JPH05503365A - 蛍光の変化をモニターすることによる色反応の測定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 蛍光の変化をモニターすることによる色反応の測定発明の分野 本発明は、化学的に不活性の光透過性マトリクス中にカプセル化された蛍光団に 達する光に対する発色団の制御によって、溶液中の発色団の存在を検出もしくは 測定し又は濃度を定量する方法に関する。

発明の背景 化学的及び酵素的反応が、微生物又は他のアッセイにおいて、ある物質の存在を 検出し又は定量するのに使用される。これらの多くの試験は、関係物質の存在又 は量を示す色又は蛍光の発生又は変化に依存している。

微生物学において使用される色の変化に依存する多くの反応例がある。　Ｂａ５ ｃｏｒａｂ、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｔｅ５ｔｓ　ｉｎ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｉｄｅ ｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ、　Ｍｅｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１９．１０５ 　（１９８７）　、例えば、種々の生物体は、それらの醗酵、酸化、又は炭素源 の同化によって大きく分類することができる。炭水化物の醗酵はｐＨの低下の原 因となる酸を生成する結果となる。このｐＨの低下は、ブロムチモールブルー又 はフェノールレッドのようなｐｌ（指示薬を用いて容易に検出することができる 。双方の指示薬では、特定の炭水化物の醗酵を示す酸性状態は黄色い色をもたら す（ブロムチモールブルーの場合は青緑から、フェノールレッドの場合は挑／赤 から）。ブドウ糖のような単糖類からイヌリンのような多糖類にわたる種々の炭 水化物のために同じアプローチが採用できる。類似の方式で、ｐＨの上昇もまた 追跡することができる。デカルボキシラーゼ及びウレアーゼの存在及びマロン酸 塩を用いる能力の存在を検出するための方法は、指示薬における色の変化によっ て示されるように、ｐＨ上昇を基礎にしている。

生物体が特定の物質を分解することができるか否かを決定する別のアプローチは 、中間体又は最終生成物の１又は２以上と反応することのできる試薬を使用する ことである。たとえば、硝酸塩の亜硝酸塩への還元である。もし亜硝酸塩が形成 されれば、スルファニル酸又はα−ナフチルアミンが反応混合物に添加されたと きは桃色乃至深赤色を呈するであろう。

硝酸／亜硝酸試験によって示された酵素反応の間接的検出とは対照的に、酵素の 存在を直接に示すための自然の基質の合成的類縫体の使用が可能である。例えば 、メチレンブルーは、ある条件下に還元酵素の作用によって還元されることがで き、青から無色へと変移する。他の試験においては、酸化酵素のアッセイは、青 色を生ずるチトクロームオキシダーゼとＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’　−テトラメチル− ｐ−フェニレンジアミンとの相互作用に依存している。

他の例は、Ｈ，Ｓの生成によって示されるような、微生物が硫黄含有アミノ酸を 分解する能力である。典型的には、酸性環境中にて生物体が高濃度の硫黄含有基 質（例えばシスティン、シスチン）と共にインキュベートされる。Ｈａｓの産生 は、クエン酸鉄アンモニウムの存在下において黒色沈殿の形成によって示される 。

酵素は通常１以上の基質に作用する。これは、酵素活性の検出のために合成の酵 素基質の使用を許容する。合成基質は、有色の又は蛍光性部分と結合した代謝的 部分を含む。結合した分子は通常、非結合の形嘘とは異なった吸収及び／又は発 光スペクトルを有する。

更に、結合していない有色の又は蛍光性部分は、結合した分子のそれよりもかな り高い吸収又は蛍光係数を示す。このことは、最大酵素活性のために必要な大量 の結合した基質の存在下における、酵素活性による少量の生成物の測定を許容す る。合成の酵素基質の一例は、酵素β−ガラクトシダーゼの活性検出に使用され る０−ニトロ−フェノール−β−ガラクトピラノシドである。結合基質は無色で ある。β−ガラクトシダーゼ酵素は、基質を加水分解してβ−ガラクトソダーゼ 及び０−二トロフェノールを生成する。０−ニトロフェノールは４０５ｎｍにお いて強い吸収を有し、その遊離はその波長における吸光度の上昇によって測定す ることができる。Ｂａｓｃｏｍｂ。

Ｅｎｚｙｍｅ　Ｔｅ５ｔｓ　ｉｎ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ ｔｉｏｎ、　Ｍｅｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

ユ９．１０５　（１９８７）　、は酵素基質の代わりに使用される合成基質及び この原理を用いて測定できる酵素活性を再評価した。

目下、化学的及び微生物反応における色又は有色最終生成物のモニターは、通常 次の２つの方法の何れかで達成される。すなわち、ｌ）色又は有色最終生成物の 検出は、肉眼観察及び定性的評価によって達成できるか、又は２）有色最終生成 物又は色の喪失の検出は、機械的に色の強度を測定することによって達成できる 。吸光度を測定する分光光度計は、一般的にこの目的に使用されている。多数の 基質の１度を測定するときは、■の機器又は１の測定原理を使用するのが有ｔＩ であり、さもなければコストが上昇する。

比色定量的反応の使用が広まっているとはいえ、特に検出感度において限界があ る。感度を改善するためにそして、微生物の同定の場合、それによって結果を得 るまでの時間を短縮するために、蛍光に基づく方法がしばしば使用される。残念 なことに、全てのアッセイについて等価な蛍光を発することは可能ではないであ ろう。加えて蛍光試薬自身、非常に毒性で、従って市販することが困難であろう 。

そのような場合には、−の酵素活性を蛍光光度法により、他を分光光度法によっ て測定する必要かあろう。しかしながら、殆どの機器は、吸光度又は蛍光の何れ かの測定に適合しており、双方を測定するのに使用できるものは殆どない。

蛍光消光という一般的原理が、酵素的又は化学的反応の検出又は定量の方法とし て受け入れられてきた。例えば、Ｆｌｅｍｉｎｇｅｒ等は、細菌のアミノペプチ ダーゼのアッセイのための分子内消光蛍光原性基質を合成した。Ｐ、　Ｆｌｅｍ ｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ　５ｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｍ１ｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ　Ｐ　ａｎｄ　ｉ ｔｓ　Ａｎａｌｏｇｓ　Ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｕｍ　ａ ｎｄ　Ｃａ１ｆ　Ｌｕｎｇ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　１２５．６０ ９　（１９８２）。

この場合において、アミノベンゾイル基の蛍光はニトロフェニルアラニル基の存 在によって消光されている。酵素が存在すると、ニトロフェニルアラニル基が切 断され、それに伴ってサンプルの蛍光が増大する。加水分解酵素、他のアミノ− 及びカルボキシペプチダーゼ及びエンドペプチダーゼを含む種々の酵素がこのタ イプの手順でアッセイされてきた６　ＹａｒＱｎ　ｅｔａｌ□Ｉｎｔｒａｍｏｌ ｅｃｕｌａｒｌｙ　ＱｕｅｎｃｈｅｄＦｌｕｏｒａｇｅｎ：ｃ　５ｕｂｓｔｒａ ｔｅｓ　ｆｏｒ　Ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ　［！ｎｚｙｍｅｓ、　Ａｎａｌ、　Ｂ ｉｏｃｈｃ＋＋＋、　９５．２２８　（１９７９）；　Ｃａｒｔｅｌ　ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ　−Ｑｕｅｎｃｈｅｄ　Ｆｌｕｏｒ ｅｓｃｅｎｔ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ　５ｕｂｓｔ ｒａｔｅｓ　ｏｆ　ＬｅｕｃｉｎｅＡｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ　ａｎｄ　Ｉ ｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉａｌ　Ａｍ１ｎｏｐｅｐｔｉｄ ａｓｅ。

Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、７３．６１７　（１９７７）；　Ｃａｒｍｅ ｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎ　Ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ　Ｑｕｅｎｃｈ ｅｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ　ａｓ　ａ　Ｆｌｕｏｒ ｏｇｅｎｉｃ　５ｕｂｓｔｒａｔｅ　ｏｆ　Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−１−Ｃｏ ｎｖｅｅｒｉｎｇ　Ｅｎｚｙｍｅ　ａｎｄ　ｏｆ　ＢａｃｔｅｒｉａｌＤｉｐｅ ｐｔｉｄｙｌ　ＣａｒｂｏｘｙｐｅｐＬｉｄａｓｅ、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、８７．　２６５　（１９７８）：　Ｆｌｏｒｅｎｔｉｎ　ｅｔ　ａｔ、、　 Ａ　Ｈｉｇｈｌｙ　５ｅｎｓｉｔｉｖｅ　Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ　Ａｓ５ａ ｙ　ｆｏｒ　’Ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎａｓｅ”、ａ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｍｅｔａ ｌｌｏａｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ　ｔｈａｔ　Ｒｅｌ基を含有する合成基質が 酵素活性を検出するために生み出されてきこのアプローチに代わるものとしては 、基質分子上の共鳴エネルギー移転蛍光基対の合成が含まれる。この方法におい ては、酵素による一方の基の切断は、臨界距離が超えられてエネルギーの移転が 除かれるために、蛍光の減少をもたらすであろう。しかしながら、先に論じたア プローチは特に基質の設計に限定されている。

更なるアプローチは、蛍光測定による発色団の推定を含む。Ｗ、　Ｂｕｌｍｂｅ ｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｉｎ　Ｗ ｈｏｌｅ　旧ｏｏｄ　’ＦｒｏｎｔＦａｃｅ″Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ、　Ｃｌ １ｎ、　ｆ（ｅａ＋ｏ。２６．４０９　（１９８０）を参照。Ｂｌｕａ＋ｂｅｒ ｇは、励起波長が色素の吸収波長と重なる、色素による蛍光の減衰に基づくアッ セイを開示した。

つづいて、Ｍ、　５ｈａｆｆｅｒ、米国特許第４．４９５．２９３号（以下５ｈ ａｆｆｅｒという）は、慣用の蛍光光度技術を用いてアッセイ溶液中のリガンド を蛍光光度法的に定量する方法を開示する特許出願をした。５ｈａｆｆｅｒにお いては、アッセイ溶液によって発せられる蛍光強度は、測定されるべきリガンド と、リガンドの存在下においてアッセイ溶液の透過性特性に変化を生じさせるこ とのできる試薬系との相互作用によって生じる、アッセイ溶液の透過性特性の変 化に関係している。より具体的には、５ｈａｆｆｅｒは、発色団を有する溶液中 において蛍光団を使用して吸光度をモニターする方法を開示している。この方法 においては、蛍光団はアッセイ混合物と相互作用し、測定されている変化に無関 係な蛍光強度をの変化を生じ得る。ｐＨ依存性の又は環境に敏感な蛍光団は利用 できないという点において、蛍光団の選択もまた限定されている。加えて、蛍光 団が溶液のときは、光が発色団サンプルを通って指数関数的に吸収されるため、 正確な吸光度測定を得るに至らないであろう。

同様に、Ｂｅｇｇｓ　＆　５ａｎｄ、　ＥＰＡ　９１，８３７は、インドールピ ルビン酸と金属イオンとの間の相互作用によって生成する発色団の存在下にて、 「その蛍光がピルビン酸インドール−金属イオン複合体によって消光されること ができ、その蛍光団のイオンが全インキュベーション時間にわたって存在してい るものである」蛍光団を用いて、蛍光の減少を測定することによるトリプトファ ンデアミナーゼ活性の定量のための溶液に基づく方法を開示している。

また、５ａｎｄｓ、米国特許第４，７９８，７８８　、は蛍光団のジアゾ化を起 こさせることによって溶液中の蛍光の減少を測定することによる窒素還元微生物 の検出方法を開示している。これらの全ての場合において、個々の蛍光団は、試 験条件下でそれが蛍光を発することを保証するために試験毎に選択する必要があ り、例えば、ｌｌ８２．０より下ではごく僅かの蛍光団しか蛍光を発しない。

従って、適当なスペクトル特性を有するいかなる蛍光団も使用することのできる ような、いかなる基質をも検出し又は定量するための一般的な方法を開発する必 要が存在する。加えて、アッセイ感度を増大することができるよう、蛍光アッセ イにおいて光量を最大にする方法を開発する必要が存在する。

発明の概要 本発明は、溶液の光透過性特性を変化させるよう直接又は間接的に機能する物質 を検出し又は濃度を定量するための方法を含み、透過光路を形成する光線を提供 し、該光路中に前記物質を含有する溶液を提供することよりなり、改良点が、前 記光路を横切るように化学的に不活性な光透過性マトリクス内の蛍光団をおき、 そして前記物質の存在又は濃度を測定するために蛍光団の発光の変化を検出する ことよりなる。本発明は、比色法、濁度測定法又は比濁分析法において蛍光光度 リーダーを用いて未知物質の検出又は濃度測定をおこなう方法を含む。色、濁度 又は光散乱の変化は、光透過性マトリクス内に囲い込まれた不活性の蛍光団の蛍 光の変化を観察することによってモニターするとかできる。特に、比色反応にお いては、この結果は発色団の吸収スペクトルが蛍光団の励起及び／又は発光スペ クトルと重なっており、それによって、蛍光における変化を結果的に関係物質の 量に関係づけられる反応中の色の強度に関係づけることを許容するときに、達成 することができる。スペクトルが可視光に限られないことに注意しなければなら ない。

本発明は、関係波長において透明である化学的に不活性のマトリクス中に囲い込 まれ又は埋め込まれた蛍光団を使用する方法を提供する。蛍光団は、透過光路を 横断するように配置され、発色団の吸光度又は吸光度変化を間接的にモニターす る。マトリクス中に囲い込まれ又は埋め込まれた蛍光団の使用は、検出光の強度 に対する反応成分の逐次的影響を許容する。

本発明はまた、該物質と又は該物質に関係づけられた化合物と反応して色素原性 の反応生成物を形成する色素原性試薬であって、該色素原反応生成物が蛍光団の 励起及び発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有し蛍光団及び蛍光検出器に 達する光を制御するものである試薬を使用して、溶液中の物質の存在を検出し又 は濃度を定量するための方法を提供することにも向けられており、透過光路を形 成する光線を提供し、該光路中に該物質及び色素原試薬を含む溶液を置き、色素 原で制御された光を横切って、化学的に不活性の透明マトリクス中に、色素原反 応生成物の吸光度スペクトルと重なる励起及び発光波長を有する蛍光団を置き、 そして蛍光発光の変化を検出して該物質の存在又は濃度を測定することよりなる 。

加えて、本発明は、該物質又は該物質と関係づけられた化合物と反応して色素原 性の反応生成物を形成する色素原試薬であって、該色素原反応生成物が蛍光団の 励起及び発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有して蛍光団及び蛍光検出器 に達する光を制御するものである試薬を使用して、物質の存在を検出し又は濃度 を定量するための方法に向けられており、透過光路を形成する光線を提供し、色 素原反応生成物の吸光度スペクトルと重なる励起及び発光波長を有する、化学的 に不活性の光透過性マトリクス中に入った蛍光団を該光路を横切るように置き、 蛍光団で制御された光を横切って該物質と色素原性試薬を含む溶液を置き、そし て該物質の存在又は濃度を定量するために蛍光団の発光の変化を検出することよ りなる。

加えて、本発明は、該物質又は該物質と関係づけられた化合物と反応して色素原 性の反応生成物を形成する色素原試薬であって、該色素原反応生成物が蛍光団の 励起スペクトルと重なる吸収スペクトルを存して蛍光団及び蛍光検出器に達する 光を制御するものである試薬を使用して、物質の存在を検出し又は１度を定量す るための方法に向けられており、透過光路を形成する光線を提供し、該光路中に 該物質及び発色団を含む溶液を置き、発色団で制御された光を横切って、化学的 に不活性の透明マトリクス中に、色素原反応生成物の吸光度スペクトルと重なる 励起波長を有する蛍光団を置き、そして蛍光団の発光の変化を検出して該物質の 存在又は濃度を測定することよりなる。

加えて、本発明は、上記の方法に使用する反応チャンバーよりなる反応チャンバ ーに関し、前記制御された光を横切って前記反応チャンバー内に置かれた不活性 の光透過マトリクス中に囲い込まれ又は埋め込まれた色素原性反応生成物の吸収 スペクトルと重なる発色及び／又は励起スペクトルを有する蛍光団、及び未知物 質の存在を検出し又は濃度を定量するために、制御された光をモニターする手段 よりなる。

この方法の主要な利点は以下の通りである。

イ）　蛍光光度計を使用して色素原性反応を検出し且つ定量する能力。これは、 蛍光を使用して実質的に全ての色反応がモニターしつることから、蛍光光度計の 有用性を劇的に高める。適切な励起／発光プロフィールを有する蛍光団を注意深 く選択することによって、最適の試験が容易に開発できる。こうして、蛍光及び 吸光測定のために単一の機器を使用できる。

口）　化学的に不活性の光透過性マトリクス中の蛍光団の反応混合物からの分離 は、アッセイ混合物の環境によって蛍光源が乱されないという結果をもたらす。

ハ）　加えて、サンプルすなわちマトリクスの全光路長を調べるということは、 一層正確にサンプルを表し、それ故に一層感度の高いアッセイを与える。

更に加えて、本発明は、上述の方法を実施するためのキットにも関する。

図面の簡単な説明 図ＩＡは、前面蛍光測定法を用いた色素原性反応生成物による励起及び／又は発 光の制御を示す。

図ＩＢは、発光に基づく吸光度測定を示す。

図２は、励起に基づく吸光度測定を示す。

図３は、収れん点における種々のｐＨにおいて測定したときの色素キシレノール ブルーの吸収スペクトルである。

図４は、吸光度データ上における最小二乗法曲線当てはめ操作の結果を示す。

図５は、蛍光に基づく吸光度データ上における最小二乗法曲線当てはめ操作の結 果を示す。

図６は、蛍光に基づく吸光度データと吸光度データ上における最小二乗法曲線当 てはめ操作の結果を示す。

図７は、蛍光強度とキシレノールブルー濃度との関係を示す。

図８は、直接及び間接吸光度測定の比較を示す。

詳細な説明　−最良の形態 このアプローチにおいて、化学的に不活性の光透過性マトリクス中に囲い込まれ 又は埋め込まれた蛍光団からの蛍光は、色素原試薬と関連物質又は該関連物質に 関連づけられた他の化合物との相互作用によって形成される色素原性反応生成物 によって変調される。該アッセイは、透過光路を横切るように予め蛍光団を配置 した反応チャンバー中で行われる。反応チャンバーはセル、マイクロ希釈若しく はマイクロプレートのウェル又は血竣培養瓶であってよい。

蛍光光度測定に基づく光度測定アッセイにおいては、蛍光強度は介在する色素原 の吸光度の変化によって制御される。色の変化が起こると、発色団材料は蛍光団 に達する光量を変化させ及び／又は検出器に達する光量を変化させる。発色団材 料の濃度及び／又は存在の測定は、試薬及び測定すべき物質の相互作用に依存し 又は色素原試薬及び関係物質に関係づけられた他の化合物の相互作用に依存して いる。もし測定すべき物質が溶液中に存在しているなら、発色団は特定波長の光 を吸収する。同様に、発色団を使用しないアッセインステムにおいては、蛍光の 変化は溶液中の混濁測定的又は比濁分析的変化によって影響を受け得る。

蛍光測定に基づく比色法的アッセイの要件は、色素原性反応生成物の吸収スペク トルと、選んだ蛍光団の励起及び／又は発光スペクトルとの特別の重複の必要に 基づく。励起光源と蛍光団マトリクス（典型的には２ｍｍ光路）との間に発色団 （典型的には８ｍｍ）を挾み込むことは、色素原性反応生成物の全光路長につい ての完全な調べをを保証する。これは、吸光度の正確な、比例的に定量的な定量 を提供する。単色の励起及び検出波長は、付随する蛍光強度の変化を達成するよ う最大吸収の変化を利用するように選択される。

マトリクス全体に均一に分布した蛍光団が、典型的には水性のアッセイ混合液か ら完全に隔離されており、何らの反応にも関与しないということには注意しなけ ればならない。固定化した蛍光団はスペクトル的に活性な発色団によって減衰さ れ又は高められることのできる光源としてのみ働く。マトリクスは、例えばリポ ソーム、ビーズ、エポキシ等の、関係波長において透明であるいかなる不活性な 支持体であってもよい。同様に、反応チャンバーにおいて蛍光フィルターを使用 することができる。

蛍光は幾つかの方法でモニターできる。励起及び／又は発光に基づく測定すなわ ち図ＩＡの前面蛍光光度法、発光に基づく吸光度測定すなわち図ＩＢの慣用の蛍 光光度法、及び、励起に基づく吸光度測定すなわち図２の慣用の蛍光光度法によ るもの。図ＩＢの発光に基づく吸光度測定に示すように、透過光路中の光は、専 ら光を制御する色素原性反応生成物を通る単一光路をなす。吸収／蛍光発光の重 なりのみが重要である。図２に示したように、色素原性反応生成物を光路におい て蛍光マトリクスの前に配置することは、励起の制御を許容する。この配置にお いて、吸収／蛍光励起の重なりのみが重要である。前面蛍光測定は色素原性反応 生成物を通る２本の光路を必要とする。励起光及び蛍光発光の双方が、今や吸収 性発色団によって同時に影響をうけることができ、それによっていかなるデルタ 変化にも寄与し、最も好都合な状況を与える。図ＩＡの励起及び／又は発光に基 づく吸光度測定を参照。この状況において、蛍光団の励起及び発光に対応する２ つの区別された領域におけるスペクトルの変化が生み出される。

代わりに、ＣＯ７を生じる微生物は、もしその層がｐＨ非感受性蛍光団を含有す る化学的に不活性な光透過性マトリクスとスペクト。

ル的に組み合わさっているならば、ガス透過性プロトン不透過性マトリクス中に ｐＨ感受性発色団をカプセル化することによって検出することができる。蛍光発 光における変化は、溶液中の微生物の存在に相関させることができる。この場合 には、蛍光検出器は埋め込まれた蛍光団の下に配置することができる。

特に、蛍光に基づく吸光度測定を使用するアッセイの開発に必要な構成要素は次 のものを含む。

イ）　光透明マトリクス及び蛍光団の選択。

全ての用途に必須なわけではないが、材料の調製を単純化し且つ安定性及び有用 性を高めるためには、多くの基準を考慮しなければならない。

１、　関係領域におけるスペクトル的透明性。典型的には２５０ｎｍ−７００ｎ ｍ ２、　両極端のｐＨで化学的に不活性且つ安定であること。

３、　長期間にわたって、固定化した蛍光団とマトリクス環境の間でのいかなる 不安定化相互作用もないこと。

特に、エポキシに基づくシステムに関しては、上述のものに加えて必要な他の特 性がある。これらは次のものを含む。

１、　材料の配布を容易化する低い粘性。

２、　室温２５℃（８時間）硬化又は６５℃高温（１時間）硬化。

３、　反応容器、典型的には基板に結合するための粘着性を育すること。

上記の基準に適応させるため、紫外線硬化及びエポキシに基づく接着剤の双方を 使用してもよい。上記の全ての特性を示す最適な材料はＥ　ｐ　ｏ　ｔ　ｅ　ｋ 　ＴＩ′３０１　（Ｆ！ｐｏｘｙ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　！ｎｃｏｒｐｏｒａ ｔｅｄ　Ｉｎｃ。

Ｂ１１１ｅｒｉｃａ、　ＭＡ、）である。

色素原性アッセイにおける変化を示すために蛍光団を使用することは、蛍光団の 励起及び／又は発光スペクトルが発色団の吸収スペクトルと重なることを必要と する。非常に安定な蛍光性色素の一つは、７−ジニチルアミノー４−メチルクマ リン、ＤＭ　ｃｏｕｍａｒｉｎ　”（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）であ ることが判明している。この材料は、適当なスペクトル的要件を有しく励起３６ ５　ｎｍ、発色４５０ｎｍ）、それを下記の発色団試験に高度に適するものにし ている高い量子収率を有する。

下記の特定の用途においは、前面蛍光検出は、マルチウェル上の−の反応ウェル のオーバーヘッドモニタリングに使用される。

このモードにおいては白又は代わりのタイプの反射パネルを、集められる蛍光の 量を高めるために使用することができる。

これらの試験を開発するために使用した蛍光光度計は、限定されたスペクトル通 過幅励起（３６５ｎｍ）及び発光（４５０ｎｍ）を有する単一波長能力を有して いた。この光は、与えられたいかなる試験に対しても、吸光度変化における最大 速度を与えるスペクトル領域のみを調べることを提供する。

最適に組み合わせたときは、単一のマトリクス中にスペクトル的に重なり合う広 いスペクトル領域をカバーする一連の蛍光団を調製するとかできる。これは、い かなる発色団試験のためにもＵＶ、可視又は赤外スペクトル領域で使用できる一 般的な材料を提供するであろう。実際、可視及び赤外における蛍光団は、低コス トの白熱光源からの十分な光がある場合には、信号／ノイズ比が光の増大ととも に改善されることから、データの質の優位な改善を提供するであろう。可能な場 合には、しかしながら、発色団の収れん点、すなわち反応を通じて一定である発 色団スペクトルプロフィール内のスペクトル位置の使用が、発色団の吸収波長と して選択され、そしていがなるデルタ変化の測定のための内部標準を提供するた めにも選択される。図３を参照。

蛍光に基づく吸光度測定による発色団の濃度の定量的測定は以下の方法で達成さ れる。

この手順は、光源及び不活性蛍光マ）　ＩＪクスの間に色素原性反応生成物を置 くことにより、溶液中の反応混合（溶液が関係物質及び色素原性試薬を含む）生 成物の濃度測定のための一般的な目的アプローチの概略を示す。図ＬＡにおける ように、前面励起／発光検出蛍光光度計は、以下に基づく発色団の正確な予測を 許容する。

■）　色素原反応生成物の吸収スペクトルと蛍光団励起スペクトルとのスペクト ルの重なりによる、前面、単色、又は限られたスペクトル通過幅の蛍光団に達す る励起光の減衰。

ＴＩ）　色素原性反応生成物の吸収スペクトルと蛍光団発光スペクトルとのスペ クトルの重なりによる、前面の単色の又は限られたスペクトル通過幅の検出器に 達する発生した蛍光の減衰。

計算される実際の吸光度は上記の両方の吸収の寄与を含むであろう。この独特な 方法を実験的に証明する関連するグラフ及び計算を含む具体的な実施例の完全な 記述を以下に示す。

１）　分光光度計を用いた確認標準曲線の作成関係波長における組み合わせた吸 光度に基づき０．１乃至１．　０の吸光度範囲を与えるよう、一連の１度の共通 の水溶性色素を調製する。キシレノールブルーに関しては、４００−６００ｎｍ の間に光のスペクトル制御（吸収）が起こる。以下に論する蛍光団に調節するた めに、吸光度測定は水標準に対して行った。４００−６００ｎｍ範囲の励起及び 発光領域に対応する波長を任意に、すなわち５３０ｎｍ及び５９０ｎｍに選んだ 。これらの波長での吸光度をまとめ、合わせた吸光度（すなわち５３０ｎｍでの 吸光度＋５９０ｎｍでの吸光度＝吸光皮相）対濃度の標準曲線を得た。

比較的低１度での吸光度対濃度のプロット、すなわちＢｅｅｒ　Ｌａｍｂｅｒｔ 　Ｐｌｏｔは、原点を通る直線を与えるであろう。データへの最小二乗法直線当 てはめは、単位温度当たりの吸光度単位の正確な予測をもたらす。色素の未知濃 度の波長吸光度が特に必要ならば、分光光度法的に決定した励起及び発光波長の 一定の比率が使用できる。

いかなる蛍光測定においても、反射又は散乱の問題がこの測定を妨害しないこと を保証するため、蛍光光度計が光の励起及び発光波長を（十分なストークスシフ トを以て）区別できることが非常に重要である。

図４．５及び６は、ａ）吸光度データ、ｂ）蛍光に基づく吸光度データ及びＣ） 蛍光に基づく吸光度データ対吸光度データに対する、最小二乗法曲線当てはめ操 作の結果に関するデータを示す。

吸光度（和）＝Ｅ＊ｃ＊ｄを使用。

ここに、Ｅ＝両波長における組み合わせた吸光係数Ｃ＝濃度 ｄ＝光路長（１ｃｍ） Ｅ、すなわち新しい吸光係数が計算でき、次に記述の蛍光測定に基づく吸光度と 比較することができる。

２）　蛍光光度計を用いた吸光度に基づく蛍光測定の作成４００−６００ｎｍ領 域に励起及び発光スペクトル通過幅を有する適当な蛍光団を、アクリルマトリク スの透明なシートに埋め込む。このマトリクスのシートは、励起光が蛍光団に到 達する前に全１ｃｍのセル幅を横切らなければならないように前面蛍光光度計内 に置かれたＩｃｍのセルの１側面を形成する。同様に発する蛍光もまた蛍光光度 計によって検出される前に１ｃｍの光路を通過しなければならない。

最初に、慣用のセル中に水を入れ、蛍光団の蛍光強度（任意の単位）を評価する 。次いで、セルに別々にその範囲の色素溶液を入れ蛍光を測定する。蛍光強度は 今や、次の式を用いて、組み合わせた波長吸光度を決定するために使用すること ができる。

ｌｏｇ　１０　（Ｉ　ｍａ、／　Ｉ　ｓａｍｐ）　＝吸光度（５３０＋５９０） ここに、ｌ、、、＝水標準の蛍光強度 Ｉ　５ａｓｈ”サンプルの蛍光強度（図７参照）Ｓ＝効果的に光路長を拡張する （すなわちＣＯＳθ＝ａｄｊ／ｈｙｐ　＝　１．１）励起／発光の３０’の角度 に対する補正。

吸光度対濃度のプロットは、直線的であり該方法の数学的記述の直接の確認を提 供する分光光度法データに重なるであろう。

一旦上記の決定がなされれば、同じ色素のいかなる未知濃度も、該プロットを使 用し又は吸光係数を用いて直接に計算することができる。図８を参照。

以下の実施例は、本発明の詳細な説明するのに役立つ。試薬の濃度及び他の種々 のパラメーターは、本発明の方法を例示するためにのみ示すものでありそれらを 限定するものと解してはならない。

実施例１−　β−ラクタマーゼアッセイβ−ラクタマーゼは、ペニシリンのラク タム環の結合を開裂する酵素である。ラクタム環の開裂によりカルボキシル基が 生成する。

開裂は該抗生物質の効力をなくす。β−ラクタマーゼ活性を検出する一つの方法 は、開いたラクタム環と澱粉（ヨウ素親和性）との間での１１分子に対する競合 に基づく。このアッセイにおいては、Ｉ２は色素原性試薬である。ペニシリンの 開いたラクタム環は、β−ラクタマーゼ活性の化合物関連生成物である。ヨウ素 滴定法においては、Ｉ２は澱粉に非共有的に結合して強い青紫の色を生ずる。も しも埋め込まれた蛍光団が存在すれば、その蛍光は減少するであろう。β−ラク タマーゼの存在下においては、ペニシリンＧは修飾されモしてＩ２が開いたラク タム環に結合して、コンパートメントからの色の消失をもたらす。コンパートメ ントとの色が消失するとともに、蛍光が増大する。

試験は以下の通りに行った。

１、　埋め込まれた蛍光団の調製 発砲させないように注意しながら、１２ｍｌのエポキシ樹脂を２ｍｌの硬化剤と 共に５〜１０分間穏やかに混合し、次いで４ｍｌの混合物を除去して捨てた。７ −シメチルアミノー４−メチルクマリン、ＤＭ　ｃｏｕｍａｒｉｎ　”　（Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を１００％無水メタノールに１．０Ｘ１０−” Ｍの濃度に溶解し、４０μｌをエポキシ混合物の１０ｍ１に加えた。材料を更に １時間混合し、次いで５０μｌを白の９６ウエルのトレーのウェル内に配布した 。これは２ｍｍの有効鉛直光路を提供する。これは、約８ｍｍの水性アッセイの 光路長に対比される。

２、β−ラクタマーゼのアッセイ ０．５のマクファーランド濁度標準に等価の、食塩水／ブルロニック中の細菌分 離物の接種用懸濁液を調製し、そして３００μｌの該細菌性接種物を２５ｍｌ’ のＰｏｓ　１ｎｏｃｕｌｕ＋ａ”培地（Ｂａｘｔｅｒ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ 　Ｉｎｃ、、　ＭｉｃｒｏＳｃａｎ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　）に加えた。この接種 物の１１５ａｔを、０．８ｍｇ／ｍＪのペニシリンＧ　（Ｗｙｅｔｈ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｉｅｓ）、０，２％の澱粉（Ｊ、Ｔ、　Ｂａｋｅｒ）　、及びエポキ シに埋め込んだ蛍光団とを含む反応ウェルに加えた。次に、細菌分離物の未希釈 接種物の５０μｌを加えた。混合物を５％時間３７°Ｃにてインキュベートした 。最後に、５０μｍの２％ヨウ素溶液（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔ ｓ）、を加え、混合物を１０分間インキュベートした。

もしβ−ラクタマーゼが存在すれば、青い色は退色してなくなり、蛍光が増大す るであろう。

表１ 合計　５０　８７　１３７ β−ラクタマーゼ試験のための対照方法は、パンケージ挿入説明書に従って接種 されインキュベートされたＭｉｃｒｏＳｃａｎ　ＰＯ３慣用パネル（Ｓｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いることよりなる。これらの慣用の終夜結 果は、実施例１に開示の方法による５時間及び３０分で得られた結果と比較され た。

インドールは、ジメチルアミノシンナムアルデヒドと低ｐＨで反応させるとき緑 青色の複合体を形成する。このキノイド複合体の形成に際して３８５ｎｍ及び４ ５０ｎｍ（それぞれ、蛍光団励起及びグ　発色波長）の吸収のデルタ増大が起こ る（それぞれ、蛍光団励起及び発色波長）。両方の波長における吸光度の増大は 、検出される有）　効合計の蛍光変化を最大にする。色素原反応生成物を透過す る励起光及び検出される発光は減少するであろう。図ＩＡ、励起及び／又は発色 に基づく吸光度測定を参照。結果としておこる測定される蛍光の減少は存在する インドールの量に関係している。試験は次の用発泡させないよう注意しながら、 ６ｍ１のエポキシ樹脂を１ｍＩ！の硬化剤と共に５−１０分間緩やかに混合した 。これは製造業者の推奨する樹脂／硬化剤比率でないことに注意しなければなら ない。

それは硬化剤が過剰に存在する多数の実験から決定されたものであるからである 。過剰の硬化剤はウェルの表面に残留し、反応混合物と相互作用して偽の陽性反 応を生ずる。７−シメチルアミノー４−メチルクマリン、ＤＭ　Ｃｏｕ＋＋＋ａ ｒｉｎ　”　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）を１００％の無水メタノー ルに１．８Ｘ１０−”Ｍの１度に溶解し、６５μｌを硬化しつつあるエポキシ混 合物に加える。材料を更に１時間混合し、次いで５０μｌを９６穴のミクロタイ ター板の白のウェルに配布した。これは、有効鉛直光路長２ｍｍを提供する。こ れは約８ｍｍの水性アッセイの光路長に対比される。

２、　インドールのアッセイ ０．５のマクファーランド濁度標準に等価の、食塩水／ブルロニック中の細菌分 離物の接種用懸濁液を調製し、そして１１５μｌの該接種物を、エポキシに埋め 込んだ蛍光団に加えて、０３％のトリプトファン（Ｓｉｇｍａ）、０．１％のＢ ａｃｔｏ−ｐｅｐｔｏｎｅ（Ｄｉｒｃｏ）　、及び０．５％のＫＰＯ，緩衝液、 ｐＨ７，６を含む反応ウェルに加えた。反応混合物を３５℃で２時間インキュベ ートした。最後に、７５μｌの色素原試薬、１．２ＭのＨＣｌ中のジメチルアミ ノシンナムアルデヒドを加えた。混合物を１０分間反応させた。

もしインドールが分離物により生成されれば、反応混合物は緑色になるであろう 。蛍光の測定は最初の測定に比較して著明な減少をしめすであろう。この変化を 、次いで、反応混合物中に存在したインドールの１度に関係付けることができる 。この方法論は、必要とされるインキュベーション時間が約２時間でありこれは 約２４時間のインキュベーション時間を要する慣用のインドール試験とは対照的 であるという点において、慣用の方法論に対する改善である。

表２ インドール試験のための慣用の方法は、ＭｉｃｒｏＳｃａｎ　ＧＮ　１０専用板 （Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）用パッケージ挿入説明書に従って 行った。

インキュベーション時間は終夜であった。

実施例３　オキシダーゼアッセイ 更なる具体例においては、本原理は酵素オキシダーゼの検出に適用することがで きる。この酵素の存在又は不存在は、醗酵及び非醗酵細菌の両方の同定に使用さ れる。この試験は、大気中の酸素の存在下において、反応混合物の無色から實へ の変化を観察することによって、生物体のレドックス色素Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’　 −テトラメチル−ｐ−フェニレンジアミンを酸化する能力を検出する。もし、７ −メチル−アミノ−クマリン又は７−シメチルー４−メチル−クマリンのような 蛍光団が試験チャンバーの基板内のマトリクス中に固定化されていれば、酵素が 存在すればその蛍光は青色の形成によって消光されるであろう。色の強度が強い 程、７−メチル−アミノ−クマリン又はジメチルアミノ−４−メチルクマリンの 蛍光減衰は大き１）０．５のマクファーランド濁度標準に等価の、食塩水／ブル ロニック中の細菌分離物の接種用懸濁液を調製する２）　この接種物の５０μｌ を、基板上にエポキシに埋め込まれた蛍光団と、２．５ｍＭのＮ、　Ｎ、　Ｎ’ 、Ｎ’　−テトラメチル−ｐ−７二二レンジアミン（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍＭ のＮ−アセチルシスティン、５０ｍＭのコハク酸及び５０ｍＭのＮａＯＨ，ｐＨ ６，０に等価な乾燥材料を有するチャンバーに加える。上記の成分及びエポキシ に埋め込んだ基板上の蛍光団を含む対照チャンバーに５０μｌの食塩水を加える 。

３）　３５℃で２時間インキュベートする。前面蛍光光度計を用いて測定する。

図ＩＡ、励起及び／又は発光に基づく吸光度測定を参照。

４）　オキシダーゼ陽性生物体においては、蛍光の測定は対照に比して著明な減 少を示し、酸化されたＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’　−テトラメチル−ｐ−フェニレンジ アミンに関係づけられるであろう。

代わりに、零時間との比較における蛍光の減少は、オキシダーゼ活性の指標とす ることができよう。

実施例４　フェニルアラニン−アンモニア−分解酵素アッセイ更なる具体例にお いて、本原理は酵素フェニルアラニン−アンモニア−分解酵素（Ｌ−アミノ酸オ キシダーゼ、フェニルアラニンテスト、デアミナーゼテスト）の検出に適用でき る。この酵素の存在は、族のプロテアーゼの特異的認識及びＭｏｒａｘｅｌｌａ 　ｐｈｅｎｙｌｐｙｒｕｖｉｃａの同定に使用されてきた。この試験は、Ｌ−ア ミノ酸を脱アミノ化してα−ケト酸及びアンモニアを形成する生物体の能力を検 出する。合成化合物ｐ−ニトロフェニルアラニンを基質として使用して、酵素活 性は、ｐ−ニトロフェニルピルビン酸をもたらし、これはＮａＯＨの添加後の褐 色の外観により検出できる。もしも７−メチル−アミノ−クマリン又は７−ダニ チルアミン−４−メチル−クマリン（ＤＭＣ）のような蛍光団を使用すれば、ｐ −ニトロ−フェニルピルビン酸の量に関係した蛍光の消光が起こる。

試験は次の通りに行った。

玉！ １）０．５のマクファーランド濁度標準に等価の濁度に、食塩水／プルロニック 中に細菌分離物の接種物を調製する２）　この接種物の５０μｌを、壁に固定化 された蛍光団ジメチルクマリンと５ｍＭのＤＬ−β−（ｐ−ニトロフェニル）− アラニン（Ｋｏｃｈ　Ｌｉｇｈｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｏ，ＩＭのト リス（ヒドロキシ−メチル）メチルアミン、０．１ＭのＫＨ，ＰＯ２、ｐＨ８， ０に等価な乾燥材料を有するチャンバーに加える。上記の成分とチャンバーの基 板上に固定された蛍光団とを含む対照チャンバーに５０μｌの食塩水を加える。

３）　３５℃で２時間インキュベートする。

４）　インキュベート後、試験チャンバー及び対象チャンバーに０．２ＭのＮａ ＯＨの２５μｌを加える。もしｐ−ニトロフェニルピルビン酸が存在すれば、反 応混合物は黄褐色になるであろう。蛍光の測定は対象に比して著明なそして存在 するｐ−ニトロフェニルピルビン酸に関係づけられる減少を示すであろう。

実施例５　Ｖｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓｋａｕｅｒ試験更なる１の具体例においては、 本原理はＶｏｇｅｓ−Ｐｒｏｓｋａｕｅｒ（Ｖ　−Ｐ）試験陽性の生物体の検出 にも適用できる。Ｖ−Ｐ反応（Ｖｏｇｅｓ、　Ｏ。

ａｎｄ　Ｐｒｏｓｋａｕｅｒ、　Ｂ、　Ｂｅｉｔｒａｇ　ｚｕｒ　Ｅｒｎａｈｒ ｕｎｇｓｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅ　ｕｎｄ　ｄｅｒＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ− ｄｉａｇｎｏｓｅ　ｄｅｒ　Ｂａｋｔｅｒｉｅｎ　ｄｅｒ　ｈａｍｏｒｒｈａｇ ｉｓｃｈｅｎ　Ｓｅｐｔｉｃａｍｉｅ　Ｚ、　Ｈｙｇ、　Ｉｎｆｅｋｔ、　Ｋｒ 、　２８．２０．１８９８　）は、ブドウ糖又はピルビン酸からのアセトイン（ アセチル−メチル−カルビノール）及び／又はジアセチル（ブタンジオン）の生 成を検出する。この試験は、Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ、　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ａ及びＳａ　１ｍｏｎｅ　Ｉ　ｌａ属のメンバーをＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、 　Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ及び５ｅｒｒａｔｉａ属のそれから分離する際に重要で ある。その試験は、ピルビン酸ナトリウム（０，１Ｍ）、クレアチン（０，０７ ％）、ピロリン酸チアミン（０，２６ｍＭ）及びフタル酸緩衝液（０，０５Ｍ） 、ｐＨ４，８に等価の乾燥材料を含有するチャンバーの基板に固定化されたエス クリン（ｅｓｃｕｌｉｎ）、７−メチルアミノ−クマリン又は７−シメチルアミ ノー４−クマリンのような蛍光団よりなる。

門 濁度において０．５のマクファーランド濁度標準に等価の細菌性接種物の５０μ ｌを試験コンパートメントに加える。食塩水の５０μｌを対象コンパートメント に加える。３５℃における２時間のインキュベーションの後、ＩＭのＮａＯＨ中 の２．５％のナフトール溶液の２５μｌを、試験及び対象チャンバーの双方に加 える。陽性反応は、赤色の呈色及び前面蛍光測定によって同時に起こる測定され る蛍光の減少によって示される。図１１励起及び／又は発光に基づく吸光度測定 を参照。

本原理の更なる具体例は、イムノアッセイ技術例えば、直接又はサンドイッチ、 ＥＬＩＳＡアッセイにおける抗体に結合したｌ々−オキシダーゼの活性の測定等 において使用することができよう。反応チャンバー内に固定化された蛍光団の蛍 光の消光は、２．２−アジノージ−（３−エチルベンゾチアゾリンスルホン−６ ）ジアンモニウム塩基賀と反応する酵素による色の変化を検出するのに使用する ことができよう。

同様な具体例は、それに対して酵素分子が結合するものである核酸プローブの結 合の測定に適用できよう。前記酵素の活性は、固定化された蛍光団の蛍光を制御 することのできる生成物を遊離する色素原基質に対する作用によって実証される 。

本明細書及び実施例は説明のためのものであって本発明を限定するものでないこ と、及び、本発明の精神及び範囲内の他の具体例はそれら自身当業者に示唆され ているであろうことは理解しなければならない。

Σ（ Ｋ キシレノールブルー ボ 寥 寥 ポ 刺 特表千５−５０３３６５　（１０） 寸 寥 猷 頼 ■　◆　（ 寥の 要約書 本発明は、蛍光強度を測定するための蛍光光度計検出器を使用して、比色的、濁 度測定的又は比濁分析的反応におけるいがなる物質の１度をも定量する方法に関 する。特に、不活性のマトリクス中の蛍光団の蛍光強度の測度を観察することに よって色の変化をモニターすることができる。発色団の吸収スペクトルは蛍光団 の励起及び／又は発光スペクトルに重なり、それによって蛍光における変化を反 応における色の強度に、従って関係物質の量に関係づけることを許容する。

補正嘗の翻訳文提出書（特許法第１８４条の７第１項）巳 「　特許庁長官　殿 り　１　特許出願の表示 ン　ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０８１１８ メ　２　発明の名称 蛍光の変化をモニターすることによる色反応の測定３　特許出願人 住　所　アメリカ合衆国６００１５、イリノイ、ディヤフィールド、バクスター バークウェイ１ 名　称　バクスター、ダイアグノスチックス、インコーホレイテッド 国　籍　アメリカ合衆国 ４、代理人 住　所　大阪市中央区淡路町２丁目１番１３号　弘栄ビル１９９２年４月６日 ６　添付書類の目録 （１）　補正書の翻訳文　１通 補正嘗の翻訳文 請求項１２及び１４を特徴する 請求項ｌ乃至８を別紙の補正した請求項１乃至４におきかえる。

その他の請求項は変更なく、請求項の番号を新たにする。

補正に係る請求の範囲 １、　溶液中の物質の存在を検出する方法であって、透過光路を形成する光線を 発する光源を提供し、前記物質及び色素原性試薬を含有する溶液を前記光路中に 置き、前記光源と、化学的に不活性の光透過性のマトリクス中に埋め込まれた隔 離された蛍光団であって前記色素原性ｇ＊と検出されている前記物質との反応に よって形成される発色団の吸収スペクトルに重なる励起スペクトルを有するもの である蛍光団との間に、前記光路を横切るように前記溶液を挟み込み、そして該 発色団によって減衰され又は高められる光の結果生ずる蛍光団の発光の変化を検 出することよりなる方法。

２、　溶液中の物質の存在を検出する方法であって、透過光路を形成する光線を 発する光源を提供し、前記物質及び色素原性試薬を含有する溶液を前記光路中に 置き、前記光源と、化学的に不活性の光透過性のマトリクス中に埋め込まれた隔 離された蛍光団であって前記色素原性試薬と検出されている前記物質との反応に よって形成される発色団の吸収スペクトルに重なる励起スペクトルを有するもの である蛍光団との間に、前記光路を横切るように前記溶液を挟み込み、そして該 発色団によって減衰され又は高められる光をもたらす蛍光団の発光の変化を検出 することよりなる方法。

３　溶液中の物質の存在を検出する方法であって、透過光路を形成する光線を発 する光源を提供し、前記物質及び色素原性試薬を含有する溶液を前記光路中に置 き、前記光源と、化学的に不活性の光透過性のマトリクス中に埋め込まれた隔離 された蛍光団であって前記色素原性試薬と検出されている前記物質との反応によ って形成される発色団の吸収スペクトルに重なる発光スペクトルを有するもので ある蛍光団との間に、前記光路を横切るように前記溶液を挟み込み、そして該発 色団によって減衰され又は高められる光の結果生ずる蛍光団の発光の変化を検出 することよりなる方法。

４　溶液中の物質の存在を検出する方法であって、透過光路を形成する光線を発 する光源を提供し、前記物質及び色素原性試薬を含有する溶液を前記光路中に置 き、前記光源と、化学的に不活性の光透過性のマトリクス中に埋め込まれた隔離 された蛍光団であって前記色素原性試薬と検出されている前記物質との反応によ って形成される発色団の吸収スペクトルに重なる発光スペクトルを有するもので ある蛍光団との間に、前記光路を横切るように前記溶液を挟み込み、そして該発 色団によって減衰され又は高められる光をもたらす蛍光団の発光の変化を検出す ることよりなる方法。

国際調査報告　。、ア７．１．。、ｚｎａ’ｎ。

０発　明　者　オルソン、キャロライン、シエルチュク アメリカ合衆国９５６１６、カリフォルニア、デービス、エルマセロドドライブ 　１２８９

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．溶液の光透過性特性を直接的に又は間接的に変化させるよう機能する物質を 検出し又は濃度を定量するための方法であって、イ）透過光路を形成する光線を 提供し、ロ）該光路中に前記物質を含む溶液を提供しハ）改善が、化学的に不活 性な光透過性マトリクス中の蛍光団を前記光路を横切るように配置することにあ り、そしてニ）前記物質の存在又は濃度を測定するために蛍光団の発光の変化を 検出することよりなる方法。
2. ２．前記透過性特性が比色定量的、濁度測定的、比濁分析的である、請求項１に 記載の方法。
3. ３．当該物質又は当該物質に関係づけられた物質と反応して色素原性反応生成物 を形成する色素原性試薬を用いて溶液中の物質の存在を検出し又は濃度を定量す る方法であって、該色素原性反応生成物が蛍光団及び蛍光検出器に達する光を制 御するように蛍光団の励起及び発光スペクトルと重なる吸収スペクトルを有する ものである方法あり、 イ）透過光路を形成する光線を提供し、ロ）該光路中に前記物質及び前記色素原 性試薬を含んだ溶液を置き、 ハ）前記色素原性反応生成物の吸光度スペクトルに重なる励起及び発光スペクト ルを有する、化学的に不活性の光透過性マトリクス中の蛍光団を発色団によって 制御された光を横切るように置き、ニ）前記物質の存在又は濃度を測定するため に蛍光団の発光の変化を検出することよりなる方法。
4. ４．前記検出器が前面蛍光光度計である、請求項３に記載の方法。
5. ５．当該物質又は当該物質に関係づけられた物質と反応し蛍光団から発せられる 光及び蛍光検出器に達する光を制御するよう蛍光団の励起及び発光スペクトルと 重なる吸収スペクトルを有するものである色素原性反応生成物を形成する色素原 性試薬を用いて溶液中の物質の存在を検出し又は濃度を定量する方法であって、 イ）透過光路を形成する光線を提供し、ロ）前記色素原性反応生成物の吸収スペ クトルに重なる発光スペクトルを有する、化学的に不活性な光透過性マトリクス 中に蛍光団を前記光路を横切るように置き、 ハ）蛍光により制御された光を横切るように、前記物質及び色素原性試薬を含む 溶液を置き、そして ニ）前記物質の存在又は濃度を測定するために蛍光団の発光の変化を検出するこ とよりなる方法。
6. ６．前記蛍光検出器が慣用の（直角）蛍光光度計又は前面蛍光光度計である、請 求項５に記載の方法。
7. ７．当該物質又は当該物質に関係づけられた物質と反応し蛍光団及び蛍光検出器 に達する光を制御するよう蛍光団の励起スペクトルと重なる吸収スペクトルを有 するものである色素原性反応生成物を形成する色素原性試薬を用いて溶液中の物 質の存在を検出し又は濃度を定量する方法であって、 イ）透過光路を形成する光線を提供し、ロ）前記物質及びを含む溶液を前記光路 中に置き、ハ）前記発色団の吸収スペクトルに重なる励起スペクトルを有す、化 学的に不活性な光透過性マトリクス中の蛍光団を前記光を横切るように置き、 ニ）前記物質の存在又は濃度を測定するために蛍光団の発光の変化を検出するこ とよりなる方法。
8. ８．前記蛍光検出器が慣用の（直角）蛍光光度計又は前面蛍光光度計である、請 求項７に記載の方法。
9. ９．請求項３、５又は７に記載の方法において使用する反応チャンバーであって 、 イ）前記制御された光を横切るように前記反応チャンバー内におかれた、色素原 性反応生成物の吸収スペクトルに重なる発光又は励起スペクトルを有する、不活 性の光透過性マトリクス中に囲い込まれ又は埋め込まれた蛍光団、及び ロ）未知物質の存在を検出し又は濃度を定量するために制御された光をモニター する手段とからなるチャンバー。
10. １０．前記不活性のマトリクスがエポキシである、請求項９に記載の反応チャン バー。
11. １１．光制御剤としての色素原性反応生成物と蛍光を検出するための蛍光光度法 検出器とを用いて物質の存在を検出し又は濃度を定量するための請求項３に記載 の方法を実施するためのキットであって、 イ）前記制御された光を横切るように当該容器中に置かれた、発色団の吸収スペ クトルに重なる発光及び励起スペクトルを有する、不活性の光透過性マトリクス 中の蛍光団を収容した第１の容器、及び ロ）色素原性試薬を収容した第２の容器からなるキット。
12. １２．前記第１の容器がマルチウェルプレート又はセルよりなる群より選ばれる ものである、請求項１１に記載のキット。
13. １３．光制御剤としての色素原性反応生成物と蛍光を検出するための蛍光光度法 検出器とを用いて未知物質の存在又は濃度を検出するための請求項５に記載の方 法を実施するためのキットであって、イ）前記制御された光を横切るように当該 容器中に置かれた、発色団の吸収スペクトルに重なる発光スペクトルを有する、 不活性の光透過性マトリクス中の蛍光団を収容した第１の容器、及びロ）色素原 性試薬を収容した第２の容器からなるキット。
14. １４．前記第１の容器がマルチウェルプレート又はセルよりなる群より選ばれる ものである、請求項１３に記載のキット。
15. １５．光制御剤としての色素原性反応生成物と蛍光を検出するための蛍光光度法 検出器とを用いて未知物質の存在又は濃度を検出するための請求項５に記載の方 法を実施するためのキットであって、イ）前記制御された光を横切るように当該 容器中に置かれた、発色団の吸収スペクトルに重なる励起スペクトルを有する、 不活性の光透過性マトリクス中の蛍光団を収容した第１の容器、及びロ）発色試 薬を収容した第２の容器からなるキット。
16. １６．前記第１の容器がマルチウェルプレート又はセルよりなる群よりえらばれ るものである、請求項１５に記載のキット。