DE68926529T2

DE68926529T2 - Schnelle Methode zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Sterilisierungs-Zyklus sowie ein schnell arbeitender biologischer Indikator

Info

Publication number: DE68926529T2
Application number: DE68926529T
Authority: DE
Inventors: William E. 2501 Hudson Road St.Paul Mn 55133-3427 Foltz; Richard R. 2501 Hudson Road St.Paul Mn 55133-3427 Matner; Lewis P. 2501 Hudson Road St.Paul Mn 55133-3427 Woodson
Original assignee: Minnesota Mining and Manufacturing Co
Current assignee: 3M Co
Priority date: 1988-11-29
Filing date: 1989-11-22
Publication date: 1997-01-09
Anticipated expiration: 2009-11-23
Also published as: EP0371682A2; ES2087087T3; AU616069B2; CA2002902C; KR0163168B1; EP0371682A3; DE68926529D1; JP2799203B2; AU4469589A; US5073488A; KR900008033A; JPH02195898A; CA2002902A1; EP0371682B1

Description

Gebiet der Erfindung.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Schneilverfahren zur Ermittlung der Wirksamkeit eines Sterilisationszyklus. Insbesondere wird bei der vorliegenden Erfindung ein Enzym verwendet, dessen Aktivität mit der Lebensfähigkeit wenigstens eines Keimes korreliert werden kann, der üblicherweise zur überwachung der Wirksamkeit der Sterilisation verwendet wird und im folgenden als "Testkeim" bezeichnet wird. Nach einem Sterilisationszyklus, der für den Testkeim subletal ist, ist das Enzym immer noch aktiv genug, um in einem relativ kurzen Zeitraum, z.B. normalerweise innerhalb von 8 Stunden oder weniger, mit einem Enzymsubstrat zu reagieren Das Enzym wird jedoch nach einem Sterilisationszyklus, der für den Testkeim letal ist, inaktiviert bzw. in seiner Aktivität merklich eingeschränkt. Die Erfindung betrifft des weiteren biologische Sterilitätsindikatoren, die ein solches Enzym enthalten.

Hintergrund der Erfindung

Biologische Indikatoren und chemische Indikatoren, die zur Ermittlung der Wirksamkeit der Sterilisation verwendet werden, sind im Stand der Technik wohlbekannt. Bei herkömmlichen biologischen Indikatoren wird ein Testkeim, der um ein Vielfaches widerstandsfähiger ist gegenüber dem verwendeten Sterilisationsverfahren als die meisten Keime, die aufgrund der natürlichen Kontamination vorhanden wären, auf einen Träger aufgetragen und zusammen mit den zu sterilisierenden Gegenständen in die Sterilisationsvorrichtung eingelegt. Nach Abschluß des sterilisationszyklus wird der Träger in einem Nährmediuin inkubiert, um festzustellen, ob einer der Testkeime den Sterilisationsvorgang überlebt hat. Das Wachstum einer nachweisbaren Anzahl von Keimen dauert normalerweise mindestens 24 Stunden. Während dieser Zeit sollten die angeblich sterilisierten Gegenstände in Quarantäne gehalten werden.
In der Praxis gibt es in der Klinik jedoch meistens weder den Platz, um die angeblich sterilisierten Gegenstände entsprechend in Quarantäne zu halten, noch eine ausreichende Anzahl solcher Gegenstände, um Quarantänemaßnahmen wirklich durchführen zu können. Infolgedessen werden die angeblich sterilisierten Gegenstände wieder in das Lager zurückgelegt, in der Annahme, daß die Sterilisation ordnungsgemäß durchgeführt wurde, und daß dies durch einen späteren Bericht des Labors bestätigt wird.
Bei handelsublichen chemischen Indikatoren werden Chemikalien verwendet, die die Sterilität durch Farbänderungen oder durch einen übergang vom festen in den flüssigen Zustand anzeigen. Der Vorteil solcher Indikatoren besteht darin, daß die Ergebnisse am Ende des Sterilisationszyklus bekannt sind. Diese Ergebnisse zeigen jedoch nur an, wie bei der im US-Patent Nr. 4,448,548 beschriebenen Vorrichtung, daß eine bestimmte Temperatur für einen bestimmten Zeitraum erreicht wurde; oder, wie im US-Patent Nr. 4,348,209, daß Ethylenoxidgas vorhanden war. Diese Vorrichtungen zeigen nicht an, ob alle zum Inaktivieren des Testkeims erforderlichen Bedingungen gegeben waren. Nur der lebende Keim kann die wirklichen Beziehungen zwischen physikalischen und chemischen Parametern feststellen, die vorhanden sein müssen, um die Sterilität zu beeinflussen. Auf dem Gebiet der Sterilisation wird daher allgemein anerkannt, daß biologische Tests die genauesten Sterilitätstests sind.
Es besteht jedoch nach wie vor ein Bedarf an einem Sterilitätsindikator, der schnelle Ergebnisse liefert, aber dennoch ein hohes Maß an Sicherheit bietet, daß alle zum Erreichen der Sterilisation notwendigen Parameter einschließlich der miteinander in Beziehung stehenden Parameter wie Zeit, Temperatur und Feuchtigkeitskonzentration, Chemikalien- oder Strahlungsdosis, gegeben sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Ermittlung der Wirksamkeit eines Sterilisationszyklus und zur Feststellung, ob es sich bei den Sterilisationsmedien um Dampf, trockene Wärme, Strahlung, Ethylenoxid oder andere gasförmige oder flüssige Stoffe handelt, wobei das Verfahren die Zuverlässigkeit der herkmmlichen biologischen Indikatoren mit einer Geschwindigkeit kombiniert, die näher bei der Geschwindigkeit der chemischen Indikatoren liegt. Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren und Vorrichtungen zur Anzeige der Wirksamkeit der Sterilisation bereit, die in den meisten Fällen innerhalb von acht Stunden ein Scheitern des Sterilisationsvorganges anzeigen können.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur raschen Ermittlung der Wirksamkeit eines Sterilisationszyklus bereit, das gekennzeichnet ist durch die folgenden Schritte:
a) den Sterilisationszyklus einer Quelle für aktives Enzym aussetzen, die eine nachweisbare Menge des Enzyms liefert, wobei das Enzym nach einem Sterilisationszyklus, der für wenigstens einen, üblicherweise zur überwachung der Sterilisation verwendeten Testkeim subletal ist, eine ausreichende Wirksamkeit besitzt, um mit einer wirksamen Menge eines Substratsystems für das Enzym zu reagieren, so daß innerhalb von weniger als vierundzwanzig Stunden ein nahweisbares enzymmodifiziertes Produkt entsteht, wobei das Enzym nach einem Sterilisationszyklus, der für den Testkeim letal ist, inaktiviert bzw. in seiner Wirksamkeit eingeschränkt ist,
b) nach Beendigung des Sterilisationszyklus Inkubieren des Enzyms mit einer wirksamen Menge des Enzymsubstratsystems für eine Zeitdauer und unter Bedingungen, die ausreichen, um die Reaktion jedes aktiv bleibenden Enzyms mit dem Substrat zu beschleunigen.
Das Reaktionsgemisch wird dann beispielsweise in einem Fluorimeter oder einem Kolorimeter untersucht, um feststellen zu können, ob ein enzymmodifiziertes Produkt vorhanden ist. Das Vorhandensein eines nachweisbaren enzymmodifizierten Produkts über dem Untergrund innerhalb eines festgelegten Zeitraums (je nach der Art des Enzyms und des Substrats, der jeweiligen Konzentration und den Inkubationsbedingungen) deutet auf ein Scheitern des Sterilisationsvorgangs hin. Das Fehlen eines nachweisbaren enzymmodifizierten Produkts innerhalb des festgelegten Zeitraums deutet auf einen Sterilisationszyklus hin, der für den Testkeim letal war und daher ordnungsgemäß abgelaufen ist.
Die Quelle für aktives Enzym kann das von einem Keim isolierte gereinigte Enzym sein oder ein Keim, der selbst üblicherweise zur überwachung der Sterilisation verwendet wird, wie zum Beispiel Bacillus stearothermophilus oder Bacillus subtilis. Wenn ein solcher Keim als Enzymquelle verwendet wird, kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung den folgenden Schritt umfassen:
c) die nach Beendigung des Sterilisationszyklus noch lebenden Keime mit einem wäßrigen Nährmedium inkubieren, das in der Lage ist, bei der Inkubation das Wachstum der noch lebenden Keime zu beschleunigen, und mit einem Detektormaterial, das entsprechend dem Wachstum der Keime unter Bedingungen, die geeignet sind, das Wachstum der noch lebenden Keime zu beschleunigen, eine nachweisbare Änderung erfahren kann.
Die vorliegende Erfindung stellt des weiteren schnell ablesbare Sterilitätsindikatoren bereit, die bei der praktischen Durchführung der oben beschriebenen Verfahren von Nutzen sind. Ein solcher Sterilitätsindikator umfaßt folgendes:
a) einen äußeren Behälter (10) mit flüssigkeitsundurchläs sigen und im wesentlichen nicht gasabsorbierenden Wänden (12), wobei der Behälter (10) wenigstens eine Öffnung (14) aufweist; und
b) eine gasdurchlässige, bakterienundurchlässige Einrichtung (22), welche die Öffnung (14) bedeckt; dadurch gekennzeichnet, daß
in dem äußeren Behälter (10) eine nachweisbare Menge eines isolierten aktiven Enzyms enthalten ist, wobei das Enzym nach einem Sterilisationszyklus, der für wenigstens einen üblicherweise zur überwachung der Sterilisation verwendeten Testkeim subletal ist, eine ausreichende Aktivität besitzt, um mit einer wirksamen Menge eines Substratsystems für das Enzym zu reagieren, so daß innerhalb von weniger als vierundzwanzig Stunden ein nachweisbares enzymmodifiziertes Produkt entsteht, wobei das Enzym jedoch nach einem Stenlisationszyklus, der für den Testkeim letal ist, inaktiviert oder in seiner Wirksamkeit eingeschränkt ist.
Ein weiterer schnell ablesbarer Sterilitätsindikator umfaßt folgendes:
a) einen äußeren Behälter (10) mit flüssigkeitsundurchlässigen und im wesentlichen nicht gasabsorbierenden Wänden (12), wobei der Behälter (10) wenigstens eine Öffnung (14) aufweist;
b) eine gasdurchlässige, bakterienundurchlässige Einrichtung (22), welche die Öffnung (14) bedeckt;
c) in dem äußeren Behälter (10) eine Quelle für aktives Enzym in einer nachweisbaren Konzentration, wobei das Enzym nach einem Sterilisationszyklus, der für wenigstens einen üblicherweise zur überwachung der Sterilisation verwendeten Testkeim subletal ist, eine ausreichende Aktivität besitzt, um mit einer wirksamen Menge eines Substratsystems für das Enzym zu reagieren, so daß innerhalb von weniger als vierundzwanzig Stunden ein nachweisbares enzymmodifiziertes Produkt entsteht, wobei das Enzym jedoch nach einem Sterilisationszyklus, der für den Testkeim letal ist, inaktiviert oder in seiner Wirksamkeit eingeschränkt ist;
außerdem befindet sich in dem Behälter (10) eine wirksame Menge eines Enzymsubstrats, das in wäßriger Lösung mit einem aktiven Enzym reagieren kann, so daß ein nachweisbares enzymmodifiziertes Produkt entsteht.
Die Tatsache, daß die vorliegende Erfindung zur raschen Ermittlung der Wirksamkeit eines Sterilisationszyklus in der Lage ist, basiert auf der Entdeckung, daß:
1) bestimmte Enzyme noch aktiv sind, nachdem ein Sterilisationszyklus durchgeführt wurde, der marginal ausreicht, um die Testkeime abzutöten, deren Lebensfähigkeit mit der Aktivität des Enyzms korreliert; und
2) die Enzymaktivität nach dem marginalen Sterilisationszyklus ausreicht, um ein Substratsystem für dieses Enzym innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums, z.B. im allgemeinen innerhalb von weniger als etwa acht Stunden, in eine nachweisbare Produktmenge umzuwandeln.
wenn ein Testkeim zusammen mit dem Enzym bzw. als Enzymquelle verwendet wird, können Testkeime nur in einer sehr geringen Anzahl den marginalen Sterilisationszyklus überleben. Im Zusammenhang mit den inaktivierten Keimen ist die Enzymaktivität jedoch ausreichend, um ein Scheitern der Sterilisation anzeigen zu können.
Das Enzymnachweisverfahren der vorliegenden Erfindung funktioniert bei marginalen Sterilisationszyklen absolut sicher, weil die Enzyme der vorliegenden Erfindung widerstandsfähiger sind gegen die Sterilisationsbedingungen als der Testkeim. Bei weniger vollständigen Sterilisationszyklen kann aufgrund des Vorhandenseins einer nachweisbaren Menge eines enzymmodifizierten Produkts und damit aufgrund des Vorhandenseins einer Enzymaktivität vorhergesagt werden, ob der Testkeim überlebt bzw. lebensfähig ist, wenn er den gleichen Sterilisationsbedingungen ausgesetzt und für mindestens 24 Stunden mit Nährmedium inkubiert wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist eine Querschnittsansicht einer Ausführungsform eines Sterilitätsindikators der vorliegenden Erfindung, wo die Verschlußvorrichtung 26 abgenommen ist.
Fig. 2 ist eine auseinandergezogene perspektivische Ansicht des Sterilitätsindikators von Fig. 1 mit der Verschlußvorrichtung 26.
Fig. 3 ist eine Querschnittsansicht einer bevorzugten Ausführungsform eines Indikators der vorliegenden Erfindung, wo sich der Verschluß 56 in der geschlossenen Position befindet.
Fig. 4 ist eine auseinandergezogene perspektivische Ansicht des Indikators von Fig. 3.
Fig. 5 ist eine Querschnittsansicht einer weiteren bevorzugten Ausführungsform eines Sterilitätsindikators der vorliegenden Erfindung, wobei sich der Verschluß 86 in der offenen Position befindet.
Fig. 6 ist eine auseinandergezogene perspektivische Ansicht des Sterilitätsindikators von Fig. 5.
Fig. 7 ist eine graphische Darstellung der relativen Fluoreszenz im Vergleich zur Inkubationszeit für Sterilitätsindikatoren der vorliegenden Erfindung, nach einem für verschiedene Zeitdauern durchgeführten Sterilisationszyklus.
Fig. 8 ist ebenfalls eine graphische Darstellung der relativen Fluoreszenz im Vergleich zur Inkubationszeit für Sterilitätsindikatoren der vorliegenden Erfindung, nach einem für verschiedene Zeitdauern durchgeführten Sterilisationszyklus.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung nützlichen Enzyme sind Enzyme umfassend extrazelluläre und intrazelluläre Enzyme, deren Aktivität mit der Lebensfähigkeit von mindestens einem üblicherweise zur überwachung der Wirksamkeit der Sterilisation verwendeten Keim korreliert, der nachfolgend als "Testkeim" bezeichnet wird. Unter "korreliert" ist zu verstehen, daß die Enzymaktivität über dem Untergrund zur Vorhersage des zukünftigen Wachstums des Testkeims herangezogen werden kann. Bei dem Enzym muß es sich um ein Enzym handeln, das nach einem Sterilisationszyklus, der für den Testkeim subletal ist, hinreichend aktiv bleibt, um innerhalb von 24 Stunden, und in bevorzugten Ausführungsformen innerhalb von 8 Stunden oder weniger, mit einem Substratsystem für das Enzym zu reagieren, jedoch nach einem Sterilisationszyklus, der für den Testkeim letal wäre, inaktiviert bzw. in seiner Aktivität merklich eingeschränkt wird.
Der folgende Test hat sich bei der Identifikation jener Enzyme als nützlich erwiesen, die die erforderlichen Eigenschaften aufweisen, um bei erfindungsgemäßen Vorrichtungen und Verfahren zur überwachung der Sterilisation von Nutzen zu sein. Unter Sterilisationsbedingungen, die gerade noch ausreichen, um die Population von 1 x 10&sup6; Testkeimen um etwa 6 log zu reduzieren, besitzt das Enzym eine Restaktivität gleich dem "Untergrund", gemessen durch Reaktion mit einem Substratsystem für das Enzym; unter Sterilisationsbedingungen, die lediglich ausreichen, um die Population von 1 x 10&sup6; Testkeimen um mindestens 1 log, aber weniger als 6 log, zu reduzieren, besitzt das Enzym jedoch eine Aktivität größer als der "Untergrund", gemessen durch Reaktion mit dem Enzymsubstratsystem. Das Enzymsubstratsystem ist eine Substanz bzw. Mischung von Substanzen, auf die das Enzym einwirkt, um ein nachweisbares, z.B. fluoreszierendes oder farbiges, enzymmodifiziertes Produkt zu erzeugen. Die Enzymaktivität wird gemessen anhand der Menge des erzeugten, nachweisbaren enzymmodifizierten Produkts. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Enzym um ein Enzym, das nach Stenlisationsbedingungen, die nicht ausreichen, um die Population des Testkeims um 6 log zu reduzieren, noch ausreichend Aktivität besitzt, um mit dem Enzymsubstratsystem zu reagieren und innerhalb von 24 Stunden, vorzugsweise innerhalb von 8 Stunden oder weniger, und am meisten bevorzugt innerhalb von 2 Stunden oder weniger eine nachweisbare Menge eines enzymmodifizierten Produkts zu erzeugen.
Vorzugsweise ist die Aktivität des Enzyms nach Sterilisationsbedingungen, die nicht ausreichen, um die Keimpopulation um 6 log zu reduzieren, mindestens 2 % größer, und noch mehr bevorzugt mindestens 5 % größer als der Untergrund, und liegt am meisten bevorzugt mindestens 10 % über dem Untergrund. Es versteht sich, daß der Grad der restlichen Enzymaktivität, der für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als "Untergrund" bezeichnet wird, höher sein kann als der durch spontane Umwandlung des Enzymsubstrats in das Produkt nach der vollständigen und irreversiblen Inaktivierung des Enzyms erreichte Aktivitätsgrad.
Enzyme, die dem oben beschriebenen Test standhalten können, sind beispielsweise hydrolytische Enzyme aus sporenbildenden Keimen. Solche Enzyme umfassen β-D-Glucosidase, α-D- Glucosidase, alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, Butyratesterase, Caprylatesteraselipase, Myristatlipase, Leucinaminopeptidase, Valinaminopeptidase, Chymotrypsin, Phosphohydrolase, α-D-Galactosidase, β-D-Galactosidase, α- L-Arabinofuranosidase, N-Acetyl-β-glucosaminidase, β-D-Cellobiosidase, Alaninaminopeptidase, Prolinaminopeptidase, Tyrosinaminopeptidase, Phenylalaninaminopeptidase, β-D-Glucuronidase, und eine aus sporenbildenden Keimen wie z.B. Candida, Bacillus und Clostridium gewonnene Fettsäure esterase
Besonders nützliche Enzyme aus Bacillus stearothermophilus sind beispielsweise α-D-Glucosidase, β-D-Glucosidase, alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, Butyratesterase, Caprylatesteraselipase, Leucinaminopeptidase, Chymotrypsin, Phosphohydrolase, α-D-Galactosidase, β-D-Galactosidase, Alaninaminopeptidase, Tyrosinaminopeptidase und Phenylalaninaminopeptidase und eine Fettsäureesterase. Besonders nützliche Enzyme aus Bacillus subtilis sind beispielsweise α-L-Arabinofuranosidase, β-D-Glucosidase, N-Acetyl-β-glucosaminidase, β-D-Cellobiosidase, Alaninaminopeptidase, Prolinaminopeptidase, Tyrosinaminopeptidase, Leucinaminopeptidase und Phenylalaninaminopeptidase.
β-D-Glucosidase und α-L-Arabinofuranosidase aus Bacillus subtilis sind besonderes nützlich bei der Überwachung der Ethylenoxid-Sterilisation. α-D-Glucosidase aus Bacillus stearothermophilus ist besonders nützlich für die Überwachung der Bedingungen bei der Dampfsterilisation.
Die Quelle für aktives Enzym kann folgendes sein:
1) das aus einem geeigneten Keim gewonnene gereinigte, isolierte Enzym;
2) ein Keim, aus dem das Enzym stammt, oder dem das Enzym durch Genmanipulation eingepflanzt wurde; oder
3) ein Keim, dem das Enzym während der Sporenbildung bzw. während des Wachstums eingepflanzt wurde, so daß das Enzym in dem Keim enthalten ist oder zu diesem gehört, z.B. ein während der Sporenbildung einer Spore eingepflanztes Enzym, das damit in der Spore enthalten ist. Bevorzugte Keime, die als Quelle für ein bei der praktischen Dürchführung der vorliegenden Erfindung nützliches Enzym verwendet werden können, sind Bakterien oder Pilze im Sporenzustand bzw. im vegetativen Zustand. Besonders bevorzugte Enzymquellen sind beispielsweise die Keimarten Bacillus, Clostridium, Neurospora und Candida.
Wenn ein Keim als Quelle für aktives Enzym verwendet wird, kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung den Schritt des Inkubierens aller noch lebenden Keime mit einem wäßrigen Nährmedium nach Abschluß des Sterilisationszyklus umfassen. Mit diesem Schritt wird anhand herkömmlicher Verfahren bestätigt, ob die Sterilisationsbedingungen ausreichend waren, um alle Keime in dem Indikator abzutöten, was darauf hindeutet, daß die Sterilisationsbedingungen ausreichend waren, um alle Gegenstände in der Sterilisationsvorrichtung zu sterilisieren. Wenn das Keimwachstum in herkömmlicher Weise zur Bestätigung der Ergebnisse des Enzymtests herangezogen wird, sollte es sich um einen Keim handeln, der herkömmlicherweise zur Überwachung der Sterilisationsbedingungen verwendet wird. Diese herkömmlicherweise verwendeten Keime sind im allgemeinen um ein Vielfaches widerstandsfähiger gegenüber dem verwendeten Sterilisationsverfahren als die meisten bei einer natürlichen Kontamination auftretenden Keime. Die Bakterienspore gilt als die widerstandsfähigste Form mikrobiellen Lebens. Dies ist die Lebensform der Wahl bei allen Tests zur Ermittlung der Sterilisationswirksamkeit von Vorrichtungen, Chemikalien und Verfahren. Sporen aus den Keimarten Bacillus und Clostridia werden am häufigsten verwendet, um Sterilisationsvorgänge unter Verwendung von Sattdampf, trockener Wärme, Gammastrahlung und Ethylenoxid zu überwachen.
Besonders bevorzugte Keime, die allgemein zur Überwachung der Sterilisationsbedingungen verwendet werden, umfassen Bacillus stearothermophilus und Bacillus subtilis. Bacillus stearothermophilus ist besonders nützlich zur Überwachung der Sterilisation unter Dampfsterilisationsbedingungen. Das Enzym α-D-Glucosidase wurde in Sporen von Bacillus stearothermophilus nachgewiesen, wie sie im Handel erhältlich sind unter der Bezeichnung "ATCC 8005" und "ATCC 7953" bei American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Bacillus subtilis ist besonders nützlich zur Überwachung der Gas- und Trockensterilisation. Das Enzym β-D-Glucosidase wurde in B. subtilis nachgewiesen (das z.B. im Handel erhältlich ist unter der Bezeichnung "ATCC 9372" bei American Type Culture Collection).
Wenn isoliertes Enzym verwendet wird, oder wenn der als Enzymquelle verwendete Keim gegenüber den Sterilisationsbedingungen nicht widerstandsfähiger ist als die natürlichen Verunreinigungen, kann alternativ ein anderer, üblicherweise zur Überwachung der Sterilisationsbedingungen verwendeter Keim zusammen mit der Enzymguelle dem Sterilisationszyklus ausgesetzt werden. In einem solchen Fall kann das Verfahren der vorliegenden Erfindung wiederum den Schritt des Inkubierens aller nach dem Sterilisationszyklus noch lebenden Keime mit einem wäßrigen Nährmedium umfassen, um die Wirksamkeit der Sterilisation zu bestätigen.
Obwohl die vorliegende Erfindung hier in erster Linie hinsichtlich einer einzigen Enzym- und/oder Keimart beschrieben wurde, bezieht sie sich selbstverständlich auch auf die Verwendung einer Vielzahl von Enzym- und/oder Keimarten. Ein einzelner Sterilitätsindikator kann beispielsweise drei Arten von isolierten Enzymen enthalten (die aus drei Arten von Keimen stammen können), wobei ein Enzym wärmebeständig ist, ein zweites widerstandsfähig ist gegen Gassterilisation, und ein drittes widerstandsfähig ist gegen Strahlung, z.B. Gamma- und Beta-Strahlung. Dementsprechend kann ein einzelner Sterilitätsindikator drei Arten von Keimen enthalten, wobei eine Keimart wärmebeständig ist, eine zweite widerstandsfähig ist gegen Gassterilisation, und eine dritte widerstandsfähig ist gegen Strahlung.
Im Kontext der vorliegenden Anmeldung ist ein Enzymsubstratsystem per definitionem eine Substanz oder Mischung von Substanzen, auf die ein Enzym einwirkt, und die in ein enzymmodifiziertes Produkt umgewandelt wird. Im allgemeinen handelt es sich bei dem enzymmodifizierten Produkt um ein lumineszierendes, fluoreszierendes, farbiges oder radioaktives Material. Das Enzymsubstratsystem kann jedoch aus einer Verbindung bestehen, die bei Umsetzung mit dem Enzym ein Produkt erzeugt, das mit einer weiteren Verbindung oder Zusammensetzung reagieren wird, so daß man ein lumineszierendes, fluoreszierendes, farbiges oder radioaktives Material erhält. Wenn das Substratsystem während der Sterilisation in der Indikatorvorrichtung enthalten sein soll, darf das Substrat während der Sterilisation oder Inkubation vorzugsweise nicht spontan zerfallen oder in ein nachweisbares Produkt umgewandelt werden. Bei Vorrichtungen, die zur Überwachung der Dampf- oder Trockensterilisation verwendet werden, muß das Substrat beispielsweise bei Temperaturen zwischen etwa 20 und 180ºC stabil sein. Wenn das Enzymsubstratsystem in herkömmlichen Nährböden vorhanden sein soll, sollte es vorzugsweise in den Nährböden stabil sein, d.h. in den Nährböden keine Eigenfluoreszenz zeigen.
Im Stand der Technik gibt es eine Reihe fluorogener und chromogener Substrate für den Nachweis von Enzymen verschiedenen Ursprungs, die bekannt sind, im Handel erhältlich sind und bei einer Vielzahl enzymatischer Verfahren verwendet wurden. (M. Roth, Methods of Biochemical Analysis, Vol. 17, D. Block, Hrsg., Interscience Publishers, New York, 1969, S. 189; S. Udenfriend, Fluorescence Assay in Biology and Medicine, Academic Press, New York, 1962, S. 312; und D.J.R. Lawrence, "Fluorescence Techniques for the Enzymologist", Methods in Enzymology, Vol 4, S.P. Colowick und N.O. Kaplan, Hrsg., Academic Press, New York, 1957, S. 174). Es gibt zwei Grundtypen von Enzymsubstratsystemen, die im Zusammenhang mit dem Nachweis spezifischer Enzyme beschrieben werden. Der erste Typ eines Substratsystems kann fluorogen oder chromogen sein und mit einer chemischen Formel wie zum Beispiel AB bezeichnet werden. Unter der Einwirkung des Enzyms zerfällt AB zu A + B. B wäre beispielsweise fluoreszierend oder farbig. Ein spezielles Beispiel für ein fluorogenes Substrat dieses Typs wäre 4-Methylumbelliferylphosphat. In Gegenwart des Enzyms Phosphatase zerfällt das Substrat zu 4-Methylumbelliferon und Phosphat. Andere fluorogene Substrate dieses Typs sind beispielsweise die Derivate von 4-Methylumbelliferyl, 7-Amido-4-methylcumarin, Indoxyl und Fluorescein, die weiter unten aufgeführt sind. Ein Beispiel für ein chromogenes Substrat dieses Typs ist 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat. In Gegenwart von Phosphatase zerfällt das Substrat zu Indigoblau und Phosphat. Andere chromogene Substrate dieses Typs sind beispielsweise Derivate von 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl, Nitrophenol und Phenolphthalein, die weiter unten aufgeführt sind.
Der zweite Typ eines Substratsystems, das allgemein zum Nachweis von Enzymen verwendet wird, kann beispielsweise mit der chemischen Formel CD bezeichnet werden, die durch ein spezielles Enzym in C + D umgewandelt wird. Weder C noch D sind jedoch fluoreszierend oder farbig, aber D kann weiterhin mit der Verbindung Z zu einer fluoreszierenden oder farbigen Verbindung umgesetzt werden, um auf diese Weise Enzymaktivität anzuzeigen. Ein spezielles fluorogenes Beispiel dieses Typs ist die Aminosäure Lysin. In Gegenwart des Enzyms Lysindecarboxylase verliert Lysin ein CO&sub2;-Molekül. Der verbleibende Teil des Lysins wird dann als Cadaverin bezeichnet, das stark basisch ist. Ein basischer Indikator wie zum Beispiel 4-Methylumbelliferon kann darin enthalten sein und in Gegenwart einer starken Base fluoreszieren. Ein chromogenes Substrat dieses Typs wäre 2-Naphthylphosphat. Das Enzym Phosphatase reagiert mit dem Substrat, so daß man β-Naphthol erhält. Das freigesetzte β-Naphthol reagiert mit einem chromogenen Reagens, das 1-Diazo-4-benzoylamino-2,5-diethoxybenzol enthält, das im Handel erhältlich ist als "Fast Blue BB Salt" bei Sigma Chemical, und erzeugt dabei eine violette Farbe. Weitere Beispiele dieses Typs sind unten bei den Naphthylderivaten aufgeführt.
Den obigen Ausführungen ist somit leicht zu entnehmen, daß es möglich ist, das Vorhandensein spezifischer Enzymen in Mikroorganismen auf viele verschiedene Arten nachzuweisen.
Ein bevorzugtes Enzymsubstratsystem ist ein fluorogenes sy- Stern, das hier als Verbindung definiert ist, die enzymatisch mgdifiziert werden kann, z.B. durch Hydrolyse, um daraus ein Fluorophor zu erhalten, das eine merklich modifizierte oder gesteigerte Fluoreszenz besitzt.
Es versteht sich, daß die fluorogenen Verbindungen an sich entweder nichtfluoreszierend oder metafluoreszierend sind (d.h. fluoreszierend auf eine deutlich andere Art und Weise, z.B. aufgrund der Farbe oder der Intensität, als die entsprechenden enzymmodifizierten Produkte), und die entsprechenden Erregungs- und Erfassungswellenlängen werden in einer den Benutzern fluorometrischer Geräte wohlbekannten Weise dazu verwendet, um das durch die Enzymmodifikation erzeugte Fluoreszenzsignal von jeder anderen eventuell vorhandenen Fluoreszenz zu trennen.
Im Stand der Technik gibt es eine Reihe fluorogener Substrate für Enyzme verschiedenen Ursprungs, aie bekannt sind, im Handel erhältlich sind und bei enzymologischen Verfahren eingesetzt wurden. Dazu gehört eine Vielzahl fluorogener 4-Methylumbelliferylderivate (hydrolysierbar zu 4-Methylumbelliferon); Derivate von 7-Amido-4-methyl-cumarin, z.B. Britisches Patent Nr. 1,547,747 und Europaisches Patent Nr. 0,000,063 (Ajinomoto); Diacetylfluoresceinderivate; und Fluorescamin.
Geeignete 4-Methylumbelliferylderivate sind beispielsweise:
4-Methylumbelliferyl-2-acetamido-4,
6-D-Benzyliden-2-deoxy-β-D-glucopyranosid;
4-Methylumbelliferylacetat;
4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-galactosaminid;
4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-glucosaminid;
4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-β-D-glucosaminid;
2'-(4-Methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuraminsäure;
4-Methylumbelliferyl α-L-arabinofuranosid;
4-Methylumbelliferyl α-L-arabinosid;
4-Methylumbelliferylbutyrat;
4-Methylumbelliferyl β-D-cellobiosid;
Methylumbelliferyl β-D-N,N'-Diacetylchitobiosid;
4-Methylumbelliferylelaidat; 4-Methylumbelliferyl
β-D-fucosid; 4-Methylumbelliferyl α-L-fucosid;
4-Methylumbelliferyl β-L-fucosid; 4-Methylumbelliferyl
α-D-galactosid; 4-Methylumbelliferyl β-D-galactosid;
4-Methylumbelliferyl α-D-glucosid; 4-Methylumbelliferyl
β-D-glucosid; 4-Methylumbelliferyl β-D-glucuronid;
4-Methylumbelliferyl p-guanidinobenzoat;
4-Methylumbelliferylheptanoat; 4-Methylumbelliferyl
α-D-mannopyranosid; 4-Methylumbelliferyl
β-D-mannopyranosid; 4-Methylumbelliferyloleat;
4-Methylumbelliferylpalmitat; 4-Methylumbelliferylphosphat;
4-Methylumbelliferylpropionat; 4-Methylumbelliferylstearat;
4-Methylumbelliferylsulfat; 4-Methylumbelliferyl β-D-N,N',
N"-triacetylchitotriose; 4'-Methylumbelliferyl
2,3,5-tri-o-benzoyl-α-L-arabinofuranosid;
4-Methylumbelliferyl-p-trimethylammoniumcinnamatchlorid;
und 4-Methylumbelliferyl β-D-xylosid.
Geeignete 7-Amido-4-methylcumarinderivate sind beispielsweise folgende:
L-Alanin-7-amido-4-methylcumarin;
L-Prolin-7-amido-4-methylcumarin;
L-Tyrosin-7-amido-4-methylcumarin;
L-Leucin-7-amido-4-methylcumarin;
L-Phenylalanin-7-amido-4-methylcumarin; und 7-Glutaryl phenylalanin-7-amido-4-methylcumarin.
Geeignete Peptidderivate von 7-Amido-4-methylcumarin sind beispielsweise folgende: N-t-BOC-lle-Glu-Gly-Arg
7-amido-4-methylcumarin; N-t-BOC-Leu-Ser-Thr-Arg
7-amido-4-methylcumarin; N-CBZ-Phe-Arg
7-amido-4-methylcumarin; Pro-Phe-Arg
7-amido-4-methylcumarin; N-t-BOC-Val-Pro-Arg
7-amido-4-methylcumarin; und N-glutaryl-Gly-Arg
7-amido-4-methylcumarin.
Geeignete Diacetylfluoresceinderivate sind beispielsweise Fluoresceindiacetat, Fluorescein di-(β-D-galactopyranosid) sowie Fluoresceindilaurat.
Wenn es sich bei dem Enzym, dessen Aktivität nachgewiesen werden soll, um α-D-Glucosidase, Chymotrypsin oder Fettsäureesterase handelt, z.B. aus Bacillus stearothermophilus, ist das fluorogene Enzymsubstrat am meisten bevorzugt 4-Methylumbelliferyl-α-D-glucosid, 7-Glutarylphenylalanin-7amido-4-methylcumarin oder 4-Methylumbelliferylheptanoat. Wenn es sich bei dem Enzym, dessen Aktivität nachgewiesen werden soll, um α-L-Arabinofuranosid handelt, z.B. aus Bacillus subtilis, ist ein äußerst bevorzugtes fluorogenes Enzymsubstrat 4-Methylumbelliferyl-α-L-arabinofuranosid. Wenn es sich bei dem Enzym, dessen Aktivität nachgewiesen werden soll, um β-D-Glucosidase handelt, z.B. aus Bacillus subtilis, ist ein äußerst bevorzugtes Enzymsubstrat 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucosid.
Ein weiteres geeignetes Enyzmsubstratsystem ist eine chromogene Verbindung, die enzymatisch modifiziert werden kann, um ein chromophores Derivat bzw. ein Produkt zu erhalten, das sich mit einer anderen Verbindung zu einem chromophoren Derivat umsetzt, wobei das Chromophor eine andere bzw. intensivere Farbe besitzt. Es versteht sich, daß die chromogenen Verbindungen an sich entweder ungefärbt oder deutlich anders gefärbt sind, z.B. in einer anderen Farbe oder Intensität, als die entsprechenden enzymmodifizierten Produkte. Entsprechende Erregungs- und Erfassungswellenlängen werden in einer den Benutzern kolorimetrischer Geräte wohlbekannten Weise eingesetzt, um das durch die Enzymmodifikation erzeugte Farbsignal von jeder anderen eventuell vorhandenen Farbe zu trennen.
Bei enzymologischen Verfahren wurde eine Reihe chromogener Substrate verwendet. Geeignete chromogene Substrate sind beispielsweise 5-Broin-4-chlor-3-indolyl-Derivate; Nitrophenylderivate; Indoxylderivate; und Phenolphthaleinderivate.
Geeignete 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-Derivate sind beispielsweise 5-Brom-6-chlor-3-indolylacetat, 5-Brom-4-chlor-3-indolylacetat, 5-Brom-4-chlor-3-indoxyl-β-D-galactopyranosid,
5-Brom-4-chlor-3-indolyl-1,3-diacetat,
5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-fucopyranosid,
5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucopyranosid,
5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronsäure,
5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat, und
5-Brom-4-chlor-3-indolylsulfat.
Geeignete Nitrophenylderivate sind beispielsweise p-Nitrophenol- und o-Nitrophenolderivate. Besonders geeignete p- Nitrophenole sind Diethyl-p-nitrophenylphosphat; di-p-Nitrophenylphosphat; p-Nitrophenyl-2-acetamido-2-deoxy-3-O-β- galactopyranosyl-β-glucopyranosid;
p-Nitrophenyl-2-acetamido-2-deoxy-β-glucopyranosid;
p-Nitrophenylacetat; p-Nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosami nid; p-Nitrophenyl-β-D-N,N' -diacetylchitobiosid;
p-Nitrophenyl-α-glucopyranosid; p-Nitrophenyl-α-maltosid;
p-Nitrophenyl-β-maltosid; p-Nitrophenyl-α-mannopyranosid;
p-Nitrophenyl-β-mannopyranosid; p-Nitrophenylmyristat; p- Nitrophenylpalmitat; p-Nitrophenylphosphat; Bis (p-nitrophenyl)phosphat; Tris(p-nitrophenyl )phosphat; p-Nitrophenyl-β- glucopyranosid; p-Nitrophenyl-β-glucuronid;
α-p-Nitrophenylglycerin; p-Nitrophenyl-α-rhamnopyranosid; p-Nitrophenylstearat; p-Nitrophenylsulfat; p-Nitrophenyl-2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-glucosaminid; p-Nitrophenylthymidinmonophosphat; p-Nitrophenylthymidinmonophosphat; p-Nitrophenyl-2,3,4-tri-O-acetyl-β-glucuronsäuremethylester; und p-Nitrophenylvalerat.
Besonders geeignete o-Nitrophenole sind beispielsweise o- Nitrophenylacetat, o-Nitrophenyl-β-glucosid und o-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosid. Weitere besonders geeignete Nitrophenylderivate sind Nitrophenyl-β-fucopyranosid; Nitrophenyl-α-galactopyranosid; Nitrophenyl-β-galactopyranosid;
Nitrophenylbutyrat; Nitrophenylcaprat; Nitrophenylcaproat;
Nitrophenylcaprylat; Nitrophenyllaurat; und Nitrophenylpropionat.
Geeignete Indoxylderivate sind Indoxylacetat; Indoxyl-β-D- glucosid; 3-Indoxylsulfat; 3-Indoxylphosphat.
Geeignete phenolphthaleinderivate sind beispielsweise: Phenolphthaleindibutyrat; Phenolphthaleindiphosphat; Phenolphthaleindisulfat; Phenolphthaleinglucuronsäure; Phenolphthalein mono-β-glucosiduronsäure; Phenolphthalein mono-β-glucuronsäure; und Phenolphthaleinmonophosphat.
Alle oben beschriebenen chrornogenen Substrate reagieren direkt mit einem entsprechenden Enzym, so daß ein Chromophor entsteht.
Zusätzliche Enzymsubstrate, die 1-Naphthyl-, 2-Naphthylund Naphthyl-AS-BI-Derivate enthalten, werden nutzbringend eingesetzt, wenn das enzymmodifizierte Derivat weiter mit einem chromogenen Reagens umgesetzt wird, beispielsweise mit Diazofarbstoffen, z. B. 1-Diazo-4-benzoylamino-2,5- diethoxybenzol (im Handel erhältlich als "Fast Blue BB Salt" bei Sigma Chemical), 1-Diazo-4-benzoylamino-2,5- diethoxybenzol, p-Diazo-2,5-diethoxy-N-benzoylalanin, 4- Chlor-2-methylbenzoldiazoniumchlorid, und o-Aminoazotoluoldiazoniumsalz, so daß ein Chromophor entsteht.
Besonders geeignete 1-Naphthylderivate umfassen 1-Naphthyl- N'acetyl-β-D-glucosaminid.
Besonders geeignete 2-Naphthylderivate sind beispielsweise 2-Naphthylphosphat; 2-Naphthylbutyrat; 2-Naphthylcaprylat; 2-Naphthylmyristat; L-Leucyl-2-naphthylamid; L-Valyl-2- naphthylamid; L-Cystyl-2-naphthylamid; N-Benzoyl-DL-arginin-2-napthylamid; N-Glutaryl-phenylalanin 2-naphthylamin; 2-Napththylphosphat; 6-Br-2-naphthyl-α-D-galactopyranosid; 2-Napththyl-β-D-galactopyranosid; 2-Naphthyl-2-D-glucopyranosid; 6-Brom-2-naphthol-β-D-glucopyranosid; 6-Brom-2-naphthyl-2-D-mannopyranosid; und 2-Naphthyl-α-L-fucopyranosid.
Besonders geeignete Naphthyl-AS-BI-Derivate sind beispielsweise Naphthyl-AS-BI-phosphat; und Naphthyl-AS-BI-β-D-glucuronid.
Wenn es sich bei dem Enzym, dessen Aktivität nachgewiesen werden soll, um α-D-Glucosidase handelt, z.B. aus Bacillus stearothermophilus, ist das chromogene Enzymsubstrat am meisten bevorzugt p-Nitrophenyl-α-glucopyranosid. Wenn es sich bei dem Enzym, dessen Aktivität nachgewiesen werden soll, um α-L-Arabinofuranosidase handelt, z.B. aus Bacillus subtilis, ist ein äußerst bevorzugtes chromogenes Enzymsubstrat p-Nitrophenyl-α-L-arabinofuranosid. Wenn es sich bei dem Enzym, dessen Aktivität nachgewiesen werden soll, um β- D-Glucosidase handelt, z.B. aus Bacillus subtilis, ist ein äußerst bevorzugtes chromogenes Enzymsubstrat p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosid.
Um das Verfahren der vorliegenden Erfindung durchführen zu können, muß man über das Enzym, dessen Aktivität nachgewiesen werden soll, genau Bescheid wissen, und auch über die Enzymsubstrate, die mit dem Enzym reagieren werden, so daß ein Produkt entsteht, das anhand seiner Fluoreszenz, Farbe, etc. nachgewiesen werden kann (siehe M. Roth, Methods of Biochemical Analysis, Bd. 7, D. Glock, Hrsg., Interscience Publishers, New York, N.Y., 1969, auf das hier Bezug genommen wird.) Das jeweils zu verwendende Enzymsubstrat richtet sich nach der Art des Enzyms, dessen Aktivität untersucht wird. Nachfolgend werden eine Reihe bevorzugter fluorogener und chromogener Enzymsubstrate aufgeführt sowie ein Enzym, das mit dem Substrat reagieren wird, um ein Produkt mit einer merklich modifizierten bzw. gesteigerten Fluoreszenz bzw. Farbe zu erzeugen.
Das Enzym und sein entsprechendes Enzymsubstrat werden in einer gepufferten wäßrigen Lösung umgesetzt. Der Ionenzustand der gepufferten Lösung sollte so gewählt werden, daß Enzym und Enzymsubstrat nicht beeinflußt werden. Vorzugsweise wird ein isotoner Puffer wie zum Beispiel phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Tris(hydroxymethyl )aminomethan- HCl-Lösung, oder Acetatpuffer gewählt. Diese bevorzugten isotonen Puffer sind kompatibel mit den meisten fluorogenen und chromogenen Enzymsubstraten. Eine weitere Überlegung bei der Wahl der Pufferlösungen ist ihr Einfluß auf die Enzymaktivität. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung enthält beispielsweise einen hohen Anteil an anorganischem Phosphat, das ein starker kompetitiver Inhibitor für alkalische Phosphatase ist. Für dieses Enzym ist daher ein Tris-HCl- Puffer ratsam.
Die Konzentration des in dem Reaktionsgemisch vorhandenen Enzymsubstrats richtet sich nach der Art des speziellen Substrats und Enzyms, der Menge, in der das Enzymprodukt erzeugt werden muß, um optisch oder mit einem entsprechenden Gerät nachweisbar zu sein, und der Zeitdauer, die zu warten man bereit ist, um festzustellen, ob aktives Enzym in dem Reaktionsgemisch vorhanden ist. Vorzugsweise ist die Menge des Enzymsubstrats ausreichend, um nach dem Sterihsationszyklus innerhalb eines Zeitraums von etwa acht Stunden mit noch vorhandenem aktiven Enzym reagieren zu können, so daß wenigstens 1 x 10&supmin;&sup8; mol enzymmodifiziertes Produkt erzeugt werden. Wenn es sich bei dem Enzymsubstrat um ein 4-Methylumbelliferylderivat handelt, hat man festgestellt, daß seine Konzentration in der wäßrigen Pufferlösung vorzugsweise zwischen etwa 1 x 10&supmin;&sup5; und 1 x 10&supmin;³ mol liegt.
Die das Enzymsubstrat enthaltende wäßrige Lösung wird vorzugsweise auch auf einen pH-Wert von etwa 5,0 bis 9,5, vorzugsweise etwa 7,5, eingestellt, um bei einigen basischen fluorogenen Substraten Eigenfluoreszenz zu vermeiden.
Das Enzymsubstrat in der wäßrigen Pufferlösung wird mit der Enzymguelle inkubiert, deren Aktivität zu untersuchen ist, nachdem die Enzymquelle dem Sterilisationszyklus unterzogen wurde. Die Inkubation wird solange und unter solchen Bedingungen durchgeführt, daß eine nachweisbare Menge des enzymmodifizierten Produkts freigesetzt werden kann, wobei angenommen wird, daß das Enzym aktiv bleibt. Im allgemeinen beträgt die Menge des mittels bekannter Methoden nachweisbaren Produkts mindestens 1 x 10&supmin;&sup8; mol. Vorzugsweise sind die Inkubationsbedingungen ausreichend um mindestens 1 x 10&supmin;&sup8; mol enzymmodifiziertes Produkt zu erzeugen, und noch mehr bevorzugt etwa 1 x 10&supmin;&sup6; bis 1 x 10&supmin;&sup5; mol enzymmodifiziertes Produkt. Die zur Erzeugung einer nachweisbaren Menge an enzymmodifiziertem Produkt erforderliche Inkubationszeit und -temperatur richtet sich nach der Art des Enzyms und des Substrats und nach der Konzentration, in der diese jeweils in dem Reaktionsgemisch enthalten sind. Im allgemeinen beträgt die erforderliche Inkubationszeit zwischen etwa 1 Minute und 12 Stunden, und die Inkubationstemperatur beträgt zwischen etwa 20 und 70ºC. Wenn Bacillus subtilis oder Bacillus stearothermophilus als Enzymguelle dient, beträgt die erforderliche Inkubationszeit vorzugsweise zwischen etwa 10 Minuten und 3 Stunden, und die erforderliche Inkubationstemperatur liegt zwischen 30 und 40ºC bzw. zwischen 52 und 65ºC.
Allgemein anwendbare Methoden zum Nachweis eines enzymmodifizierten Produkts, die bei der biochemischen Analyse verwendet werden können, umfassen photometrische, potentiometrische, gravimetrische, kalorimetrische, konduktometrische und amperometrische Verfahren. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden fluorometrische und spektralphotometrische Vefahren zur Messung einer nachweisbaren Menge an enzymmodifiziertem Produkt bevorzugt. Das spezifische Enzymsubstrat kann beispielsweise ein 4-Methylumbelliferylderivat enthalten, das durch Wechselwirkung mit dem Enzym Umbelliferon ergibt, was fluorimetrisch überwacht wird, oder das Substrat kann ein Nitrophenol oder ein ähnliches Derivat enthalten, das durch Wechselwirkung mit dem Enzym Umbelliferon ergibt, was fluorimetrisch überwacht wird, oder das Substrat kann ein Nitrophenol oder ein ähnliches Derivat enthalten, das durch Wechselwirkung mit dem Enzym ein gefärbtes Produkt ergibt, was kolorimetrisch überwacht wird.
Das Verfahren der Erfindung ermöglicht einen sehr raschen Nachweis der Enzymaktivität, womit Bedingungen, die das Überleben von Keimen ermöglichen, sowie die Wirksamkeit der Sterilisation vorhergesagt werden können. Bei den verwendeten Tests zur Bestimmung von Enzymen ist im allgemeinen nur eine relativ kurze Inkubationszeit erforderlich, z.B. etwa zehn Minuten bis etwa drei Stunden, normalerweise etwa 30 bis etwa 90 Minuten, um enzymmodifiziertes Produkt in ausreichender Menge zu erzeugen, das dann beispielsweise durch spektroskopische Messungen nachgewiesen wird.
In seiner einfachsten Form umfaßt ein bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens nützlicher Sterilitätsindikator eine Quelle für aktives Enzym in einem Behälter mit flüssigkeitsundurchlässigen und im wesentlichen nicht gasabsorbierenden Wänden. Der Behälter besitzt mindestens eine Öffnung, damit Sterilisationsmedien mit dem Enzym in Kontakt kommen können, und eine gasdurchlässige, bakterienundurchlässige Einrichtung, welche die Öffnung bedeckt. Wahlweise kann der Indikator in dem Behälter folgendes umfassen:
1) einen Keim, der üblicherweise zur Überwachung der Wirksamkeit der Sterilisation verwendet wird, entweder als Quelle für das Enzym oder zusätzlich zu der Enzymquelle;
2) einen Träger, auf den die Quelle für aktives Enzym aufgetragen wird, allein oder in Kombination mit einem stenlisationsbeständigen Keim;
3) ein Substrat für das aktive Enzym und ein wäßriges Reaktionsmedium für das Enzym und sein Substrat; und
4) für den Fall der Verwendung eines sterilisationsbeständigen Keimes ein Nährmedium und einen Wachstumsindikator.
Sterilitätsindikatoren wie sie beschrieben sind in den US- Patenten Nr. 3,346,464; 3,585,112; 3,846,242; 4,291,122; 4,461,837; 4,416,984; 4,596,773; 3,440,144; 4,528,268; 2,854,384; 3,239,429; 3,752,743; 4,304,869; 4,579,823; und 4,580,682 können nutzbringend eingesetzt werden, wenn ein für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignetes Enzym anstelle von oder zusätzlich zu dem stenlisationsbeständigen Keim darin enthalten ist.
Die folgende Beschreibung betrifft die bevorzugten Ausführungsformen der Anmelderin. Bei den folgenden Vorrichtungen sind viele Variationen möglich, die aber dennoch in den Rahmen der vorliegenden Erfindung fallen.
Anhand von Fig. 1 und 2 ist ein bevorzugter Sterilitätsindikator dargestellt, der einen äußeren Behälter in Form eines zylindrischen Röhrchens 10 mit im wesentlichen nicht gasabsorbierenden und flüssigkeitsundurchlässigen Wänden 12 und einem offenen Ende 14 besitzt. Das Röhrchen 10 enthält einen Enzymträger 16, wie zum Beispiel einen Streifen Filterpapier, auf dem sich eine vorbestimmte Menge an aktivem isoliertem Enyzm und/oder eine vorbestimmte Anzahl lebender Keime befindet. Das Röhrchen 10 enthält auch einen normalerweise versiegelten, durch Druck zu öffnenden inneren Behälter 18, wie zum Beispiel eine zerbrechliche Glasampulle, die ein geeignetes, in einer wäßrigen Pufferlösung 20 gelöstes oder suspendiertes Enzymsubstrat enthält, und die wahlweise ein wäßriges Nährmedium enthält. Vorzugsweise ist das Enzymsubstrat bei Temperaturen zwischen etwa 20 und 180ºC stabil und in der Lage, mit aktivem Enzym zu reagieren, so daß man ein lumineszierendes, fluoreszierendes, farbiges oder radioaktives Material erhält. Das wäßrige Nährmedium ist in der Lage, bei der Inkubation das Wachstum lebender Keime zu beschleunigen, wenn es mit diesen in Kontakt kommt. Der innere Behälter 19 ist vorzugsweise mit genauem Sitz in den äußeren Behälter 10 eingepaßt, so daß sehr wenig Volumen von dem äußeren Behälter frei bleibt. Die Glasampulle 18 ist von der Wand 12 des Röhrchens 10 durch den Träger 16 aus Filterpapier getrennt. Das offene Ende 14 des Röhrchens 10 ist mit einem gasdurchlässigen, bakterienundurchlässigen Verschlußelement 22, wie zum Beispiel einer Folie, versehen. Die Folie 22 kann auf dem offenen Ende 14 des Röhrchens 10 beispielsweise durch Hitze oder Verklebung befestigt werden, oder auch mit einer Verschlußvorrichtung 26, beispielsweise mit einer Kappe (in Fig. 1 abgenommen dargestellt), die mit einer Öffnung 28 versehen ist. Während der Sterilisation mit einem gasförmigen Sterilisationsmittel dringt das gasförmige Sterilisationsmittel durch die Folie 22 und strömt durch das Innere des äußeren Behälters, um mit dem Enzymträger 16 in Kontakt zu kommen.
Wie in Fig. 2 gezeigt, kann die Vorrichtung von Fig. 1 leicht zusammengebaut werden, indem in das offene Ende 14 des Röhrchens 10 nacheinander der Träger 16 für aktives Enzym und die zerbrechliche Glasampulle 18 eingesetzt werden, und das offene Ende 14 des Röhrchens mit der Folie 22 versiegelt wird, indem die Folie 22 über das offene Ende 14 gelegt und dann die Kappe 26 auf die Folie 22 gesetzt und mit dem Röhrchen 10 schließend in Eingriff gebracht wird.
Der äußere Behälter 10 besteht aus einem Material, das den in Dampfsterilisatoren auftretenden hohen Temperaturen standhält. Herkömmliche Dampfsterilisatoren erreichen im allgemeinen Temperaturen in der Größenordnung von 121ºC- 135ºC. Außerdem müssen die Wände des Behälters 10 für Gase und Flüssigkeiten im wesentlichen undurchlässig sein. Der äußere Behälter 10, der den Träger 16 enthält, der mit den lebenden Keimen oder dem aktiven isolierten Enzym beschichtet ist, und in dem das restliche aktive Enzym mit dem in dem durch Druck zu öffnenden inneren Behälter 18 enthaltenen Enzymsubstrat reagiert, ist vorzugsweise durchscheinend (einschließlich "durchsichtig"), so daß eine Änderung in der Fluoreszenz oder Farbe optisch festgestellt werden kann, ohne die Indikatorvorrichtung zerlegen zu müssen. Vorzugsweise ist der äußere Behälter 10 auch soweit verformbar, daß die durch Druck zu Öffnende innere Kammer 18 aufreißt, wenn die äußere Kammer 10 durch äußere Druckeinwirkung verformt wird. Der Behälter 10 kann hergestellt werden durch Spritzgießen oder Extrudieren geeigneter Materialien wie zum Beispiel Polycarbonat, Polypropylen, Polyamide, Polymethylpentene und verschiedene Polyester. Polypropylen ist das bevorzugte Material. Diese Materialien sind ausreichend temperaturbeständig, um Dampf- oder Trockensterilisationszyklen standzuhalten, absorbieren keine gasförmigen Sterilisationsmedien, sind flüssigkeitsundurchlässig, durchscheinend oder durchsichtig und verformbar.
Die Verschlußvorrichtung 26 kann aus jedem beliebigen Material bestehen, das den Sterilisationstemperaturen standhält. Wie bei dem Behälter 10 sind geeignete Materialien beispielsweise Polycarbonat, Polypropylen, Polyarnide, Polymethylpentene und verschiedene Polyester, wobei Polypropylen bevorzugt wird
Die aktiven isolierten Enzyme und/oder Keime, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind normalerweise auf einen geeigneten Träger 16 aufgetragen. Es wird jedoch in Erwägung gezogen, das Enzym und/oder den Keim auf die Innenwände des äußeren Behälters 10 oder auf die Außenwände des inneren Behälters 18 aufzubringen. Vorzugsweise befinden sich jedoch das isolierte Enzym und/oder der Keim auf ein und demselben oder auf getrennten Enzymträgern. Der Enzymträger ist vorzugsweise wasserabsorbierend, wie zum Beispiel Filterpapier, und sollte das Keimwachstum bzw. die Enzymaktivität nicht behindern. Folienartige Materialien wie zum Beispiel Stoff, Polypropylenvlies, Reyon oder Nylon und mikroporöse polymere Materialien werden besonders bevorzugt. Metallfoliensubstrate wie zum Beispiel solche aus Aluminium oder nichtrostendem Stahl können jedoch ebenso verwendet werden, sowie Substrate aus Glas (z.B. Glasperlen oder Glasfasern), Porzellan oder Kunststoff. Außerdem kann der Enzymträger aus einer Kombination von Materialien hergestellt sein, beispielsweise aus Papier, das auf einem Trägerstreifen aus Kunststoff oder Glas befestigt ist.
Um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen, sollte der äußere Behälter 10 wünschenswerterweise eine vorbestimmte Menge aktives Enzym enthalten. Dies läßt sich leicht bewerkstelligen mit isoliertem Enzym unter Anwendung allgemeiner Methoden der Proteinreinigung wie zum Beispiel Salzfraktionierung, Chromatographie und Elektrophorese, die beschrieben sind in Colowick, 5., und Kaplan, N.O. (Hrsg.), Methods in Enzymology, Academic Press, New York, Bd. I-VII, (1957-1964). Vorzugsweise liegt die Anfangskonzentration des isolierten Enzyms im Bereich zwischen etwa 1 x 10&supmin;¹&sup0; und 5 x 10&supmin;² Einheiten, mehr bevorzugt zwischen etwa 1 x 10&supmin;&sup8; und 1 x 10&supmin;&sup7; Einheiten, und am meisten bevorzugt zwischen 1 x 10&supmin;&sup7; und 1 x 10&supmin;³ Einheiten. Wenn ein Keim verwendet wird, ist es ebenfalls wünschenswert, eine vorbestimmte ungefähre Anzahl von Keimen zu verwenden. Bei Bakterien oder Pilzsporen erfolgt dies durch Herstellen einer Sporensuspension mit einer bekannten volumetrischen Sporenkonzentration, Anfeuchten des Trägers 16 (z.B. Filterpapier) mit einer geringen, vorbestimmten Menge der Suspension, und Trocknen des Trägers. Mit dieser Methode läßt sich die ungefähre Anzahl der auf dem Träger befindlichen Sporen leicht berechnen. Andere Methoden können natürlich ebenfalls verwendet werden. Wenn der Keim als Enzymquelle verwendet wird, richtet sich die zu verwendende Keimpopulation nach der Aktivität des Enzyms in diesem Organismus. Die Enzymaktivität richtet sich nach den Kulturbedingungen und der Wahl des Keimstammes, läßt sich aber durch entsprechende Anpassung der Keimpopulation regulieren. Wenn es sich bei dem Keim um Bacillus stearothermophilus oder Bacillus subtilis handelt, liegt die Anzahl der zur Erzeugung einer ausreichenden Enzymmenge erforderlichen Keime bei etwa 1 x 10&sup8; bis 1 x 10² Keimen. Wenn B. stearothermophilus als Enzymquelle dient, werden etwa 1 x 10³ bis 1 x 10&sup7; Keime bevorzugt. Wenn B. subtilis als Enzymguelle dient, werden etwa 1 x 10&sup6; bis 1 x 10&sup8; Keime bevorzugt.
Wenn ein Keim als Quelle für aktives Enzym verwendet wird, kann die Inkubation der Vorrichtung auch nach der zur Herstellung einer nachweisbaren Menge enzymmodifiziertes Produkt erforderlichen Zeit fortgesetzt werden, um mittels herkömmlicher Techniken zu bestätigen, ob die Sterilisationsbedingungen ausreichend waren, um alle Keime in dem Indikator abzutöten, was darauf hindeutet, daß die Sterilisationsbedingungen ausreichend waren, um alle Gegenstände in dem Sterilisator zu sterilisieren. Wenn das Keimwachstum in herkömmlicher Weise zur Bestätigung der Ergebnisse des Enzymtests herangezogen wird, sollte ein Keim verwendet werden, der herkömmlicherweise zur Überwachung der Sterilisationsbedingungen dient. Diese herkömmlicherweise verwendeten Keime sind im allgemeinen um ein Vielfaches widerstandsfähiger gegenüber dem verwendeten Sterilisationsverfahren als die meisten bei einer natürlichen Kontamination auftretenden Keime. Bevorzugte Keime sind beispielsweise Bacillus stearothermophilus und Bacillus subtilis.
Für den Fall, daß isoliertes Enzym verwendet wird, oder daß der als Quelle für aktives Enzym verwendete Keim gegenüber den Sterilisationsbedingungen nicht widerstandsfähiger ist als die natürlichen Verunreinigungen, können alternativ auch andere üblicherweise zur Überwachung der Sterilisationsbedingungen verwendete Keime in dem Behälter 10 enthalten sein. Bei einer solchen Vorrichtung dient das isolierte Enzym bzw. der Keim, aus dem ein nützliches Enzym gewonnen werden kann, zur Anzeige der Enzymaktivität innerhalb von im allgemeinen etwa 10 Minuten bis 3 Stunden nach der Inkubation, und der üblicherweise verwendete Keim wird weiterhin in einem Nährmedium für die Dauer von mindestens etwa 24 Stunden inkubiert, um die Ergebnisse bezüglich der Enzymaktivität zu bestätigen.
Eine wäßrige Lösung des entsprechenden Enzymsubstrats ist normalerweise in dem durch Druck zu öffnenden inneren Behälter 18 enthalten. Es wird jedoch in Erwägung gezogen, das Enzymsubstrat in trockener Form zusammen mit dem Enzymträger 16 in den äußeren Behälter 10 aufzunehmen. Das aktive Enzym und sein Substrat könnten in der Tat in trockener Form in demselben Träger 16 enthalten sein. Bei dieser Konstruktion würde der innere Behälter 18 vorzugsweise das wäßrige Reaktionsmedium tragen, das notwendig ist, damit das aktive Enzym und sein Substrat miteinander reagieren können.
Wenn ein üblicherweise zur Überwachung der Sterilisation verwendeter Keim in der Vorrichtung enthalten ist (als Quelle für aktives Enzym oder zusätzlich zu der Quelle für aktives Enzym) und das Überleben von Keimen nach herkömmlichen Methoden bestätigt werden soll, enthält der innere Behälter 18 vorzugsweise eine wäßrige Lösung des Enzymsubstrats und des Nährmediums. Das Nährmedium ist vorzugsweise kompatibel mit den meisten fluorogenen und chromogenen Enzymsubstraten und ist kein kompetitiver Inhibitor für das Enzym. Die Arten von Nährmedien, die in der vorliegenden Erfindung geeigneterweise verwendet werden, sind im Stand der Technik wohlbekannt. Beispiele für bevorzugte Nährmedien sind wäßrige Lösungen von Sojabohnen-Casein- Nährlösung, flüssigem Thioglycolat und Dextrose-Trypton (Difco Laboratories, Inc.). Eine modifizierte tryptische Sojanährlösung ohne Glucose wird besonders bevorzugt. Um eine Kontamination zu vermeiden, werden solche Nährmedien nach dem Einbringen in den inneren Behälter normalerweise sterilisiert. Allgemein bekannte Indikatoren für das Keimwachstum, die in Gegenwart lebender Keime ihre Farbe ändem, sind vorzugsweise in mindestens einem der Behälter vorhanden. Das Material des Wachstumsindikators ist vorzugsweise löslich in dem wäßrigen Nährmedium und verfärbt dieses (im Falle des Keimwachstums), so daß eine Farbänderung durch die durchscheinenden Wände des äußeren Behälters leicht zu sehen ist. Außerdem ist das Material des Wachstumsindikators vorzugsweise so gewählt, daß es die Farbe oder Lumineszenz des enzymmodifizierten Produkts nicht beeinträchtigt. Materialien für den Wachstumsindikator, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind im Stand der Technik wohlbekannt und umfassen pH-empfindliche Farbstoff-Indikatoren (wie zum Beispiel Bromthymolblau, Brorncresolpurpur, Phenolrot, etc.), Oxidations-Reduktions- Farbstoffindikatoren (wie zum Beispiel Methylenblau, etc.). Bei solchen Materialien kommt es im allgemeinen zu Farbänderungen in Reaktion auf ein phänomen des Keimwachstums, wie zum Beispiel eine Änderung des pH-Werts, Oxidations-Reduktions-Potentiale, etc.
Der innere Behälter 18, der die wäßrige Lösung des Enzymsubstrats enthält, und/oder der das wäßrige Nährmedium enthält, besteht aus einem Material, das für Gase und Flüssigkeiten undurchlässig ist und unter der Einwirkung von Druck geöffnet werden kann (d.h. es ist "durch Druck zu öffnen"), damit das Enzymsubstrat und/oder das Nährmedium in den äußeren Behälter gelangen kann. Der innere Behälter besteht vorzugsweise aus einem zerbrechlichen Material, beispielsweise aus Glas, und ist, wie oben erwähnt, vorzugsweise mit engem Sitz in den äußeren Behälter eingepaßt und wirkt mit diesem zusammen, so daß der innere Behälter zerbricht oder platzt, wenn der äußere Behälter verformt wird. In einer anderen Ausführungsform kann der innere Behälter mit einem Stopfen verschlossen werden, so daß der Stopfen herausgedrückt wird und den Inhalt des inneren Behälters freigibt, wenn Druck aufihn einwirkt. In noch einer weiteren Ausführungsforrn kann der Verschluß 26 eine Vorrichtung zum Zerbrechen der Ampulle umfassen, wie sie im US-Patent Nr. 4,304,869 dargestellt ist, wobei der Verschluß vom Boden der Verschlußvorrichtung nach unten ragende Nasen aufweist, die dazu dienen, beim Zusammendrücken der Verschlußvorrichtung die Ampulle zu zerbrechen. In ähnlicher Weise kann die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung in einem System mit einem Stift zum Zerbrechen der Ampulle verwendet werden, der im Boden des äußeren Behälters 10 angeordnet ist.
Der aktives Enzym enthaltende äußere Behälter 10 besitzt mindestens eine Öffnung, durch die das Sterilisationsmittel (z.B. Dampf, Ethylenoxid) während der Sterilisation mit der Quelle für aktives Enzym in Kontakt kommen kann. Diese Öffnung ist normalerweise verschlossen bzw. mit einer gasdurchlässigen, bakterienundurchlässigen Einrichtung zugestöpselt. Geeignete Einrichtungen sind beispielsweise das Verschlußelement 22, das aus faserigen Materialien wie zum Beispiel Baumwolle, Glaswolle, Stoff bestehen kann; Faservliese aus Polypropylen, Reyon, Polypropylen/Reyon, Nylon, Glas- oder anderen Fasern; Filterpapiere, mikroporöse hydrophobe und hydrophile Filme, offenporige Polymerschaumstoffe und halbdurchlässige Kunststoff-Folien, wie sie beschrieben sind im US-Patent Nr. 3,346,464. Faserige oder porige Materialien werden bevorzugt, weil diese Materialien Sterilisationsgase problemlos hindurchlassen. Bevorzugte Materialien für das Verschlußelement sind hydrophobe Materialien wie zum Beispiel Nylonvlies, mikroporöse hydrophobe Folie oder Glasfaservlies. Besonders bevorzugt ist eine mikroporöse hydrophobe Folie, die im Handel erhältlich ist bei Celanese Separations Products, Charlotte, North Carolina, unter dem Handelsnamen "Celgard K-442 Microporous Film" Diese faserigen oder porigen Verschluβelemente dienen in der Tat als Filter für Bakterien und Pilze und sollten daher eine Porengröße von maximal etwa 0,5 µm (Mikrometer) besitzen (d.h. Teilchen, die größer sind als etwa 0,5 µm (Mikrometer), nicht hindurchlassen). Alternativ kann die Verschlußeinrichtung ein gewundener, bakterienundurchlässiger Kanal sein, wie er beschrieben ist im US-Patent Nr. 4,461,837.
Eine bevorzugte Ausführungsform eines Sterilisationsindikators der vorliegenden Erfindung ist in Fig. 3 und 4 veranschaulicht. Die Vorrichtung umfaßt einen äußeren Behälter 40 mit im wesentlichen Gas nicht absorbierenden und flüssigkeitsundurchlässigen Wänden 42 und einem offenen Ende 44. Der äußere Behälter 40 umfaßt einen durch Druck zu Öffnenden inneren Behälter 48, der eine wäßrige Lösung 50 eines geeigneten Enzymsubstrats enthält, vorzugsweise vermischt mit einem wäßrigen Nährmedium. Das offene Ende 44 des äußeren Behälters 40 ist mit einem gasdurchlässigen, bakterienundurchlässigen Verschlußelement 52 bedeckt. Damit endet auch die Ähnlichkeit mit der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung. Bei der Vorrichtung von Fig. 3 und 4 befindet sich der Enzymträger 46 am unteren verschlossenen Ende des äußeren Behälters 40, und eine Sperre 47 ist wie ein Stopfen zwischen dem Enzymträger 46 und dem durch Druck zu öffnenden inneren Behälter 48 angeordnet. Die Sperre 47 besteht vorzugsweise aus nichtfluoreszierenden Materialien zur Verwendung bei fluorogenen Enzymsubstraten, wie zum Beispiel aus Faservliesen aus Fasern wie zum Beispiel Baumwolle, Reyon, Polypropylen, Polypropylen/Reyon-Mischungen, Nylon oder Glas. Am meisten bevorzugt besteht die Sperre 47 aus einem Polypropylenfaservlies wie zum Beispiel dem Wärmeisolierungsvlies der Marke "Thinsulate 200-B", im Handel erhältlich bei 3M, St. Paul, MN.
Die Sperre 47 dient zur Isolierung des Enzymträgers 46 gegenüber dem inneren Behälter 48, wodurch kalte Stellen vermieden werden, an denen die Ampule 48 über dem Träger 46 positioniert werden kann. Das Vorhandensein kalter Stellen kann dazu führen, daß sich Kondensat auf dem Enzymträger bildet. Das Kondensat kann die Aktivität des Enzyms auf dem Träger 46 beeinträchtigen. Die Sperre 47 besteht vorzugsweise aus einem hydrophoben Material, so daß enzymmodifiziertes Produkt sich um den Enzymträger herum konzentriert und sich nicht rasch in den Bereich des Behälters ausbreitet, der auf der anderen Seite der Sperre liegt. Durch Aufrechterhaltung einer höheren Konzentration des enzymmodifizierten Produkts im unteren Teil des Indikators kann das enzymmodifizierte Produkt, ob es nun lumineszierend oder farbig ist, nach einer kürzeren Inkubationszeit nachgewiesen werden als dies der Fall wäre, wenn der Träger 46 mit dem gesamten Inhalt des inneren Behälters 48 umgesetzt wird. Wie in Beispiel 1 dargestellt, liefern bevorzugte Vorrichtungen, die eine Sperre 47 enthalten, im allgemeinen zuverlässige Informationen über die Wirksamkeit der Sterilisation innerhalb von etwa 10 Minuten. Bei ähnlichen Vorrichtungen, die keine solche Sperre verwenden, dauert es etwa zwei Stunden, bis zuverlässige Informationen über die Wirksamkeit der Sterilisation vorliegen.
Der Verschluß 56 besteht aus einem Oberteil 57 und nach unten ragenden Seitenwänden 59. Der Verschluß besitzt einen hohlen Körper, der am Boden offen ist, wobei der Innendurchmesser des Verschlusses etwa gleich ist dem Außendurchmesser des äußeren Behälters 40, so daß der Verschluß 56 reibschlüssig mit dem offenen Ende 44 des äußeren Behälters 40 in Eingriff treten kann. In die Seitenwände 59 ist vorzugsweise eine Vielzahl von Fenstern 58 eingeschnitten. Wenn die Indikatorvorrichtung in eine zu sterilisierende Charge eingelegt wird, wird der Verschluß 56 über die öffnung in dem äußeren Behälter gelegt, so daß die äußeren Seitenwände 42 des äußeren Behälters die Fenster 58 nicht verstellen. In dieser Position kann Sterilisationsmittel in dem Sterilisator in den Behälter 40 gelangen, indem es durch die Fenster 58 fließt. Bei Abschluß des Sterilisationszyklus kann der Verschluß vollständig eingesetzt werden, indem er nach unten gedrückt wird, so daß die Seitenwände 42 des äußeren Behälters mit der Innenseite des Oberteils 57 in Eingriff gedrückt werden, so daß die Fenster 58 verstellt werden. Das Innere des Behälters 40 ist dann nach außen hin versiegelt.
Die Figuren 5 und 6 veranschaulichen eine alternative bevorzugte Ausführungsform des Sterilisationsindikators der vorliegenden Erfindung. Wie die Vorrichtung von Fig. 3 und 4 umfaßt auch diese Vorrichtung einen äußeren Behälter 70 mit Gas nicht absorbierenden und flüssigkeitsundurchlässigen Wänden 72 und einem offenen Ende 74; einen durch Druck zu öffnenden inneren Behälter 78 in dem äußeren Behälter 70, der eine wäßrige Lösung des Enzymsubstrats 80 enthält, vorzugsweise vermischt mit Nährmedium; und ein gasdurchlässiges, bakterienundurchlässiges Verschlußelement 82, das durch die Kappe 86 auf dem offenen Ende 74 des äußeren Behälters gehalten wird. Der Enzymträger 77 in dem äußeren Behälter 70 ist beispielsweise mit einem Kleber oder durch Heißsiegeln an einem Dochtstreifen 76 befestigt. Der Dochtstreifen kann aus jedem wasserabsorbierenden Material bestehen, beispielsweise aus Filterpapier, Stoff oder Reyon.
Außerdem kann der Dochtstreifen aus einer Materialkornbination bestehen, beispielsweise aus Papier, das an einem Trägerstreifen aus Kunststoff oder Glas befestigt ist. Vorzugsweise wird der Dochtstreifen 76 aus polyethylenbeschichtetem Papier hergestellt. Die Abmessungen des Dochtstreifens und die Anordnung des Enzymträgers auf dem Dochtstreifen sind vorzugsweise dergestalt, daß im Falle des Zerbrechens des inneren Behälters die Flüssigkeit darin in den unteren Teil des äußeren Behälters und unter den Enzymträger 77 gelangt. Die wäßrige Enzymsubstratlösung 80 wandert an dem Dochtstreifen 76 nach oben zu dem Enzymträger 77. Das enzymmodifizierte Produkt konzentriert sich auf dem Enzymträger 77 und sein Vorhandensein wird innerhalb kürzerer Zeit erfaßt als dies der Fall wäre, wenn der Träger mit der gesamten in dem inneren Behälter 78 vorhandenen Lösung in Kontakt kommt.
Im Gebrauch wird der in Fig. 3 und 4 dargestellte Sterihtätsindikator zusammen mit einer Anzahl beispielsweise mit Dampf oder Ethylenoxidgas zu sterilisierender Gegenstände in eine Sterilisationskammer gelegt. Wenn sich der Indikator in dem Sterilisator befindet, ist der Verschluß 56 in der offenen Stellung, so daß die Fenster 58 offen sind und damit das Eindringen von Sterilisationsmittel ermöglichen. Wenn das Sterilisationsmittel in die Kammer eingeleitet wird, dringt das Sterilisationsmittel durch das Verschluβelement 52 und strömt an der Sperre 47 vorbei, um das Enzym zu desaktivieren und die auf dem Träger 46 vorhandenen Testkeime abzutöten. Am Ende des Sterilisationszyklus ist der Verschluß 56 vollständig eingesetzt, so daß er die Fenster 58 verstellt, und die Glasampulle 48 wird beispielsweise durch Druck mit dem Finger zerbrochen, so daß die wäßrige Lösung des Enzymsubstrats und des Nährmediums mit dem Enzymträger 46 in Kontakt kommen. Der Indikator wird dann in eine geeignete Inkubationsumgebung gelegt (z.B. kann der Indikator bei etwa 56ºC für etwa 10 Minuten bis 2 Stunden inkubiert werden). Durch das Sterilisationsmittel nicht inaktiviertes Enzym wird dann mit seinem Substrat reagieren, so daß ein vorzugsweise farbiges oder fluoreszierendes enzymmodifiziertes Produkt entsteht. Das Auftreten einer Farbänderung oder einer Änderung der Fluoreszenz wird durch die durchscheinenden Wände 42 des äußeren Behälters 40 festgestellt oder spektrophotometrisch gemessen und zeigt an, daß der sterilisationszyklus nicht alle auf dem Träger 46 vorhandenen aktiven Enzyme inaktiviert hat. Das Vorhandensein aktiven Enzyms läßt darauf schließen, daß die Testkeime überlebt haben bzw. noch gewachsen sind und zeigt an, daß der sterilisationszyklus vielleicht nicht ausreichend war, um die Gegenstände in dem Sterilisator vollständig zu sterilisieren. Das Fehlen jeglicher Farbänderung oder Änderung der Fluoreszenz zeigt an, daß der Sterilisationszyklus ausreichend war, um sämtliches Enzym auf dem Träger 46 zu inaktivieren, und damit ausreichend war, um die Gegenstände in dem Sterilisator zu sterilisieren. Durch weitere Inkubation der Vorrichtung (bei 56ºC für etwa 24 bis 48 Stunden) kann der frühe Hinweis auf das Überleben von Testkeirnen aufgrund von Farbänderungen in den Nährmedien bestätigt werden.
Eine bevorzugte Methode zur Überwachung der Fluoreszenz eines erfindungsgemäßen Indikators ist ein Fluorimeter, das speziell für die in dieser Erfindung beschriebenen Vorrichtungen ausgelegt ist. Ein Fluorimeter schaltet die subjektive Interpretation aus, zu der es dann kommt, wenn man versucht, optisch zwischen einem niedrigen Anteil an fluoreszierendem Produkt und Untergrund oder gar keiner Fluoreszenz zu unterscheiden. Ein Fluorirneter kann so geeicht werden, daß eine Mindestmenge fluoreszierenden Produkts innerhalb einer vorgegebenen Inkubationszeit nachgewiesen werden kann.
Ein besonders bevorzugtes Fluorimeter, das zur Verwendung bei den erfindungsgemäßen Vorrichtungen ausgelegt ist, besteht aus einer Kammer, die das Umgebungslicht abschirmen soll, während der äußere Behälter des Indikators so positioniert wird, daß der darin befindliche Enzymträger mit UV-Licht einer Wellenlänge von 365 nm beleuchtet werden kann, und eine Photodiode jede resultierende Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 460 nm erfassen kann. Das Fluorimeter ist so geeicht, daß es mindestens 1,0 x 10&supmin;&sup5; M 4-Methylumbelliferon nachweisen kann.
Zur Differenzierung der fluoreszenz-positiven Vorrichtungen von den nichtfluoreszierenden oder negativen Vorrichtungen knnen mehrere Methoden eingesetzt werden. Bei einer ersten Methode wird ein Grenzwert für die Fluoreszenz, der äquivalent ist zu der von 1 x 10&supmin;&sup5; M 4-Methylumbelliferon erzeugten Fluoreszenz, in dem Fluorirneter eingestellt. Wenn eine Testprobe mit ausreichend aktivem Enzym eine ausreichende Menge Substrat umwandelt, so daß der Grenzwert überschritten wird, nachdem der Enzymträger mit dem Substrat z.B. bei 56ºC für die Dauer von 15 Minuten reagieren konnte, zeigt das Fluorimeter das Vorliegen einer positiven Probe an, indem beispielsweise eine rote Lampe aufleuchtet. Wenn das durch die Reaktion zwischen dem Enzym und seinem Substrat erzeugte fluoreszierende Produkt den Grenzwert nach der 15- minütigen Inkubation nicht überschreitet, zeigt das Fluorimeter beispielsweise das Vorliegen einer negativen oder nichtfluoreszierenden Probe mittels einer grünen Lampe an.
Bei der zweiten Methode mißt das Fluorimeter die anfängliche Fluoreszenz am Beginn des Inkubationszeitraums. Die Kammer des Fluorimeters wird auf die für das in der Vorrichtung getestete spezielle Enzym optimale Temperatur aufgeheizt. Bei dem aus Bacillus stearothermophilus gewonnenen Enzym α-D-Glucosidase beträgt die Temperatur 56ºC. Während des Inkubationszeitraums überwacht das Fluorimeter weiterhin die Fluoreszenz und zeigt das Vorliegen einer positiven fluoreszierenden Probe, wenn mindestens eine 5%ige Zunahme der Intensität über die anfängliche Fluoreszenz festgestellt wird, beispielsweise mit einer roten Lampe an. Wenn innerhalb des festgelegten Inkubationszeitraums eine Zunahme um weniger als 5 % erfolgt, zeigt das Fluorimeter das Vorliegen einer negativen oder nichtfluoreszierenden Probe beispielsweise durch eine grüne Lampe an.
Der Sterilitgtsindikator der vorliegenden Erfindung wurde in erster Linie mit Bezug auf Sterilisationsmedien wie Ethylenoxid, Dampf und dergleichen beschrieben. Der Indikator ist jedoch nicht auf diese Anwendungen begrenzt und kann ebenso zur Anzeige der Wirksamkeit anderer Sterilisationsrnedien, wie zum Beispiel trockene Hitze, Strahlung, Propylenoxid, Methylbromid, Ozon, Chlordioxid, Formaldehyd und andere gasförmige und flüssige Mittel, verwendet werden.
Die Erfindung wird anhand der folgenden nichteinschränkenden Beispiele erläutert, in denen alle Prozentangaben Gewichtsprozent sind, wenn nicht anders angegeben.

BEISPIEL 1

Dieses Beispiel veranschaulicht die Korrelation zwischen den Fluoreszenzergebnissen der enzymatischen Nachweismethode der vorliegenden Erfindung und den Ergebnissen herkömmlicher Methoden zum Nachweis des Überlebens von Sporen. Dieses Beispiel veranschaulicht außerdem die kürzeren Anzeigezeiten, die mit der in Fig. 3 und 4 veranschaulichten Vorrichtung erreicht werden können, bei der eine Sperre 47 zwischen der Ampulle 48 und dem Enzymträger 46 verwendet wird.
Bacillus stearothermophilus, im Handel erhältlich als "ATCC 7953" von American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, wurde über Nacht (16 Stunden) bei 58ºC in tryptischer Sojanährlösung kultiviert. Mit dieser Kultur wurde die Oberfläche von Agarplatten geimpft, die aus 8 g/l Nährlösung, 4 g/l Hefeextrakt, 0,1 g/l Manganchlorid und 20 g/l Agar mit einem pH-Wert von 7,2 bestanden. Die Platten wurden 72 Stunden bei 58ºC inkubiert. Die Sporen wurden von den Platten abgeschabt und in sterilem destilliertem Wasser suspendiert. Die Sporen wurden von den vegetativen Teilchen durch 20-minütiges Zentrifugieren der Suspension bei 7000 UpM und 4ºC getrennt. Der Überstand wurde abgegossen, und die Sporen wurden wieder in sterilem destilliertem Wasser suspendiert. Dieser Reinigungsvorgang wurde mehrmals wiederholt. Die Sporen von Bacillus stearothermophilus wurden auf Filterpapierscheiben mit einem Durchmesser von 6,35 mm (1/4 Zoll), die im Handel erhältlich sind als Filterpapier der Marke "S&S #903" von Schleicher & Schuell, Inc., Keene, NH, in einer Population von 1,6 x 10&sup6; Sporen pro Scheibe aufgetragen. Dies wurde erreicht durch Herstellen einer Suspension von B. stearothermophilus-Sporen in Wasser mit einer Konzentration von 1 x 10&sup8; Sporen/ml, Pipettieren von 10 µl dieser Suspension auf jede Filterpapierscheibe und dann Trocknenlassen der Scheiben.
Es wurden zwei Arten von Vorrichtungen in folgender Weise hergestellt. Die erste Vorrichtung wurde hergestellt wie in Fig. 3 und 4 gezeigt, wobei sich der sporenbeschichtete Streifen 46 am Boden des äußeren Behälters 40 befand, und eine Sperre 47 zwischen der Ampulle 48, die das Enzymsubstrat enthielt, und dem Sporenstreifen angeordnet war. Eine Scheibe aus geblasener Polypropylen-Mikrofaser mit einem Durchmesser von 1,75 mm (11/16 Zoll) und einem Gewicht von 200 g/m², im Handel erhältlich als Wärmeisolierung der Marke "Thinsulate 200-B" von 3M, St. Paul, MN, wurde als Sperre 47 verwendet. Die Ampulle 48 enthielt 0,67 ml Nährmedium, bestehend aus 17 g eines bakteriologischen Peptons und 0,17 g L-Alanin, sowie 0,1 g 4-Methylumbelliferylα-D-glucosid, im Handel erhältlich bei Sigma Chemical Company, St. Louis, MO, gelöst in 200 pl N,N-Dirnethylforrnarnid und 0,03 g pH-Indikator-Farbstoff Bromkresolpurpur pro Liter Wasser. Der pH-Wert des Enzymsubstrats und der Nährlösung wurde mit 0,1 N Natriumhydroxid auf 7,6 eingestellt.
Das äußere Röhrchen 40 und die Kappe 56 bestehen beide aus Polypropylen. Das äußere Röhrchen hatte eine Länge von 5,08 cm (2,0 Zoll), einen Außendurchmesser von 85,1 mm (0,335 Zoll) und einen Innendurchmesser von 77,0 mm (0,303 Zoll). Die Kappe hatte eine Länge von 1,275 cm (0,510 Zoll) bei einem Innendurchmesser von 83,3 mm (0,328 Zoll). Die innere Ampulle 48 bestand aus Glas und hatte eine Länge von 3,96 cm (1,56 Zoll) bei einem Außendurchmesser von 65,5 mm (0,258 Zoll) und einer Wandstärke von 2,5 mm (0,010 Zoll). Das Verschlußelement 52 war ein Stück Polypropylen mit einem Durchmesser von 1,27 mm (1/2 Zoll), im Handel erhältlich als mikroporöse Folie der Marke "Celgard K-442" von Celanese Separations Products, Charlotte, N.C..
Die zweite Vorrichtung war identisch mit der ersten Vorrichtung, nur daß hier die Sperre 47 weggelassen war.
Fünf Chargen beider Arten von Vorrichtungen wurden in metallene Instrumentenschalen gelegt und bei 132ºC für die Dauer von 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 und 3,0 Minuten in einem Normaldruck-Dampfsterilisator sterilisiert, der im Handel erhältlich ist unter der Bezeichnung "Amsco Eagle Model 2013 Sterilizer" von American Sterilizer Company, Ene, PA. Nach der Sterilisation wurden die inneren Ampullen, die das Enzymsubstrat und das Nährmedium enthielten, zerbrochen, und die Einheiten wurden bei 56ºC inkubiert. Die Röhrchen wurden mit einer UV-Lampe (λ = 366 nm) beleuchtet, um nach einer Inkubationszeit von 10 Min., 20 Min., 30 Min., 60 Min., 120 Min., 180 Min. und 240 Min. die Fluoreszenz optisch anzuzeigen. Außerdem wurde das Sporenwachstum, angezeigt durch eine Farbänderung von Purpur nach Gelb, nach einer 24-stündigen Inkubation bei 56ºC durch Sichtprüfung ermittelt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle I angegeben. Tabelle 1 Die Angaben in Tabelle I veranschaulichen, daß das Vorhandensein aktiver α-D-Glucosidase mit den Methoden der vorliegenden Erfindung wesentlich rascher nachgewiesen werden kann als das Vorhandensein lebender Sporen. Die Angaben zeigen auch, daß der Nachweis von aktivem Enzym in einer Vorrichtung zur Vorhersage eines etwaigen Sporenwachstums in der Vorrichtung herangezogen werden kann.
Die Angaben in Tabelle I veranschaulichen, daß bei Verwendung der Vorrichtung 1 (mit einer Sperre zwischen der Ampulle und dem Sporenstreifen) bereits nach 10 Minuten die Enzymaktivität für alle Einheiten nachgewiesen werden kann, die nach einer 24-stündigen Inkubation ein Sporenwachstum zeigen. Bei Verwendung der Vorrichtung 2 (ohne Sperrmaterial) ist eine 2-stündige Inkubation erforderlich, um Enzymaktivität bei allen Einheiten nachzuweisen, die nach 24- stündiger Inkubation ein Sporenwachstum zeigen.

BEISPIEL 2

Es wurden Vorrichtungen gemäß der Darstellung in Fig. 5 und 6 hergestellt, wo sich der Enzymträger 77 auf einem Docht 76 befand. Ein gemäß Beispiel 1 hergestellter Sporenstreifen wurde auf ein Ende eines 0,10 mm dicken polyethylenbeschichteten Papierstücks von 6,35 mm x 28,58 mm mittels Hitze aufgeklebt. Die Ampulle 78 enthielt 5 ml/l eines nichtionischen Tensids, das im Handel erhältlich ist als Polyoxyethylen-Sorbitan-Monooleat "Tween 80" von der ICI Americas, Inc., Wilmington, Delaware, um den Sporenträger sowie das Enzymsubstrat, die Nährböden und Indikatoren in der Lösung von Beispiel 1 besser benetzen zu können. Das äußere Röhrchen, die Kappe und die innere Ampulle waren identisch mit den in den Vorrichtungen von Beispiel 1 verwendeten. Das Verschlußelement war ein sterilisationsfähiges Filterpapier.
Fünf Chargen von Vorrichtungen wurden in metallene Instrumentenschalen gelegt und bei 132ºC für die Dauer von 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 und 3,0 Minuten in einem Normaldruck- Dampfsterilisator sterilisiert, der im Handel erhältlich ist unter der Bezeichnung "Amsco Eagle Model 2013 Stenlizer" von American Sterilizer Company, Ene, PA. Danach wurden die inneren Ampullen zerbrochen, und die Vorrichtungen wurden bei 56ºC inkubiert. Die Röhrchen wurden mit einer UV-Lampe (λ = 366nm) beleuchtet, um die Fluoreszenz nach 10 Min., 20 Min., 30 Min., 60 Min., 120 Min., 180 Min. und 240 Min. optisch anzuzeigen. Außerdem wurde das Sporenwachstum, angezeigt durch eine Farbänderung von Purpur nach Gelb, nach einer 24-stündigen Inkubation durch Sichtprüfung ermittelt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben. TABELLE II
* Weist auf eine oder mehrere falsche positive Reaktionen hin, die wohl das Ergebnis einer restlichen Enzymaktivität nach der Inaktivierung der Sporen bei marginalen Sterilisationszyklen sind.
Die Angaben in Tabelle II zeigen, daß ein wesentlich rascherer Nachweis überlebender Sporen mit den Vorrichtungen und Enzymnachweismethoden der vorliegenden Erfindung möglich ist als bei einem herkömmlichen 24-stündigen Sporenwachstum.

BEISPIEL 3

Dieses Beispiel veranschaulicht mehrere Enzyme in Verbindung mit Bacillus stearothermophilus, die bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung von Nutzen sind. In diesem Beispiel wurde eine Enzymsubstrateinheit verwendet, die im Handel erhältlich ist unter der Bezeichnung "API-XYM System" bei API Analytab Products, Plainview, NY. Diese Substrateinheit bestand aus 19 verschiedenen trockenen, chromogenen Enzymsubstraten, die einzeln in einer Reihe von Mikromulden verpackt waren. Durch Zugabe einer wäßrigen Probe zu jeder Mikromulde wird das Substrat wieder angefeuchtet. Die Testeinheit wird für die gewünschte Dauer inkubiert, und die Reaktionen werden nach Zugabe der mit dem System mitgelieferten Detektorsubstanzen sichtbar gemacht.
Die gemäß Vorrichtung 1 von Beispiel 1 hergestellten Vorrichtungen wurden für die Dauer von 1 Minute bzw. 3 Minuten bei 132ºC in dem in Beispiel 1 verwendeten Dampfsterilisator gelassen. Es wurde festgestellt, daß die Sporen von Bacillus stearothermophilus bei Verwendung in dieser Vorrichtung eine Exposition von 1 Minute überleben und nach 3 Minuten abgetötet werden. Nach der Exposition wurden die Sporenstreifen aseptisch in jede Mikrornulde in der Enzymsubstrateinheit eingebracht, und in jede Mulde wurden 50 µl steriles destilliertes Wasser gegeben. Eine Einheit enthielt die 1 Minute in dem Sterilisator gelassenen Sporenstreifen, eine zweite Einheit enthielt die 3 Minuten in dem Sterilisator gelassenen Sporenstreifen, und eine dritte Einheit enthielt unbehandelte Sporenstreifen.
Die Einheit mit den unbehandelten Sporenstreifen wurde bei 56ºC 5 Stunden inkubiert. Die Einheiten mit den behandelten Sporenstreifen wurden bei 56ºC 7 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Detektorsubstanzen A und B (erhältlich zusammen mit dem "API-XYM Systern") zwecks Farbentwicklung bei enzymatischen Reaktionen, die in den Mikromulden in jeder Einheit auftreten können, zugegeben.
Die in jeder Mikromulde jeder Einheit festgestellte Farbe ist in Tabelle III angegeben. Eine Reihe von Enzymen zeigte eine leicht nachweisbare Aktivität nach 1-minütiger Exposition, und keine bzw. eine wesentlich verminderte Aktivität nach 3-minütiger Exposition. Mehrere von den Enzymen stammten nicht aus B. stearothermophilus und zeigten im unbehandelten Zustand keine nachweisbare Aktivität. Mehrere andere Enzyme (wie zum Beispiel Myristatlipase, Valinaminopeptidase, Chymotrypsin und β-Glucuronidase), die im unbehandelten Zustand keine nachweisbare Aktivität zeigten, wurden unter der Einwirkung von Wärme offensichtlich aktiviert. Man nimmt an, daß diese Enzyme, die nach einer 1-minütigen Exposition eine nachweisbare Aktivität zeigen und nach einer 3-minütigen Exposition keine bzw. eine verminderte Aktivität, bei der vorliegenden Erfindung vorteilhaft eingesetzt werden könnten, selbst wenn im unbehandelten Zustand keine Enzymaktivität festgestellt wird. TABELLE III
Tabelle III veranschaulicht, daß eine Reihe von Enzymen, die in B. stearothermophilus vorhanden sind, wie zum Beispiel alkalische Phosphatase, Butyratesterase, Caprylatesteraselipase, Myristatlipase, Leucinarninopeptidase, Valinaminopeptidase, Chyrnotrypsin, saure Phosphatase, Phosphohydrolase, α-Galactosidase, β-Glucuronidase und α- Glucosidase bzw. β-Glucosidase nach einem subletalen Stenlisationsprozeß noch ausreichend Aktivität besitzen, um nachgewiesen zu werden, bevor ein Sporenwachstum festgestellt wird.

BEISPIEL 4

Bacillus stearothermophilus Sporen, hergestellt gemäß Beispiel 1, wurden auf 6,35 x 28,58 mm große Träger aus Futerpapier, das im Handel erhältlich ist als Filterpapier mit der Bezeichnung "S&S #591A" von Schleicher und Schuell, Inc., Keene, NH, in Konzentrationen von 1,0 x 10&sup7;, 7,5 x 10&sup5; 1,0 x 10&sup5; 1,7 x 10&sup4;, 2,8 x 10³ Sporen pro Träger aufgetragen und getrocknet. Die Vorrichtungen wurden mit diesen Sporenstreifen zusammengesetzt, wie in Fig. 3 und 4 dargestellt und als Vorrichtung 1 in Beispiel 1 beschrieben.
Drei Chargen von Vorrichtungen wurden in metallene Instrumentenschalen gelegt und bei 132ºC in einem Normaldruck- Dampfsterilisator, der im Handel erhältlich ist als Dampfsterilisator mit der Bezeichnung "Amsco Eagle Model 2013" bei der American Sterilizer Cornpany, Eerie, PA, für die Dauer von 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 und 3,0 Minuten sterilisiert. Nach der Exposition wurden die inneren Ampullen zerbrochen, und die Vorrichtungen wurden bei 56ºC inkubiert. Die Röhrchen wurden mit einer UV-Lampe (λ = 366 nm) beleuchtet, um nach einer Inkubation von 10 Min., 20 Min., 30 Min., 60 Min., 120 Min., 180 Min., 240 Min., 300 Min. und 360 Min. die Fluoreszenz optisch anzuzeigen. Außerdem wurde das Sporenwachsturn, angezeigt durch eine Farbänderung von Purpur nach Gelb, nach einer 24-stündigen Inkubation durch Sichtprüfung ermittelt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle IV angegeben. Tabelle IV Tabelle IV (Forts.)
Tabelle IV zeigt, daß selbst bei einer geringen Sporenpopulation die Überlebensrate der Sporen anhand der Enzymaktivität (d.h. Fluoreszenz) vorhergesagt werden konnte, lange bevor ein Keimwachstum festgestellt wurde.

BEISPIEL 5

Dieses Beispiel vergleicht die Anzeigezeiten für Vorrichtungen, in denen unterschiedliche Stämme von Bacillus stearothermophilus Sporen verwendet werden. Die folgenden Stämme wurden getestet: "ATCC 8005", im Handel erhältlich bei American Type Culture Collection. Rockville, Maryland; Sporen aus Keirnkulturen in drei verschiedenen handelsüblichen biologischen Indikatoren, nämlich dem biologischen Indikator "ATTEST " von 3M, St. Paul, MN; dem biologisch/chemischen Indikator "Proof PLUS " von American Sterilizer Co., Eerie, PA, und dem biologisch/chemischen Indikator "Assert " von Surgicot, Smithtown, NY; "NCTC 10003", im Handel erhältlich bei Nation Collection of Type Cultures, Colindale, London, England; "German Earthspore", gewonnen aus einer Kultur von Erdestreifen vorn Hygieneinstitut Hamburg, Hamburg, Deutschland, in tryptischer Sojalösung nach einer 5-minütigen Exposition bei 121ºC (die 5- minütige Exposition diente dem Abtöten sämtlicher vegetativen Keime in der Erde, so daß nur B. stearothermophilus übrigbleibt; und ein skandinavischer Stamm, isoliert aus Sporenstreifen, die hergestellt wurden vom Statens Institute for Falkehelse, Oslo, Norwegen.
Alle Sporen wurden auf Agar als Nährboden gezüchtet, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Sporen wurden mit 11.000 UpM 5 Stunden bei 4ºC in einem Dichtegradienten zentrifugiert, der im Handel erhältlich ist als Percoll bei Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden. Nach dem Zentrifugieren wurden die Sporen wieder in sterilem destilliertem Wasser suspendiert. Bei German Earthspore wurden zwei einzelne Zelischichten während des Zentrifugierens in dem Dichtegradienten isoliert. Mittels Phasenkontrastmikroskopie wurde festgestellt, daß die untere Schicht hauptsächlich aus Sporen bestand, und die obere Schicht hauptsächlich aus vegetativen Zellen und vegetativen Teilchen mit einer geringen Anzahl an Sporen bestand. Beide Schichten wurden getrennt voneinander getestet.
Die Sporen wurden auf 6,35 x 28,58 mm große Streifen Filterpapier (Filterpapier vom Typ "S&S 591A") in einer Population von mindestens 1 x 10&sup6; pro Träger aufgetragen und getrocknet. Die Vorrichtungen wurden zusammengesetzt wie die Vorrichtung 1 in Beispiel 1, nur daß bei einer Charge von Vorrichtungen mit den Sporen "ATCC 8005" das verwendete Enzymsubstrat 4-Methylumbelliferyl-β-D-galactosid war, im Handel erhältlich bei Sigma, zu 0,1 g/l gelöst in 200 pl N,N-Dimethylformamid, anstelle von 4-Methylumbelliferyl-α- D-glucosid, um die Enzymaktivität von β-D-Galactosidase auf den "ATCC 8005" Sporen nachzuweisen. Drei Chargen wurden bei 132ºC für 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 und 3,0 Minuten in einem Dampfsterilisator "Amsco Eagle Model 2013" sterilisiert. Nach der Exposition wurden die inneren Ampullen zerbrochen, und die Einheiten wurden bei 56ºC inkubiert. Die Röhrchen wurden mit einer UV-Lampe (λ = 366 nm) beleuchtet, um die Fluoreszenz nach einer Inkubation von 10 Min., 20 Min., 30 Min., 60 Min., 120 Min., 180 Min. und 240 Min. optisch anzuzeigen. Außerdem wurde das Sporenwachsturn, angezeigt durch eine Farbänderung von Purpur nach Gelb, nach 24-stündiger Inkubation durch Sichtprüfung festgestellt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle V angegeben. Tabelle V Tabelle V (Forts.) Tabelle V (Forts.)
Tabelle V zeigt, daß alle getesteten Stämme von B. stearethermophilus eine Enzymaktivität besaßen (entweder von α-D- Glucosidase oder von β-D-Galactosidase), die mit der Überlebensrate der Sporen korrelierte. Bei den meisten Einheiten, in denen Sporen überlebten, wurde in einem Inkubationszeitraum von 2 Stunden Fluoreszenz festgestellt, und bei vielen Einheiten wurde nach 10-minütiger Inkubation Fluoreszenz festgestellt. Die Zellschicht, die hauptsächlich aus vegetativen Zellen von "German Earthspore" bestand, zeigte auch nach einer subletalen Exposition ein Überleben von Enzymen. Dies deutet darauf hin, daß die zu den vegetativen Zellen gehörige α-D-Glucosidase bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnte. Bei mehreren Einheiten mit dem skandinavischen Stamm wurde ein Überleben von Enzymen festgestellt und kein Keimwachstum bei der weiteren Inkubation. Dies wurde früher schon beobachtet und tritt in marginalen Zyklen auf. Das Enzym bleibt etwas länger aktiv als die Spore, und dadurch erhält man einen zusätzlichen Sicherheitsspielraum, indem man mehr Zyklen überwacht, was die Sterilität der Gegenstände in dem Sterilisator sicherstellt.

BEISPIEL 6

Sporen von Bacillus stearothermophilus wurden auf eine Vielzahl von Materialien aufgetragen, um die Fluoreszenzanzeigezeit zu vergleichen. Die Sporen von B. stearotherrnophilus wurden gewonnen wie in Beispiel 1 beschrieben, und sie wurden in Ethanol suspendiert und mit ungefähr 1 x 10&sup6; Sporen pro 6,35 x 28,58 mm großem Streifen aus den folgenden Materialien aufgetragen: Polypropylen/Reyon-Faservlies, im Handel erhältlich als Faservlies "Novonette #149-190" bei Kendall Fiber Products Division; Nylonfaservlies, im Handel erhältlich als "Novonette #149-000" bei Kendall Fiber Products Division, Boston, MA; mikroporöse hydrophobe Folie, im Handel erhältlich als mikroporöse hydrophobe Folie "Celgard 2500" bei Celanese Separations Products, Charlotte, NC; mikroporöse hydrophile Folie, im Handel erhältlich als mikroporöse hydrophile Folie "Celgard Nr. 3401" bei Celanese Separations Products; Aluminiumfolie, im Handel erhältlich bei Reynolds, Metals Company, Richmond, VA; Filterpapier, im Handel erhältlich als Filterpapier mit der Bezeichnung "S&S 591A" von Schleicher & Schuell; Filterpapier, im Handel erhältlich als Filterpapier mit der Bezeichnung "S&S 903" von Schleicher & Schuell; und Glasfaservlies, im Handel erhältlich als "Manniglas #1267 Nonwoven Glass Fiber Paper" bei Manning Paper Cornpany, Division of Hammermill Paper Co., Troy, NY. 10 Mikroliter der suspendierten Sporen, d.h. 1 x 106 Sporen, wurden ebenfalls in Polypropylenröhrchen derselben Abmessungen wie oben in Beispiel 1 beschrieben eingebracht.
Vorrichtungen, in denen die Sporenstreifen verwendet wurden, wurden gemäß Beispiel 1, Vorrichtung 1, und wie in Fig. 3 und 4 gezeigt hergestellt, nur daß hier ein Stück Polypropylenvliesgaze mit einem Durchmesser von 1,75 mm (11/16 Zoll), die im Handel erhältlich ist "0,5 oz. Celestra Nonwoven Polypropylene" bei Crown Zellerback Corp., Camas, Washington, sandwichartig zwischen den Sporenstreifen 46 und den Boden des äußeren Röhrchens gelegt wurde. Durch diese sandwichartige Anordnung wurde sichergestellt, daß die Sporenstreifen mit Nährmedium benetzt werden, wenn die Ampulle 48 zerbricht, da die Gaze wie ein Docht wirkt, der Nährmedium über das hydrophobe Nylonvlies, die mikroporöse hydrophobe Folie, die Aluminiumfolie oder das Glasfaservlies hinwegzieht. Vorrichtungen mit sporenbeschichteten Röhrchen wurden gemäß Beispiel 1, Vorrichtung 1 hergestellt, nur daß hier die Vorrichtung keinen Sporenstreifen und auch keine Sperre enthielt. Drei Chargen der Indikatoren wurden in dem Dampfsterilisator "Amsco Eagle Model 2013" bei 132ºC für die Dauer von 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 und 3,0 Minuten sterilisiert. Nach der Exposition wurden die Ampullen, die die Enzymsubstratlösung und das Nährmedium enthielten, zerbrochen, und die Vorrichtungen wurden bei 56ºC inkubiert und mit einer langwelligen UV-Lampe (λ = 366 nm), die im Handel erhältlich ist als "Blak-Raylamp", Typ UV L-21, bei Ultraviolet Products, Inc., San Gabriel, CA., alle 15 Minuten für 1 Stunde, und dann stündlich für die Dauer von bis zu 6 Stunden auf Fluoreszenz untersucht. Die Inkubation wurde 24 Stunden fortgesetzt, und die Vorrichtungen wurde auf die Anzeige eines Wachstums (gelb) oder keines Wachstums (purpur) überprüft.
Die Ergebnisse sind in Tabelle VI dargestellt. Tabelle VI Tabelle VI (Forts.) Tabelle VI (Forts.)
Bei allen Indikatoren, bei denen die auf die Träger aufgetragenen Sporen die Dampfsterilisation überlebten, wurde innerhalb von 15 Minuten das Überleben der Sporen (aufgrund der Enzymaktivität) festgestellt. Bei den Indikatoren, bei denen die Sporen direkt auf die Röhrchen aufgetragen waren, dauerte es bis zu zwei Stunden, um alle Fälle einer aktiven α-D-Glucosidase und damit das Überleben von Sporen zu erfassen. Dieser längere Zeitraum bis zum Erhalt einer zuverlässigen Anzeige ist darauf zurückzuführen, daß bei den als Indikator dienenden sporenbeschichteten Röhrchen das gesarne Volumen an Nährmedium auf Fluoreszenz untersucht werden muß. Bei den Vorrichtungen, bei denen Sporenstreifen und eine Sperre zwischen der Ampulle und dem Sporenstreifen verwendet werden, muß dagegen nur der Sporenstreifen auf Fluoreszenz untersucht werden. Die Sperre wirkt als semipermeable Membran, damit eine geringe Menge Nährmedium und Enzymsubstrat mit dem Sporenträger in Kontakt kommen kann. Die Reaktion des Enzyms auf jedem Teil des Trägers mit dem Enzymsubstrat kann innerhalb einer wesentlich kürzeren Zeit beobachtet werden als die Reaktion des Enzyms mit dem gesamten Inhalt der Ampulle.

BEISPIEL 7

Bacillus subtilis vom Typ "ATCC 9372" wurde über Nacht (16 Stunden) bei 37ºC in tryptischer Sojalösung kultiviert. Mit dieser Kultur wurde die Oberfläche von Agarplatten geimpft, die aus 8 g/l Nährlösung, 0,011 g/l Mangansulfat und 20 g/l Agar mit einem pH-Wert von 7,2 bestanden. Die Platten wurden bei 37ºC 6 Tage lang inkubiert, und die Sporen wurden von den Platten abgeschabt und in sterilem destilliertem Wasser suspendiert. Die Sporen wurden von den vegetativen Teilchen getrennt, indem die Suspension mit 7000 UpM bei 4ºC für 20 Minuten zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde abgegossen, und die Sporen wurden wieder in sterilem destilliertem Wasser suspendiert. Dieser Reinigungsvorgang wurde mehrmals wiederholt.
Die Sporen von Bacillus subtilis wurden in einer Population von 1,0 x 10&sup8; auf 6,35 x 28,58 mm große Filterpapierstreifen mit der Bezeichnung "S&S 591A" aufgetragen. Die Vorrichtungen wurden mit diesen Sporenstreifen hergestellt, wie in Fig. 3 und 4 gezeigt, und wie in Beispiel 1, Vorrichtung 1 beschrieben. Drei Chargen dieser Vorrichtungen wurden bei 54ºC und 50 % rel. Feuchte 30 Minuten lang vorbehandelt. Die Vorrichtungen wurden dann 15, 30, 60 und 120 Minuten bei 54ºC und 50 % rel. Feuchte 600 mg/l Ethylenoxid ausgesetzt in einem Gassterilisator vom Typ Steri-Vac 4008, der im Handel erhältlich ist bei 3M Co., St. Paul, Minnesota, und der gemäß der Norm AAMI BEOU-3/82 der "Association for the Advancement of Medical Instrumentation, Standard for BIER/EO Gas Vessels" modifiziert worden war. Nach der Exposition wurden die inneren Ampullen aus den Vorrichtungen herausgenommen, und 0,67 ml einer Lösung, die identisch war mit der in der inneren Ampulle, außer daß sie 0,03 g/l 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (im Handel erhältlich bei ICN Pharmaceuticals Inc., Cleveland, Ohio) enthielt anstelle des pH-Indikatorfarbstoffs Bromkresolpurpur, und 0,1 g/l 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucosid (im Handel erhältlich bei Sigma) anstelle von 4-Methylumbelliferyl-α-D-glucosid, wurden in das äußere Röhrchen pipettiert. Die Vorrichtungen wurden bei 37ºC inkubiert. Die Vorrichtungen wurden mit einer UV-Lampe (λ = 366 nm) bestrahlt, um nach einer Inkubation von 30 Min., 60 Min., 90 Min., 120 Min., 180 Min., 240 Min., und 300 Min. Fluoreszenz optisch anzuzeigen. Außerdem wurde das Sporenwachstum, angezeigt durch Farbänderung von farblos nach rot, nach einer Inkubation von 24 und 168 Stunden durch Sichtprüfung festgestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII angegeben. TABELLE VII
* zeigt an, daß eine oder mehrere der auftretenden falschen positiven Reaktionen das Ergebnis einer restlichen Enzymaktivität nach der Inaktivierung der Sporen bei marginalen Sterilisationszyklen ist.
Tabelle VII zeigt an, daß bei den Vorrichtungen, wo die Sporen den 15-minütigen Kontakt mit Ethylenoxid überlebten, die aus der Reaktion von aktiver β-D-Glucosidase mit 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucosid resultierende Fluoreszenz nach 90-minütiger Inkubation durch Sichtprüfung festgestellt wurde. Das Enzym war nach 120-minütigem Kontakt mit Ethylenoxid vollständig inaktiviert, womit bewiesen war, daß ein 120-minütiger Kontakt mit Ethylenoxid einen vollständigen und wirksamen Sterilisationszyklus darstellt. Eine gewisse restliche Enzymaktivität wurde nach einer 3- bzw. 4-stündigen Inkubation bei einigen wenigen Sterilisationszyklen von 30 bzw. 60 Minuten festgestellt.

BEISPIEL 8

Gemäß Beispiel 7 gewonnene Sporen von Bacillus subtilis vorn Typ "ATCC 9372" wurden in einer Population von 1,0 x 10&sup8; auf 6,35 x 28,58 mm große Filterpapierstreifen mit der Bezeichnung "S&S 591A" aufgetragen. Mit diesen Sporenstreifen wurden Vorrichtungen hergestellt, wie in Fig. 3 und 4 gezeigt und in Beispiel 11 Vorrichtung 1 beschrieben. Drei Chargen dieser Vorrichtungen wurden bei 54ºC und 50 % rel. Feuchte 30 Minuten vorbehandelt. Die Vorrichtungen wurden dann 15, 30, 60 und 120 Minuten bei 54ºC und 50 % rel. Feuchte mit 600 mg/l Ethylenoxid in einem Gassterilisator vorn Typ "Steri-Vac 4008", der gemäß Beispiel 7 modifiziert worden war, in Kontakt gebracht. Danach wurden die Sporenstreifen aus den Vorrichtungen genommen und in einzelne Mulden in einer Mikrotiterplatte mit 96 Mulden gelegt, die im Handel erhältlich ist unter der Bezeichnung "Dynatech MicroFLUOR System" bei Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, Virginia. Jede Mulde enthielt 200µl einer Lösung von 17 g/l bakteriologischem Pepton, 0,17 g/l L-Alanin, 0,03 g/l Triphenyitetrazoliumchlorid und 0,1 g/l 4-Methylurnbelliferyl-β-D-glucosid. Drei negative Kontrollmulden in der Platte enthielten die Lösung von Nährmedium und Enzymsubstrat ohne den Sporenstreifen. Die Platte wurde bei 37ºC inkubiert, und die Fluoreszenz jeder Mulde wurde nach einer Inkubationszeit von 0, 60, 120, 180 und 240 Minuten in einem Fluorometer gemessen, das im Handel erhältlich ist unter der Bezeichnung "3M FluoroFAST 96" bei der 3M Cornpany, St. Paul, Minnesota. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII angegeben, und zwar als Durchschnitt der relativen Fluoreszenz für die drei Mulden. TABELLE VIII DURSCHNITTLICHE RELATIVE FLUORESZENZ (in relativen Fluereszenzeinheiten)
Die Ergebnisse von Beispiel 7 zeigen, daß Sporen von Bacillus subtilis den in diesem Beispiel beschriebenen 15-minütigen Kontakt mit Ethylenoxid überleben und nach einem Kontakt von mindestens 30 Minuten abgetötet werden. Wie aus der den 15 Minuten behandelten Sporenstreifen enthaltenden Mulde hervorgeht, wird die Aktivität des Enzyms β-D-Glucosidase und damit das Überleben von B. subtilis nach 3-stündiger Inkubation durch eine Zunahme der relativen Fluoreszenz von mindestens dem 2,5fachen der Fluoreszenz des Untergrunds der negativen Kontrollprobe nach 3-stündiger Inkubation angezeigt. Bei der unbehandelten Kontrollprobe weist eine Zunahme der relativen Fluoreszenz um mehr als das 2,5fache der Fluoreszenz des Untergrunds der negativen Kontroliprobe nach nur 1-stündiger Inkubation ebenfalls auf Enzymaktivität und Überleben von Sporen hin.
Bei den mit Ethylenoxid mindestens 30 Minuten sterilisierten Streifen hatte die relative Fluoreszenz jedoch einen Wert von weniger als dem 2,5fachen der negativen Kontrollprobe nach 3-stündiger Inkubation. Dies deutet also auf restliche Enzymaktivität und keine überlebenden Sporen hin.
Fig. 7 ist die graphische Darstellung der in Tabelle VIII aufgeführten Ergebnisse. In der Figur stellt Linie A die 15 Minuten behandelte Vorrichtung dar, Linie B stellt die 30 Minuten behandelte Vorrichtung dar, Linie C stellt die 60 Minuten behandelte Vorrichtung dar, Linie D stellt die 120 Minuten behandelte Vorrichtung dar und Linie E stellt die negative Kontrollprobe dar.

BEISPIEL 9

Gemäß Beispiel 7 gewonnene Sporen von Bacillus subtilis vom Typ "ATCC 9372" wurden in einer Population von 1,0 x 10&sup8; auf 6,35 x 28,58 mm große Filterpapierstreifen mit der Bezeichnung "S&S 591A" aufgetragen. Mit diesen Sporenstreifen wurden Vorrichtungen hergestellt, wie in Fig. 3 und 4 gezeigt und in Beispiel 11 Vorrichtung 1 beschrieben. Drei Chargen der Vorrichtungen wurden bei 54ºC und 50 % rel. Feuchte 30 Minuten vorbehandelt. Die Vorrichtungen wurden dann 15, 30, 60 und 120 Minuten bei 54ºC und 50 % rel. Feuchte mit 600 mg/l Ethylenoxid in einem Gassterilisator vom Typ "Steri-Vac 400B" in Kontakt gebracht, der gemäß Beispiel 7 modifiziert worden war. Danach wurden die Sporenstreifen zusammen mit drei identischen unbehandelten Sporenstreifen aus den Vorrichtungen herausgenommen und in einzelne Mulden in einer Mikrotiterplatte mit 96 Mulden gelegt, die im Handel erhältlich ist unter der Bezeichnung "Dynatech MicroFLUOR System" bei Dynatech Laboratories Inc., Alexandria, Virginia. Jede Mulde enthielt 200µl einer Lösung von 17 gil bakteriologischem Pepton, 0,17 g/l L-Alanin, 0,03 g/l Triphenyltetrazoliumchlorid und 0,1 g/l Methylumbelliferyl-α-D-arabinofuranosid, im Handel erhältlich bei Sigma. Drei negative Kontrollmulden in der Platte enthielten die Lösung von Nährmedium und Enzymsubstrat ohne den Sporenstreifen. Die Platte wurde bei 37ºC inkubiert, und die Fluoreszenz jeder Mulde wurde nach einer Inkubationszeit von 0, 60, 120, 180 und 240 Minuten in einem Fluorimeter gemessen, das im Handel erhältlich ist unter der Bezeichnung "3M FluoroFAST 96" bei der 3M Company, St. Paul, Minnesota. Die Ergebnisse sind als Durchschnitt der relativen Fluoreszenz für die drei Mulden in Fig. 8 angegeben, wobei die durchschnittliche relative Fluoreszenz aufgetragen ist im Vergleich zur Inkubationszeit für Mulden mit Sporen, die 15, 30, 60 und 120 Minuten behandelt worden waren, und mit der negativen Kontrollprobe. In der Figur stellt F die 15 Minuten behandelte Vorrichtung dar, G stellt die 30 Minuten behandelte Vorrichtung dar, H stellt die 60 Minuten behandelte Vorrichtung dar, J stellt die 120 Minuten behandelte Vorrichtung dar, und K stellt die negative Kontrollprobe dar.
Die Ergebnisse von Beispiel 7 zeigen, daß Sporen von B. subtilis einen is-minütigen Kontakt mit Ethylenoxid des oben beschriebenen Typs überleben und nach einem mindestens 30-minütigen Kontakt abgetötet werden. In diesem Beispiel hatte die α-D-Arabinofuranosidase nach dem 120-minütigen Zyklus immer noch eine Restaktivität, was als vollständiger und wirksamer Sterilisationszyklus angesehen wird. Der Fluoreszenzgrad entspricht der Fluoreszenz des Untergrunds, und die Sterilisation gilt als gescheitert, wenn die Fluoreszenz wesentlich über diesen Wert ansteigt. Nach 3-stündiger Inkubation beträgt beispielsweise der Unterschied an relativen Fluoreszenzeinheiten (RFE) zwischen dem 15 Minuten behandelten Streifen und dem 120 Minuten behandelten Streifen 2166. Dieser Unterschied ist ganz beachtlich und deutet darauf hin, daß bei den gegebenen Ethylenoxidbedingungen eine Dauer von 15 Minuten einen unvollständigen Sterilisationszyklus darstellt. Der Unterschied zwischen dem 30 Minuten behandelten Streifen und dem 120 Minuten behandelten Streifen beträgt nur 745 RFE. Bei marginalen Stenlisationszyklen von 30 Minuten gilt dieser Unterschied als unwesentlich und deutet auf eine restliche Enzymaktivität hin.

BEISPIEL 10

Gemäß Beispiel 1 gewonnene Sporen von Bacillus stearothermophilus ("ATCC 7953") wurden nach einmaligem Waschen in einer Population von 1 x 10&sup8; Sporen/ml in destilliertem Wasser suspendiert. Mit dem folgenden Verfahren wurde das Enyzm α-D-Glucosidase gereinigt. Die Suspension (200 ml) wurde gegen 2 l einer Lösung von 10 mM Acetatpuffer und 5 mM CaCl&sub2;, pH = 6,2, über Nacht bei 4ºC dialysiert. Unlösliche Rückstände wurden dann durch Zentrifugieren entfernt. Der Überstand wurde mit festem Ammoniumsulfat fraktioniert. Der Niederschlag von 20%-60% Ammoniumsulfat wurde auf einem Büchner-Trichter mit einem Filterkissen gesammelt. Das Filterkissen wurde hergestellt, indem eine Suspension (100 g/l) von "Celite Filter Aid", im Handel erhältlich bei Manville Specialty Product Group, Lompoc, CA, über zwei Lagen Filterpapier Whatrnan No. 1 geleitet wurde. Nach dem Filtrieren wurde das Filterkissen ¹ºCelite Filter Aid" in 20 ml der Lösung aus 10 mM Acetatpuffer und 5 mM CaCl&sub2;, pH = 6,2, suspendiert und 4 Stunden bei 4ºC gerührt. "Celite Filter Aid" wurde aus dem löslichen Enzym herausgefiltert. Die hellbraune Enzymlösung wurde über Nacht gegen 4 l der Lösung von 10 mM Acetatpuffer und 5 mM CaCl&sub2; bei 4ºC dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde aus dem Dialyseschlauch abgezogen und gefiltert, um unlösliche Teilchen zu entfernen.
Die dialysierte Lösung wurde auf einen pH-Wert von 6,2 eingestellt, und es wurden 2 Volumeneinheiten kaltes Aceton (20ºC) unter Rühren zugesetzt. Die Aceton-Enzym-Lösung wurde 6 Stunden auf -20ºC gehalten. Der hellbraune Niederschlag wurde durch Schwerkraftfiltration bei 4ºC gesammelt und in 10 ml der Lösung aus 10 mM Acetatpuffer und 5 mM CaCl&sub2;, pH = 6,2, gelöst. Die hellbraune Lösung wurde auf einen pH Wert von 5,5 eingestellt durch Zugabe von 0,1 M Acetatpuffer, pH = 4,6. Die Lösung wurde wieder mit zwei Volumeneinheiten kaltem Aceton (-20ºC) behandelt und über Nacht bei 20ºC aufbewahrt. Der Niederschlag wurde durch Schwerkraftfiltration gesammelt und in 10 ml der Lösung aus 10 mM Acetatpuffer und 5 mM CaCl&sub2;, pH = 6,2, gelöst. Die hellbraune Lösung wurde 48 Stunden gegen 4 l einer Lösung aus 50 mM Phosphatpuffer und 5 mM EDTA, pH = 6,2 (Puffer A) bei 4ºC dialysiert, wobei der Puffer alle 24 Stunden komplett ausgetauscht wurde.
5 ml der dialysierten Probe wurden in eine Säule (2,5 x 30 cm) gegeben, die mit Kügelchen vom Typ "DEAE-Sephadex " gefüllt war, im Handel erhältlich bei Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, und mit 50 mM Phosphatpuffer und 5 mM EDTA, pH = 6,2, ins Gleichgewicht gebracht. Die Säule wurde nacheinander mit folgendem gewaschen: a) 500 ml Puffer A, und b) 200 ml eines linearen 0-0,8 M NaCl Gradienten in Puffer A. Die Strömungsgeschwindigkeit wurde auf ungefähr 5 ml/60 min gehalten. Die auftretenden aktiven Fraktionen wurden gesammelt und 48 Stunden gegen 4 l destilliertes Wasser dialysiert, wobei alle 24 Stunden komplett ausgetauscht wurde. Die gefriergetrockneten Fraktionen wurden in 3 ml einer Lösung aus 150 mM Phosphatpuffer und 5 mM EDTA, pH = 6,2 (Puffer B), suspendiert. Diese Suspension wurde durch eine Säule (2,5 x 30 cm) geleitet, die mit Kügelchen vom Typ "Sephadex G-100", im Handel erhältlich bei Pharmacia, Inc., gefüllt war, wobei der Puffer B eine Strörnungsgeschwindigkeit von ungefähr 15 ml/60 Min. besaß. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und gegen 4 l destilliertes Wasser dialysiert. Die dialysierten Fraktionen wurden dann gefriergetrocknet.
Sieben 6,35 x 28,58 mm große Streifen aus Filterpapier mit der Bezeichnung "S&S 903" wurden mit einer Suspension von 0,02 M gereinigter α-D-Glucosidase in destilliertem Wasser getränkt. Sieben weitere Papierstreifen desselben Typs und mit denselben Abmessungen wurden mit einer Lösung von Sporen von B. stearothermophilus ("ATCC 7953") in einer Konzentration von 1 x 10&sup6; Sporen/ml, gewonnen wie in Beispiel 1 beschrieben, in destilliertem Wasser suspendiert. Sämtliche Trägerstreifen wurden über Nacht bei Umgebungstemperatur (20ºC) luftgetrocknet.
Mit diesen Sporenstreifen wurden Vorrichtungen hergestellt, wie in Fig. 3 und 4 gezeigt und in Beispiel 1 als Vorrichtung 1 beschrieben. Diese Vorrichtungen wurden in einem Normaldruck-Dampfsterilisator, der im Handel erhältlich ist als "Amsco Eagle Model 2013", bei 132ºC und 469,4 kg/cm² (33 psi) für die Dauer von 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 und 3,0 Minuten behandelt. Danach wurden die inneren Ampullen, die das Enzymsubstrat und das Nährmedium enthielten, zerbrochen, und die Einheiten wurden bei 56ºC 24 Stunden inkubiert. Die Röhrchen wurden mit einer UV-Lampe (λ = 366 nm) beleuchtet, um die Fluoreszenz optisch anzuzeigen.
Die relative Fluoreszenz jeder Vorrichtung wurde ebenfalls gemessen mit einem Fluorometer vom Typ "3M FlouoroFAST ", bei 366 nm. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX angegeben. Tabelle IX
Die Ergebnisse in Tabelle IX zeigen, daß die Vorrichtungen, bei denen das gereinigte Enzym verwendet wird, die gleiche optisch sichtbar gemachte Fluoreszenz aufweisen, und ungefähr die gleiche gemessene Fluoreszenz, wie die Vorrichtungen, bei denen B. stearothermophilus verwendet wird. Dieses Beispiel zeigt also, daß die Aktivität des gereinigten Enzyms allein, unabhängig von der Spore, aus der es gewonnen wurde, geeignet ist, um das Überleben von Sporen nachzuweisen.

Claims

1. Verfahren zur raschen Ermittlung der Wirksamkeit eines Sterilisationszyklus, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

a) den Sterilisationszyklus einer Quelle für aktives Enzym aussetzen, die eine nachweisbare Menge des Enzyms liefert, wobei das Enzym nach einem Sterilisationszyklus, der für wenigstens einen, üblicherweise zur Überwachung der Sterilisation verwendeten Testkeim subletal ist, eine ausreichende Wirksamkeit besitzt, um mit einer wirksamen Menge eines Substratsystems für das Enzym zu reagieren, so daß innerhalb von weniger als vierundzwanzig Stunden ein nachweisbares enzymmodifiziertes Produkt entsteht, wobei das Enzym nach einem Sterilisationszyklus, der für den Testkeim letal ist, inaktiviert bzw. in seiner Wirksamkeit eingeschränkt ist,

b) nach Beendigung des Sterilisationszyklus Inkubieren des Enzyms mit einer wirksamen Menge des Enzymsubstratsystems für eine Zeitdauer und unter Bedingungen, die ausreichen, um die Reaktion jedes aktiv bleibenden Enzyms mit dem Substrat zu beschleunigen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, des weiteren dadurch gekennzeichnet, daß die Quelle für aktives Enzym Bakterien oder Pilze im Sporenzustand bzw. im vegetativen Zustand sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, des weiteren dadurch gekennzeichnet, daß das aktive Enzym von einem Keim isoliert wurde.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, des weiteren dadurch gekenilzeichnet, daß es sich bei dem Enzym um ein Enzym handelt, das

a) dann, wenn es einem Sterilisationszyklus unterzogen wird, der gerade ausreichen würde, um die Population von 1 x 10&sup6; Testkeimen um 6 log zu reduzieren, eine Wirksamkeit gleich dem "Untergrund" besitzt, gemessen durch Reaktion mit einer wirksamen Menge eines Enzymsubstratsystems, das in der Lage ist, mit dem aktiven Enzym zu reagieren, um ein nachweisbares enzymmodifiziertes Produkt zu erzeugen; und

b) dann, wenn es einem Sterilisationszyklus unterzogen wird, der ausreicht, um die Population von 1 x 10&sup6; Testkeimen um mindestes 1 log, aber weniger als 6 log zu reduzieren, eine Wirksamkeit größer als der "Untergrund" besitzt, gemessen durch Reaktion mit einer wirksamen Menge des Enzymsubstratsystems.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, des weiteren dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Enzym um β-D-Glucosidase, α-D-Glucosidase, alkalinische Phosphatase, saure Phosphatase, Butyratesterase, Caprylatesteraselipase, Myristatlipase, Leucinarninopeptidase, Valinaminopeptidase, Chymotrypsin, Phosphohydrolase, α-D-Galactosidase, β-D-Galactosidase, α-L-Arabinofuranosidase, β- D-Glucuronidase, N-Acetyl-β-glucosaminidase, β-D-Cellobiosidase, Alaninaminopeptidase, Prolinaminopeptidase, Tyrosinaminopeptidase, Leucinaminopeptidase, Phenylalaninaminopeptidase und eine aus sporenbildenden Keimen gewonnene Fettsäureesterase handelt.

6. Verfahren nach Anspruch 2, des weiteren dadurch gekennzeichnet, daß die Quelle für aktives Enzym Bacillus stearothermophilus oder Bacillus subtilis ist.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, des weiteren dadurch gekennzeichnet, daß das Enzymsubstratsystem enzymatisch modifiziert werden kann zu einem enzymmodifizierten Produkt, das sich von dem Enzym oder Enzymsubstratsystern hinsichtlich seiner Lurnineszenz, Fluoreszenz, Farbe oder Radioaktivität unterscheidet.

8. Verfahren nach Anspruch 7, des weiteren dadurch gekennzeichnet, daß das Enzymsubstratsystem fluerogen und ausgewählt ist aus 4-Methylumbelliferylderivaten, 7-Amido- 4-methylcumarinderivaten, Diacetylfluoresceinderivaten und Fluorescamin.

9. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Bakterien oder Pilze üblicherweise zu Überwachung der Sterilisation verwendet werden, wobei das Verfahren des weiteren gekennzeichnet ist durch den folgenden Schritt

c) die nach Beendigung des Sterilisationszyklus noch lebenden Bakterien oder Pilze mit einem wäßrigen Nährmedium inkubieren, das in der Lage ist, bei der Inkubation das Wachstum der noch lebenden Bakterien oder Pilze zu beschleunigen, und mit einem Detektormaterial, das je nach dem Wachstum der Bakterien oder Pilze unter Bedingungen, die geeignet sind, das Wachstum der noch lebenden Bakterien oder Pilze zu beschleunigen, eine nachweisbare Änderung erfahren kann.

10. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Enzym nach einem Sterilisationszyklus, der für wenigstens einen üblicherweise zur Überwachung der Sterilisation verwendeten Testkeim subletal ist, eine ausreichende Wirksamkeit besitzt, um mit dem Substratsystem zu reagieren, so daß innerhalb von zwölf Stunden oder weniger ein nachweisbares enzymmodifiziertes Produkt entsteht.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, bei dem das Enzym nach einem Sterilisationszyklus, der für wenigstens einen üblicherweise zur Überwachung der Sterilisation verwendeten Testkeirn subletal ist, eine ausreichende Wirksamkeit besitzt, um mit dem Substratsystem zu reagieren, so daß innerhalb von weniger als acht Stunden ein nachweisbares enzymmodifiziertes Produkt entsteht.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1-9, bei dem das Enzym nach einem Sterilisationszyklus, der für wenigstens einen üblicherweise zur Überwachung der Sterilisation verwendeten Testkeim subletal ist, eine ausreichende Wirksamkeit besitzt, um mit dem Substratsystem zu reagieren, so daß innerhalb von drei Stunden oder weniger ein nachweisbares enzymmodifiziertes Produkt entsteht.

13. Sterilitätsindikator, umfassend:

a) einen äußeren Behälter (10) mit flüssigkeitsundurchlässigen und im wesentlichen nicht gasabsorbierenden Wänden (12), wobei der Behälter (10) mindestens eine Öffnung (14) aufweist; und

b) eine gasdurchlässige, bakterienundurchlässige Einrichtung (22), welche die Öffnung (14) bedeckt;

dadurch gekennzeichnet, daß

in dem äußeren Behälter (10) eine nachweisbare Menge eines isolierten aktiven Enzyms enthalten ist, wobei das Enzym nach einem Sterilisationszyklus, der für wenigstens einen üblicherweise zur Überwachung der Sterilisation verwendeten Testkeim subletal ist, eine ausreichende Wirksamkeit besitzt, um mit einer wirksamen Menge eines Substratsystems für das Enzym zu reagieren, so daß innerhalb von weniger als vierundzwanzig Stunden ein nachweisbares enzymmodifiziertes Produkt entsteht, wobei das Enzym jedoch nach einem Sterilisationszyklus, der für den Testkeim letal ist, inaktiviert oder in seiner Wirksamkeit eingeschränkt ist.

14. Sterilitätsindikator, umfassend:

a) einen äußeren Behälter (10) mit flüssigkeitsundurchlässigen und im wesentlichen nicht gasabsorbierenden Wänden (12), wobei der Behälter (10) wenigstens eine Öffnung (14) aufweist;

c) in dem äußeren Behälter (10) eine Quelle für aktives Enzym in einer nachweisbaren Konzentration, wobei das Enzym nach einem Sterilisationszyklus, der für wenigstens einen üblicherweise zur Überwachung der Sterilisation verwendeten Testkeim subletal ist, eine ausreichende Wirksamkeit besitzt, um mit einer wirksamen Menge eines Substratsystems für das Enzym zu reagieren, so daß innerhalb von weniger als vierundzwanzig Stunden ein nachweisbares enzymmodifiziertes Produkt entsteht, wobei das Enzym jedoch nach einem Sterilisationszyklus, der für den Testkeim letal ist, inaktiviert oder in seiner Wirksamkeit eingeschränkt ist;

außerdem befindet sich in dem Behälter (10) eine wirksame Menge eines Enzymsubstrats, das in wäßriger Lösung mit einem aktiven Enzym reagieren kann, so daß ein nachweisbares enzymmodifiziertes Produkt entsteht.

15. Indikator nach Anspruch 14, bei dem die Quelle für aktives Enzym üblicherweise zur Überwachung der Sterilisation verwendete Bakterien oder Pilze sind, und wobei der Indikator des weiteren dadurch gekennzeichnet ist, daß das Enzymsubstrat in einem versiegelten, sich Öffnen lassenden, gas- und flüssigkeitsundurchlässigen inneren Behälter (18) zusammen mit einem wäßrigen Nährmedium enthalten ist, das in der Lage ist, bei der Inkubation das Wachstum der Bakterien oder Pilze zu beschleunigen, und mit einem Detektormaterial, das je nach dem Wachstum der Bakterien oder Pilze seine Farbe sichtbar ändern kann.