhdisteisiin kuuluu detergenttejä, kelatoivia aineita, metalli-ionikofaktoreita, antibioot-10 teja, vetyionikonsentraatio- ja puskurointiaineita ja tarkemmin entsyymiaktiivisuuden affektoreita, kuten kompeti-tiiviset inhibiittorit.

Siispä tämän keksinnön tarkoitus on antaa menetelmä mikro-15 organismien nopeaan ja tarkkaan tunnistukseen.

Tämän keksinnön vielä eräs tarkoitus on käyttää edullisesti yhdisteiden, jotka vaikuttavat mikro-organismien entsyymiaktiivisuuksiin, ominaisuuksia, jotta saadaan ääret-20 tömän nopea ja tarkka tunnistamissysteemi.

Nämä ja muut päämäärät saavutetaan tällä keksinnöllä, joka tarjoaa menetelmän tunnistamattomien mikro-organis-mien nopeaan tunnistamiseen. Keksinnön oleelliset tunnus-' 25 merkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksisa. Tämän menetelmän mukaan lukuisien substraattien entsymaattisen pilkkomisen nopeudet määritetään ainakin yhden entsyymi- * * pilkkomiseen vaikuttavan aineen, jota kutsutaan "affekto- • ·· V · riksi", tehokkaan konsentraation läsnäollessa. Nämä sub- 30 straatit valitaan fluorogeenisistä ja kromogeenisistä sub-straateista, jotta luodaan entsymaattisten pilkkomisno-;*·*: peuksien luonteenomainen malli entsyymeille, joita tunnis- .* . tamattomat mikro-organismit ilmentävät. Entsymaattisten / pilkkomisnopeuksien luonteenomainen malli on tunnistamat- 35 toman mikro-organismin "sormenjälki", kun affektori on läsnä. Tunnistamattoman mikro-organismin entsymaattisten ./ { pilkkomisnopeuksien mallia verrataan samojen substraattien entsymaattisten pilkkomisnopeuksien malliin yhden tai useamman tunnistetun mikro-organismin luokan tai ala 98831 10 luokan, jolle on sama affektori, läsnäollessa. Tunnistamaton mikro-organismi tunnistetaan sitten kuuluvaksi tunnettujen mikro-organismien, joka tarkimmin sopii entsymaattis-ten pilkkomisnopeuksien malliin affektorin läsnäollessa, 5 tiettyyn luokkaan tai alaluokkaan.

Eräässä tämän keksinnön suoritusmuodossa annetaan menetelmä tunnistaa tunnistamaton mikro-organismi. Tämän menetelmän mukaan lukuisien substraattien entsymaattisen pilkkomisen 10 nopeus ainakin yhden tunnistamattoman mikro-organismin ilmentämän entsyymin toimesta määritetään ainakin yhden affektorin tehokkaan konsentraation läsnäollessa. Subst-raatteihin voi kuulua yksi tai useampi fluorogeenisen tai kromogeenisen ryhmän substraateista, joiden pilkkominen 15 aikaansaa entsymaattisten pilkkomisien nopeuksien mallin, jotka ovat luonteenomaisia tunnistamattomalle mikro-organismille affektorin läsnäollessa. Entsymaattisten pilkkomisnopeuksien mallia, joka on luonteenomaista tunnistamattomalle mikro-organismille, verrataan sitten entsymaattis-20 ten pilkkomisnopeuksien malliin, joka on luonteenomainen yhdelle tai useammalle tunnistetulle mikro-organismiluokal-le tai -alaluokalle, ja jotka on saatu samoille substraateille vaikuttavan affektorikonsentraation läsnäollessa.

' Tuntematon mikro-organismi tunnistetaan sitten kuuluvaksi 25 tunnettujen mikro-organismien luokkaan tai alaluokkaan, joilla on sellainen substraattien entsymaattisen pilkkomis->te<; nopeuksien malli affektorin tai af f ektoreiden läsnäollessa, « t ... mikä lähinnä vastaa mallia, joka saatiin tunnistamattomalle « i » I « « ' mikro-organismille.

30 * Menetelmään voi vielä sopivasti kuulua yhden tai useamman ·* · ·.· · substraatin entsymaattisen pilkkomisnopeuden määrittäminen ainakin yhdellä entsyymillä, jota yksi tai useampi tunnis-,···. tettujen mikro-organismien luokista tai alaluokista ilmen- '·' 35 tää affektorin tai affektorien, jotka on testattu tunnista- ' ' mattomalle mikro-organismille, vaikuttavan konsentraation '·' · läsnäollessa. Tällä tavoin luodaan entsymaattisten pilkko- 98831 11 misnopeuksien malli affektorin tai affektorien läsnäollessa, mikä on luonteenomaista jokaiselle tunnistetulle mikro-organismien luokalle tai alaluokalle. Entsynaattisten pilk-komisnopeuksien mallia, joka on luonteenomaista tunnista-5 Tilattomalle mikro-organismille, verrataan sitten pilkkomis-nopeuksien malliin, joka on luonteenomaista tunnistettujen mikro-organismin luokille tai alaluokille, samoilla substraateilla affektorin läsnäollessa. Tuntematon mikro-organismi tunnistetaan sitten kuuluvaksi tunnettujen mikro-10 organismien luokkaan tai alaluokkaan, joilla on sellainen entsymaattisten pilkkomisnopeuksien malli, joka lähimmin vastaa mallia, joka saatiin tuntemattomalle mikro-organismille.

15 Tämän keksinnön edullinen suoritusmuoto antaa menetelmän tunnistaa tunnistamattoman mikro-organismin. Tämän edullisen menetelmän mukaan lukuisien substraattien entsymaatti-set pilkkomisnopeudet ainakin yhdellä entsyymillä, jota tunnistamaton mikro-organismi ilmentää, määritetään ainakin 20 yhden affektorin tehokkaan konsentraation läsnäollessa.

Substraatteihin voi kuulua yksi tai useampi fluorogeenisen tai kromogeenisen ryhmän substraateista, joiden pilkkominen aikaansaa entsymaattisten pilkkomisien nopeuksien mallin, jotka ovat luonteenomaisia tunnistamattomalle mikro-orga-25 nismille affektorin läsnäollessa. Samojen substraattien entsymaattinen pilkkomisnopeus ainakin yhdellä entsyymillä, jota tunnistamaton mikro-organismi ilmentää, määritetään • » .. myös affektorin tehokkaan konsentraation puuttuessa. Tällä « · tavoin luodaan entsymaattisten pilkkomisnopeuksien, jotka 30 ovat luonteenomaisia tunnistamattomalle mikro-organismille • · < · · affektorin puuttuessa, malli. Määritetään entsymaattisten • · · • ti * pilkkomisnopeuksien, jotka ovat luonteenomaisia tunnista- ··· mattomalle mikro-organismille affektorin läsnäollessa,

I a I I

.···. mallin ja entsymaattisten pilkkomisnopeuksien, jotka ovat • # 35 luonteenomaisia tunnistamattomalle mikro-organismille affektorin puuttuessa, mallin toiminta. Toiminnan arvoa, joka ' ' määritettiin tunnistamattomalle mikro-organismille, verra- • 98831 12 taan toiminnan arvoon, joka määritettiin yhdelle tai useam-melle tunnistetulle mikro-organismien luokalle. Tunnetuille mikro-organismeille määritetään toiminta substraattien entsymaattisten pilkkomisnopeuksien mallista, joka on saatu 5 affektorin tehokkaan konsentraation läsnäollessa ja substraattien entsymaattisten pilkkomisnopeuksien mallista, joka on saatu affektorin tehokkaan konsentraation puuttuessa.

Sen mukaisesti tuntematon mikro-organismi tunnistetaan kuuluvaksi tunnettujen mikro-organismien luokkaan tai alaluok-10 kaan, jonka entsymaattisten pilkkomisnopeuksien mallin toiminta-arvo lähimmin vastaa toiminta-arvoa, joka on määritetty entsymaattisten pilkkomisnopeuksien mallista, joka on saatu tuntemattomalle mikro-organismille.

15 Tunnistettujen mikro-organismiluokkien entsymaattisten pilkkomisnopeuksien mallit voidaan sopivasti luoda tämän keksinnön mukaisesti sekä affektorin läsnäollessa että puuttuessa. Sen mukaisesti substraattien entsymaattinen pilkkomisnopeus ainakin yhdellä entsyymillä, jota ilmentää 20 yksi tai useampi tunnistettujen mikro-organismien luokka tai alaluokka, määritetään ainakin yhden affektorin tehokkaan konsentraation läsnäollessa. Tällä tavoin luodaan entsymaattisten pilkkomisnopeuksien malli, joka on lucn-j teenomaista tunnistetuille mikro-organismeille affektorin 25 läsnäollessa. Samojen substraattien entsymaattiset pilkko-..... misnopeudet ainakin yhdellä entsyymillä, jota yksi tai • t . useampi tunnistettujen mikro-organismien luokka ilmentää, • « ... määritetään myös affektorin tehokkaan konsentraation puut- « · · tuessa. Tällä tavoin luodaan entsymaattisten pilkkomisno-30 peuksien malli, joka on luonteenomaista tunnistetuille (*·< * * mikro-organismeille affektorin puuttuessa. Entsymaattisten • · · V · pilkkomisnopeuksien luonteenomaisia malleja mikro-organis- .:. mien tunnetuille luokille ja alaluokille voidaan käyttää

t t I I

tämän keksinnön menetelmässä, kuten edellä olleessa kappa-35 laessa on kuvattu.

Jokaisessa menetelmässä, joka on kuvattu tähän keksintöön, 13 - 98831 on edullista, että entsymaattiset pilkkomisnopeudet määritetään kahdelle tai useammalle mikro-organismien luokalle. Pilkotut substraatit ovat edullisesti fluorogeenisiä. Näihin fluorogeenisiin substraatteihin voi kuulua biologinen 5 analogi, joka on johdettu fluorilla, kuten 7-hydroksi-4-metyylikurmariini, 7-amino-4-metyylikurmariini, p-naftyy-liamiini, fluoreskeiini, resofuriini, hydroksipyreenitri-sulfonaatti. Tässä menetelmässä käytetyssä affektorissa voi olla dodekyylisulfaattia, natriumfluoridia, natriumkloridi-10 a, natriumatsidia, etyleenidiamiinitetraetikkahappoa, u- reaa, CHAPS:aa, setyylipvridiinikloridia, klooripromatsii-r.ia, 2-f enoksi etanolia , kobolttikloridia , ouabainumia, nat-riumdeoksikolaattia, bensalkoniumkloridia, sykloseriinia, p-am.inosalisyylihappoa, levamisolea tai metalli-ioneja, 15 joihin kuuluvat Mg, Ca, Zn, Cu, Co, Au tai Hg. Vaihtoehtoisesti niihin voi kuulua noiden affektorien yhdistelmä tai seos. Affektoriin voi edullisesti kuulua natriumdodekyyii-sulfaattia noin 0,5-2,0 % pitoisuutena. Eräässä toisessa edullisessa affektorissa voi olla etyleenidiamiinitetrae-20 tikkahappoa noin 1-100 mM pitoisuutena. Vielä eräässä edullisessa affektorissa voi olla bensalkoniumkloridia noin 0,01-2 % pitoisuutena. Eräs toinen edullinen affektorien seos voi sisältää bensalkoniumkloridia noin 0,01- 2 % : pitoisuutena ja etyleenidiamiinitetraetikkahappoa noin 1- 25 100 mM pitoisuutena.

• · . Erityisen edullisia substraatti- ja af f ektoriyhdistelmiä • · ovat: • · » 4MU-a-D-galaktosidi

30 0,1 % bensalkoniumkloridi, jossa 30 mM EDTA

• ' 4MU-a-D-glukosidi ·»·

V: 0/1 bensalkoniumkloridi, jossa 30 mM EDTA

4MU-3-D-glukuroniidi

f···, 0,1 % bensalkoniumkloridi, jossa 30 mM EDTA

35 4MU-p-galaktosidi • · 1,25 % natriumdodekyylisulfaatti : 1,0 % bensalkoniumkloridi • 98831 14 0,75 % bensalkoniumkloridi 0,1 mM klooriaurihappo

0,1 % bensalkoniumkloridi, jossa 30 mM EDTA 4MU-p-D-glukosidi 5 30 mM EDTA

4MU-fosfaatti 10 mM EDTA 5 mM EDTA 10 mM ZnCL.

10 4MU-nonanoaatti 0,1 % bensalkoniumkloridi 4MU-palmiitti 1 % natriurndodekyylisulfaatti 4 MU-s t e ara a 11 i 15 1 % natriurndodekyylisulfaatti

L-arginiini AMC

0,1 % bensalkoniumkloridi L-alaniini-AMC

0,75 % bensalkoniumkloridi 20 2 mM CoCl· bestatiini (0,2 rcg/ml) 0,33 mM klooriaurihappo 2,5 mM sinkkikloridi 10 mM EDTA 25

Useissa tapauksissa entsyymit, joita tunnistamattomat mikro-organismit ilmentävät, ovat alunperin läsnä ympissä.

• · · *·* * Sen mukaisesti on näille tunnistamattomille mikro-organis meille tämän keksinnön menetelmä määrittää entsymaattiset *"*·* 30 pilkkomisncpeudet sekä affektorin läsnäollessa että puut- • · · : tuessa hyvin nopea ja tunnistamaton mikro-organismi voi daan tunnistaa 30 minuutissa tai vähemmässä ajassa.

• # ♦ ««·· • · ♦ • ·

Jotta tätä keksintöä ymmärrettäisiin paremmin, viitataan ‘•'U 35 seuraavaan kuvaukseen ja esimerkkeihin yhdessä mukana •; ‘: olevien taulukkojen ja kuvioiden kanssa, ja jonka laajuu teen viitataan liitetyissä patenttivaatimuksissa.

Il · 98831 15

Kuvio 1 on piirros, joka osoittaa hydrolyysinopeudet ala-niiniaminopeptidaasilla neljälle (4) Enterobacteriaceae-lajille: L coli, E. cloacea, K. pneumoniae ja C_;_ freundii, 5 kuten esimerkissä 1 on kuvattu.

Kuvio 2 on piirros, joka osoittaa hydrolyysinopeuksien prosentti-lisääntymisen alaniiniaminopeptidaasilla bakteereille, jotka kuvattiin kuviossa 1, 5 mM EDTA:n läsnäolles-10 sa, kuten esimerkissä 1 kuvattiin.

Kuvio 3 on piirros, joka osoittaa hydrolyysinopeudet β-d-galaktosidaasilla kolmelle (3) kannalle jokaisesta neljästä Enterobacteriaceae-lajista, jotka on kuvattu ottaen huomi-15 oon kuviot 1 ja 2, kuten esimerkissä 2 kuvattiin.

Kuvio 4 on piirros, joka osoittaa β-d-galaktosidaasin hydrolyysinopeuksien prosenttilikasvun 1 % SDS:n läsnäollessa samoille bakteerikannoille kuin kuviossa 3 kuvattiin, 20 kuten esimerkissä 2 kuvattiin.

Kuvio 5 on piirros, jossa verrataan L-alaniini-7-amido-4-metyylikumariinin (LAL) hydrolyysinopeuksia sekä bensalko-niumkloridin kanssa että ilman sitä kahdelle kannalle jo-25 kaisesta seuraavasta bakteerikannasta: E^ coli, E. cloa-] cae, E. aeroqenes, K. pneumoniae, C. freundii, P. mirabilis ja M_;_ morqanii, kuten esimerkissä 3 kuvattiin.

• · · * · * • · «

Kuvio 6 on piirros, joka osoittaa hydrolyysinopeudet β-d-*:**: 30 galaktosidaasilla kolmelle (3) kannalle jokaisesta seuraa- vasta mikro-organismista: K^_ pneumoniae. E. aeroqenes, E♦ cloacae, C. freundii ja E. coli, kuten esimerkissä 4 kuvat- • ·« 11 '" " " *::: tiin.

. : 35 Kuvio 7 on piirros, joka osoittaa mikro-organismien, jotka : kuvattiin kuvion 6 β-d-galaktosidaasin hydrolyysinopeuksil- le 1,6 % bensalkoniumkloridin läsnäollessa, lisääntymisen/ t 16 - 98831 supression prosentin, kuten esimerkissä 4 kuvattiin.

Kuvio 8 on piirros, joka osoittaa 4-metyyliumbelliferyyli-β-d-galaktosidaasin hydrolyysinopeudet kolmelle (3) kannal-5 le jokaisesta samasta mikro-organismista, jotka kuvattiin ottaen huomioon kuviot 7 ja 8, kuten esimerkissä 5 kuvattiin .

Kuvio 9 on piirros, joka osoittaa β-d-galaktosidaasihydro-10 lyysinopeuksien kasvun/supression 0,8 mM klooriaurihapon läsnäollessa kolmelle (3) kannalle jokaisesta mikro-organismista, joka on kuvattu kuviota 8 varten, kuten esimerkissä 5 kuvattiin.

15 Kuvio 10 on piirros, joka osoittaa L-alaniini-7-amido-4-metyylikumariini (L-alaniini-AMC):n entsymaattisen hydro-lyysin nopeudet kolmelle (3) kannalle jokainen duplikaattina seuraavista mikro-organismeista: E_^ coli, E. cloacae, E. aerogenes, C. freundii, K. pneumoniae, M. morqanii ja 20 mirabilis, kuten esimerkissä 6 kuvattiin.

Kuvio 11 on piirros, joka osoittaa L-alaniini-AMC:n hydrolyysinopeudet 0,8 mM kobolttikloridin läsnäollessa samoille organismeille, jotka kuvattiin kuviota 10 varten, kuten e-25 simerkissä 6 kuvattiin.

Kuvio 12 on piirros, joka osoittaa L-alaniini-AMC:n hydro-

«»I

V * lyysinopeudet samoille mikro-organismeille huomioon ottaen kuviot 10 ja 11, kuten esimerkissä 7 kuvattiin.

·:♦·· 30 ;*·*; Kuvio 13 on piirros, joka osoittaa L-alaniini-AMC:n hydro- lyysinopeuksien lisääntymisen/supression 8 mM sinkkiklori- • · · •••j din läsnäollessa samoille mikro-organismien kannoille, • · '···' jotka kuvattiin kuviota 12 varten, kuten esimerkissä 7 . · 35 kuvattiin.

Kuvio 14 on piirros, joka osoittaa 4MU-£-d-glukuronidin 17 - 98831 hydrolyysinopeuksien lisääntymisen/supression kahdeksalle (8) E_;_ coli-kannalle, kuten esimerkissä 8 kuvattiin.

Kuvio 15 on piirros, joka osoittaa 4MU-p-d-glukuronidin 5 hydrolyysinopeuksien lisääntymisen/supression 0,08 % bens-alkoniumkloridin ja 16 mM EDTA:n läsnäollessa kahdeksalle (8) E^_ coli-kannalle, kuten esimerkissä 8 kuvattiin.

Kuviot 16A ja B ovat pylväsdiagrammeja, jotka edustavat 10 data-alueita useille mikro-organismikannoille, jotka on testattu 4MU-fosfaatilla ja 4MU-fosfaatilla 5 mM EDTA:n läsnäollessa, kukin erikseen; kun taas kuvio 16C on pylväsdiagrammi kuvioissa 16A ja B olevien data-aluearvojen algoritmisista arvoista, kuten esimerkissä 9 kuvattiin.

15

Kuviot 17A ja B ovat pylväsdiagrammeja, jotka edustavat data-alueita useille mikro-organismikannoille, jotka on testattu 4MU-palmitaatilla ja 4MU-palmitaatilla 1 % SDS:n läsnäollessa, kukin erikseen; kun taas kuvio 17C on pylväs-20 diagrammi kuvioissa 17A ja B olevien data-aluearvojen algoritmisista arvoista, kuten esimerkissä 10 kuvattiin.

Fluorogeenisiä yhdisteitä käytetään tämän keksinnön mukaisesti määrittämään entsyymiaktiivisuus. Nämä yhdisteet ovat 25 luonnossa esiintyvien metaboliittien analogeja. Niissä on tyypillisesti fluoresoiva osa sitoutunut luonnon metabo- * * Hittiin. Entsymaattinen pilkkominen vapauttaa tämän fluo- • · · ·.· · resoivan osan. Vapaan osan fluoresenssi on paljon suurempi kuin sidotun osan. Näitä yhdisteitä voidaan siten käyttää *:**; 30 määrittämään entsyymiaktiivisuutta yhdistämällä ne kyseessä olevan näytteen kanssa entsyymiaktiivisuudelle sopivissa \ fysiologisissa olosuhteissa ja tarkkailemalla fluoresenssin • · · ·;·; kasvun nopeutta.

: 35 Esimerkkejä fluorogeenisistä pilkkomistuotteista, jotka j ovat hyödyllisiä tässä keksinnössä, ovat: 7-hydroksi-4- metyylikurmariini, merkitty myös β-metyyliumbelliferonina 18 - 98831 (4MU); 7-amino-4-metyylikurmariini (AMC); β-naftyyliamiini; fluoreskeiini; resofuriini; hydroksipyreenitrisulfonaatti. Vaihtoehtoisesti tai yhdessä fluorogeenisten pilkkomis-substraattien kanssa voidaan käyttää myös muita indikaatto-5 ri-pilkkomissubstraatteja tässä keksinnössä, kromogeeniset, radiometriset ja fluorometriset substraatit mukaanluettuina, mutta ei niihin rajoittuen.

Tutkittaessa entsyymimekanismeja voidaan käyttää monia yh-10 disteitä joko inhiboimaan tai lisäämään entsyymireaktio- nopeuksia. Näitä yhdisteitä on pääasiassa käytetty välineinä koettamaan entsyymien molekyylibiologiaa ja niiden ympäristöä. Näihin yhdisteisiin kuuluu detergentit, kela-toivat aineet, metalli-ioni lisätekijät, antibiootit, ve-15 tyionipitoisuus ja puskuroivat aineet ja entsyymiaktiivisuuden tunnusomaisemmat vaikuttajat, kuten kilpailevat inhibiittorit .

Yhdistettäessä fluorogeenisiä substraatteja entsyymipilkko-20 miseen vaikuttavien yhdisteiden kanssa ja käyttämällä substraattien entsymaattisen hydrolyysin nopeuksia niin kutsuttujen vaikuttavien yhdisteiden läsnäollessa; ja manipuloimalla nämä nopeudet yhdessä muun entsyyminopeuden informaation kanssa ei vaikuttavista entsyymeistä käyttä-25 mällä sopivia algoritmeja, voidaan saatua informaatiota käyttää auttamaan muodostamaan mikrobilajeja. Esimerkiksi * * erityinen fluorogeeninen substraatti voi reagoida yhtä • · · ·.* * hyvin kahden bakteerilajin kanssa, mutta yhdisteellä voi olla syvempi teho entsymaattiseen pilkkomisnopeuteen yhdel-·;·*: 30 lä bakteerilajilla kuin toisella. Esimerkkejä sellaisista tehoista voi löytyä seuraavista esimerkeistä.

• · · •••j Keksintö, jolla lisätään fluoresenssiä ja kinetiikkaa bak- teerien ja muiden organismien nopeaan tunnistamiseen niiden ·;··: 35 f luorogeenisten substraattien entsymaattisella hydrolyysil- ·; I lä ja menetelmät keksinnön käyttämiseen on esitetty U.S.

patenttihakemuksessa sarjanr. 209677, Sussman et ai., jä-

II

19 - 98831 tetty 20. kesäkuuta 1988. Hakemus on siirretty samalle siirron saajalle kuin tämä keksintö. Sussman et ai. patenttihakemus kuvaa kantajan, jolla on ainakin yksi kinetiikkaa ja fluoresenssiä lisäävä kannattaja kiinnitettynä sen pääl-5 le tai sisään. Kuivunut fluorogeeninen substraatti liuotetaan fluoresenssiä lisäävään kantajaan ensin liuottamalla se sopivaan liuottimeen ja sitten antamalla liuoksen laskeutua kannattajaan. Liuotin poistetaan kuivaamalla tai tyh-jöeksikaattorissa. Mikro-organismit, jotka saadaan biologi-10 sista näytteistä, tunnistetaan käyttämällä fluorogeenisiä substraatteja, vapaata fluoria tai molempia, lisäämällä nestenäyte yhteen tai useampaan moninaisista kinetiikoista ja fluoresenssiä lisäävistä kannattajista.

15 Jokaisessa kannattajassa on fluorogeeninen substraatti, joka voi vapauttaa yhden seuraavista fluoreista: 7-hydrok-si-4-metyylikurmariini, 7-amino-4-metyylikurmariini, β-naftyyliamiini, fluoreskeiini ja resorufiini, muiden muassa. Näytteessä läsnäolevat entsyymit hydrolysoivat subst-20 raatit. Jos substraatit ovat fluorogeenisiä, määritetään hydrolyysinopeudet mittaamalla fluoresenssin kasvun nopeus. Jos substraatti on ei-fluorogeeninen, kinettiikkaa ja fluoresenssia lisäävä kannattaja on antanut laskeutua sen päälle entsyymisubstraatin ja kuivan vapaan fluorin, joka li-25 sääntyy tai tukahtuu hydrolyysituotteen läsnäollessa. Tällä tavalla entsyymin läsnäolo, joka hydrolysoi tiettyä subst- * * raattia, havaitaan ja jos toivottua saadaan aikaan yhden • · · ·.· * tai useamman entsyymin reaktionopeusprofiili näytteessä.

Entsyymin reaktionopeusprofiili analysoidaan sitten ja ·:··; 30 verrataan tunnettujen mikro-organismien referenssient- syymin reaktionopeusprofiilin kanssa, jotta tunnistettai- *. siin tuntematon mikro-organismi. Johtuen kantamuuntelusta • · · •••j ja lajien samankaltaisuuksista ei monia mikro-organismila- jeja voida kuitenkaan tunnistaa tarpeeksi käyttämällä ·;··; 35 patenttihakemuksen sarjanr. 209677 keksintöä ja menetelmää.

Tämän keksinnön edullisessa suoritusmuodossa käytetään U.S.

20 - 98831 patenttihakemuksen sarjanr. 209677 keksintöä, mutta menetelmää parannetaan suorittamalla määritys entsyymiaktiivisuuteen vaikuttavien aineiden läsnäollessa. Kuten seuraa-vissa esimerkeissä on kuvattu, nämä entsyymiaktiivisuuteen 5 vaikuttavat aineet antavat positiivisemman tunnistamisen eri bakteerikannoille. Sen mukaisesti tämän keksinnön e-dullisessa suoritusmuodossa käytetään fluorogeenisiä yhdisteitä määrittämään entsyymiaktiivisuutta.

10 Esimerkkejä hyödyllisistä vaikuttajayhdisteistä ovat mutta ei rajoitu seuraaviin: natriumdodekyylisulfaatti (SDS); natriumfluoridi; natriumkloridi; natriumatsidi; etyleenidi-amiinitetraetikkahappo (EDTA); urea; (3-[3-kooliamidopro-pyyli)-dimetyyliamminio]-1-propaanisulfonaatti} (CHAPS); 15 setyylipyridiinikloridi; klooripromatsiini; 2-fenoksietano-li; kobolttikloridi, ouabainum; natriumdeoksikolaatti; bensalkoniumkloridi; sykloseriini; p-aminosalisyylihappo; levamisole; samoin kuin metalli-ionit Mg, Ca, Zn, Cu, Co,

Au ja Hg. Halutut pitoisuudet näille yhdisteille vaihtele- 20 vat 1 μΜ - 100 mM rajoissa tai edullisesti 0,1 % - 2 % w/v.

Erityisen edullisia yhdisteitä ovat; SDS 0,5 - 2,0 %, edull. 1,0 % w/v.

EDTA 1-100 mM, edull. 10 mM-30 mM.

25 Bensalkoniumkloridi 0,01 - 2 %, edull. 0,1 - 0,75 % wv.

Bensalkoniumkloridi/EDTA-seos 0,01 - 2 %, edull. 0,1 - ’ * 0,75 % bensalkoniumkloridi ja 1-100 mM, edull. 10 mM - • ·« ; 30 mM EDTA.

·;*! 30 Hyödyllisiä substraatti- ja vaikuttajayhdistekombinaatioita ·*·*· ovat: *. 4MU-p-D-galaktosidi - SDS tai bensalkoniumkloridi ···

·*·: 4MU-fosfaatti - EDTA

« « « t «

'··' 4MU-palmitaatti - SDS

·; 35 4MU-stearaatti - SDS

·. ; L-alaniini-AMC - EDTA tai bensalkoniumkloridi

Erityisen edullisia substraatti- ja affektoriyhdistekombi- 21 - 98831 naatioita ovat: 4MU-a-D-galaktosidi 0,1 % bensalkoniumkloridi, jossa 30 mM EDTA 4MU-a-D-glukosidi

5 0,1 % bensalkoniumkloridi, jossa 30 mM EDTA

4MU-p-D-glukuronidi 0,1 % bensalkoniumkloridi, jossa 30 mM EDTA 4MU~3-galaktosidi 1,25 % natriumdodekyylisulfaatti 10 1,0 % bensalkoniumkloridi 0,75 % bensalkoniumkloridi 0,1 mM klooriaurihappo

0,1 % bensalkoniumkloridi, jossa 30 mM EDTA 4MU-3~D-glukosidi 15 30 mM EDTA

4MU-fosfaatti 10 mM EDTA 5 mM EDTA 10 mM ZnCl2 20 4MU-nonanoaatti 0,1 % bensalkoniumkloridi 4MU-palmitaatti 0,1 % natriumdodekyylisulfaatti 4MU-strearaatti 25 1 % natriumdodekyylisulfaatti

L-arginiini AMC

**** 0,1 % bensalkoniumkloridi

V * L-alaniini-AMC

0,75 % bensalkoniumkloridi *: ; 30 2 mM CoCl, bestatiini (0,2 mg/ml) *. 0,33 mM klooriaurihappo • · · ···· 2,5 mM sinkkikloridi

: 10 mM EDTA

·;··: 35 ; Usein annetun lajin yksittäisillä kannoilla on nopeudet, joilla on taipumus ryhmittyä tiettyyn substraattiin. Tällä 22 - 98831 perusteella voidaan yksi laji erottaa toisesta. On kuitenkin tapauksia, joissa yksittäisillä kannoilla on suuresti vaihtelevat nopeudet ja monien lajien organismien nopeudet menevät päällekkäin. Näissä tapauksissa nopeuksia, jotka on 5 saatu substraatilla yksinään, verrataan kolmella tavalla nopeuksiin, jotka on saatu substraatille, joissa on lisätty yhdiste.

Ensimmäiseksi, nopeuksia verrataan suoraan, jotta määrite-10 tään, ovatko kunkin lajin kannat ryhmittyneet enemmän "vaikuttavien" nopeuksien kanssa kuin normaalien nopeuksien kanssa. Tämä voi auttaa yhden tai useamman lajin erottamista .

15 Toiseksi, prosenttia inhibiitio/lisääntyminen lasketaan käyttämällä kaavaa: ((kontrollinopeus - "vaikuttava" nopeus)/kontrollino-peus x 100 %).

20 Tämä kaava antaa positiivisen arvon, jos "vaikuttava" no- . . peus edustaa kontrollinopeuden inhibiitiota ja negatiivi sen arvon, jos "vaikuttava" nopeus edustaa kontrollinopeuden kasvua. Nämä tulokset antavat usein erilaista informaa- ·' " 25 tiota, kun hydrolyysinopeudet yksinään eivät voisi antaa.

' Yhdisteellä voi olla vaikutusta yhden lajin nopeuksiin, mikä voi olla monta kertaa suurempi kuin teho, joka sillä • · · : : : on toiseen lajiin.

....: 30 Vertailun kolmannessa menetelmässä on algoritmin käyttö, .·;·, joka on kuvattu liitteessä A. Algoritmin käyttämisen edut • « · • ovat, että se antaa kohinasuodattimen (muutoksille pienillä • · · ··.: kontrollinopeuksilla, jotka tuottaisivat inhibiitio/lisään- tyminen prosentin, jolla on hyvin suuri absoluuttinen arvo, 35 vaikka ei merkityksellinen) . Algoritmi tuottaa myös ei-ne-gatiivisen arvon, joka on sopiva sovelletettavaksi tietokoneohjelmiin, kuten on kuvattu yleisesti siirretyssä U.S.

98831 23 hakemuksessa sarjanr. 209677, käytettäväksi analysoimaan nopeusdataa. Erilaisia parametrejä voidaan säätää, jotta optimoitaisiin algoritmi. Algoritmi tarkastelee sekä substraatin hydrolyysinopeutta lisätyn yhdisteen kanssa ja ilman 5 että käyttää hydrolyysin kahden nopeuden suhteen toimintaa luomaan arvon, joka on suurempi kuin, samanlainen tai pienempi kuin merkitty neutraali arvo. Arvot, jotka ovat suurempia kuin neutraali arvo, edustavat kasvua hydrolyysin substraattinopeuksissa affektoriyhdisteiden toimesta, ar-10 vot, jotka ovat pienempiä kuin neutraali arvo, edustavat inhibiitiota hydrolyysin substraattinopeuksissa affektori-yhdisteiden toimesta ja arvot, jotka ovat samoja kuin neut-raaliarvo, eivät edusta merkittävää tehoa. Algoritmiarvo-jen logaritmia voidaan myös käyttää.

15

Seuraavat esimerkit valaisevat lisää keksinnön erilaisia piirteitä ja ne eivät ole tarkoitettu millään lailla rajoittamaan keksinnön ulottuvuutta, joka on kuvattu liitetyissä patenttivatimuksissa.

20

Esimerkki 1

Eri bakteerien alaniiniaminopeptidaasihydrolyysinnopeudet määritettiin seuraavalla menetelmällä. Etanoliin liuotettua 6,25 pg L-alaniini-7-amido-4-metyylikumariinia (Sigma 25 Chemical Co., St. Louis, Mo. 63178) pipetoitiin 6 mM läpimitan 740E-paperilevylle (Schleicher ja Scheull Inc. Keene, NH 03431), joka oli kiinnitetty muovikannattimeen. Liuotin • · · V ; poistettiin haihduttamalla. Levylle lisättii 25 μΐ 1 McFar- land-organismisuspensiota. Organismisuspensio valmistettiin 30 laimentimeen, jossa oli 0,1 M Tris, jonka pH oli säädetty 8,0:ksi, 0,85 % NaCl, 0,02 % Triton X-100. Fluoresenssiä « ·, tarkasteltiin jaksottain Dynatech MicroFLUOR-lukijalla «·· ···· (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA 22021). Fluore- '···’ senssin kasvu 10 minuutissa laskettiin vähennyslaskulla.

·. · 35 Määritettiin suhteelliset entsymaattiset hydrolyysinopeudet ' kolmelle (3) kannalla jokaisesta neljästä (4) Enterobacte- riaceae-lajista, jotka oli saatu kliinisistä eristeistä.

24 - 98831

Alaniiniaminopeptidaasin hydrolyysinopeudet on esitetty graafisesti kuviossa 1. Kuvio 1 osoittaa, että substraatti-hydrolyysin suhteelliset nopeudet neljällä (4) lajilla menevät päällekkäin ja yhtään lajeista ei voida erottaa 5 toisistaan käyttämällä tätä hydrolyysinopeuden informaatiota.

Lisättiin levyille, jotka oli valmistettu samallalailla kuin edellä kuvattiin, etyleenidiamiinitetraetikkahappoa 10 (EDTA) (Sigma Chemical Co.), jolloin saatiin lopullinen 4 mM EDTA-pitoisuus, sen jälkeen kun oli lisätty organismi-suspensiota. Mitattiin substraattihydrolyysin nopeudet.

Näitä nopeuksia verrattiin kontrollinopeuksiin alaniiniami-nopeptidaasiaktiivisuuteen ilman EDTA:ta. Jotkut lajit, ku-15 ten Klebsiella pneumoniae osoittivat vaatimatonta kasvua entsyymiaktiivisuudessa, kun taas Enterobacter cloacae osoitti laskua. Hydrolyysinopeuksia verrattiin prosenttili-sääntymisenä ja piirrettiin kuvioon 2 (0 % vastaa ei tehoa johtuen EDTA-lisäyksestä). Kuvio 2 osoittaa, että kolme (3) 20 testattua E^_ cloacae-k an taa osoittavat paljon enemmän ala-niiniaminopeptidaasihydrolyysinopeuksien lisääntymistä johtuen 5 mM EDTA-lisäyksestä kuin minkään toisen testatun lajin kannoista tekee. Täten ilmiö prosentti-lisääntyminen on hyödyllinen erottelemaan näiden Enterobacteriaceae-la.jien 25 välillä.

Esimerkki 2 • · · V ' Valmistettiin substraattilevyt, joissa jokaisessa oli 25 pg 4-metyyliumbelliferyyli-3~D-galaktosidaasia (Sigma Chemical ·;·* 30 Company) , kuten esimerkissä 1 kuvattiin. Samanlaiseen pape- rilevysarjaan lisättiin natriumdodekyylisulfaattia (Sigma \ Chemical Company) 1 % tasolla. Lopullinen konsentraatio oli • · · •••j 0,8 % SDS:ää, kun niihin lisättiin uudelleen 25 pl organis- . ·' misuspensiota, kuten esimerkissä 1 kuvattiin, i 35 : Kuvio 3 osoittaa fluoresenssin muutoksen yli 10 minuutissa kolmelle kannalle, jokaisesta E_;_ coli, E. cloacae, K.

Il . 98831 25 pneumoniae ja C^_ freundii. Johtuen kantamuuntelusta mitään näistä lajeista ei voitu erottaa β-galaktosidaasin hydro-lyysinopeuksilla. Kun kuitenkin verrattiin eroa näiden nopeuksien välillä ja levyjen, joissa oli 4MU-|J-D-galaktosi-5 daasia ja SDS:ää, hydrolyysinopeuksia verrattiin ja tulokset laskettiin prosenttilisääntymisenä, voitiin E^ coli erottaa muista kolmen testatun lajin kannoista, kuten tuloksista piirrettynä kuvioon 4 nähdään. Täten SDS:n vaikutuksesta β-galaktosidaasin hydrolyysinopeuksiin tulee tun-10 nusomainen piirre, mieluummin kuin hydrolyysinopeudet itsessään.

Esimerkki 3

Kuten esimerkissä 1 lisättiin bensalkoniumkloridia (Sigma 15 Chemical Co.) 6,25 pgraan L-alaniini-7-amino-4-metyylikuma-riinia (LAL), jolloin saatiin 0,4 % konsentraatio. Verrattiin LAL-hydrolyysinopeuksia bensalkoniumkloridin kanssa ja ilman kuviossa 5 kahteen (2) kantaan jokaisesta E_^ coli, E. cloacae, E. aeroqenes, K. pneumoniae. C. freundii, P.

20 mirabilis ja Mj_ morganii. Kuten kuviossa 5 nähdään, poikkeuksena Proteus- Morqanella-kannat, on olemassa melkoista datojen päällekkäinmenemistä alaniiniaminopeptidaasinope-uksissa, sekä bensalkoniumkloridin kanssa että ilman. Kuvio 5 osoitta myös, että kaksi (2) testattua Enterobacter 25 aeroqenes-kantaa osoittavat suurinta hydrolyysinopeuksien . , lisääntymistä johtuen 0,4 % bensalkoniumkloridilisäyksestä.

*:··· Sen mukaisesti bensalkoniumkloridilisäys on hyödyllinen ;*·*; erotettaessa E_j_ aeroqenes-laieia muista Enterobacteriaceae- suvun jäsenistä.

30 • · ... Esimerkki 4 • · · " • · · *. Substraattilevyt, joissa oli 25 pg 4-metyyliumbelliferyyli- ..*·* β-d-galaktosidia (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)( : : valmistettiin kuten edellä olevissa esimerkeissä kuvattiin.

: 35 Lisättiin samanlaiseen levysarjaan 20 μΐ 2 % bensalkonium- . kloridiliuosta. Lopullinen bensalkoniumkloridikonsentraatio oli 1,6 %, kun lisättiin 25 μΐ esimerkissä 1 kuvattua 26 - 98831 organismisuspensiota.

Kuvio 6 osoittaa fluoresenssin muutoksen yli 10 minuutissa kolmelle kannalle, jokaisesta K^_ pneumoniae. E. aeroqenes, 5 cloacae, C. freundii ja E^. coli. Minkä tahansa lajin e- rottaminen olisi vaikeaa β-d-galaktosidaasihydrolyysinope-uksien perusteella. Kuitenkin sen jälkeen, kun on laskettu prosenttiosuus, millä nämä nopeudet lisääntyvät bensalkoni-umkloridin läsnäollessa, tulee E_^ aeroqeneksen erottaminen 10 muista neljästä kannasta mahdolliseksi, kuten kuviossa 7 on osoitettu. Sen mukaisesti β-d-galaktosidaasin hydrolyysino-peuden lisääminen prosentteina on hyödyllinen erotettaessa näiden eri Enterobacteriaceae-lajeja.

15 Esimerkki 5

Substraattilevyt, joissa jokaisessa oli 25 pg 4-metyylium-belliferyyli^-d-galaktosidia, valmistettiin kuten edellä olevissa esimerkeissä kuvattiin. Lisättiin samallalailla valmistettuun levysarjaan 20 μΐ 1 mM klooriaurohappoa 20 (AuHC14). Lopullinen klooriaurihappokonsentraatio oli 0,8 mM, kun lisättiin 25 μΐ esimerkissä 1 kuvattua organismi-suspensiota .

Kuvio 8 osoittaa fluoresenssin muutoksen yli 10 minuutissa 25 kolmelle kannalle, jokaisesta E_;_ coli, E. cloacae, E.

;·· aeroqenes, C. f reundii ja K^ pneumoniae. Minkään lajin e- rottamista ei voitaisi tehdä näistä hydrolyysinopeuksista.

• ·

Kuitenkin sen jälkeen, kun on laskettu prosenttiosuus, mil- • · · lä nämä nopeudet inhiboituvat klooriaurihapon läsnäollessa, . 30 kuten kuviossa 9 on osoitettu, tulee E_;_ aeroqeneksen erot taminen mahdolliseksi. Sen mukaisesti klooriaurihapon hyd- • · · • · · *·* * rolyysinopeuden prosentti-inhibiitio tulee hyödylliseksi ·;· erotettaessa näitä eri Enterobacteriaceae-lajeja.

35 Esimerkki 6

Valmistettiin paperilevyjä, joissa jokaisessa oli 6,25 pg L-alaniini-7-amino-4-metyylikumariinia (L-alaniini-AMC),

II

98831 27 kuten edellisissä esimerkeissä kuvattiin. Valmistettiin samanlainen sarja, joissa lisäksi oli kobolttikloridia. Kobolttikloridin lopullinen konsentraatio oli 0,8 mM, sen jälkeen kun oli lisätty 25 μΐ esimerkissä 1 kuvattua orga-5 nismisuspensiota.

L-alaniini-AMC:n fluoresenssin muutos mitattiin useille organismeille, E^_ coli, E^_ cloacae. E. aeroqenes, C. freun-dii, K^_ pneumoniae, M. morqanii ja P^_ mirabilis mukaanluet-10 tuina, yli 10 minuutin jakson ajan ja piirrettiin kuviossa 10 näkyviin pylväsdiagrammeihin. Kuten kuviossa 10 on kuvattu, ei yhtään yksittäistä lajia voitu erottaa hydrolyy-sinopeuksien perusteella yksinään. Näitä hydrolyysinopeuk-sia verrattiin hydrolyysinopeuksiin, kun kobolttikloridia 15 lisättiin L-alaniini-AMC:hen. Nopeuksia verrattiin käyttämällä liitteessä A kuvattua algoritmia. Tämä algoritmi käyttää kahden nopeuden suhteen funktiota. Näiden vertailujen tulokset on piirretty kuvioon 11, joka osoittaa arvot, jotka on laskettu käyttämällä algoritmia. colille las-20 ketut arvot putoavat tavallisesti alle neutraaliarvon nolla alle, kun taas useimpien muiden ei putoa.

Esimerkki 7

Valmistettiin paperilevyjä, joissa jokaisessa oli 6,25 pg 25 L-alaniini-7-amido-4-metyylikurmariinia (L-alaniini-AMC), kuten edellisissä esimerkeissä kuvattiin. Valmistettiin ·;··· samanlainen sarja, joissa myös oli sinkkikloridia. Sinkki- kloridin lopullinen konsentraatio oli 8 mM, sen jälkeen kun • · · 011 lisätty 25 μΐ esimerkissä 1 kuvattua organismisuspensi-ota.

• « • · · • · · * L-alaniini-AMC:n fluoresenssin muutos mitattiin useille organismeille, joihin kuului E_;_ coli, E. cloacae, E. aero-genes, C. f reundii , K. pneumoniae , M. morqanii ja Ρ^_ mira-35 bilis, yli 10 minuutin jakson ajan ja piirrettiin kuviossa 12 näkyviin pylväsdiagrammeihin. Kuviossa 12 kuvatut tulokset osoittavat selvästi, että ei yhtään yksittäistä lajia i . 98831 28 voitu erottaa hydrolyysinopeuksien perusteella yksinään. Kuitenkin kuten kuviossa 13 nähdään, hydrolyysinopeudet samalle substraatille, kun on lisätty sinkkikloridia, osoittavat selvää P_j_ mirabiliksen erottamista kaikista 5 muista testatuista lajeista.

Esimerkki 8

Valmistettiin esimerkissä 1 kuvattuja paperilevyjä useita sarjoja (2 sarjaa kohti) lisäämällä 20 μΐ 20 mM EDTA-liuos-10 ta ja kuivaamalla haihduttamalla. Seuraavaksi lisättiin 20 μΐ 0,1 % bensalkoniumkloridiliuosta jokaiseen levyyn ja kuivattiin haihduttamalla. Sitten lisättiin 20 μΐ 1,25 mg/ml 4-metyyliumbelliferyyli-p-d-glukuronidi-liuosta (BRG) (Sigma Chemicals Co., St. Louis, Mo.) etanolissa molempiin 15 levysarjoihin ja toiseen samalla lailla valmistettuun levy-sarjaan, joissa ei ollut bensalkoniumkloridia tai EDTA:ta. Etanoli haihdutettiin vetokaapissa, jossa oli hyvä veto.

Kun molemman tyyppisiin levyihin oli lisätty 25 μΐ organis-misuspensiota, lopullinen konsentraatio oli joko 1 mg/ml 20 BGR; tai 1 mg/ml BGR, 0,08 % bensalkoniumkloridia ja 16 mM EDTA:ta.

Kuvio 14 osoittaa 4MU-p-d-glukuronidin hydrolyysinopeudet nanogrammoina vapaata fluoria minuuttia kohti 8 eri E_^ 25 coli-kannan duplikaattitestissä. E^_ coli on organismi, v; jonka katsotaan olevan 99 % positiivinen tälle substraatil- *:··· le tavanomaisin menetelmin (kasvuun perustuva) . Huomaa, että useimmat kannat osoittavat hyvin vähän entsyymiaktii- visuutta näissä olosuhteissa. Kuvio 15 osoittaa 4MU-£-d- #30 glukuronidin hydrolyysinopeudet samoille E^_ coli-kannoille , • · ... kun bensalkoniumkloridia ja EDTA: ta on edellä kuvattuina « · · *. * konsentraatioina. Kaikki 8 kantaa osoittavat kohonnutta >#*j* entsyymiaktiivisuutta bensalkoniumkloridin ja EDTA:n läsnä- ollessa.

Esimerkki 9

Valmistettiin paperilevyjä, kuten esimerkissä 1 kuvattiin, f ’ ; 35 98831 29 pipetoimalla 20 μΐ maljaa kohti liuosta, jossa oli 4-metyy-liumbelliferyylifosfaattia (1,25 mg/ml) ja kuivattiin tyhjiössä. Toiseen sarjaan paperilevyjä pipetoitiin 20 μΐ maljaa kohti liuosta, jossa oli 4-metyyliumbelliferyylifos-5 faattia (1,25 mg/ml) ja etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA, 5 mM) ja kuivattiin tyhjiössä. Sen jälkeen, kun oli lisätty 25 μΐ organismiliuosta, kuten esimerkissä 1 kuvattiin, oli EDTArn lopullinen konsentraatio 4 mM.

10 Testattiin 5 kantaa jokaisesta kahdesta lajista, pneumoniae ja mirabilis, duplikaattina. Hydrolyysinopeuksien suhteen logaritmi saatiin, kuten esimerkin 7 yleisesti siirretyssä U.S. patenttihakemuksessa sarjanr. 209677 on kuvattu. Nämä tulokset on esitetty pylväsdiagrammina kuvi-15 ossa 16. "L" ja "H" esittävät alhaista ja korkeaa datapisteitä, vastaavasti, datan hajaantumiseksi. Piirros on mitoitettu automaattisesti käyttämällä korkeita ja matalia datapisteitä minimi- ja maksimiarvoina (merkitty Min ja Max, vastaavsti). "M" merkitsee kaikkien datojen keskiarvoa 20 tälle lajille, "S" oikealle "M":stä edustaa plus yksi standardijakaumaa ja "S” vasemmalle ”M":stä edustaa miinus yksi standardijakaumaa.

Kuvio 16A osoittaa, että ei voitu tehdä mitään eroa K_^ 25 pneumoniaen ja mirabiliksen välillä nopeuksista, jotka saatiin yksin 4MU-fosfaatille. Kuvio 16B osoittaa selvästi datan parempaa erottamista, kuten että useimmat K_;_ pneumo-niae-kannat voitiin erottaa useimmista P^ mirabilis-kan-noista, kun EDTA:ta on läsnä levyllä 4MU-fosfaatin kanssa.

. 30 Kuviossa 16A nähdään algoritmiarvojen pylväsdiagrammi da- • · ... talle, joka on esitetty 16A:ssa ja 16B:ssä, kuten esimer- • · · * kissa 6 ja liitteesä A kuvattiin. Algoritmiarvot antavat *:* 100 % erottamisen K_^ pneumoniaen ja P_^ mirabiliksen välil- lä. Täten nopeuksien vertailu yksinään 4MU-fosfaatille ja 35 EDTA:n kanssa antaa paremman erottamisen kuin 4MU-fosfaatti tai 4MU-fosfaatti EDTA:n kanssa voisi antaa erikseen.

98831 30

Esimerkki 10

Valmistettiin paperilevyjä, kuten esimerkissä 1 kuvattiin, pipetoimalla 20 μΐ maljaa kohti liuosta, jossa oli 4-metyy-liumbelliferyylipalmiaattia (1,25 mg/ml) ja 1,25 % natrium-5 dodekyylisulfaattia (SDS) ja myös kuivattiin tyhjiössä. Sen jälkeen, kun oli lisätty 25 μΐ organismisuspensiota, kuten esimerkissä 1 kuvattiin, oli SDS:n lopullinen konsentraa-tio 1 %.

10 Testattiin 11 Mycobacterium qordoneae-kantaa (MGOR) ja 10 M. terrae-kantaa. Hydrolyysinopeuksien suhteen logaritmi saatiin, kuten esimerkin 7 yleisesti siirretyssä U.S. patenttihakemuksessa sarjanr. 209677 on kuvattu. Nämä tulokset on esitetty pylväsdiagrammina kuviossa 17. "L" ja 15 "H" esittävät matalaa ja korkeaa datapistettä lajille, vastaavasti. Piirros on mitoitettu automaattisesti käyttämällä korkeita ja matalia datapisteitä minimi- ja maksimiarvoina (merkitty Min ja Max, vastaavsti). "M" merkitsee kaikkien datojen keskiarvoa tälle lajille, "S"-arvot edus-20 tavat datan jakaumaa keskimääräisenä +/- 1 standardijakaumaa .

Nämä kaksi läheistä sukua olevaa Mycobacteria-lajia ovat vaikeasti erotettavissa biokemiallisesti. Koska useimmat M^_ 25 terrae-jäsenet reagoivat entsymaattisesti 4-metyyliumbelli- feryylipalmitaatin kanssa, myös jotkut M_^ gordoneae-lajin ·;··· jäsenet reagoivat aiheuttaen datan päällekkäinmenemistä kuviossa 17A. Kuvio 17B osoittaa suurempaa entsymaattista • · t nopeuden kasvua MGOR:lie kuin MTER:lie, kun on lisätty 1 % 30 SDS:ää ja nämä datat nähdään kuviossa 17C tämän vaikutuksen • « ... algoritmisena esityksenä.

• · » • · · *!* Lisäkokeet ovat osoittaneet, että SDS on hyödyllinen vai- kuttamaan muiden esteraasi-substraattien nopeuksiin. Muita 35 affektoriyhdisteitä voidaan yhtä hyvin käyttää esteraasi- substraattien kanssa (s.o. EDTA, bensalkoniumkloridi, jne).

98831 31

Koska täten on kuvattu tässä olevat tämän keksinnön edulliset suoritusmuodot, voivat asiantuntijat tehdä lisämuutoksia ja modifikaatioita poikkeamatta keksinnön hengestä ja ulottuvuudesta ja on mahdollista vaatia kaikkia sellaisia 5 muutoksia ja modifikaatioita.

10 • · • · « • · « • · • 1 • · · • · t • · · t · · 98831 32

Liite A

Seuraava algoritmi vertailee mikro-organismien aiheuttamien entsymaattisen hydrolyysin nopeuksia yksinään substraatin läsnäollessa substraatin entsymaattisen hydrolyysin nopeu-5 teen entsyymipilkkomiseen vaikuttavan yhdisteen läsnäollessa. Algoritmi voidaan ohjelmoida tietokoneeseen ja käyttää analysoimaan nopeusdatan suhdetta seuraavasti:

Annetaan R = substraatin entsymaattisen hydrolyysin nopeus 10 entsyymipilkkomiseen vaikuttavan aineen (esimerkiksi, na-nogramma-yksikköinä vapaata fluoria minuuttia kohti) puuttuessa .

Annetaan I = substraatin entsymaattisen hydrolyysin nopeus 15 entsyymipilkkomiseen vaikuttavan aineen (esimerkiksi, nanogramma-yksikköinä vapaata fluoria minuuttia kohti) läsnäollessa.

Osa keskihajontaa, toistuvista yrityksistä määrittää nopeu-20 det R ja I identtisissä olosuhteissa, kutsutaan Kl, on tulos instrumentin perusviivan liikehdinnästä, vahvistimen kohinasta ja sellaisista vaikutuksista, joista kaikki ovat riippumattomia todellisesta nopeudesta. Varsin todennäköisesti merkittävillä mitatuilla nopeuksilla on niiden 25 keskihajonnassa vielä lisäkomponentti, kutsutaan K2, joka on verrannollinen tietyn nopeuden, R tai I, neliöjuureen.

Siksi funktiot R' ja 1' kuvataan tietyn nopeuden, R tai I

• · φ·;·# suhteeksi, vastaavasti, sen odotettuun keskihajontaan, seuraavasti: 30 R’ = X/(Kl + K2 x /X) I' 0 Y/ (Kl + K2 x VY) • · · • · · V ‘ Seuraavat vakiot valitaan, jotta optimoidaan algoritmiarvot ··· ja asiantuntijat voivat niitä säädellä. Tätä keksintöä .”·. varten vakiot on valittu seuraavasti: 35

Kl = 0,10 * ; K2 = 0,04 98831 33 W1 = 1,00 W2 = 1,00 ja W3 = 20,09

Jos R > 2 x K1, niin annetaan X = R 5 Jos R < 2 x Kl, niin annetaan X = 2 x Kl

Myös, jos I > 2 x Kl, niin annetaan Y = I Jos I < 2 x Kl, niin annetaan Y = 2 x Kl Nämä ehdot estävät erojen hyvin pienissä entsymaattisissa 10 hydrolyysinopeuksissa (s.o. vähemmän kuin 2 x Kl), olemasta merkittäviä algoritmin lopullisissa vaiheissa.

Funktiot F1-F5 kuvataan seuraavasti:

Annetaan FI = I I' - R’l (tarkoittaen I'-R':n abso-15 luuttista arvoa) niin, jos FI W1, niin annetaan F2 = F1.

Jos F1 on <_ tai = W1, niin annetaan F2 = 0.

Annetaan F3 = F2/(F2 + W2) F4 = W3 x (1 + F3 x (Y - X)/X) 20 F5 = Ln F4 (missä Ln on luonnollinen log).

Arvoilla, jotka F1-F5 määrittävät, on seuraava merkitys: F1 - Testaa kahden hydrolyysinopeuden välisen eron suuruuden sen jälkeen, kun on kompensoitu keskihajon-25 nalle. Jos niiden erojen suuruus on yksi tai suu rempi kuin muutos nopeudessa R:stä I:hen, on merkittävä.

* * ·:*·· F2 - Sallii merkittävän nopeuseron mennä algoritmin läpi ... 30 ja suodattaa merkityksettömät nopeuserot pois.

• · · • ♦ · F3 - On sama funktio kuin F2:lla, mutta saa merkittävät erot näyttämään vielä merkittävimmiltä tekemällä *:··· niiden arvon suuremmaksi kuin merkityksettömät ... 35 arvot.

• · · • · · • *. F4 - On todellinen algoritmi. Huomaa että F4 on vastaavi- , ,*·* en hydrolyysinopeuksien (Y - X)/X suhteen funktio.

40 F5 - On F4:n luonnollinen log (Ln).

Algoritmin tarkoitus on ryhmittää merkityksettömät nopeuserot neutraaliarvoon W3 ja toimia suodattimena suurille e- . 98831 34 roille hyvin korkeiden hydrolyysinopeuksien välillä.

Taulukko 1 osoittaa algoritmin, jossa on annettu hypoteettiset arvot R:lle ja I:lle seuraavasti: 5 i < • • · • · · • · · • · · • · ·»« • · · • · · * • · · l

II

35 9 8831 igSSSSSSSoSS-SSooooo^oooooSSSSo : ?0000 00 00220 o--0-0-00:0 MC-O-OOOO-

Mill 11111' . CM — (N σ> UJ — — I I I I I

v-_. *—* „ gsassssssissssssassssssssissss ^ ri CM CM — — OOOOOOOO — ΙΟΟΟΟΟΟΙΛΙΛΧΟ — rXONNNN 0 — to — ΟΙΛΟΟΜ — - otnmcooeoinococootDcoooCDOin — t- ot^cooc-ooLnioinotn — — — 000 — — tocoto — ooo^^ro oeoco·—cm — — — — — o — eooooo — — — «otocoooot--t-c-c- CMCM— OOCOCOCOCDCOCO — — MCOCM — — — — — ·— — — — — OO — □ M0lA(D(0(0(0(0l0Ot-r)IOtD(CU)(0U)t0U)(0 — o — o — O N 0 0 ou>no>o)0)0)cn(ncnotono)0)0>0)C)(no)c>cno)(DU>ou)u)(0(o .................................

000000000000000000000000000000

OlONlflOO-NOO)OlflNinOOHNOO-tDO)lO^OOHO)0 pg ΟΟΙΟΝΟΜΟΟΟΟΟΟΙΟΝίΟ^ΛΟηπΟΝΙΟΟΟΟΝί-ΟΌ tr,..............................

OCMCOOCM — UltOCOCOOCMrjCnCM — IOIOCOCO — CMOIO — O — — — CM — — CMCMCMCMCMCM — — CMCMCMCMCMCMCMCM — ΟΛΝΛΟΟ - NOOlOrtNIOOO - NOO - CD O CD — COO — O CD ^ ΟΟΙΟΝιΟΜΟΟηΟΟΟΙϋΝΛΜΟΟΟΙΟηΝΙϋΟΟηΝΜηΟ ONPJOiN - ΛΙΟ(ΟΙΟΟΝΟΟ>Ν — lf> CD CO CD — CM O «Ο — O — — — CM ^ — — CM CM CM CM CM CM — — CMCMCMCMCMCMCMCM — o X o — c— — ooor^oooomoooooooo — r— — oooc-oo X «. onN-nMDO-onnnonnnnnnnot^-oiMon-o 3 ...............................

— (O — NNO— OOOOIOtOtOIOIOtOIDtOlDlOtO — Nt—O — OOOO

3 CM CM — CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM —

tO EH

(J)P)(7)C7)CnCJ>0)P)CJ)0)CS — C- — O O O C— OOCOCOGOCOCDCOCOCOCOCD

«. roororjoooorooooc- — ώμοο - — 0000000000 ...............................

CDCOCOIOCOCOCOIOCOCOCO — CMC— O — OOOOCMCMCMCMCMCMCMCMCMCM CMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCMCM — 2?2E°OO^-0000000000000O0OOO^-r-> i_i 2 °.ul tv!^°0°°0Q0OO0-00'0c‘,n° o.S S — ο ο ο

ΙΛ — CM — ΟΟΟΟΟΟιΟΛιΛΛιΟΛΛιΛιηιΟιο^· CM — OOOOOO

00000000000000000 — — οοΛιοίοιηιηΐΛ it» m m £. ΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟιΛΟΟιΛΓΜ — OOOCMCMCMCMCMCMCMCMCMCM ιΛιηιηιηιηιΛΛΛΛίηιη - cm — oooooooooooooooo

♦H

ε

CO

•H

c

(Ö-CMCO — .rtcot^cOOO-CMrO — OCOt-COOO— CMrO — iDCOC-OOOO

U — — — — — — — CMCM CM C-ICJCMCMCMCMCMO

O

36 98831

^Λ'ΤΛΛΟΛΟιηο O O to O O N O N

N(j)0)oor'inojiot'io o o cr> o o o o o -y» * * ' * # · * · · K < · QJ.....

i oooooo^Ln^rcco^occ^rcM— ^ I · I I » CM ui ι i uj cm ι ι ι i CO CD CD CM ΗΟΠΛιΛΙΟΟιΛΙΟΐΟιίΜΟΟΟΟ υ)ΐη(οηο(οο<-·^·^·^οοο©·^>-ΐ5οοοο ft,...................

ΟΟΗΝΝΟΟηΟΟΠΝΝηΟΝΟΟΟ mroHr-i,-icnNU)ns)cnNHconh>M‘iA'4' tOlOintDOON^^OO^^^OCO^·^ ....................

U, H^^h-nONOonoNi-ooNOOO CM CM CM CM CM CM —I «-< CM CM —* toioHnM'O’fntOOOhONecooo (nO)0)<DU)OintO(OU>OUIU>(OUMOCDO)0 n...................

^ oooooooooooooooooo—<

·-* co σ> cd —<oo--*cr)coococT>cocDcouo _ nNIDOOONMDOOOOlOOIOriNN

(ϋ CM.................. +

0 ^TfNOiO^O^^^NON^N^NTfMM

N N H τΤ CM CM

rfl ^ιοσ)ίο^Μσ>ο·-·θΓ>α>οοο£7>οοσ>οο«ο

1 CD CM CO O COCDCMf-COOOOCOOCD O—<CMCM

-H h^NOm^O^^NONHNHNJBM

CM CM ·—* o

M

-¾ COCDCOCOaOCOCOCOCOCDCDOOCOCOOOCOO

5 OOOOOOOOOOOO—IOOOOOO

5 M NNNNNNNNCMNNOOCMNOONO

<0

EH

[»'fs^oooiNOoeooiDooiDin ^ OON^OIMOOHOOOOO^OHNN

*................. .

tO'H’NSOWOOOONNNOONcfliJM CM CM —I -tf· CM CM

iO<Olf>ir>iOiOif)iOiDiDino«-*miOtOOmO

CMCMCMCMCMCMCMCMCMiMCMOOCMCMCMCMCMO

H .......* .......»

OOOOOOOOOOOOOOOOOOCM

I I I

ooooooo'tf·—'OiDinmo^tDO ΟΛΟΟΛΝ^ΟΟΟΝΝΝΟΟΝΟΝΝ K.................+ + lO TT CM —< OOOOOOOOOOOOOU3U3

rH rH

•H

E

en -(NlOkC^tOI^CDCftOHtMn^^lCMOO) •h nnoorjnrxowTrwtfWTfv^kf e m tr>

M

o

II

Claims (7)

98831 37

1. Menetelmä tunnistamattoman mikro-organismin tunnistamiseksi, tunnettu siitä, että siinä määritetään suuren määrän substraatteja entsymaattisen 5 pilkkomisen nopeus ainakin yhdellä entsyymillä, jota tunnistamaton mikro-organismi ilmentää ainakin yhden affekto-rin tehokkaan konsentraation läsnäollessa, jolloin mainitut substraatit valitaan ryhmästä, joka koostuu fluorogee-nisistä ja kromogeenisistä substraateista, ja affektori 10 valitaan ryhmästä, joka koostuu natriumdodekyylisulfaatis-ta, natriumfluoridista, natriumkloridista, natriumatsidis-ta, etyleenidiamiinitetraetikkahaposta, ureasta, 3-(3-kolamidopropyy1idimetyy1iammonio)-1-propaani sulfonaat i s ta (CHAPS), setyylipyridiniumkloridista, klooripromatsiinis-15 ta, 2-fenoksitanolista, kobolttikloridista, ouabaiinista, natriumdeoksikolaatista, bentsalkoniumkloridista, syklose-riinistä, p-aminosalisyylihaposta, levamisolista ja metalli-ioneista käsittäen Mg, Ca, Zn, Cu, Co, Au ja Hg tai entsyymin pilkkomiseen vaikuttavien aineiden yhdistelmän 20 joukosta, jotta luodaan entsyymaattisten pilkkomisnopeuk- sien malli, joka on luonteenomainen tunnistamattomalle mikro-organismille mainitun vaikuttavan aineen läsnäollessa; ja ; _·, tunnistetaan mainittu tuntematon mikro-organismi kuuluvak- 25 si tunnettujen mikro-organismien luokkaan, jonka sub- . straattien, mainitun affektorin läsnäollessa, entsymaat- tisten pilkkomisnopeuksien malli lähinnä vastaa mallia, joka saatiin tuntemattomalle mikro-organismille. • I» • · « • · ·

2. Patenttivaatimuksen l mukainen menetelmä tunnistamat- j ·.. toman mikro-organismin tunnistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää lisäksi mainitulle tunnistamatto-.* . malle mikro-organismille luonteenomaisen entsymaattisten pilkkomisnopeuksien mallin vertaamisen mainittujen sub-·;’ 35 straattien entsymaattisten pilkkomisnopeuksien mallin : : kanssa, joka saatiin mainitun vaikuttavan aineen yhdelle :’· : tai useammalle tunnistetulle mikro-organismiluokalle te hokkaan konsentraation läsnäollessa. 98831 38

3. Menetelmä tunnistamattoman mikro-organismin tunnistamiseksi, kuten patenttivaatimuksessa 1 esitettiin, tunnettu siitä, että mainittu substraatti sisältää fluorogeeni-siä substraatteja. 5

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä tunnistamattoman mikro-organismin tunnistamiseksi, tunnettu siitä, että siinä määritetään mainittujen substraattien entsymaattinen pilk-10 komisnopeus ainakin yhdellä entsyymillä, jota yksi tai useampi tunnistamaton mikro-organismi ilmentää affektorin tehokkaan konsentraation poissaollessa, jotta luodaan ent-syymaattisten pilkkomisnopeuksien malli, joka on luonteenomainen tunnistamattomalle mikro-organismille mainitun 15 affektorin poissaollessa; verrataan entsymaattisten pilkkomisnopeuksien mallin, joka malli on luonteenomainen mainitulle tunnistamattomalle mikro-organismille mainitun affektorin läsnäollessa, funktiota entsymaattisten pilkkomisnopeuksien malliin, joka 20 malli on luonteenomainen mainitulle tunnistamattomalle mikro-organismille mainitun affektorin poissaollessa, mainittujen substraattien entsymaattisten pilkkomisnopeuksien mallin, joka malli on saatu affektorin tehokkaan konsentraation läsnäollessa, mainittujen substraattien entsymaat-’ ' ' 25 tisten pilkkomisnopeuksien mallin, joka malli on saatu : ’ affektorin tehokkaan konsentraation poissaollessa yhdelle • tai useammalle identifioidulle mikro-organismin luokalle ’1·’1· tai alaluokalle, suhteen funktioon. • · « • · 1 * · ·

5. Menetelmä tunnistamattoman mikro-organismin tunnista- miseksi, kuten patenttivaatimuksessa 4 esitettiin, tunnet-tu siitä, että mainitut entsymaattisten pilkkomisnopeuksi-• en mallit mainituille mikro-organismien tunnistetuille luokille luodaan 35 määrittämällä mainittujen substraattien entsymaattinen pilkkomisnopeus ainakin yhdellä entsyymillä, jota yksi tai : useampi tunnistettujen mikro-organismien luokka tai ala luokka ilmentää ainakin yhden affektorin tehokkaan kon- li 98831 39 sentraation läsnäollessa, jotta luodaan entsymaattisten pilkkomisnopeuksien malli, joka on luonteenomainen tunnistetulle mikro-organismille mainitun affektorin läsnäollessa; 5 määrittämällä mainittujen substraattien entsymaattinen pilkkomisnopeus ainakin yhdellä entsyymillä, jota yksi tai useampi tunnistettujen mikro-organismien luokka tai alaluokka ilmentää ainakin yhden affektorin tehokkaan kon-sentraation puuttuessa, jotta luodaan entsyymaattisten 10 pilkkomisnopeuksien malli, joka on luonteenomainen tunnistetulle mikro-organismille mainitun affektorin puuttuessa.

6. Menetelmä tunnistamattoman mikro-organismin tunnistamiseksi, kuten patenttivaatimuksessa 5 esitettiin, tunnet- 15 tu siitä, että mainittu substraatti sisältää fluorogeeni-sen substraatin.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä tunnistamattoman mikro-organismin tunnistamiseksi, tunnettu siitä, 20 että menetelmä käsittää lisäksi mainitun tuntemattoman mikro-organismin tunnistamisen kuuluvaksi mikro-organismin mainitun luokan alaluokkaan, jolla substraattien entsymaattisten pilkkomisnopeuksien malli mainitun affektorin läsnäollessa lähinnä korreloi tunnistamattomalle mikro-or-25 ganismille saatuun malliin. • · • t • « « • · · • · · • · • · • · v 1 M • · · • · · 98831 40