JP2799203B2 - 滅菌サイクル効能測定法及び迅速読取生物学的インジケータ - Google Patents
滅菌サイクル効能測定法及び迅速読取生物学的インジケータInfo
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Description
方法に関する。特に、本発明はその活性が滅菌効能をモ
ニターするため通常に使用される少なくとも一つの微生
物(以下“試験微生物”と称する)の生存度と相関でき
る酵素を使用する。試験微生物に亜致死的である滅菌サ
イクルに続いてこの酵素は比較的短時間では、例えば通
常には8時間又はそれ以下で酵素基質と反応するのに十
分に活性のままである。しかしながら、この酵素は試験
微生物に致死的である滅菌サイクルに続いて不活性化さ
れ又は活性がかなり減少される。本発明は更にこの酵素
を含む生物学的滅菌インジケータに関する。
ジケータ及び化学的インジケータは当業者に周知であ
る。従来の生物学的インジケータでは、自然の汚染によ
り存在する大抵の有機体よりも、使用される滅菌法に対
して何倍も耐性の大きい試験微生物がキヤリア上に塗被
されそして滅菌されるべき物品と共に滅菌器に入れられ
る。滅菌サイクルの完了後にこのキヤリアは栄養培地で
培養されて試験微生物のどれ程が滅菌工程に生存したか
どうかを測定する。検出可能な数の有機体の成長は通常
には最少24時間を要する。この期間の間、推定上滅菌さ
れた物品を隔離すべきである。
れた物品の適正な隔離のための空間又は真の隔離を許す
のに十分な数の物品の何れをも有しない。結果として、
滅菌が適正でありかつ実験室から続く報告により確認さ
れるであろうとの前提の下で推定上滅菌された物品をス
トツクに戻して置く。
変化により滅菌性を指示する化学品を利用する。この化
学品インジケータの利点は結果が滅菌サイクルの最後で
知れることにある。しかしながら、これらの結果は、米
国特許第4,448,548号に記載される装置におけるよう
に、特定の温度が特定の時間の間に到達したこと;米国
特許第4,348,209におけるように、エチレンオキシドガ
スが存在することのみを示す。これらの装置は試験微生
物を不活性化するために必要なすべての条件が得られた
どうかを示さない。生きている生物のみが滅菌に影響す
るために必要な物理的及び化学的パラメータの真の関係
を検知できる。それ故に、生物学的試験が最も正確な滅
菌性試験であることが滅菌の技術で認められている。
の濃度又は放射線線量の相互関係パラメータを含めて、
滅菌を得るのに必要なすべてのパラメータが到達した高
いレベルの信頼性を供する滅菌インジケータが必要とさ
れている。
キシド又はガス状又は液体試剤の何れにせよ、化学的イ
ンジケータの速度に近い速度を有する従来の生物学的イ
ンジケータの信頼性と組合わせた、滅菌サイクルの効能
を測定する方法を供する。本発明は殆どの場合で、8時
間以内で滅菌欠陥を指示できる、滅菌効能を指示する方
法と装置を供する。
酵素が滅菌をモニタするため通常に使用される少なくと
も一つの微生物の生存度と相関する活性を有すること;
そして b) 滅菌サイクルの完了に続いて、この酵素に対して
有効量の基質システムと共に、酵素供源を培養するこ
と、このシステムは残留活性酵素と反応して検出可能な
酵素変性生成物を生ずることができること、 を含む。
て酵素変性生成物の存在を決定する。確立した時間内で
(酵素と基質の素性、各々の濃度、及び培養条件に応じ
て)バツクグラウンド以上の検出可能な酵素変性生成物
の存在が滅菌の失敗を示す。確立した時間内で検出可能
な酵素変性生成物がないことは試験生物に致死的であ
り、それ故に適切である滅菌サイクルを示す。
それ自体滅菌をモニターするため通常に使用される微生
物、例えばBacillus stearothermophilus又はBacillus
subtilisでよい。この微生物を酵素供源として使用する
時には本発明の方法は下記の段階を含む: c) 滅菌サイクルの完了に続いて、培養で、生存の微
生物の成長を促進できる水性栄養培地、及び生存の微生
物の成長を促進するのに適した条件下で、微生物の成長
に対応して検出可能な変化を受けることができる検出体
物質と共に、生きたままである微生物の何れかを培養す
ること。
取滅菌インジケータを供する。この一つの滅菌インジケ
ータは下記のものを含む: a) 液体不透過性及び実質上ガス非吸収性壁を有する
外側容器、この容器は中に少なくとも一つの開口を有
し、ガス透過性、細菌不浸透性装置がこの開口を覆う;
そして b) その活性が滅菌をモニターするために通常に使用
される少なくとも一つの微生物の生存度と相関する、検
出可能量の分離された活性酵素が外側容器内に含まれ
る。
外側容器、この容器は中に少なくとも一つの開口を有
し、ガス透過性、細菌不浸透性装置がこの開口を覆う; b) 検出可能な濃度で活性酵素の供源が外側容器内に
含まれ、この酵素は滅菌をモニターするために通常に使
用される少なくとも一つの微生物の生存度と相関する活
性を有し;そして c) 活性酵素と反応して検出可能な酵素変性生成物を
生ずることができる、有効量の酵素基質システムがまた
外側容器内に含まれる。
以下の発見に基づいている: 1) その生存度が酵素の活性と相関する試験微生物を
殺すのに限界近くに十分である滅菌サイクルに続いて若
干の酵素が活性のままであり;そして 2) 限界近くの滅菌サイクルに続いたこの酵素活性が
比較的短時間内に、例えば一般に約8時間内に酵素に対
する基質システムを検出可能な濃度の生成物に変換する
のに十分であること。
れる場合には、非常に少数の試験微生物がこの限界近く
の滅菌サイクルに生存する。しかしながら、滅菌欠陥を
示すには不活性化微生物と関連して十分な酵素活性があ
る。
ーフとして作用し、その理由は本発明の酵素が試験微生
物より滅菌条件に対してより耐性であるからである。完
全さが少く劣る滅菌サイクルでは検出可能な酵素変性生
成物の存在、従つて酵素活性の存在を使用して試験微生
物が少なくとも24時間の間同一の滅菌条件を受けかつ栄
養培地で培養されるならば試験微生物の生き残り又は生
存度を予想できる。
含む、その活性が滅菌効率をモニターするために通常に
使用される少なくとも一つの微生物(以下“試験微生
物”と称す)の生存度と相関する酵素である。“相関す
る”とはバツクグラウンド以上に、酵素活性を使用して
試験微生物の未来の成長を予想できることを意味する。
この酵素は試験微生物に亜致死的である滅菌サイクルに
続いて、24時間以内で、そして好適具体例では8時間以
内で酵素のための基質システムと反応するのに十分に活
性のままであり、しかも試験微生物に致死的である滅菌
サイクルに続いて不活性化され又は活性においてかなり
減少されるものでなければならない。
な必要特性を有する酵素を認定する際に有用であること
が判つた。約6ログ(logs)で1×106試験微生物の集
団を減少するのに丁度十分である滅菌条件を受けた時に
酵素は酵素のための基質システムと反応で測定して“バ
ツクグラウンド”に等しい残留酵素活性を有する:しか
しながら、少なくとも1ログ、しかも6ログ以下で1×
106試験微生物の集団を減ずるだけの滅菌条件を受けた
酵素は酵素基質システムと反応で測定して“バツクグラ
ウンド”より大きい酵素活性を有する。この酵素基質シ
ステムは酵素により作用して検出可能な、例えば蛍光の
又は着色した、酵素変性生成物を生ずる基質又は基質の
混合物である。酵素活性は生じた検出可能な酵素変性生
成物の量により測定される。好ましくは、6ログで試験
微生物の集団を減ずるには不十分な滅菌サイクルに続い
て、酵素基質システムと反応しそして24時間以内、好ま
しくは8時間又はそれ以下、そして最も好ましくは2時
間又はそれ以下以内に検出可能な量の酵素変性生成物を
生ずるのに十分な活性を有するものである。
な滅菌条件後の酵素活性はバツクグラウンドより少なく
とも2%大きく、そして更に好ましくは少なくとも5%
大きく、そして最も好ましくはバツクグラウンドより少
なくとも10%大きい。本発明の目的に対して“バツクグ
ラウンド”として定義される残留酵素活性レベルは酵素
が全部かつ不可逆的に不活性化された後に生成物へ酵素
基質の自然の変換により得られるものより高いと了解さ
れる。
生物からの水解酵素を含む。この酵素は胞子形成微生
物、例えば、微生物のCandida,Bacillus及びClostridiu
m種から得られる、β−D−グルコシダーゼ、α−D−
グルコシダーゼ、アルカリンホスフアターゼ、酸ホスフ
アターゼ、ブチレートエステラーゼ、カプリレートエス
テラーゼリパーゼ、ミリステートリパーゼ、ロイシンア
ミノペプチダーゼ、バリンアミノペプチダーゼ、キモト
リプシン、ホスフオヒドロラーゼ、α−D−ガラクトシ
ダーゼ、β−D−ガラクトシダーゼ、α−L−アラビノ
フラノシダーゼ、N−アセチル−β−グルコサミニダー
ゼ、β−D−セロビノシダーゼ、アラニンアミノペプチ
ダーゼ、プロリンアミノペプチダーゼ、チロシンアミノ
ペプチダーゼ、フエニルアラニンアミノペプチダーゼ、
β−D−グルクロニダーゼ、及び脂肪酸エステラーゼを
含む。
はα−D−グルコシダーゼ、β−D−グルコシダーゼ、
アルカリンホスフアターゼ、酸ホスフアターゼ、ブチレ
ートエステラーゼ、カプリレートエステラーゼリパー
ゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、キモトリプシン、ホ
スフオフイドロラーゼ、α−D−ガラクトシダーゼ、β
−D−ガラクトシダーゼ、アラニンアミノペプチダー
ゼ、チロシンアミノペプチダーゼ、及びフエニルアラニ
ンアミノペプチダーゼ及び脂肪酸エステラーゼを含む。
Bacillus subtilisからの特に有用な酵素はα−L−ア
ラビノフラノシダーゼ、β−D−グルコシダーゼ、N−
アセチル−β−グルコサミニダーゼ、β−D−セロビオ
シダーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、プロリンアミ
ノペプチダーゼ、チロシンアミノペプチダーゼ、ロイシ
ンアミノペプチダーゼ及びフエニルアラニンアミノペプ
チダーゼを含む。
びα−L−アラビノフラノシダーゼがエチレンオキシド
滅菌のモニタリングに特に有用である。Bacillus stear
othermophilusからのα−D−グルコシダーゼは蒸気滅
菌条件をモニターするために特に有用である。
した酵素; 2) 酵素が固有であり又は遺伝工学により加えられる
微生物;又は 3) 酵素が微生物に配合され又は結合されるように胞
子形成又は成長の間に酵素を加えた微生物、例えば胞子
形成の間に胞子に酵素を加え、これが胞子内に結合され
るようになる。本発明の実施に有用な酵素の供源として
使用できる好適な微生物は胞子又は植物状態の何れかの
細菌又はカビ類である。酵素の特に好適な供源は微生物
のBacillus,Clostridium,Neurospora,及びCandida種を
含む。
本発明の方法は生きたままである微生物の何れかを培養
すること、続いて水性栄養培地で滅菌サイクルを完了す
ることの工程を含む。この工程を含むことは従来の技術
により滅菌条件がインジケータ中の微生物中のすべてを
殺すのに十分であつたかどうかを確認してこの滅菌条件
が滅菌器中のすべての物品を滅菌するのに十分であるこ
とを示す。微生物の成長が酵素試験の結果を確認するた
め従来の方法で使用される場合には、この微生物は滅菌
条件をモニターするために通常に使用されるものでなけ
ればならない。これらの従来使用される微生物は一般に
天然の汚染で出合う大抵の有機体より使用される滅菌法
に対して何倍もより耐性である。細菌胞止は微生物ライ
フの最も耐性な形として認識される。これは装置、化学
品及び方法の滅菌効能を測定するためのすべての試験で
選択される生活形である。Bacillus及びClostridiaから
の胞子が飽和蒸気、熱気、γ線及びエチレンオキシドを
利用する滅菌法をモニターするために最も普通に使用さ
れる。
好適な微生物はBacillus stearothermophilus及びBacil
lus subtilisを含む。Bacillus stearothermophilusが
蒸気滅菌条件下の滅菌をモニターするために特に有用で
ある。酵素α−D−グルコシダーゼはBacillus stearot
hermophilus,例えばAmerican Type Culture Collectio
n,Rockville,Marylandから“ATCC8005"及び“ATCC7953"
として市販されるものの胞子に認められる。Bacillus s
ubtilisはガス及び乾燥滅菌の条件をモニターするため
に特に有用である。酵素β−D−グルコシダーゼはB.su
btilis(例えば、American Type Culture Collectionか
ら“ATCC9372"と市販される)に見出された。
供源として使用される微生物が天然の汚染物より滅菌状
態に対してより耐性でない場合には、滅菌条件をモニタ
ーするために通常に使用される別の微生物が酵素供源と
共に滅菌サイクルに置かれる。再び、この場合には、本
発明の方法は水性栄養培地と共に滅菌サイクル後に残つ
て生きている微生物を培養して滅菌効能を確認する工程
を含む。
記載したが、本発明は同様に複数の酵素及び/又は微生
物種の使用を言及すると了解されるべきである。例え
ば、単一滅菌インジケータは3種の分離した酵素(これ
は3種の微生物から誘導できる)を含有でき、一つの酵
素は熱に耐性であり、第2はガス状滅菌媒体に耐性であ
り、第3は放射線、例えば、γ線及びβ線に耐性であ
る。同様に、単一滅菌インジケータは3種の微生物を含
有でき、一つの種は熱に耐性であり、第2の種はガス状
滅菌媒体に耐性であり、そして第3の種は放射線に耐性
である。
より作用されそして酵素変性生成物に変換される、物質
又は物質の混合物と定義される。一般に、酵素変性生成
物は発光性、蛍光性、着色性、又は放射性の物質であ
る。しかしながら、この酵素基質システムは酵素と反応
した時に、付加的化合物又は組成物と反応して発光性、
蛍光性、着色性、又は放射性物質を生ずる化合物からな
る。好ましくは、基質システムが滅菌中インジケータ装
置に含まれるべき場合には、この基質は滅菌又は培養の
間自然に破壊し又は検出可能な生成物に変換してはなら
ない。例えば、蒸気及び乾熱滅菌をモニターするため使
用する装置では、この基質は約20から180℃の間の温度
で安定でなければならない。好ましくはまた、酵素基質
システムが従来の成長培地に含まれるべき場合には、成
長培地中で安定でなければならず、例えば成長培地中で
自己蛍光を発してはならない。
程で使用されている、種々の起源の酵素の検出のための
多数の蛍光発生及び呈色性基質を含む(M.Roth,Methods
of Biochemical Analysis,第17巻、D.Block編、Inters
cience Publishers,ニユーヨーク、1969年、第189頁;S.
Udenfriend,Fluorescence Assay in Biology and Medic
ine,Academic Press,ニユーヨーク、1962年、第312頁;
及びD.J.R.Lawrence,“Fluorescence Techniques for t
he Enzymologist"Methods in Enzymology.第4巻、S.P.
Colowick及びN.O.Kaplan、編、Academic Press.ニユー
ヨーク、1957年、第174頁、ここで参照として挿入す
る)。特定の酵素の検出に対して記載される二つの基本
型式の酵素基質システムがある。第一型式の基質システ
ムは蛍光発生又は呈色性の何れかで、ABのような化学式
が与えられる。酵素により作用される時には、A+Bに
分解する。例えば、Bは蛍光性又は呈色性である。この
種の蛍光発生基質の特定例は4−メチルウムベリフエリ
ルホスフエートである。酵素ホスフエートの存在で、基
質は4−メチルウムベリフエロン及びホスフエートに分
解する。この種の他の蛍光発生基質は4−メチルウムベ
リフエリル、7−アミノ−4−メチルクマリン、インド
キシル及びフルオレシンの誘導体を含み、下記に列挙す
る。この種の呈色性基質の例は5−ブロモ−4−クロロ
−3−インドリルホスフエートである。ホスフエートの
存在で、基質はインジゴブルー及びホスフエートに分解
する。この種の他の呈色性基質は下記に列挙する、5−
ブロモ−4−クロロ−3−インドリル、ニトロフエノー
ル及びフエノールフタレインの誘導体を含む。
ステムは化学式CDで与えられ、これは例えば特定の酵素
によりC+Dへ変換できる。しかしながら、C又はDは
何れも蛍光性又は呈色性ではないが、Dは更に化合物Z
と反応して蛍光性又は呈色性化合物を生ずることがで
き、かくして酵素活性を示す。この種の特定の蛍光発生
例はアミノ酸リシンである。酵素リシンデカルボキシラ
ーゼの存在では、リシンはCO2の分子を失う。次にリシ
ンの残りの部分はカダベリンと称され、これは強塩基性
である。4−メチルウムベリフエロンのような塩基性イ
ンジケータが配合されそして強塩基の存在で蛍光を発
す。この種の呈色性基質は2−ナフチルホスフエートで
ある。放出されたβ−ナフトールはSigma Chemicalから
の“Fast Blue BB Salt"として市販の、1−ジアゾ−4
−ベンゾイルアミノ−2,5−ジエトキシベンゼンを含有
する呈色性試薬と反応して紫色を生ずる。この種々の他
の例を下記のナフチル誘導体の下に列挙する。
中の特定の酵素の存在を測定することが可能であること
が容易に認められる。
で変性されてかなり変性された又は蛍光を増加させた誘
導体フルオロフオールを生ずることができる化合物とし
てここで定義される蛍光発生体である。
性(即ち、対応する酵素変性生成物より、例えば色彩又
は強度の何れかにより、明確に異なる方法で蛍光性)の
何れかでありそして蛍光計測機器の使用者に周知の方式
で、励起と検出の適当な波長を使用して存在する他の蛍
光から酵素変性により生じた蛍光信号を分離する。
に使用される種々の起源の酵素のための多数の蛍光発生
基質を含む。これらの中には種々の蛍光発生4−メチル
ウムベリフエリル誘導体(4−メチルウムベリフエロン
へ加水分解できる);4−アミド−4−メチル−クマリン
の誘導体、例えば、ドイツ国特許第1,547,747号及びヨ
ーロツパ特許第0,000,063(味の素)、両特許はここで
参照として挿入;ジアセチルフルオレスセイン誘導体;
及びフルオレスカミンがある。
のを含む: 4−メチルウムベリフエリル−2−アセトアミド−4;6
−O−ベンジリデン−2−デオキシ−β−D−グルコピ
ラノシド; 4−メチルウムベリフエリルアセテート; 4−メチルウムベリフエリル−N−アセチル−β−D−
ガラクトサミニド; 4−メチルウムベリフエリル−N−アセチル−α−D−
グルコサミニド; 4−メチルウムベリフエリル−N−アセチル−β−D−
グルコサミニド; 2′−(4−メチルウムベリフエリル)−α−D−N−
アセチルノイラミニツリ酸; 4−メチルウムベリフエニルα−L−アラビノフラノシ
ド; 4−メチルウムベリフエリルα−L−アラビノシド;4−
メチルウムベリフエリルブチレート;4−メチルウムベリ
フエリルβ−D−セロビノシド;メチルウムベリフエリ
ルβ−D−N,N′−ジアセチルキトビオシド;4−メチル
ウムベリフエリルエライデート;4−メチルウムベリフエ
リルβ−D−フコシド;4−メチルウムベリフエリルα−
L−フコシド;4−メチルウムベリフエリルβ−L−フコ
シド;4−メチルウムベリフエリルα−D−ガラクトシ
ド;4−メチルウムベリフエリルβ−D−ガラクトシド;4
−メチルウムベリフエリルα−D−グルコシド;4−メチ
ルウムベリフエリルβ−D−グルコシド;4−メチルウム
ベリフエリルβ−D−グルクロニド;4−メチルウムベリ
フエリルp−グアニジノベンゾエート;4−メチルウムベ
リフエリルヘプタノエート;4−メチルウムベリフエニル
α−D−マンノピラノシド;4−メチルウムベリフエリル
β−D−マンノピラノシド;4−メチルウムベリフエリル
オレエート;4−メチルウムベリフエリルパルミテート;4
−メチルウムベリフエリルホスフエート;4−メチルウム
ベリフエリルプロピオネート;4−メチルウムベリフエリ
ルステアレート;4−メチルウムベリフエリルサルフエー
ト;4−メチルウムベリフエリルβ−D−N,N′,N″−ト
リアセチルキトトリオーゼ;4′−メチルウムベリフエリ
ル2,3,5−トリ−o−ベンゾイル−α−L−アラビノフ
ラノシド;4−メチルウムベリフエリル−p−トリメチル
アンモニウムシンナメートクロリド;及び4−メチルウ
ムベリフエリルβ−D−キシロシド。
のものを含む: L−アラニン−7−アミド−4−メチルクマリン;L−プ
ロリン−7−アミド−4−メチルクマリン;L−チロシン
−7−アミド−4−メチルクマリン;L−ロイシン−7−
アミド−4−メチルクマリン;L−フエニルアラニン−7
−アミド−4−メチルクマリン;及び7−グルタリル−
フエニルアラニン−7−アミド−4−メチルクマリン。
導体は下記のものを含む: N−t−BOC−Ile−Glu−Gly−Arg 7−アミド−4−メ
チルクマリン;N−t−BOC−Leu−Ser−Thr−Arg 7−ア
ミド−4−メチルクマリン;N−CBZ−Phe−Arg 7−アミ
ド−4−メチルクマリン;Pro−Phe−Arg 7−アミド−4
−メチルクマリン;N−t−BOC−Val−Pro−Arg 7−アミ
ド−4−メチルクマリン;及びN−グルタニル−Gly−A
rg 7−アミド−4−メチルクマリン。
スセインジアセテート、フルオロセインジ−(β−D−
ガラクトピラノシド)、及びフルオロスセインジラウレ
ートを含む。
stearothermophilusからのα−D−グルコシターゼ、
キモトリプシン、又は脂肪酸エステラーゼである場合に
は、蛍光発生酵素基質は最も好ましくは各々4−メチル
ウムベリフエリル−α−D−グルコシド、7−グルタリ
ルフニエルアラニン−7−アミド−4−メチルクマリン
又は4−メチルウムベリフエリルヘプタノエートであ
る。その活性が検出される酵素が、例えば、Bacillus s
ubtilisから誘導されるα−L−アラビノフライシダー
ゼである場合には、最も好適な酵素基質は4−メチルウ
ムベリフエリル−α−L−アラビノフラノシドである。
その活性が検出されるべき酵素が、例えば、Bacillus s
ubtilisから誘導された、β−D−グルコシダーゼであ
る場合には、最も好適な蛍光発生酵素基質は4−メチル
ウムベリフエリル−β−D−グルコシドである。
ように酵素で変性できる呈色性化合物、又は他の化合物
と反応して発色団が異なる又はより強い色彩を有する誘
導体発色団を生ずる生成物である。この呈色性化合物は
それ自体着色されず又は対応する酵素変性生成物より、
例えば色彩又は強度で、明らかに異なつて着色されると
了解される。比色計機器の使用者に周知の方法で、励起
と検出の適当な波長を使用して存在する他の色彩から酵
素変性により生じた着色信号を分離する。
有用な呈色性物質の中には5−ブロモ−4−クロロ−3
−インドリル誘導体;ニトロフエニル誘導体;インドキ
シル誘導体;及びフエノールフタレイン誘導体がある。
体は5−ブロモ−6−クロロ−3−インドリルアセテー
ト、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルアセテー
ト、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドキシル−β−
D−ガラクトピラシノド、5−ブロモ−4−クロロ−3
−インドリル−1,3−ジアセテート、5−ブロモ−4−
クロロ−3−インドリル−β−D−フコピラノシド、5
−ブロモ−5−クロロ−3−インドリル−β−D−グル
コピラノシド、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリ
ル−β−D−グルクロン酸、5−ブロモ−4−クロロ−
3−インドリルホスフエート、及び5−ブロモ−4−ク
ロロ−3−インドリルサルフエートを含む。
及びo−ニトロフエノール誘導体を含む。特に有用なp
−ニトロフエノールはジエチル−p−ニトロフエニルホ
スフエート;ジ−p−ニトロフエニルホスフエート;p−
ニトロフエニル−2−アセトアミド−2−デオキシ−3
−O−β−ガラクトピラノシル−β−グルコピラノシ
ド;p−ニトロフエニル−2−アセトアミド−2−デオキ
シ−β−グルコピラノシド;p−ニトロフエニルアセテー
ト;p−ニトロフエニル−N−アセチル−β−D−グルコ
サミニド;p−ニトロフエニル−β−D−N,N′−ジアセ
チルキトビオシド;p−ニトロフエニル−α−グルコピラ
ノシド;p−ニトロフエニル−α−マルトシド;p−ニトロ
フエニル−β−マルトシド;p−ニトロフエニル−α−マ
ンノピラノシド;p−ニトロフエニル−β−アンノピラノ
シド;p−ニトロフエニルミリステート;p−ニトロフエニ
ルパルミテート;p−ニトロフエニルホスフエート;ビス
(p−ニトロフエニル)ホスフエート;トリス(p−ニ
トロフエニル)ホスフエート;p−ニトロフエニル−β−
グルコピラノシド;p−ニトロフエニル−β−グルクロニ
ド;α−p−ニトロフエニルグリセリン;p−ニトロフエ
ニル−α−ラムノピラノシド;p−ニトロフエニルステア
レート;p−ニトロフエニルサルフエート;p−ニトロフエ
ニル−2,3,4,6−テトラ−O−アセチル−β−グルコサ
ミニド;p−ニトロフエニルチミジンモノホスフエート;p
−ニトロフエニル−2,3,4−トリ−O−アセチル−β−
グルクロン酸メチルエステル;及びp−ニトロフエニル
バレレートを含む。
ルアセテート、o−ニトロフエニル−β−グルコシド及
びo−ニトロフエニル−β−D−グルコピラノシドを含
む。他の特に有用なニトロフエニル誘導体はニトロフエ
ニル−β−フコピラノシド;ニトロフエニル−α−ガラ
クトピラノシド;ニトロフエニル−β−ガラクトピラノ
シド;ニトロフエニルブチレート;ニトロフエニルカプ
レート;ニトロフエニルカプロエート;ニトロフエニル
カプリレート;ニトロフエニルラウレート;及びニトロ
フエニルプロピオネートを含む。
ト;インドキシルβ−D−グルコシド;3−インドキシル
サルフエート;3−インドキシルホスフエートを含む。
レインジブチレート;フエノールフタレインジホスフエ
ート;フエノールフタレインジサルフエート;フエノー
ルフタレイングルクロン酸;フエノールフタレインモノ
−β−グルコシドウロン酸;フエノールフタレインモノ
−β−グルクロン酸;及びフエノールフタレインモノ−
ホスフエートを含む。
して発色団を生ずる。
−ジアゾ−4−ベンゾイルアミノ−2,5−ジエトキシベ
ンゼン(Sigma Chemicalから“Fast Blue BB Saltとし
て市販)、1−ジアゾ−4−ベンゾイルアミノ−2,5−
ジエトキシベンゼン、p−ジアゾ−2,5−ジエトキシ−
N−ベンゾイアラニン、4−クロロ−2−メチルベンゼ
ンジアゾニウムクロリド、及びo−アミノアゾトルエン
ジアゾニウム塩と反応して発色団を生ずる場合には1−
ナフチル、2−ナフチル及びナフチル−AS−BI誘導体を
含有する別の酵素基質が有用に使用される。
アセチル−β−D−グルコサミニドを含む。
フエート;2−ナフチル−ブチレート;2−ナフチル−カプ
リレート;2−ナフチル−ミリステート;L−ロイシル−2
−ナフチルアミド;L−バリル−2−ナフチルアミド;L−
シスチル−2−ナフチルアミド;N−ベンゾイル−DL−ア
ルギニン−2−ナフチルアミド;N−グルタリル−フエニ
ルアラニン2−ナフチル−アミン;2−ナフチル−ホスフ
エート;6−Br−2−ナフチル−α−D−ガラクトピラノ
シド;2−ナフチル−βD−ガラクト−ピラノシド;2−ナ
フチル−2−D−グルコピラノシド;6−ブロモ−2−ナ
フトール−β−D−グルコピラノシド;6−ブロモ−2−
ナフチル−2−D−マンノピラノシド;及び2−ナフチ
ル−α−L−フコピラノシドを含む。
BI−ホスフエート;及びナフチル−AS−BI−β−D−グ
ルクロニドを含む。
stearothermophilusからのα−D−グルコシダーゼで
ある場合には、呈色性酵素基質は最も好ましくはp−ニ
トロフエニル−α−グルコピラノシドである。その活性
が検出されるべき酵素が、例えばBacillus subtilisか
ら誘導されるα−L−アラビノフラノシダーゼである場
合には、最も好適な呈色性酵素基質はp−ニトロフエニ
ル−α−L−アラビノフラノシドである。その活性が検
出されるべき酵素が、例えば、Bacillus subtilisから
誘導されるβ−D−グルコシダーゼである場合には、最
も好適な呈色性酵素基質はp−ニトロフエニル−β−D
−グルコピラノシドである。
るべき酵素、及び螢光、色彩等により検出できる生成物
を生ずるように酵素と反応する酵素に関して操作者が熟
知していることが必須である(M.Roth,Methods of Bioc
hemical Analy Sis,第7巻、D.Glock編、Interscience
publishers,ニユーヨーク、N.Y.1969を見よ。ここで参
照として挿入する)。使用される適当な酵素基質はその
活性が検討中の酵素の素性によつて異なる。下記のもの
は多数の好適な螢光発生及び呈色性酵素基質及び基質と
反応してかなり変性した又は増大した螢光又は色彩を有
する生成物を生ずる酵素のリストである。
る。この緩衝溶液のイオン条件は酵素と酵素基質が影響
されないものであるべきである。好ましくは、等張緩衝
液、例えば、ホスフエート緩衝塩溶液、トリス(ヒドロ
キシメチル)アミノメタン−HCL溶液、又はアセテート
緩衝液が選択される。これらの好適な等張緩衝液は殆ど
の螢光発生及び呈色性酵素基質と相和性である。緩衝液
を選択する際に他に考慮することは酵素活性に対する影
響である。例えば、ホスフエート緩衝塩はアルカリホス
フエートの強い競争的阻害剤である、高濃度の無機ホス
フエートを含有する。この酵素に対して、それ故に、ト
リス−HCl緩衝液が勧められる。
と酵素の素性、可視又は器具の何れかにより検出される
べく生じなければならない酵素−生成物の量、活性酵素
が反応混合物に存在するかどうかを測定するために気分
よく待たれる時間の量に応じて異なる。好ましくは、酵
素基質の量は少なくとも1×10-8モルの酵素変性生成物
が生ずるように、滅菌後に約8時間以内に存在する残り
の活性酵素と反応するのに十分である。酵素基質が4−
メチルウムベリフエリル誘導体である場合には、緩衝水
溶液中のその濃度は好ましくは約1×10-5から1×10-3
モルの間であることが判明した。
基性螢光発生基質の自己螢光を阻止するために、約5.0
から9.5、好ましくは約7.5のpHに調節される。
にその活性が検出されるべき酵素供源と共に培養され
る。
との仮定で、検出可能量の酵素変性生成物を放出するの
に十分な条件下で培養を続ける。一般に、公知の方法に
より検出可能である生成物の量は少なくとも1×10-8モ
ルである。好ましくは、培養条件は少なくとも1×10-8
モルの酵素変性組成物、更に好ましくは約1×10-6から
1×10-5モルの酵素変性生成物を生ずるのに十分であ
る。検出可能量の酵素変性生成物を生ずるのに必要な培
養時間と温度は酵素と基質の素性、及び反応混合物に存
在する各々の濃度に応じて異なる。一般に、必要な培養
時間は約1分から12時間であり、そして約20から70℃で
ある。好ましくは、Bacillus subtilis又はBacillus st
earothermophilusが酵素の供源である場合には、必要な
培養時間は各々約10分から3時間であり、そして必要な
培養温度は約30から40℃、そして約52から65℃である。
ために一般に適用できる方法は比色、電圧測定、質量測
定、熱量測定、伝導度測定、及び電流測定の技術を含
む。本発明の目的に対して、検出可能な酵素変性生成物
を測定する螢光測定法及び分光測定法が適している。例
えば、特定の酵素基質は酵素と相互作用でウムベリフエ
ロンを生ずる4−メチルウムベリフエリル誘導体を含
み、これは螢光測定でモニターされ、又は基質は酵素と
相互作用で着色した生成物を生ずるニトロフエノールを
含み、これは比色法でモニタされる。
これを使用して微生物の生存を許す条件、かくして滅菌
効能を予言できる。使用した酵素測定試験は一般に比較
的短い時間、例えば、約10分から約3時間まで、通常に
は約30から約90分の培養のみを必要として、例えば、分
光測光による検出のために十分な酵素変性生成物を供す
る。
な滅菌インジケータは液体不透過性及び実質上ガス非吸
収性の壁を有する容器内に活性酵素の供源を含む。この
容器は少なくとも一つの開口を有して滅菌媒体が酵素と
接触することを許しそしてガス透過性、細菌不浸透性装
置が開口を覆う。任意に、このインジケータは容器内に
下記のものを含む: 1)酵素の供源として、又は酵素の供源に加えての何れ
かで、滅菌効能をモニタするために通常に使用される微
生物; 2)単一で又は滅菌耐性微生物と組合わせて、活性酵素
の供源で被覆されるキヤリア; 3)活性酵素のための基質及び酵素とその基質のための
水性反応媒体;及び 4)滅菌耐性微生物が使用される場合には、栄養成長培
地及び成長インジケータ。
又はそれと共に含まれる場合には、米国特許第3,346,46
4号;第3,585,112号;第3,846,242号;第4,291,122号;
第4,461,837号;第4,416,984号;第4,596,773号;第3,4
40,144号;第4,528,268号;第2,854,384号;第3,239,42
9号;第3,752,743号;第4,304,869号;第4,579,823号;
及び第4,580,682号に記載されるものに類似の滅菌イン
ジケータに有用に使用できる。
下記の装置の多くの変型が可能であり、それにもかかわ
らず、これらは本発明の範囲内に入る。
吸収性及び液体不透過性壁12と開放端部14を有する、円
筒状管10の形で外側容器を有する好適滅菌インジケータ
を示す。管10を酵素キヤリア16、例えば、予め決めた量
の活性分離酵素及び/又は予め決めた数の生存の微生物
を保持する濾紙のストリツプを含む。管10はまた通常に
密封され、圧力開放できる内側容器18、例えば、緩衝水
溶液中に溶解され又は懸濁された好適な酵素基質を含有
しそして任意に水性栄養成長培地を含む、壊れ易いガラ
スアンプルを含む。好ましくは、この酵素基質は約20か
ら180℃の温度で安定でありそして活性酵素と反応して
発光性、螢光性、着色性又は放射性物質を生ずることが
できる。水性栄養培地は培養で生存の微生物と接触する
時にその成長を促進できる。内側容器18は好ましくは外
側容器10内にぴたつたりと保持され、このため外側容器
の容積のごく僅かが非占有のままである。ガラスアンプ
ル18は 紙キヤリア16により管10の壁12から分離され
る。管10の開放端部14にはシートのようなガス透過性、
細菌不浸透性閉鎖部材22が設けられる。このシート22は
例えば、熱又は接着剤シーリングにより、又は閉鎖装置
26、例えば、中を通した孔28を有するキヤツプ(第1図
に外して示す)によつて管の開放端部14にシールでき
る。ガス状滅菌剤で滅菌の間に、ガス状滅菌剤はシート
22を透過していて外側容器の内部を通過して酵素キヤリ
ア16と接触する。
14の中に活性酵素キヤリア16と壊れ易いガラスアンプル
18を続いて挿入するそして開放端部14の上にシート22を
置き、管10と密に接触してシートの22の上にキヤツプ26
を配置することによつてシート22で管の開放端部を密封
することにより容易に組立てられる。
料から作られる。通常の蒸気滅菌器は一般に121−135℃
のオーダーの温度に達する。更に、容器10の壁は気体及
び液体に実質上不透過性でなければならない。生存の微
生物又は活性分離酵素で覆われ、そしてそこで残留活性
酵素が圧力開放できる内側容器18中に含まれる酵素基質
と反応するキヤリア16を含有する外側容器は好ましくは
半透明であり(“透明”を含む)、このため螢光と色彩
の変化はインジケータ装置を分解することなく可視的に
観察される。また、好ましくは、外側容器10は十分に変
形可能であり、このため外部圧力を使用して外側容器10
を変形する時の圧力開放できる内側容器18が破壊され
る。ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、
ポリメチルペンテン及び種々のポリエステルを含む適当
な材料を射出成形し又は押出すことにより容器10を製造
できる。これらの材料は蒸気又は乾熱滅菌サイクルに対
して十分に耐熱性、ガス状滅菌培地に非吸収性、液体不
透過性、半透明性又は透明性そして変形可能である。
造できる。容器10の場合のように、好適な材料はポリカ
ーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリメチル
ペンテン及び種々のポリエステルを含み、ポリプロピレ
ンが好適である。
通常には適当なキヤリア16上に保持される。しかしなが
ら、この酵素及び/又は微生物は外側容器10の内壁又は
内側容器18の外壁により保持されることが意図される。
しかしながら、好ましくは、分離酵素及び/又は微生物
は同一の又は別の酵素キヤリアに保持される。この酵素
キヤリアは好ましくは水吸収性、例えば、濾紙でありそ
して微生物成長又は酵素活性を阻害すべきではない。シ
ート状材料、例えば、布、不織ポリプロピレン、レーヨ
ン又はナイロン、そして微孔性重合体材料が特に好適で
ある。しかしながら、金属ホイル物質、例えば、アルミ
ニウム又はステンレス鋼、並びにガラス(例えば、ガラ
スビーズ又はガラス繊維)、磁器、又はプラスチツクの
物質を使用できる。更に、プラスチツク又はガラス裏張
りストリツプに固着された紙のような材料の組合わせか
らこの酵素キヤリアを製造できる。
量の活性酵素を含有することが望ましい。これはタンパ
ク質精製の一般的方法、例えば、ここで参照として挿入
する、Colowick,S及びKaplan,N.O.(編),Methods in
Enzymology,Academic Press,ニユーヨーク、第I−VII
巻、(1957−1964)に記載されるように、塩分別、クロ
マトグラフイー及び電気泳動を使用して分離酵素で容易
に行なわれる。好ましくは分離酵素の初期濃度は約1×
10-10から5×10-2単位の間、更に好ましくは約1×10
-8から5×10-3単位の酵素、そして最も好ましくは約1
×10-7から1×10-3単位の間である。微生物を使用する
場合には、同様に予め決めた大体の数の微生物を使用す
ることが望ましい。これは公知の容量胞子濃度を有する
胞子懸濁液を調製すること、小さい、予め決めた容量の
懸濁液を用いてキヤリア16(例えば、濾紙)を湿らすこ
と、そしてキヤリアを乾燥することによつて細菌又はカ
ビ類の胞子により行なわれる。この方法はキヤリア上に
含まれる胞子の大体の数を容易に計算することができ
る。勿論、他の方法も使用できる。微生物を酵素の供源
として使用する場合には、使用される微生物集団はこの
微生物中の酵素の活性に応じて異なる。この酵素は培養
条件及び微生物の系統選択によつて異なるが、微生物集
団が調節することによつて制御できる。この微生物がBa
cillus stearothemophilus又はBacillus subtilisであ
る場合には、十分な酵素を生ずるのに必要な微生物の数
は約1×108から1×102の微生物により供される。酵素
の供源がB.stearothermophilusである場合には、約1×
103から1×107微生物が好適であり、B.sublilisの場合
は1×106から1×108である。
菌条件がインジケータ中のすべての微生物を殺すのに十
分であつたかどうかを確認するために、検出可能な酵素
変性生成物を生ずるのに必要な時間の後に装置の培養を
続けることができ、滅菌条件が滅菌器中のすべての物品
を滅菌するのに十分であつたことを示す。微生物の成長
が酵素試験の結果を確認するため従来の方式で使用され
る場合には、この微生物は滅菌条件をモニタするために
通常に使用されるものでなければならない。これらの通
常に使用される微生物は天然の汚染で見られる大抵の有
機体より一般に数倍滅菌工程に対して耐性である。好適
な微生物はBacillus stearothermophilus及びBacillus
subtilisを含む。
として使用される微生物が天然の汚染体より滅菌条件に
より耐性でない場合には、滅菌条件をモニターするため
に通常に使用される別の微生物を容器10内に含有でき
る。この装置では、分離酵素又は有用な酵素が得られる
微生物を使用して培養後一般に約10分から3時間以内に
酵素活性の読示が得られ、そして通常に使用される微生
物を少なくとも約24時間栄養培地中で更に培養して酵素
活性結果を確認する。
側容器18に含まれる。しかしながら、乾燥形の酵素基質
は酵素キヤリア16と共に外側容器10内に含まれよう。実
際に、活性酵素とその基質は同じキヤリア16中に乾燥形
で存在できよう。この構造では、内側容器18は好ましく
は活性酵素とその基質が反応するのに必要な水性反応培
地を保有する。
る微生物が装置中に含まれ(活性酵素の供源として、又
は活性酵素の供源の外に)そして従来の方法により微生
物生存の確認が望まれる時には、内側容器18は酵素基質
の水溶液及び栄養成長培地を含む。好ましくは、この栄
養成長培地は大抵の螢光発生及び呈色性酵素基質と相和
性でありそして酵素に対して競争的阻害剤ではない。本
発明に有用に使用される型式の栄養培地は当業者に周知
である。好適な栄養培地の例は大豆−カゼイン温浸ブロ
ス、流体チオグリコラート及びデキストローストリプト
ン(Difco Laboratories,Inc)の水溶液である。グルコ
ースなしで、変性したトリプシン処理大豆ブロスベース
が特に適している。汚染を避けるために、この水性栄養
培地は通常には内側容器中に配置された後に滅菌され
る。生存微生物の存在で色彩を変化す通常に公知の微生
物成長インジケータは好ましくは容器の少なくとも一つ
に存在する。この成長インジケータ物質は好ましくは水
性栄養培地に溶解性であり、そしてそれに色彩を付与し
(微生物の成長で)、このため色彩の変化を外側容器の
半透明壁を通して容易に観察できる。更に、好ましくは
成長インジケータ物質が酵素変性生成物の色彩又は発光
を阻害しないようにこの物質を選択する。本発明に使用
できる成長インジケータ物質は当業者に周知でありそし
てpH増感性染料インジケータ(例えば、ブロムチモール
ブルー、ブロムクレゾール紫、フエノールレツド等)、
酸化還元染料インジケータ(例えば、メチレンブルー
等)を含む。この物質は通常には微生物成長の現象、例
えばpH、酸化還元電位等における変化に応じて色彩で変
化する。
を含む内側容器18は気体と液体に不透過性である材料か
ら作られそしてそこに圧力の適用で開放して(即ち、
“圧力開放できる”)酵素基質及び/又は栄養培地が外
側容器に入ること許すことができる。この内側容器は好
ましくは壊れ易い材料、例えば、ガラスのものであり、
そして前記のように、好ましくは外側容器と接触関係で
外側容器内にきつちりと保持され、外側容器が変形され
る時に内側容器の破壊又は破砕を許す。別の具体例で
は、内側容器をプラグで密封でき、このプラグを圧力の
適用で追い出すと内側容器の内容物を放出する。なお別
の具体例では、米国特許第4,304,869号に示されるよう
に、閉鎖装置がアンプル破砕装置を内包し、そこではこ
の閉鎖装置はその底部からのタブを有し、これは閉鎖装
置の沈下でアンプルを破砕するのに役立つ。同様に本発
明の装置は外側容器10の底部に配置されたアンプル破砕
ピンを有するシステムに使用できる。
開口を有して滅菌剤(例えば、蒸気、エチレンオキシ
ド)が滅菌中活性酵素の供源と接触することを許す。こ
の開口は通常にはガス透過性、細菌不浸透性装置で閉鎖
され又は栓をされる。好適な装置は繊維材料、例えば
綿、ガラスウーム、布;ポリプロピレン、レーヨン、ポ
リプロピレン/レーヨン、ナイロン、ガラス又は他の繊
維から作つた不織ウエブ、濾紙、微孔性、疎水性及び親
水性フイルム、開放セル化重合体フオーム、及び半透過
性プラスチツクフイルム、例えば米国特許第3,346,644
号に記載されるものから作られる閉鎖部材22を含む。繊
維状及びセル状材料はこの材料が滅菌ガスを容易に透過
するので好適である。好適な閉鎖部材の材料は疎水性材
料、例えば、ナイロンウエブ、微孔性疎水性フイルム又
はガラス繊維不織ウエブを含む。商品名“CelgardRK−4
42 Microporous Film"としてCelanese Separations Pro
ducts,Charlotte,North Carolina,から市販の微孔性疎
水性フイルムが特に適している。実際に、繊維状又はセ
ル状閉鎖部材は細菌及びカビ類に対してフイルターとし
て役立ちそして約0.5ミクロン以上の孔径を有すべきで
はない(例えば、約0.5ミクロンより大きい寸法を有す
る粒子の通過を阻止することができる)。別法として、
この閉鎖装置はここで参照として挿入する米国特許第4,
461,837号及び1988、9.27出願した共通に譲渡された米
国特許出願第249,982号に記載されるように、細菌不浸
透性である曲がりくねつた通路でもよい。
第4図に例示する。この装置は実質上ガス非吸収性かつ
液体不透過性壁42と開放端部44を有する外側容器40を含
む。この外側容器40は圧力開放できる内側容器48を包
み、これは好ましくは水性栄養培地と混合した、好適な
酵素基質の水溶液50を含有する。外側容器40の開放端部
44はガス透過性、細胞不浸透性閉鎖部材52により覆われ
る。ここで、第1図に示した装置との類似性が終わる。
第3及び第4図の装置では、酵素キヤリア46は外側容器
40の底部閉鎖端部に配置され、そして障壁47が酵素キヤ
リア46と圧力開放できる内側容器48の間にプラグのよう
に配置される。障壁47は好ましくは螢光発生酵素基質と
共に使用のため非螢光性である材料、例えば、綿、レー
ヨン、ポリプロピレン、ポリプロピレン/レーヨン混和
物、ナイロン又はガラスのような繊維から作られた不織
ウエブから製造される。最も好適な障壁47は3M,St.Pau
l,MNから市販の“ThinsulateR200−B brand Thermal In
sulation"のようなポリプロピレン不織ウエブから作ら
れる。
めに役立ち、かくしてアンプル48がキヤリア46の上に配
置される場合に冷スポツトを排除する。冷スポツトの存
在は酵素キヤリア上で凝縮が集まることを引起こす。凝
縮物はキヤリア46上に含まれる酵素の活性に影響する。
障壁47は好ましくは疎水性材料から作られ、このため酵
素変性生成物が酵素キヤリアの周りで濃縮しそして障壁
の反対側上にある容器の区域中に急速に拡散しない。イ
ンジケータの低部分に高濃度の酵素変性生成物を保つこ
とは酵素変性生成物が発光性又は着色性の何れにせよ、
キヤリア46が内側容器48の全内容物と反応した場合より
も短時間の培養後に酵素変性生成物が検出されることを
可能にする。一般に、例1に示したように、障壁47を組
込む好適な装置は約10分以内に滅菌効能に関して信頼し
得る情報を供する。この障壁を利用しない類似の装置は
信頼し得る滅菌効能情報を供するのに約2時間要する。
る。この閉鎖装置は底部で開く中空ボデーを有し、閉鎖
装置の内径は外側容器40の外側直径に大体等しく、この
ため閉鎖装置56は外側容器40の閉鎖端部の上に摩擦して
接触される。側壁56内には好ましくは複数の窓58が切ら
れる。インジケータが滅菌されるべき装入物中に置かれ
る時に、外側容器の外部側壁が窓58をブロツクしないよ
うな方式で閉鎖装置56が外側容器中の開口の上に置かれ
る。この位置では、滅菌器中の滅菌剤が窓58を通して流
れることによつて容器40に入る。滅菌サイクルの完了時
に、閉鎖装置を押下げることによつて十分に挿入させて
外側容器の側壁をトツプ57の内部表面と接触させ、これ
によつて窓58をブロツクできる。次に容器40の内部を外
部環境から密封する。
好適具体例を示す。この装置は、第3図及び第4図の装
置のように、ガス非吸収性かつ液体不透過性壁72及び開
放端部74を有する外側容器70;好ましくは栄養成分培地
と混合した、酵素基質の水溶液を含有する外側容器70内
の圧力開放できる内側容器78;及びキヤツプ86により外
側容器の開放端部の上に保持される、ガス透過性、細菌
不浸透性閉鎖部材82を含む。外側容器70内の酵素キヤリ
ア77は例えば、接着剤又は熱シーリングによりウイツク
ストリツプ76に結合される。このウイツクストリツプ76
は任意の水吸収性材料、例えば濾紙、布又はレーヨンか
ら作られる。別に、プラスチツク又はガラス裏張ストリ
ツプに固着させた紙のように材料の組合せでこのウイツ
クストリツプを製造できる。好ましくはポリエチレン塗
被紙からこのウイツクストリツプ76を調製する。好まし
くは、ウイツクストリツプの寸法とウイツクストリツプ
上で酵素キヤリアの配置は内部容器が破壊された時に、
中の液体が外側容器の低部分内でかつ酵素キヤリア77の
下に含まれるようなものである。酵素基質水溶液は酵素
キヤリア77までウイツクストリツプ77で上に進む。酵素
変性生成物は酵素キヤリア上で濃縮しそしてその存在は
キヤリアが内側容器78中に存在する全溶液にさらされた
場合よりも短い時間で検出される。
ータを例えば、蒸気又はエチレンオキシドガスにより滅
菌されるべき多数の物品と共に滅菌室に入れる。このイ
ンジケータが滅菌器中にある時には、窓58が開いて滅菌
剤が入ることができるように閉鎖装置56は開放位置にあ
る。滅菌剤が室に導入される時には、滅菌剤は閉鎖部材
52を透過しそして障壁47を通過して酵素を不活性化しそ
してキヤリア46上に存在する試験微生物を殺す。滅菌サ
イクルの最後に、滅菌剤を濾過させた空気と交換する。
滅菌インジケータを滅菌器から引出し、窓58をブロツク
するように閉鎖装置56を十分に挿入し、そして例えば、
指圧によりガラスアンプル48を破壊して酵素基質の水溶
液と栄養成長培地が酵素キヤリア46と接触することを引
起こす。次にこのインジケータを好適な培養環境に置く
(例えば、インジケータを約10分から2時間約56℃で培
養する)。滅菌剤で不活性化されない酵素はその基質と
反応して、好ましくは着色した又は螢光性の酵素変性生
成物を生ずる。色彩又は螢光における変化の発生は外側
容器40の半透明壁42を通して観察され又は分光測光法で
測定され、そしてこの滅菌サイクルがキヤリア46上のす
べての活性酵素を不活性化しなかつたことを示す。活性
酵素があることは試験微生物の生存及び結果の副生物を
予想しそしてこの滅菌サイクルが多分滅菌器中の物品を
完全に滅菌するのに多分不十分であつたことを示す。色
彩又は螢光における変化がないことはこの滅菌サイクル
がキヤリア46上の酵素のすべてを不活性化するのに十分
であつたこと、そしてそれ故に、滅菌器中の物品を滅菌
するのに十分であつたことを示す。装置を更に培養して
(約24から48時間の間56℃で)、試験微生物生存の先の
予想を成長培地における色彩変化の存在により確認でき
る。
法は本発明で記載した装置の特に設計された螢光計であ
る。螢光計は低レベルの螢光生成物とバツクグラウンド
又は螢光なしの間で可視的に差別しようとする時に生ず
る主観的解釈を排除する。一定の培養時間内に最少量の
螢光生成物を検出するように螢光計を目盛り調整でき
る。
計は内部の酵素キヤリアが365nm波長の紫外線で照射さ
れ、そしてホトダイオードが460nm波長領域で結果の螢
光を検出できるように、インジケータの外側容器を配置
する間、周辺光をブロツクするように設計された室から
なる。この螢光計は少なくとも1.0×10-5M 4−メチルウ
ムベリフエロンを検出するように目盛調整される。
幾つかの方法を使用できる。第一のアプローチでは、1
×10-4M 4−メチルウムベリフエロンにより生じた螢光
に等しい螢光閾値限界を螢光計に確立する。酵素キヤリ
アが例えば、15分間56℃で基質と反応するにまかせれた
後に十分な活性酵素と共に試験試料が閾値限界を越える
ように十分に基質を変換する時に、螢光計は例えば、赤
色光を照射することにより陽性試料を示す。例えば、15
分の培養後に、酵素とその基質の反応により生じた螢光
生成物が閾値限界を越えない場合には、螢光計は例え
ば、緑色光で陰性又は非螢光性試料を示す。
を測定する。装置で試験される特定の酵素に対して最適
の温度に螢光計室を加熱する。
D−グルコシターゼの場合には、温度は56℃である。培
養時間の間、螢光計は螢光をモニタし続けそして例え
ば、赤色光により初期螢光より強度で少なくとも5%増
加が検出される時に、陽性の螢光性試料を示す。5%以
下の増加が確定した培養時間内で起こる場合には、例え
ば緑色光を活性化することにより陰性の又は非螢光試料
を示す。
ド、蒸気等の滅菌媒体に関連して記載した。しかしなが
ら、このインジケータはこれらの用途に限定されず、そ
して他の滅菌媒体、例えば、乾熱、放射線、プロピレン
オキシド、臭化メチル、オゾン、二酸化塩素、ホルムア
ルデヒド、そして他のガス状及び液体試剤の効能を示す
ために同様に使用できる。
分率は特記しない限り重量百分率である。
子生存検出法の結果間の関連を示す。本例はまたアンプ
ル48と酵素キヤリア46の間に障壁47を利用する第3図及
び第4図に示した装置で得られるより短時間の読取時間
を例示する。
ndから“ATCC7953"として市販のBacillus stearothermo
philusをトリプシン処理大豆ブロスに58℃に夜通し(16
時間)成長させた。この培地を使用してpH7.4で8g/の
栄養ブロス、4g/の酵母抽出物、0.1g/の塩化マンガ
ン及び20g/の寒天からなる寒天皿の表面に接種した。
皿を72時間58℃で培養した。胞子を皿からかき取りそし
て滅菌蒸留水に懸濁させた。7000rpmかつ20分間40℃で
懸濁液を遠心分離することにより植物性汚物から胞子を
分離した。上澄みを流出させそして胞子を滅菌蒸留水に
再懸濁した。この洗浄工程を数回繰返した。デイスク当
り1.6×106胞子の集団で、Schleicher & Schull,Inc.,
Keene,NHから“S & S #903 Crade Filter Paper"とし
て市販の直径6.35mm(1/4インチ)の濾紙デイスクの上
にBacillus stearothermophilus胞子を塗被する。これ
は1×108胞子/mlの濃度で水中のBacillus stearotherm
ophilus胞子の懸濁液を調製すること、各濾紙デイスク
の上にこの懸濁液10μをピペツトで移すことそしてデ
イスクを乾燥するにまかせることにより行なわれる。
第3図及び第4図のように、外側容器40の底部上に胞子
塗被ストリツプ46そして酵素基質含有アンプル48と胞子
ストリツプの間に障壁47で構成した。3M,St.Paul,MNか
ら“Thinsulate(商品名)200ブランドThermal Insulat
ion"として市販の、200g/平方メートルの重量を有す
る。ポリプロピレンブローンミクロ繊維材料の直径1.75
mm(11/16インチ)のデイスクを障壁47として使用し
た。アンプル48は栄養培地0.67mlを含有し、これは微生
物学用ペプトン17g、L−アラニン0.17g、並びにN,N−
ジメチルホルムアミド200μに溶解させた、Sigma Che
mical Company,St.Louis,MO.,から市販の4−メチルウ
ムベリフエリル−α−D−グルコシド0.1g及び水リツト
ル当り0.03gのブロモクレゾールパープルpHインジケー
タ染料からなる。酵素基質と栄養培地溶液のpHを0.1N水
酸化ナトリウムで7.6に調節した。
ある。外側容器は長さ5.08cm(2.0インチ)、外径85.1m
m(0.335インチ)そして内径77.0mm(0.303インチ)で
あつた。キヤツプは長さ1.275cm(0.510インチ)、内径
83.3mm(0.328インチ)であつた。内部アンプル48はガ
ラス製で、長さ3.96cm(1.56インチ)、外径65.5mm(0.
258インチ)そして壁厚2.5mm(0.010インチ)であつ
た。閉鎖部材52はCelanese Separation Products,Charl
otte,N.C.から“Celegard(商品名)K−442微孔性フイ
ルム”として市販の、直径1.27mm(1/2インチ)のポリ
プロピレン片であつた。
じであつた。
置きそして0.5、1.0、1.5、2.0、2.5及び3.0分の間、Am
erican Sterilizer Company,Erie,PA,から“Amsco Eagl
e(商品名)モデル2013滅菌器”として市販の、重力変
位蒸気滅菌器で132℃に暴露した。暴露後に、酵素基質
と栄養培地を含有する内部アンプルを破砕しそしてユニ
ツトを56℃で培養した。紫外線(λ=366nm)を使用し
て培養の10分、20分、30分、60分、120分、180分そして
240分後に螢光を可視で読取るために容器に照射した。
更に、紫色から黄色へ色彩変化により示される胞子成長
を56℃で24時間の培養後に可視で測定した。
が生存胞子の検出よりずつと更に迅速に本発明の方法に
より検出できることを示す。このデータは装置中で活性
酵素の検出を使用し装置中で結果の胞子成長を予想でき
ることを示す。
の間に障壁を有する)を使用すると24時間の培養後に胞
子成長を示すすべてのユニツトに対して10分後に検出で
きることを示す。装置2(障壁材料なしで)を使用する
と、24時間の培養後に胞子成長を示すすべてのユニツト
で酵素活性を検出するために2時間の培養が必要であ
る。
すように装置を組立てた。例1に従つて調製した一つの
胞子ストリツプを、厚さ0.10mmのポリエチレン塗被紙、
6.35mm×28.58mmの一端に熱シールした。アンプル78はI
CI America,Inc.,Willington,Delawareから“Tween(商
品名)80ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエー
ト”として市販の、5ml/の非イオン性界面活性剤を含
み、胞子キヤリア、並びに例1の溶液に存在する酵素基
質、栄養剤及び指示薬を湿潤することを助ける。外側容
器、キヤツプ及び内部アンプルは例1の装置に使用した
ものと同じである。閉鎖部材は滅菌グレード濾紙であつ
た。
して0.5、1.0、1.5、2.0、2.5及び3.0分間、American S
terilizer Company,Erie,PAから“Amsco Eagle(商品
名)モデル2013滅菌器”として市販の重力変位蒸気滅菌
器で132℃に暴露した。暴露後に内部アンプルを破砕し
そしてこの装置を56℃培養した。紫外線(λ=366nm)
を使用して培養の10分、20分、30分、60分、120分、180
分そして240分後に可視読示螢光のため容器に照射し
た。更に、紫色から黄色へ色彩変化により示されるよう
に、胞子生長を培養の24時間後に可視で測定した。
発明の装置と酵素検出法を使用すると胞子生存のずつと
迅速な検出が得られることを示す。
hermophilusと関連した、幾つかの酵素を例示する。こ
の例ではAPI Amalytab Products,Plainview,NYから“AP
I−XYM(商品名)システム”として市販の、酵素基質を
使用した。このキツトは個々に一連のマイクロカプセル
にパツクされた、19の異なる脱水した、呈色性酵素基質
からなる。各マイクロカプセルへ水性試料の添加は再水
和する。試験キツトを所望の間隔で培養しそしてシステ
ムと共に供給された検出剤の添加後に反応が可視化され
る。
気滅菌器で132℃で1分又は3分の間暴露した。この装
置で使用した時にBacillus stearothermophilus胞子は
1分暴露で生き残りそして3分後に殺菌される。暴露後
に酵素基質キツト中の各マイクロカプセルに胞子ストリ
ツプを無菌的に移しそして滅菌蒸留水50μを各ウエル
に加えた。一つのキツトは1分間暴露した胞子ストリツ
プを含み、第2キツトは3分間暴露した胞子ストリツプ
を含みそして第3キツトは暴露しない胞子ストリツプを
含んだ。
養した。暴露した胞子ストリツプを含むストリツプを7
時間56℃で培養するにまかせた。培養後に各キツトのマ
イクロカプセル中で生ずる酵素反応の発色のために検出
剤A及びB(“API−XYM(商品名)システム”と共に市
販)を加えた。
表に報告する。多数の酵素が1分暴露後に容易に検出で
きる活性を示しそして3分暴露後活性を示さず又は実質
上減少した活性を示した。酵素の幾つかは、B.stearoth
ermophilusに固有ではなくそして未暴露状態で検出でき
る活性を示さなかつた。未暴露状態で検出できる活性を
示さない幾つかの他の酵素(ミリステートリパーゼ、バ
リンアミノペプチダーゼ、キモトリプシン及びβ−グル
コニダーゼを含む)は明らかに熱に暴露により活性化さ
れる。1分の暴露後に検出できる活性を示しそして3分
の暴露後に活性を示さず又は減少した活性を示す酵素
が、酵素活性が未暴露状態で検出されない場合でさえ、
本発明で有用に使用できると思われる。
テラーゼ、カプリレートエステラーゼリパーゼ、ミリス
テートリパーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、バリン
アミノペプチダーゼ、キモトリプシン、酸ホスフアター
ゼ、ホスフオヒドロラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β
−グルクロニダーゼ、及びα−グルコシダーゼ、β−グ
ルコシダーゼを含む、B.stearothermophilusに存在する
多数の酵素が、胞子の成長が検出される前に、検出され
るべき亜致死滅菌暴露に続いて十分な活性を有すること
を示す。
04、2.8×103胞子の濃度で、Schleicher and Schuell,I
nc.Keen.NHから“S &S # 591 A Grade Filter Paper"
として市販の濾紙から作つた、6.35×28.58mm(1/4×3/
8インチ)のキヤリア上に、例1に従つて調製したBacil
lus stearothermophilus胞子を塗被しそして乾燥した。
第3図及び第4図に示しそして例1で装置1として記載
したように、胞子ストリツプを使用して装置を組立て
た。
て1.0、1.5、2.0、2.5及び3.0分の間America Sterilize
r Company,Erie,PAから“Amsco Eagle(商品名)モデル
2013蒸気滅菌器”として市販の重力変位蒸気滅菌器で13
2℃に暴露した。暴露後内部アンプルを破砕しそして装
置を56℃で培養した。紫外線(λ=366nm)を使用し
て、10分、20分、30分、60分、120分、180分、240分、3
00分そして360分の培養後に、螢光を可視で検出するた
めに容器を照射した。更に、紫色から黄色へ色彩変化に
より示されるように、24時間の培養後に、胞子成長を可
視で測定した。
成長が検出される前に十分に酵素活性(即ち、螢光)に
より予想されたことを示す。
子を使用する装置に対して読取時間を比較する。下記の
系統を試験した。American Type Culture Collection,R
ockville,Marylandから市販の“ATCC8005";三つの異な
る市販の生物学的インジケータ、“ATTEST(商品名)生
物学的インジケータ”、3M,St.Paul.MN.“Proof PLUS
(商品名)生物学的/化学的インジケータ”、American
Sterilizer Co.,Erie.PA及び“Assert(商品名)生物
学的/化学的インジケータ"Surgicot.Smithtown.NYに含
まれる微生物を成長させることから得られる胞子;Natio
n Collection of Type Cultures,Colindale,London,Eng
land.から市販の“NCTC10003";5分間121℃に暴露後トリ
プシン処理大豆ブロスでHygiene Institute of Hambur
g,Hamburg,Germanyにより供給されるアースストリツプ
を培養することにより得られた“German Earthspore"
(この5分間暴露を使用して地中に存在するすべての植
物性有機体を殺してB.stearothermophilusのみがとどま
る);及びStatens Institute for Falkehelse,Oslo,No
rwayにより製造された胞子ストリツプから分離されたス
カジナビアン系統。
で成長させた。Pharmacia Fine Chemicals AB,Uppsala,
SwedenからPercoll(商品名)として市販の、密度勾配
で4℃で5時間11,000rpmでこの胞子を遠心分離した。
遠心分離後に、胞子を滅菌蒸留水に再懸濁させた。Germ
an Earthsporeでは、遠心分離中に細胞の二つの別の層
が密度勾配で分離された。相接触顕微鏡を使用して底部
相が主として胞子であることが判明しそして上部相が少
数の胞子と共に主として植物性細胞と植物性汚物であつ
た。両方の層を別々に試験した。
& S 591Aグレード濾紙”)の6.35×28.58mm(1/4×3/
8インチ)ストリツプの上に胞子を塗被しかつ乾燥し
た。例1、装置1におけるように装置を組立てたが、た
だし“ATCC8005"胞子を使用する装置の一バツチで、“A
TCC8005"胞子上のβ−D−ガラクトシダーゼの酵素活性
を検出するために、使用した酵素基質は4−メチルウム
ベリフエリル−α−D−グルコシドの代りに、N,N−ジ
メチルホルムアミド200μ中に溶解した0.1g/のSigm
aから市販の4−メチルウムベリフエリル−β−D−ガ
ラクトシドであつた。これらのユニツトバツチを“Amsc
o Eagle(商品名)モデル2013蒸気滅菌器”で1.0、1.
5、2.0、2.5及び3.0分132℃に暴露した。暴露後に内部
アンプルを破砕しそしてこのユニツトを56℃で培養し
た。紫外線(λ=366nm)を使用して10分、20分、30
分、60分、120分、180分そして240分の培養後に螢光を
可視で読示するため容器に照射した。更に、紫色から黄
色へ色彩変化により示されるように、24時間の培養後に
胞子成長を可視で測定した。
統が胞子生存に関連した酵素活性(α−D−グルコシダ
ーゼ又はβ−D−ガラクトシダーゼの何れか)を有した
ことを示す。胞子が生存した殆どのユニツトで、培養の
2時間以内に螢光が検出されそして多くのユニツトで培
養10分後に螢光が検出された。殆どGerman Earthspore
からの植物性細胞からきる細胞の層はまた亜致死暴露に
続いて酵素残存を有した。これは植物性細胞に関連した
α−D−グルコシダーゼが本発明で使用できることを示
す。スカンジナビアン系統を有する幾つかのユニツトは
酵素残存を有していて更に培養で有機体の成長はなかつ
た。これは前に観察されそして限界的サイクルで起こ
る。この酵素は胞子より僅かに長く活性のままであり、
そしてサイクルの多くをモニターすることによつて余分
の安全限界を供し滅菌器中で物品の滅菌を確実にする。
stearothermophilus胞子を塗被した。例1に記載した
ように、B.stearothermophilus胞子が得られ、そしてエ
タノールに懸濁させ、下記の材料に6.35×28.58mm(1/4
×3/8インチ)ストリツプ当り大体1×106胞子を置い
た:Kendall Fiber Products Divisionから“NovonetteR
不織織物#149−190"として市販のポリプロピレン/レ
ーヨン不織ウエブ;Kemdall Fiber Products Division,B
oston.MAから“Novonette(商品名)不織織物#149−00
0"として市販のナイロン不織ウエブ;Celanese Separati
on Productions,Charlotte,NCから“CelagardR微孔性疎
水性フイルム2500"として市販の微孔性疎水性フイルム;
Celanese Separations Productsから“Celgard(商品
名)微孔性親水性フイルム3401"として市販の微孔性親
水性フイルム;Reynolds,Metals Company,Richmond,VAか
ら市販のアルミニウムホイル;Schleicher & Schuellか
ら“S & S903グレード濾紙”として市販の濾紙;そし
てManning Paper Company,Division of Hammermill Pap
er Co.,Troy,NYから“Manniglas#1267不織ガラス繊維
紙”として市販のガラス繊維不織ウエブ。
1に記載したものと同じ寸法のポリプロピレン容器に入
れた。
したように胞子ストリツプを使用する装置を組立てた
が、ただしCrown Zellerback Corp,Camas,Washingtonか
ら“0.50g Celestra(商品名)不織ポリプロピレン”と
して市販のポリプロピレン不織スクリムの直径1.75mm
(11/16インチ)片を胞子ストリツプ46と外側容器の底
部の間に挾んだ。このスクリムはウイツクとして作用し
て疎水性ナイロンウエブ、微孔性疎水性フイルム、アル
ミニウムホイル又はガラス繊維不織ウエブを通して栄養
培地を引出すので、アンプル48が破砕された時にこのサ
ンドイツチは栄養培地で胞子ストリツプを確実に湿潤す
る。胞子塗被容器を使用する装置を例1、装置1に従つ
て組立てたが、ただしこの装置は胞子ストリツプ又は障
壁を含まなかつた。このインジケータの3ユニツトバツ
チを1.0、1.5、2.0、2.5及び3.0分間132℃に“Amsco Ea
gle(商品名)モデル2013蒸気滅菌器”に暴露した。暴
露後に酵素基質溶液と栄養培地を含むアンプルを破砕
し、装置を56℃で培養しそして1時間に対して15分そし
て6時間まで毎時、Ultraviolet Products,Inc.Sav Gab
riel,CA.から“Black−Ray(商品名)ランプ”モデルUV
L−21として市販の長波長紫外線(λ=366)を使用して
蛍光を調べた。培養を24時間続け、そして成長(黄色)
又は非成長(紫色)に対して装置を読示した。
有するすべてのインジケータで、胞子生存(酵素活性に
よる)は15以内に検出された。胞子が容器上に直接に塗
被されたインジケータは、活性α−D−グルコシダーゼ
が存在し、それ故に胞子が生存するすべての場合を検出
するために2時間まで必要とした。信頼し得る読取りま
でこの増大した時間は胞子塗被容器インジケータにおい
て、培地の全体容量を蛍光についてモニターしなければ
ならない事の結果である。対照的に、胞子ストリツプ及
びアンプルと胞子ストリツプの間の障壁を使用する装置
では、蛍光について胞子ストリツプのみを見る。この障
壁は少量の培地と酵素基質が胞子キヤリアと接触するこ
とを許す半透過性膜として作用する。酵素基質とキヤリ
アの何れかの部分上の酵素の反応はアンプルの全内容物
と酵素の反応より、ずつと短い時間で見られる。
ブロスで37℃で夜通し(16時間)成長させた。この培地
を使用して、8g/の栄養ブロス、0.011g/硫酸マンガ
ン及び20g/の寒天からなる寒天皿の表面にpH7.2で接
種した。この皿を6日間37℃で培養し、皿から胞子をか
きとりそして滅菌蒸留水に懸濁させた。この懸濁液を70
00rpmでかつ20分間4℃で遠心分離することによつて植
物性汚物から胞子を分離した。上澄みを流出させそして
胞子を滅菌蒸留水に再懸濁させた。この洗浄工程を数回
繰返した。
591Aグレード濾紙”ストリツプ上に1.0×108の集団で塗
被した。第3図及び第4図に示し、かつ例1、装置1で
記載したようにこれらの胞子ストリツプを使用して、装
置を組立てた。これらの装置の3ユニツトバツチを30分
間54℃と50%相対湿度で予め調整した。この装置を“As
sociation for the Advancement of Medical Instrumen
tation,Standard for BIER/EO Gas Vessels"AAMI BEOU
−3/82に従つた変型した、3M Co.,St.Paul,Minnesota、
から市販の“Steri−Vac(商品名)400Bガス滅菌器でエ
チレンオキシド600mg/に54℃及び50%相対湿度で、1
5、30、60、及び120分間暴露した。暴露後に、内部アン
プルを装置から取出し、そして内部アンプルに含まれる
ものと同じであるが、ただしブロモクレゾールパープル
pH指示薬染料の代りに0.03g/の2,3,5−トリフエニル
テトラゾリウムクロリド(ICN Pharmaceutical Inc.,Cl
eveland Ohioから市販)及び4−メチルウムベリフエリ
ル−α−D−グルコシドの代りに0.1g/の4−メチル
ウムベリフエリル−β−D−グルコシド(Sigmaから市
販)を含む溶液0.67mlを外側容器の中にピペツトで入れ
た。この装置を37℃で培養した。紫外線(λ=366nm)
を使用して培養の30分、60分、90分、120分、180分、24
0分そして300分後蛍光を可視で検出するため装置に照射
した。更に、無色から赤色へ色彩変化により示されるよ
うに、胞子成長を培養の24及び168に可視で測定した。
結果を第VIII表に報告する。
残る装置では4−メチルウムベリフエリル−β−D−グ
ルコシドと活性β−D−グルコシダーゼの反応から生じ
た蛍光が90分の培養後可視で検出されたことを示す。こ
の酵素は120分のエチレンオキシド暴露後に完全に不活
性化され、120分のエチレンオキシド暴露が完全でかつ
有効な滅菌サイクルであることを示す。若干の残留酵素
活性は3分及び60分の限界滅菌サイクルにおいても時間
及び4時間後に検出された。
subtilis胞子を6.35×28.58mm“S & S591Aグレード濾
紙”ストリツプ上に1.8×108の集団で塗被した。第3図
及び第4図に示しかつ例1、装置1に記載したようにこ
れらのストリツプを使用して装置を組立てた。装置の3
ユニツトバツチを30分間50%相対湿度と54℃で予め調節
した。この装置を例7に記載したように変型した“Ster
i−Vac(商品名)400Bガス滅菌器”で600mg/のエチレ
ンオキシドで54℃と50%相対湿度で15、30、60及び120
分間暴露した。暴露後に胞子ストリツプを装置から取出
しそしてDynatech Laboratories,Inc.,Alexandria,Virg
iniaから“Dynatech Micro FLUOR(商品名)システム”
として市販の96ウコルマイクロタイター皿中の個々のウ
エルに移した。各ウエルは17g/の微生物学的ペプト
ン、0.17g/のL−アラニン、0.03g/のトリフエニル
テトラゾリウムクロリド及び0.1g/の4−メチルウム
ベリフエリル−β−D−グルコシドの溶液200μを含
んだ。皿中で3陰性対照ウエルは胞子ストリツプなしで
栄養培地と酵素基質の溶液を含んだ。この皿を37℃で培
養しそして3M Company,St.Paul,Minnesotaから“3M Fln
oro Fast(商品名)96蛍光計”として市販の蛍光計で
0、60、120、180及び240分の培養後に各ウエルの蛍光
を測定した。3ウエルに対する相対蛍光の平均として、
この結果を第VIII表に報告する。
る15分エチレンオキシド暴露に生存し、そして少なくと
も30分暴露後に殺菌されることを示す。15分間暴露され
た胞子ストリツプを含むウエルにより示されるように、
酵素β−D−グルコシダーゼの活性、従つてB.subtilis
微生物の生存は3時間の培養後陰性対照のバツクグラウ
ンドレベル蛍光の少なくとも2.5培の相対蛍光における
増加により3時間の培養後に示される。同様に暴露され
ない対照では、単に1時間の培養後に陰性対照のバツク
グラウンドレベル蛍光の2.5培以上の相対蛍光の増加は
酵素活性と胞子生存を示す。
菌に暴露されたストリツプは3時間の培養後に陰性対照
の2.5培以下の相対蛍光値を有した。かくして、ただ残
留酵素活性と胞子生存の欠除を示す。
る。この図ではラインAは15分間暴露した装置を表わ
し、ラインBは30分間暴露した装置を表わし、ラインC
は60分間暴露した装置を表わし、ラインDは120分間暴
露した装置を表わし、そしてラインEは陰性対照を表わ
す。
subtilis胞子を“S & S591Aグレード濾紙”の6.35×2
8.58mm(1/4×3/8インチ)上に1.0×108の集団で塗被し
た。第3図及び第4図に示しかつ例1、装置1に記載し
たように、これらの胞子ストリツプを使用して装置を組
立てた。装置の3ユニツトバツチを30分間54%相対湿度
と共に54℃に予め調節した。次に例7に記載したように
変形した、“Steri−Vac(商品名)400Bガス滅菌器”で
エチレンオキシド600mg/に54℃及び50%相対湿度で1
5、30、60及び120分間暴露した。暴露後三つの同一の未
暴露胞子ストリツプと共に、胞子ストリツプを装置から
取出し、そしてDynatech Laboratories,Inc.,Alexandri
a,Verginiaから“Dynatech Micro FLUOR(商品名)シス
テム”として市販の、96ウエルミクロタイタープレート
中の個々のウエルに移した。各ウエルは17g/の微生物
学用ペプトン、0.17g/ L−アラニン、0.03g/のトリ
フエニルテトラゾリウムクロリド及びSigmaから市販の
0.1g/のメチルウムベリフエリル−α−D−アラビノ
フラノシドの溶液200mlを含んだ。プレート中の3陰性
対照ウエルは胞子ストリツプなしで栄養培地と酵素基質
の溶液を含んだ。この皿を37℃で培養しそして3M Coman
y,St.Paul,Minnesotaから“3M Fluoro FAST(商品名)
として市販の、蛍光計で0、60、120、180そして240分
の培養後に各ウエルの蛍光を測定した。この結果を第8
図で3ウエルに対して相対蛍光の平均と記録し、そこで
は平均相対蛍光を15、30、60及び120分間暴露した胞子
を含有するウエル、及び陰性の対照について培養時間に
対してプロツトした。図では、Fは15分間暴露した装置
を表わし、Gは30分間暴露した装置を表わし、Hは60分
間暴露した装置を表わし、Jは120分間暴露した装置を
表わしそしてKは陰性の対照を表わす。
レンオキシド暴露に生存し、そして少なくとも30分暴露
の後に殺菌されることを示す。この例では、α−D−ア
ラビノフラノシダーゼはなお120分サイクルの後に残留
活性を有し、これは完全でかつ有効な滅菌サイクルと考
えられる。このレベルの蛍光はバツクグラウンドレベル
と考えられ、そしてこのレベル以上に著しい増加は滅菌
の失敗を示す。例えば、3時間の培養後に、15分間暴露
したストリツプと120分間暴露したストリツプ間で相対
蛍光単位(RFU)の差は2166である。この差は著しくそ
して使用したエチレンオキシド条件に対して不完全な滅
菌サイクルであることを示す。しかしながら、30分間暴
露したストリツプと120分間暴露したストリツプ間の差
は単に745RFUである。この差は顕著ではなくそして30分
の限界滅菌サイクルで酵素残留活性を示す。
ophilus胞子(“ATCC7953")を1回洗浄後、1×108胞
子/mlの集団で、蒸留水に懸濁させた。下記の工程を使
用して酵素α−D−グルコシダーゼを精製した。懸濁液
(200ml)を4℃で夜通し、pH6.2で、10mMアセテート緩
衝液と5mM CaCl2の溶液2に対して透析した。次に遠
心分離により不溶性残留物を取除いた。上澄みを固体硫
酸アンモニウムと共に分別した。フイルターパツドを含
むブフナー漏斗上に20−60%硫酸アンモニウムからの沈
殿物を回収した。Whatman No.1濾紙の2シート上に、Ma
nville Specialty Produot Group,Lompoc,CA.から市販
の“Celite(商品名)濾過助剤”の懸濁液(100g/)
を通過させることによりこのフイルターパツドを調製し
た。濾過後に、この“Celite(商品名)濾過助剤”パツ
ドを10mMアセテート緩衝液と5mM CaCl2の溶液20mlに、p
H6.2で、懸濁させ、そして4℃で4時間かきまぜた。濾
過により“Celite(商品名)濾過助剤”を可溶性酵素か
ら取出した。4℃で10mMアセテート緩衝液と5mM CaCl2
の溶液4に対して夜通し淡褐色の酵素溶液を透析し
た。この透析した溶液を透析管から取出しそして濾過し
て不溶物汚物を除去した。
(−20℃)をかきまぜながら加えた。このアセトン−酵
素溶液を6時間−20℃に保つた。4℃で重力濾過により
淡褐色沈殿物を回収しそしてpH6.2で、10mMアセテート
緩衝液と5mM CaCl2の溶液10mlに溶解した。淡コハク色
溶液を0.1Mアセテート緩衝液、pH4.6の添加によりpH5.5
に調節した。再び、この溶液を2容量の冷アセトン(−
20℃)で処理しそして夜通し20℃に保つた。重力濾過に
より沈殿物を回収し、そして10mMアセテート緩衝液と5m
M CaCl2の溶液pH6.2、10mlに溶解した。各24時間で完全
な緩衝液交換で、50mMホスフエート緩衝液と5mM EDTAの
溶液4に対して、pH6.2(緩衝液A)、48時間この淡
コハク色溶液を透析した。
phadex(商品名)ビーズ”をパツクしたカラムに透析し
た試料5mlを装入し、そして50mMホスフエート緩衝液と5
mM EDTA,pH6.2で平衡させた。a)緩衝液A500ml、そし
てb)緩衝液A中で線状0〜0.8M NaCl勾配の200mlで次
々にこのカラムを洗浄した。流速を約5ml/60分に保つ
た。生じた活性画分を回収しそして24時間後に完全な交
換と共に、蒸留水4に対して48時間透析した。親液性
化画分を150mMホスフエート緩衝液と5mM E TAの溶液3m
l、pH6.2(緩衝液B)に懸濁させた。この懸濁液を15ml
/60分の大体の流速で緩衝液Bと共に、Pharmacia Inc.
から市販の“Sephadex(商品名)G−100ビーズ”でパ
クツされたカラム(2.5×30cm)に通過させた。活性画
分を回収しそして蒸留水4に対して透析した。次にこ
の透析した画分を親液性化した。
4×3/8インチ)ストリツプを蒸留水中の0.02M精製α−
D−グルコシダーゼの懸濁液で飽和させた。同一型式と
寸法の7個の他の紙ストリツプに、蒸留水に懸濁させた
例1に記載したように得られた、B.stearothermophilus
胞子(“ATCC7953")の1×106胞子/ml溶液を飽和させ
た。すべてのキヤリアストリツプを周辺温度(20℃)で
夜通し風乾した。
したように、これらの胞子ストリツプを使用して装置を
組立てた。0.5、1.0、1.5、2.0、2.5及び3.0分間132℃
と469.4kg/cm2(33psi)で“Amsco Eagle(商品名)モ
デル2013滅菌器”として市販の重力変位蒸気滅菌器にこ
れらの装置を暴露した。暴露後に酵素基質と栄養培地を
含む内部アンプルを破砕しそしてこのユニツトを24時間
56℃で培養した。紫外線(λ=366nm)を使用して蛍光
を可視で読示するため容器に照射した。366nmで、“3M
Fluoro FAST(商品名)蛍光計”を使用して各装置の相
対蛍光をまた測定した。結果を第IX表に記録する。
rothermophilusを使用する装置と同一の可視で観察され
る蛍光、及び大体同じの測定された蛍光を有することを
示す。従つて、本例はそれが得られる胞子にしばられな
い、精製した酵素のみの活性が胞子生存を検出するため
に有用であることを示す。
ータの一具体例の断面図である。 第2図は閉鎖装置26を含めて、第1図の滅菌インジケー
タの分解組立透視図である。 第3図は閉鎖装置56を閉鎖位置で、本発明のインジケー
タの一好適具体例の断面図である。 第4図は第3図の分解組立透視図である。 第5図は閉鎖装置86を開放位置で、本発明の滅菌インジ
ケータの別の好適具体例の断面図である。 第6図は第5図の滅菌インジケータの分解組立透視図で
ある。 第7図は種々の時間に対して滅菌サイクルへ暴露後に本
発明の滅菌インジケータに対する相対蛍光対培養時間の
グラフ図である。 第8図はまた種々の時間に対して滅菌サイクルへ暴露後
に本発明の滅菌インジケータに対すう相対蛍光対培養時
間のグラフ図である。
Claims (3)
- 【請求項1】a) 検出できる量の酵素を供する活性酵
素の供源を滅菌サイクルに置き、この酵素が滅菌をモニ
ターするため通常に使用される少なくとも一つの微生物
の生存度と相関する活性を有するものであること; b) 前記の滅菌サイクルに続いて、酵素基質と活性の
ままである酵素の反応を促進するのに十分である時間の
間と条件の下で、残留活性酵素と反応して検出できる酵
素変性生成物を生ずることができる有効量の酵素基質シ
ステムと共に前記の酵素を培養すること; の工程を含むことを特徴とする、滅菌サイクルの有効性
を迅速に測定する方法。 - 【請求項2】a) 液体不透過性かつ実質上ガス非吸収
性壁を有する外側容器、この容器は中に少なくとも一つ
の開口を有すること;及び b) 前記の開口を覆うガス透過性、細菌不浸透性装
置; を含む滅菌インジケータであつて、その活性が滅菌をモ
ニターするために通常に使用される少なくとも一つの微
生物の生存度と相関する、検出できる量の分離された活
性酵素が前記の外側容器内に含まれることを特徴とす
る、前記の滅菌インジケータ。 - 【請求項3】a) 液体不透過性かつ実質上ガス非吸収
性壁を有する外側容器、この容器は中に少なくとも一つ
の開口を有すること; b) 前記の開口を覆うガス透過性、細菌不浸透性装
置; c) 検出できる濃度で活性酵素の供源が前記の外側容
器内に含まれること、この酵素が滅菌をモニターするた
めに通常に使用される少なくとも一つの微生物の生存度
と相関する活性を有すること; を含む滅菌インジケータであつて、更に前記の外側容器
内に、活性酵素と水溶液中で反応して検出できる酵素変
性生成物を生ずることができる有効量の酵素基質が含ま
れることを特徴とする前記の滅菌インジケータ。
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