JPH02195898A - 滅菌サイクル効能測定法及び迅速読取生物学的インジケータ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は滅菌サイクルの効能を測定するための迅速な方
法に関する。臀に、本発明はその活性が滅１効馳をモニ
ターするため通常に使用される少なくとも一つの微生物
（以下＠試験微生ｖ！Ｊ″と称する）の生存度と相関で
きる酵素を使用する。試＠倣生物に亜致死的でるる滅菌
サイクルに続いてこの酵素は比較的短時間でＶゴ、例え
ば通常には８時間又はそれ以下で酵素基質と反応するの
に十分に活性のままでるる。しかしながら、この酵素は
試験値生物に致死的でおる成田サイクルに続いて不活性
化さ匹又は活性がかなり減少さ詐る。本発明は丈にこの
＃累を官む生物学的ｇ自インジケータに関する。

滅菌の効能を測定する之めに使用される生物学的インジ
ケータ及び化学的インジケータに当業者に絢矧でろる。

従来の生物学的インジケータでは、自然の汚染により存
在する大抵の有機体よりも、使用される滅菌法に対して
何倍も耐性の大きい試験微生物がキャリア上に血被され
そして滅菌されるべき物品と共に滅菌器に入れられる。

滅菌サイクルの完了後にこのキャリアは栄養培地で培養
されて試験値生物のどれ根が滅菌工程に生存したかどう
かｔ測定する。検出可能な数の有機体の成長は通常には
最少２４時間を喪する。この期間の間、推定上滅菌され
た物品全隔離すべきでめる。

しかしながら、度々の夾施では、病院は推定上滅菌さｎ
た物品の適正な隔離のための空間又は真の隔離上杆すの
に十分な数の物品の（＃ｊ　ｆｌ　’にも有しない。結
果として、＃ｉ、菌が適正でわジかり実験室から続く報
告により確認されるでろろうとの前提の下で推定上滅菌
さルた物品をストックに戻して置く。

市販のインジケータに色彩変化又は固体から成体への変
化によシ＃、菌性會指示する化学品金利用する。この化
学品インジケータの利点は結果が滅１サイクルのｊｌｔ
ｆｆｌで知ｎることにめる。しかしながら、これらの結
果は、米国特許第４，４４８，５４８号に記載される装
置におけるように、％定の温匿が特定の時間の間に到達
したこと；米−臀許第４，３４８，２０９におけるよう
に１エチレンオキシドがスが存在することのみを示す。

これらの装置は試験微生物を不活性化するために必要な
すべての条件が得らｎたどうかを示さない。生きている
生物のみが滅菌に影響するために必要な物理的及び化学
的パラメータの真の関係を検知できる。

それ故に、生物学的試験が最も正確な滅菌性試験である
ことが滅菌の技術で認められている。

迅速な結果を供し、なお時間、温度及び水分、化学品の
濃度又は放射線線量の相互関係パラメータを含めて、滅
＃を得るのに必要なすべてのパラメータが到達した高い
レベルの信頼性を供する滅菌インジケータが必要とされ
ている。

本発明は滅菌媒体が蒸気、ＩＩＬ熱、放射線、エチレン
オキシド又はガス状又は液体試剤の何れにせよ、化学的
インジケータの速度に近い速＆ｔ”有する従来の生物学
的インジケータの信頼性と組合ゎせ九、滅菌サイクルの
効能を測定する方法を供する。本発明は殆どの場合で、
８時間以内で滅菌欠陥を指示できる、＠菌効能を指示す
る方伝と装置を供する。

本発明の方法は ａ）滅菌サイクルに活性＃素の供源を直ぐこと、この酵
素が滅菌をモニタするため通常に使用される少なくとも
一つの微生物の生存度と相関する活性を有する仁と；そ
して ｂ）滅菌サイクルの完了に続いて、この酵素に応して検
出可能な酵素変性生成物を生ずることができること、 を含む。

次に反応混会＊’ｅ例えば、蛍光針又は比色計で測定し
て酵素変性生成物の存在ｔ−１５Ｎ定する。確立した時
間内で（酵素と基質の素性、各々のｍ匿、及び培養条件
に応じて）バックグラワンド以上の検出可能な！＃累変
性生成物の存在が滅菌の失敗を示す。確立した時間内で
検出可能な酵素変性生成物がないことは試験生物に致死
的でめり、それ故に適切である滅菌サイクル金示す。

活性酵素の供ｍは有機体から分離された梢製酵素又はそ
れ自体滅菌をモニターするため通常に使生物全酵素供源
として使用する時には不発明の方法は下記の段１ｖ（ｆ
−含む： Ｃ）滅菌サイクルの完了に続い℃、培養で、生存の微生
物の成長？促進できる水性栄養培地、及び生存の微生物
の成長全促進するのに適した条件士で、微生物の成長に
対応して検出ａＪ能な変化を受けることができる慣出坏
物質と共に、生きた鷹までめる微生物のイμ」れかを培
養すること。

本発明は史に前記の方法を実施する除に有用な迅速読収
滅醒インジケータを供する。この一つの成田インジクー
タに下記のものを含む：ａ）　　？［体不透過注及び実
買上ガス非吸収性壁を有する外側容器、この容器は中に
少なくとも一つの開口を有し、ガス透過性、細菌不浸透
性装置がこの囲口金覆う；そして ｂ）その活性が滅菌をモ＝ｊｌるために通常に使用され
る少なくとも一つの微生物の生存度と相関する、検出ａ
Ｊ能蓋の分離さｎた箔注酵木が外側容器内に含°よれる
。

別の迅速読取滅菌インジケータは下記のものを含む： リ　液体不透過性及び実買上ガス非吸収性壁を有する外
側容器、この容器は中に少なくとも一つの開口を有し、
がス透過性、細菌不浸透性装置がこの開口を覆う； ｂ）検出可能な＃に度で活性酵素の供億が外側容器 器円に富まれ、この＃累は戚−をモニタするために通常
に使用される少なくとも一つの微生物の生存度と相関す
る活性ｋｉｔ、；そして Ｃ）活性酵素と反応して検出可能な酵素変性生成物で生
ずることができる、Ｍ動電の酵素基貴システムがまた外
側容器内に貧まｎる。

戚−サイクルの効能を迅速に測定する不発明の性能は下
記の発見に基づいている： １）その生存度が＃素の活性と相−する試験微生物金膜
すのに限界近くに十分でめる滅菌サイクルに続いて若干
の酵素が活性の１１でろり；そして ２）限界近くの滅菌サイクルに続いたこの酵素活性が比
較的短時間内に１例えば一般に約８時間円に＃累に対す
る基質システムを検出可能な濃度の生成物に変換するの
く十分であること。

試験微生物が酵素と共に、又μその供源として使用され
る場合には、非常に少数の試験微生物がこの限界近くの
畝函サイクルに生存する。しかし、なから、＆耐欠陥を
示すには不活性化微生物と関連して十分な酵素活性がめ
る。

本発明の酵素検出法は限界滅菌サイクルでフェイルセー
フとして作用し、その理由は本発明の酵素が試験微生物
よりｇ−条件に対してより耐性でめるかうである。完全
さが少く劣るｒ＃耐プサイクルに検出’ｅｉＪ能な＃素
度性生成物の存在、従って酵素活性の存在を使用して試
験微生物が少なくとも２４時間の間開−の滅菌条件を受
けかつ栄養培地で培養されるならば試験微生物の生き残
り又は生存度を予想できる。

本発明の実施に有用な＃索は＃ｌＪ１！Ｌ外及び細胞内
酵素全室ひ、その活性が滅＃ｉ効率をモニターするため
に通常に使用される少なくとも一つの微生物（以下１試
験微生物”と称す）の生存度と相関する酵素でめる。′
相関する”とはバックグラウンド以上に、酵素活性を使
用して試験微生物の未来の成長を予想できることを意味
する。この＃索は試験微生物に亜致死的である滅菌サイ
クルに続いて、２４時間以内で、そして好適具体例では
８時間以内で酵素のための基質システムと反応するのに
十分に活性のままでるり、しかも試験微生物に致死的で
ある滅菌サイクルに続いて不活性化され又は活性におい
てかなり減少さ往るものでなけｎばならない。

下記の試験は本発明の滅−モニター装置と方法に有用な
必要特注ｔ−Ｖする酵素を認定する際に有用でろること
が判った。約６０グ（ｌｏｇｓ）でＩ　Ｘ１０６試験微
生物の集団を減夕するのに丁度十分である＃：函条件を
受けた時に酵素は酵素のための基質システムと反応で測
定して１バツクグラウンド”に等しい残留酵素活性を有
する：しかしながら、少なくとも１０グ、しかし６０グ
以下でＩ　Ｘ　１０’試験依生物の果団會減するだけの
ｇ函条件を受けた＃素を工酵累基質システムと反応で測
定して１パツクグラウンド″より太さい酵素油性を有す
る。

このｒ＃索示質システムは酵素にぶり作用して検出可能
な、例えば蛍光の又は７Ｎ已した、酵素変性生成物を生
ずる基質又は基質の混＆物である。酵素活性は生じた検
出可能な酵素変性生成物の量に工り測定される。好まし
くは、６０グで試験微生物の集団を減するには不十分な
滅菌サイクルに続いて、酵素基質システムと反応しそし
て２４時間以内、好１しくに８時間スルそｎ以下、そし
℃最も好ましくは２時間又は七Ｃ以下以内に検出可能な
虚のは累変性生成物を生ずるのに十分な清注を有するも
のでめる◎ 好１しくは、６０グで微生物集団を減するのに不十分な
滅菌条件後の酵素活性はバックグラウンドより少なくと
も２％大きく、そして更に好ましくは少なくとも５％大
キく、そして最も好ましくはバックグラウンドより少な
くとも１０％太きい。

本発明の目的に対して６バツクグラウンド”として定義
される残留酵素活性Ｖベルは酵素が全部かつ不可逆的に
不活性化された後に生成物へ酵素基質の自然の変換によ
り得られるものより高いと了解される。

前記の試験を満たすことが判明した＃索は胞子形成微生
物からの氷解酵素ｆｔ宮む。このｒｓ素は胞子形成微生
物、例えば、微生物の０ａｎｄｉｄａ。

Ｂａｃｌｌｌｕａ及びｃｘｏｓｔｒｔａｌｕｍ　棟から
侍らｎる、β−Ｄ−グルコシダーｃ、α−Ｄ−１’ルコ
シターセ、アルカリンホスファターゼ、酸ホスファター
ゼ、ブチＶ−）エステラーゼ、カシリレートエステラー
ゼリバーぜ、ミリステートリパーゼ、ロイシンアミノペ
プチダーゼ、バリンアミノペプチダーゼ、キモトリプシ
ン、ホスフオヒｒロラーゼ、α−Ｄ−がラクトシダーゼ
、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｌ−アラビノフラノ
シダーゼ、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ、β
−Ｄ−セロビノシダーゼ、アラニンアミノペゾチダーゼ
、チロシンアミノペプチダーゼ、チロシンアミノペプチ
ダーゼ、フェニルアラニンアミノペプチダーゼ、β−Ｄ
−グルクロ４−ゼ、及び脂肪酸エステラーゼを含む。

Ｂａｃｉｌｌｕａ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ　からの％に有用な酵素はα−Ｄ−グルコシダーゼ
、β−Ｄ−グルコシダーゼ、アルカリンホスファターゼ
、酸ホスファターゼ、ブチレートエステラーゼ、カプリ
レートエステラーゼリパーゼ、ロイシンアミノペプチダ
ーゼ、キモトリプシン、ホスフオフイドロラーゼ、α−
Ｄ−がラクトシダーゼ、β−Ｄ−がラクトシダーゼ、ア
ラニンアミノペゾチダーゼ、チロシンアミノペプチダー
ゼ、及びフェニルアラニンアミノペプチダーゼ及び脂肪
酸エステラーゼを言む。Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉ
ｌｉｓからの特に有用な酵素はα−Ｌ−アラビノフラノ
シダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、Ｎ−アセチル−β
−グルコサミニダーゼ、β−Ｄ−セロビオシダーゼ、ア
ラニンアミノペゾチダーゼ、チロシンアミノペプチダー
ゼ９、チロシンアミノペプチダーゼ、ロイシンアミノペ
プチダーゼ及びフェニルアラニンアミノペプチダーゼを
言む。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ４１１ｓからのβ−Ｄ−グ
ルコシダーゼ及びａ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼがエ
チレンオキシド滅菌のモニタリングに特に有用でめる。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕａからのａ−ｆ）−グルコシダーゼは蒸気滅菌条件を
モニターするために特に有用である。

活性酵素の供殊は下記のものでめる： １）適当な微生物から誘導された、ｔｆＩ製し、かつ分
離した酵素； ２）ｍ索が固有でめり又は還体工学に工り刀ｌえらｎる
微生物；又は ６）酵素が微生物に配付され又は結合さＩＬる工うに胞
子形成又は成長の間にＩ＃累を加えた微生物、例えば胞
子形成の間に胞子に酵素を加え、こｎが胞子内に結付さ
れるようになる。本発明の実施に有用な酵素の供諏とし
て使用できる好適な微生物は胞子又は植物状態の倒れか
の細菌又はカビ類である。＃素の特に好適な供＃は微生
物のＢａｃｉｌｌｕａ。

０１ｏｓｔｒｉｃｌｉｕｍ、　Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、
及び０ａｎｄｉｄａ　ｍ　ｋ　貧む。

微生物が活性酵素の・共源として便用される時にには、
本発明の方法は生きたままでろる微生物の倒れかを培養
すること、続いて水性栄誉培地で滅＃ｉ丈イクル金完了
することの工程ｔ−言む。この工程金言むことは従来の
技術により滅菌条件がインジケータ中の微生物中のすべ
てを殺すのに十分でめったかどうかを確認してこの滅菌
条件が滅菌器中のすべての物品を滅菌するのに十分でる
ること金示す。微生物の成長が酵素試験の結果を確認す
るため従来の方法で使用される場合には、この微生物は
滅菌条件ｔモニターするために通常に便用されるもので
なければならない。こｎらの従来使用される微生＊は一
般に天然の汚東で出合う大抵の肩磯本よ９便用される滅
１ｆＩｉ法に対してイら倍もより耐性でろる。細酌胞子
は微生物ライフの最も耐性な形として認威される。こｎ
Ｖ工装置、化学品及び方法の滅菌効能を測定するための
すべての試験で選択される生活形である。Ｅａｃｉｌｌ
ｕｓ及び（３１ｏｓｔｒｉｄｉａからの胞子が飽和蒸気
、熱気、γ線及びエチレンオキシｙｔ利用する滅菌法を
モニ？するために最も普通に使用される。

滅菌条件をモニタするために通常に使用される特に好適
な微生物はＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ及び　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｕｂｔｉｌ
ｉｓ　ｆ會む。Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓが蒸気滅菌条件下の滅［−モニ丹るた
めに特に有用である。酵素α−Ｄ−グルコシダーゼはＢ
ａｃｉｌｌｕｓ　ａｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ。

例えばＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄから＠ＡＴａ
ａ　５ｏｕｓ″及び”　ＡＴＯＯ７９５３″とし℃市販
されるものの胞子に認めｂｎる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５
ｕｂｔ土ｍｉｓはがス及び乾燥滅菌の条件をモニ１する
ために特に有用でるる。

酵素β−Ｄ−グルコシダー−ｔｆはＢ、８ｕｂｔｉｌｉ
ｓ　（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　　から１ＡＴＯＯ９
６７２’″と市販される）に見出された。

別法として、分離さｎた酵素が使用され、又μ酵素の供
源として使用される微生物が天然の汚染物より滅菌状態
に対してＬ９耐性でない場合には、滅菌条件をモニタす
るために通常に使用される別の微生物が酵素供源と共に
ｇｍサイクルに置かれる。再び、この場合には、本発明
の方法は水性栄養培地と共に戚−サイクル後に残って生
き（いる微生物ｔ−培養して１ｌＩｌｃ函効能を確認す
る工程を含む。

主として単一酵素及び／又は微生物棟に関し℃ここで記
載したが、本発明は同様に複数の＃木及び／又は微生ｆ
Ｉ徊の使用を言及すると了解されるべきでめる。例えば
、単一滅−インジケータは６樟の分離した＃索（これは
６櫨の微生物から靜導できる）を富有でさ、一つの酵素
μ熱に耐性で６９、第２はガス状滅菌媒体に耐性でるり
、第６は放射線、例えば、γ線及び−一に耐性である。

同様に、単一滅鉋インジケータは６ｍの憾生物を含有て
き、一つの麺は熱に耐性でめり、第２の撫はガス状畝凶
媒体に耐性でめり、セして第６の種は放射線に耐性でめ
る。

この出願の文脈におい℃、ｒ！＃紫基質システムは酵素
により作用されそして酵素変性生成物に変換される、物
質又゛は物質の混合物と定義される。−般に、酵素変性
生成物は発光性、′Ｅ１１元注、討色性、又は放射性の
物質である。しかしながら、この酵素基質システム１２
酵素と反応しｆｃ時に、付〃口的化合物又は組成物と反
応して発光性、蛍元注、層色注、又は放射性物質を生ず
る化合物からなる。好ましくに、基質システムが滅ｌ中
インジケータ装置に言まｎるべき噛合には、この基質は
戚−又は培養の間自然に破壊し又は検出ｉＪ能な生成物
に変換してはならない。例えば、蒸気及び乾熱滅菌をト
ジ モニタするため便用する装濾では、この基質に約２Ｕか
ら１８０’Ｏの間の温度で安定でなｆｆ３ばならない。

好ましくはまた、酵素基質システムが従来の成長培地に
含まｎるべき４台には、！Ｈ，長培地中で安定でなげｎ
ばならず、例えば成長培地中で自己重元金元してはなら
ない。

従来技術は公知でめり、市販されセして徂々の＃本工程
で使用さｎでいる、種々の起源の＃累の検出のための多
数のｉｉ光発生及び呈色性基質を含む（Ｍ、Ｒｏｔｈ　
、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　
Ａｎａｌｙｓｉｓ。

第１７巻、Ｄ、Ｂｌｏｃｋ　＠　、工ｎｔｅｒｓｃｉｅ
ｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ。

ニューヨーク、１９６９年、第１８９頁；８、Ｕｄｅｎ
ｆｒｉｅｎｄ、、　　Ｆｌｕｃｒｅｓａｅｎｃｅ　　ム
５ｓａｙ　　ｉｎ　　ＢｉｏｌｏｇｙａｎｃｌＭｅｄｉ
ｃｉｎｅ　、ムｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅａａ、　ニュー
　ヨーク、１９６２年、第６１２貞；及びり、Ｊ、Ｒ，
Ｌａｗｒｅｎｃｅ。

”　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｊｌｉｎｚｙｍｏｌｏｇｉｓｔ”及
びＮ、Ｏ，Ｋａｐｌａｎ　、編、ムａａｄｅ＋ｎｉｃ　
Ｐｒｅｓａ、　＝　ｚ　−ヨーク、１９５７年、第１７
４頁、ここで参煕として挿入する）。特定の酵素の検出
に対して記載される二つの基本型式の酵素基質システム
がある。

第一型式の基質システムは蛍光発生又は呈色性のｆｌ’
Ｊ　ｎかで、ムＢのような化学式が与えらｎる。酵素に
より作用される時には、Ａ＋Ｈに分解する。

例えば、Ｂは蛍光性又は呈色性で６る。この槙の蛍光発
生基質の時定例は４−メチルウムペリフエリルホスフエ
ートでめる。酵素ホスフェートの存在で、基質は４−メ
チルウムベリフエロン及びホスフェートに分解する。こ
の種の他の蛍光発生基質は４−メチルウムベリフエリル
、７−アミノ−４−メチルクマリン、インドキシル及び
フルオレシンの誘導体１に言み、下記に列挙する。この
徳の呈色性基質の例は５−プロモー４−クロロ−６−イ
ンドリルホスフェートでロル。ホスフェートの存在で、
基質はインシイデル−及びホスフェートに分解する。こ
の種の他の呈色性基質は下記に列挙する、５−デ四モー
４−クロロ−６−インドリル、ニトロフェノール及ヒフ
エノール７ｐｖインの誘導体を含む。

酵素の検出のために通常に使用される第２ｍの基質シス
テムは化学式ＣＤで与えられ、こｎは例えば特定の酵素
によりＯ＋Ｄへ変決できる。しかしながら、Ｃ又はＤは
何ｎも蛍光性又は呈色性ではないが、Ｄｒｓ、史に化合
物２と反応して蛍光性又は呈色性化什物を生ずることが
でき、かくして酵素活性を示す０この桓の特定の蛍光発
生例はアミノ酸リシンでるる。＃索すシンデカルボキシ
ラーゼの存在では、リシンｑ　ｃｏ２の分子金失う。次
にリシンの残りの部分はカダベリンと称され、これは強
塩基性である。４−メチルウムベリフエロンのような塩
基性インジケータが配合されそして強塩基の存在で蛍光
を発す。この種の呈色性基質は２−ナフチルホスフェー
トである。放出されたβ−ナフトールは８１ｇｍａ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌからの＠Ｐａ５ｔＢｌｕｅ　ＢＢ　５ａ
ｌｔ″として市販の、１−シアｆ−４−ベンゾイルアミ
ノ−２，５−ソエトキシベンゼンを金石する呈色性試薬
と反応して紫色を生ずる。

この槙々の他の例全下記のナフチル防導体の下に夕１］
挙する。

かくして、前記から種々のアプローチを弁じ℃微生物中
の時定の酵素の存在全測定することが可能でろることが
在高に昭めｌ１ｌ）ｎる。

好適な＃累基質システムは例えば加水分解により酵素で
変性さｎてかなシ変注さｎた又は蛍光を増加させた酩碑
体フルオロフォールを生ずることができる化合物として
ここで定義される蛍光発生体でるる。

この重光光生化曾物ζ七を自体非蛍元注又にメタ蛍光性
（戸１ｊち、対応する酵素に住生成物より、例えば色彩
又は強度の何れかにより、明確に異なる方法で蛍光性）
の倒れかで６９そして蛍光社測機器の使用者に周知の方
式で、励起と検出の適当な波長を使用して存在する他の
蛍光から酵素変性により生じた蛍光信号を分離する。

従来技術は公知であり、ＴｉＪ販さｎそして酵素学的方
法に使用される植々の起源の＃素のための多数の蛍ｆｔ
、発生基質を甘む。これらの中には棟々の蛍光発生４−
メチルクムベリフエリル誘導体（４−メチルウムベリフ
エロンへ加水分解できる）；４−アミｌ−”−４−メチ
ル−クマリンの誘導体、例えば、ドイツ国％計第１，５
４７，７４７号及びヨーロッパ％肝第Ｕ、０００，０６
５　（味の素）、両特許はここで診照として挿入　；　
ゾアセチルフルオレスセイン誘導体；及びフルオレスカ
ミンがある。

有用な４−メチルクムベリフエリル肪導体金下記のもの
１−甘む： ４−メチルラムベリフェリルー２−アセドアξド−４；
６−０−ベンジリデン−２−デオキシ−β、−Ｄ−グル
コピラノシド； ４−メチルウムベリフエリルアセテート；４−メチルウ
ムベリフエリルーＮ−７セチルーβ−Ｄ−ガラクトサミ
ニド； ４−メチルラムベリフェリルーＮ−アセチル−ａ−Ｄ−
グルコサミニド； ４−メチルラムベリフェリルーＮ−アセチル−β−Ｄ−
グルコサミニド； ２’−（４−メチルラムペリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−
アセチルノイラミニツリ酸： ４−メチルクムペリフエリルα−Ｌ−アラビノフラノシ
ド； ４−メチルクムベリフエリルα−Ｌ−アラビノシＰ；４
−メチルウムベリフエリルグチＶ−）；４〜メチルウム
ベリフエリルβ−Ｄ−セロピノシト；メチルラムペリフ
ェリルβ−Ｄ　−Ｎ　、　Ｎ’−ジアセチルキト上オシ
ド；４−メチルウムベリフエリルエライデート；４−メ
チルウムベリフエリルβ−Ｄ−フコシド；４−メチルク
ムペリフエリルα−Ｌ−フコシド；４−メチルウムペリ
フエリルβ−Ｌ−フコシド；４−メチルラムペリフェリ
ルα−Ｄ−がラクトシト；４−メチルクムベリ７エリル
β−Ｄ−ガラクトシド；４−メチルウムベリフエリルα
−Ｄ−グルコシド；４−メチルクムベリフエリルβ−Ｄ
−グルコシド；４−メチルウムベリフエリルβ−Ｄ−／
’ルクロニド；４−メチルウムベリフエリルｐ−グアニ
ゾノベンゾエート；４−メチルウムベリフエリルへブタ
ノエート；４−メチルウムベリフエリルα−Ｄ−マンノ
ピラノシド；４−メチルウムベリフエリルβ−Ｄ−マン
ノピラノシド；４−メチルクムベリフエリルオレエート
；４−メチルワムベリフエリルバルミｆ−）；４−メチ
ルウムベリフエリルホスフエート；４−メチルウムベリ
７エリルプロビオネ−）；４−メチルウムベリフエリル
ステアｖ−）；４−メチルウムベリフエリルサルフエー
ト；４−メチルラムペリフェリルβ−Ｄ　−Ｎ　、　Ｎ
’、Ｎ’−）リアセチルキトトリオーゼ；４′−メチル
ウムベリフエリル２，６゜５−トリー〇−ベンゾイルー
α−Ｌ−アラビノフラノシド；４−メチルラムペリフェ
リルーｐ−）リメチルアンモニウムシンナメートクロリ
ド；及び４−メチルウムベリフェリルβ−Ｄ−キシロン
ド。

有用な７−アミド−４−メチルクマリン紡導体μ下記の
もの′ｆｔ首む： Ｌ−アラニン−７−アミド−４−メナルクマリン；Ｌ−
プロリン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−チロ
シン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−ロイシン
−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−フェニルアラ
ニン−７−アミド−４−メチルクマリン；＆ぴ７−／’
ルタリルーフェニルアラニン−７−アミドー４−メチル
クマリン。

７−アミド−４−メチルクマリンの有用なペゾチド訴導
体は下記のものを含む： Ｎ　−ｔ　−Ｂｏｏ　−Ｘ１ｅ−Ｇｌｕ　−Ｇｌｙ　−
Ａｒｇ　７−アミド−４−メチルクマリン；　Ｎ　−ｔ
　−ＢＯＣ−ＬθＵ−８ｅｒ　−Ｔｈｒ　−Ａｒｇ７−
アミド−４−メチルクマリン；　Ｎ　−ＯＢＺ　−Ｐｈ
ｅ−ムｒｇ７−アミドー４−メチルクマリン；　Ｐｒｏ
　−ｒｈｏ　−Ａｒｇ　　７−アミド−４−メチルクマ
リン；　ＩＪ　−ｔ　−ＥＯＣ−Ｖａｌ　−Ｐｒｏ　−
Ａｒｇ７−アミド−４−メチルクマリン；及び１−グル
タ＝ｈ　−Ｇｌｙ　−Ａｒｇ７−アミド−４−メチルク
マリン。

有用なゾアセチルフルオロスセイン紡導体はフルオロス
セインジアセテート、フルオロセインジ−（β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド）、及びフルオロスセインジラウレー
トを冨む。

その活性が検出されるべき酵素が、例えば、Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　ａｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからの
ａ−Ｄ−グルコシターゼ、キモトリプシン、又は加肪敵
エステラーゼでるる男合には、蛍光発生＃索ｆｉ負に最
も好ましくは各々４−メチルクムベリフエリルーα−Ｄ
−グルコシド、７−ゲルタリルフニエルアラニンー７−
アミドー４−メチルクマリン又は４−メチルクムベリフ
エリルヘ！タノエートでめる。

その活性が検出される酵素が、例えは、Ｂａｃｉｌｌｕ
θ５ｕｂｔｉｌｉｓから誘導されるα−Ｌ−７ラビノフ
２ノシダーゼである場合には、最も好適な酵素基質は４
−メチルクムペリフエリルーα−Ｌ−アラビノフラノシ
ドでろる。その油性が検出されるべき＃木が、例えば、
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　７）ｚらｖｊ導
された、β−Ｄ−グルコシダーゼでるる場合には、最も
好適な蛍光発生酵素基質は４−メチルウムベリフエリル
ーβ−Ｄ−グルコシドでめる。

別の有用な酵素基質システムは誘導体発色団を生ずるよ
うに酵素で変性できる呈色性化合物、又は他の化合物と
反応して発色団が異なる又はより強い色彩を有する誘導
体発色団を生ずる生成物である。この呈色性化什物はそ
扛自体着色さｔず又は対応する酵素変性生成物より、例
えば色彩又は強度で、明らかに異なって着色されると了
解される。比巴討機器の使用者に周知の方式で、励起と
検出の適当な波長を使用し℃存在する他の色彩から酵素
変性により生じた着色信号を分離する。

多数の呈色性物質が酵素学的方法に使用されている。有
用な呈色性物質の中には５−ゾロモー４−クロロ−３１
ンケリルｕ４体；ニトロフェニル誘導体；インドキシル
訪導体；及びフェノールフタレイン酵導体が少る。

；ｆｌｌｅ５−ゾロモー４−クロロ−６−インドリル誘
導体は５−ゾロモー６−クロロ−６−インドリルアセテ
ート、５−ゾロモー４−クロロ−６−インＰリルアセテ
ート、５−ゾロモー４−クロロ−６−イントキシルーβ
−Ｄ−ノＩラクトビクシノト、５−７”ロモー４−クロ
ロー５−インケリルー１．６−ジアセテート、５−ゾロ
モー４−クロロ−６−インドリル−β−Ｄ−フコピラノ
シド、５−フロモー４−１０ロー５−インドリル−β−
Ｄ−グルコピラノシド、５−プロモー４−クロロ−６−
イントリルーーーＤ−グルクロン酸、５−プロモー４−
クロロ−５−インドリルホスフェート、及び５−ゾロモ
ー４−クロロ−６−インｒリルサルフエートを含む。

有用なニトロフェール誘導体はｐ−ニトロフェノール及
び０−ニトロフェノール酩導体ｋｆむ。

特に有用なｐ−二トロフェノールＣニジエチル−ｐ−ニ
トロフェニルホスフェート；　Ｅ’　−Ｐ−二トロフェ
ニルホスフエート；ｐ−二トロフェニル−２−アセトア
ミＰ−２−デオヤシー６−ｏ−β−ガラクトピラノシル
ーーーグルコビラノシドｐ　Ｐ　−二トロフエニに−２
−アセドアイド−２−デオキシーβ−グルコヒラノシド
；ｐ−ニトロフェニルアｔテート；ｐ−ニトロフェニル
−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−／”ルコサミニド；ｐ−ニト
ロフェニル−β−Ｄ　−Ｍ　、　Ｍ’−ジアセチルキト
ビオシド；ｐ−二トロフエ二ルーα−グルコピラノシド
；　ｐ−ニトロフェニル−α−マルトシド；ｐ−ニトロ
フェニル−β−マルトシド；ｐ−二トロフェニル向α−
マンノヒラノシド；ｐ−二トロフェニルーβ−マンノピ
ラノシド；ｐ−ニトロフェニルミリスナート；ｐ−二ト
ロフェニルバルミ７　　ｈ　＊　ｐ　−二トロフェニル
ホスフエート；ビス（ｐ−ニトロフェニル）ホスフェー
ト；）’Ｊヌ（ｐ−ニトロフェニルサルフェート；ｐ−
ニトロフェニル−β−クルコピラノシド；ｐ−ニトロフ
ェニル−β−グルクロニド；α−ｐ−ニトロフェニルグ
リセリン；ｐ−ニトロフェニル−α−ラムノピラノシト
；ｐ−ニトロフェニルスフ　７１／　　）　；　Ｐ−ニ
トロフェニルサルフェート：ｐ−ニトロフェニル−２゜
３．４．６−テトラ−０−アセチル−β−グルコサミニ
ド；ｐ−ニトロフェニルチミジンモノホスフェート；ｐ
−ニトロフェニル−２，５，４−トリー〇−アセチルー
β−グルクロン酸メチルエステル；及びｐ−二トロフェ
ニルバレレート’ｋ　Ｋ　ｂ。

特に有用な０−ニトロフェノールはＯ−ニトロフェニル
アセテート、０−ニトロフェニル−β−グルコシド及び
０−ニトロフェニル−β−Ｄ−／”ルコビラノシドヲ言
む。他の特に有用なニトロフェニル誘導体はニトロフェ
ニル−β−フコピラノシド；ニトロフェニル−α−がラ
クトピラノシド；ニトロフェニル−β−がラクトピラノ
シｒ；ニトロフェニルデチレート；ニトロフェニル力！
レート；ニトロフェニルカソロエート一二トロフェニル
力ｒ　ＩＪレート；ニトロフェニルラフレート；及びニ
トロフェニルプロピオネートｋｆｔｒ。

有用なインドキシル′ｅｇ導体はインドキシル−アセｆ
−）；（ンドキシルβ−Ｄ−グルコシＰ；６−イントキ
シルサルフエート；６−インドリルホスフェートγ言む
。

有用なフェノールフタレイン誘導体はフェノールフタレ
インゾプチレート；フェノールフタｖインシホスフエー
ト；フェノールフタンインシサルフエート；フェノール
フタレイングルクロン酸；フェノールフタレインモノ−
β−グルコシドウロンｇＩＩ；フェノールフタレインモ
ノ−β−グルクロン叡；及びフェノールフタレイン七ノ
ーホスフェート　自：貧む。

前記の呈色性物質のすべてが適当な酵素と直接に反応し
℃発色団金生ずる。

誘導体酵素変性生成物が更に呈色性試剤、例えは、１−
シアｒ−４−ベンゾイルアミノ−２，５−シェドキシベ
ンゼン（８１ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌから“ＩＦａｓ
ｔ　Ｂｌｕｅ　ＢＢ　５ａｌｔとして市販）、１−シア
シー４−ベンゾイルアミノ−２，５−ジェトキシベンゼ
ン、ｐ−ジアゾ−２，５−シェドキシ−Ｎ−ベニｙ　ｆ
　イア　ラニン、４−クロロ−２−メチルベンゼンシア
ゾニウムクロリド、及び０−アミノアゾトルエンゾアゾ
ニクム塩と反応して元色団を生ずる場合には１−ナフチ
ル、２−ナフチル及びナフチル−Ａｓ−Ｂ１訪導体を貧
有する別の酵素基質が有用に使用される。

特に有用な１−ナフチル誘導体は１−ナフチル−Ｎ−ア
セチル−β−Ｄ−グルコサミニドｔ−５ｔｒ。

特に有用な２−ナフチル誘４坏は２−ナフチル−ホスフ
ェート；２−ナフチル−フチレート；２−ナフナルーカ
プリｖ−ト；２−ナフチル−ミリステート；Ｌ−ロイシ
Ａ−−２−ナフチルアミド；Ｌ−／４リルー２−ナフチ
ルアミｒ；Ｌ−シスチル−２−デフナルアミド；Ｎ−ベ
ンゾイル−ＤＬ−アルギニン−２−ナフチルアミド；Ｎ
−グルタリル−フェニルアラニン２−ｔフチルーアミン
；２−ナフチル−ホスフェート；　６−　Ｂｒ　−２−
ナフチル−α−Ｄ−がラクトピラノシド；２−ナフチル
−βＤ−ガラクトーピラノシド；２−ナフチル−２−Ｄ
−グルコピラノシド；６−プロモー２−ナフトール−β
−Ｄ−グルコピラノシＹ；６−ｆロモー２−ナフチル−
２−Ｄ−マンノピラノシト；及び２−ナフチル−α−Ｌ
−フコピラノシド金言む。

竹に有用なナフチル−Ａｓ−Ｂ１誘導体はナフチル−Ａ
ｓ−Ｂニーホスフェート；及びナフチルーム８−Ｂニー
β−Ｄ−グルクロニドを宮む。

その活性が検出されるべきｙｐ素が、例えば、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ｓｔｓａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから
のα−Ｄ−グルコシダーゼでるる場合には、呈色性酵素
基質は最モｌｌｆ　’！　Ｌ　＜　１１　ｐ−ニトロフ
ェニル−α−クルコビラノシｒでるる。その活性が検出
されるべき酵素が、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ
ｉｌｉａから誘導されるα−Ｌ−アラビノフラノシダー
ゼである場合には、最も好適な呈巴性酵素基質ン工ｐ−
ニトロフェニル−α−Ｌ−アラビノフラノシドでるる。

その活性が検出されるぺ＠酵素が、例えば、Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓａｕｂｔｉｌｉａから誘導されるβ−Ｄ−グルコ
シダーゼでるる場合には、最も好適な呈色性酵素基質は
ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコｔう／ンドでめる
。

本発明の方法を実施するために、その活性が検出される
べき酵素、及び螢光、色彩等により検出できる庄成物を
生するように酵素と反応する酵素に関して操作名が熟仰
していることが必須である第７６．　　Ｄ、Ｇ１００ｋ
　＠、　　工ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｅｒｓ。

ニューヨーク、Ｎ、ｙ、１９６９に児よ。ここで参照と
して挿入する）。使用される適当な酔紮基質はその活性
が検討中の酵素の累注に１って異なる。

下記のものは多数の好適な螢光発生及び呈色性酵素基質
及び基質と反応してかな９ｆ、注した又は増大した螢光
又は色彩全封する庄成物金生ずる酵素のリストである。

基　質　　　　　　　　　　横皺された酵素４−メチル
ウムペリフエリルアセテート　　エステラーゼ４−メチ
ルウムペリフエリルブチレート　　エステブーセ゛４−
メナルウムベリフエリルエライテート　リパーゼガラク
トピラノシド ダーゼ Ｐ−ニトロフェニルアセテート リパーゼ エート ４−メチルウムペリフエリルオレエート４−メｆルウム
ペリ７エリルホス７エート４−メチルウムベリフエリル
プロピオ ネート リパーゼ 酸又はアルカリホス ファダーゼ エステラーゼ Ｐ−ニトロフェニルラウレート Ｐ−ニトロフェニルミリステート Ｐ−ニトロフェニルパルミテート エステラーゼ エステラーゼ エステラーゼ フェノールフタレインゾゾチレート エステラーゼ ｐ−ニトロフェニルホスフェート アルカリ又は酸ホス ファダーゼ Ｃｉ フェニル−β−Ｄ−がラクトピラノシドフェニル−β−
Ｄ−グルクロニド フェニル−７１−Ｌ−グルコピラノシドフェニル−β−
Ｄ−グルクロニド ７−Ｄ−ガラクトク ダーゼ β−Ｄ−グルクロニ ダーゼ β−Ｄ−グルコシダ ーゼ β−Ｄ−グルクロニ ダーゼ Ｎ−グルタリル−フェニルアラニン−２−ナフチルアミ
ン ナフチル−／８−Ｂニーホスフェート インドキシルアセテート Ｎ−メテルイ／ドキシルアセテート Ｎ−メチルインドキシルミリステート ｂ−プロモインドキシルアセテート キモトリプクン ホスフオヒドララー ゼ ９１４−ゼ リパーゼ リパーゼ リパーゼ ナトリウム１−す７チルホス７エート ナトリウム２−ナフチルホスフェート ２−す７チルーブテレート β−す７チルアセテート 酸又はアルカリホス ファダーゼ 酸又はアルカリホス ファダーゼ エステラーゼ リノぐ一ゼ テート 一セ゛ ｍ巣とでの適当な酵系基質を緩爾水浴欲甲で反応させる
。この叡働凝液のイオン条件は酵素と酵素基質が影臀さ
れないものであるべきでるる。好ｌしくに、等張緩両液
、例えは、ホスフェート緩衝塩溶液、トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン−ＨＣｊ溶液、又はアセテート
緩衝液が選択される。これらの好適な等張緩衝液は殆ど
の螢光発生及び呈色性＃素基質と相和性である。緩衝液
を選択する際に他に考慮することは酵素活性に対する影
響である。例えば、ホスフェート緩衝塩はアルカリホス
フェートの強い競争的阻害剤である、高濃度の無機ホス
フェ−）１−含有する。この酵素に対して、それ故に、
トリス−Ｈｃ！緩衝液が勧められる。

反応混合物中に存在する＃累基質の濃度は特定の基質と
酵素の素性、可視又は器真の何れかによシ検出されるべ
く生じなげればならない酵素−生成物の量、活性酵素が
反応混合物に存在するかどうかを測定するために気分工
く待たれる時間の量に応じて異なる。好ましくμ、酵素
基質の量は少なくとも１　×１０”−８モルの酵素変性
生成物が生ずるように、滅菌後に約８時間以内に存在す
る残りの活性酵素と反応するのに十分である。＃率基質
が４−メテルクムベリ７エリル酵導体である場合には、
緩衝水溶液中のその濃度は好ましくは約１Ｘ　１０−６
からｉ　ｘ　ｉ　ｏ−″３モルの間であることが判明し
た。

ま九酵素基質を含Ｍする水浴液は好ましくは若干の塩基
性像光発生基質の自己螢光を阻止するために、約５．０
から９．５、好ましくは約７．５の−に調節される。

緩衝７に溶液中の酵素基質は酵素供源が減餉を受けた後
にその活性が検出されるべ′＠＃素供掠と共に培養され
る。

一定時間の間そして酵素の何れかが活性のままであると
の仮定で、検出可能量の酵素変性主成物を放出するのに
十分な条件下で培養七続ける。′−般に、公知の方法に
Ｌ夛検出可能である生成物の量は少なくともＩ　Ｘ　ｉ
　Ｏ−’モルである。好ましくは、培養条件は少なくと
もＩ　Ｘ　１０−８モルの酵素変性組成物、史に好まし
くは約１　Ｘ　１０−’から１　×１０−’モルの酵素
変性生成物を生するのに十分である。検出可能蓋の酵素
変性生成物を生するのに必要な培養時間と温度は酵素と
基質の素性、及び反応混合物に存在する各々の濃度に応
じて異なる。一般に、必要な培養時間は酌１分から１２
時間であり、そして約２０ρ島ら７０℃である。好は、
必要な培養時間に各々約１０分から６時間であり、そし
て必要な培養温度は約３０η為ら４０℃、そして約５２
から６５℃である。

生化学的分析で使用できる酵素変性生成物全検出するた
めに一般に適用できる方法は比色、電圧測定、質ｆ測定
、熱量測定、伝導度測定、及び電流測定の技術ｔ−宮む
。不発明の目的に対して、検出可能な酵素変性生成物を
測定する螢光測定法及び分光側定法が適している。例え
は、特定の酵素基質社酵素と相互作用でウムベリフエロ
ンを生ずる４−メチルウムベリフエリル鋳等体を含み、
これは螢光劇定でモニタされ、又は基質は酵素と相互作
用で着色した生成物を生するニトロフェノールを含み、
これは比色法でモニタされる。

本発明の方法は酵素活性の非常に迅速な検出を許し、こ
れを使用して微生物の生存を許す条件、たくして滅菌効
能を予言できる。使用した酵素測定試験は一般に比較的
短い時間、例えは、約１０分から約６時間まで、通常に
はわ３０１１ら約９０分の培養のみ會必要として、例え
ば、分光測光にＬる検出のために十分な酵素変性生成物
を供する。

最も単純な形では、不発明の方法を実施するのに有用な
滅菌インクケータは敢体不透過性及び笑買上ガス非吸収
性の壁ｔ−有する容器内に活性酵素の供源を含む。この
容器は少なくとも一つの開口′ｌｔ有して滅菌媒体が酵
素と接触する牟会令ことを許しそしてガス透過性、Ｉｖ
８１菌不浸？ｉ性装置が開口を情う。任意に、このイン
クケータは容器内に下記のものを含む： １）酵素の俳弁として、又はｗｌ、素の伊源に加えての
何れかで、滅菌効能をモニタするために通常に使用され
る微生物； ２）単一で又は滅鉋劇性微生物と組合わせて、活性酵素
の供源で禎１＊嘔れるキャリア；６ノ活性＃素のための
基質及び＃素と七の基質のための水性反応媒体；及び ４）滅菌耐性微生物が使用される場合には、栄養成長培
地及び成長イン７ケータ。

本発明の実施に有用な酵素が滅菌耐性微生物の代シに又
はそれと共に含まれる場合には、米国特許第３．？）　
４６．４６４号；第３．５８　ｂ、１１２号；第３．８
４６．２４２号；第４．２９１．１２２号′　　　　　
　−第４．４６１．８３７号第４．４１６．９　Ｂ　４
号°第４．５９６．７７３号第３，４４０．１４４号：
第４．５２８．２６８号第２．８５４．３８４号；第３
．２３９．４２９号第３．７５２，７４３号゛第４．３
０４．８６９号第４．５７９．８２３号；及び第４．５
８０．６８２号に記載されるものに類似の滅菌インジケ
ータを有用に使用できる。

下記の説明に出願人の好適具体例に回けられている。下
記の装置の多くの変型が司能であり、それにもかかわら
ず、これらは本発明の範囲内に入る。

ここで第１１及び第２図に言及すると、′５Ａ質上ガス
非吸収性及び液体不透過性壁１２と開放端部１４會有す
る、円筒状管１０の形で外側容器を有する好適滅菌イン
ジケータを示す。管１０を酵素キャリア１６、例えば、
予め決めた量の活性分離酵素及び／又は予め決めた数の
生存の微生物を保持する濾紙のストリップ含金む。管１
０はまた通常に密刺され、圧力開放できる内＠容器１８
、例えば、緩衝Ｘ溶液中に溶解式れ又は懸濁された好適
な酵素基質上含有しそして任意に水性栄養成長培地を含
む、廐れ易いガラスアンプル上官む。好ましくは、この
酵素基質に約２０から１８０℃の温度で安定でｔり９そ
して活性酵素と反応して発光性、螢光性、層色性又は放
射性物質金主ずることができる。水性栄養培地は培養で
生存の微生物と接触する時にその成長を促進できる。内
９Ａ’Ｊ器１８は好ましくは外側容器１０内にびった９
と保持され、この丸め外側容器の容積のごく僅かが非占
有のままである。ガラスアンプル１８は　紙キャリア１
６にエフ管１０の壁１２から分離される。

管１０の開放端部１４に沫シートのようなガス透過性、
細菌不浸透性閉鎖部材２２が設けられる。

このシート２２は例えは、熱又は接着剤シーリングにニ
ジ、又は閉鎖装置２６、例えば、中ｔ−通した孔２８ｔ
−有するキャップ（第１図に外して示す〕によって管の
開ｍ地部１４にシールできる。ガス状滅菌剤で滅菌の間
に、ガス状滅菌剤扛シート２２全透過していて外側容器
の内Ｍ１通過して酵素キャリア１６と接触する。

第２因に示すように、第１図の装置は管１０の開放熾部
１４の中に活性酵素キャリア１６と壊れ易いガラスアン
プル１ｓｔ−続いて挿入するそして開放端部１４の上に
シート２２を１１Ｌき、管１０と密に接触してシートの
２２の上にキャップ２６ｔ−配置することによってシー
ト２２で管の開放端部全４ａ鋼することによυ容易に組
立てられる。

外側容器１０は蒸気滅菌器で生ずる高温に耐性である材
料から作られる。通常の蒸気滅菌器は一般に１２１−１
３５℃のオーダーの温度に達する。

更に、容器１０の壁は気体及び献体に実質上不透過性で
なければならない。生存の微生物又は活性分離酵素で覆
われ、そしてそこで残留活性酵素が圧力開放できる内側
容器１８中に含まれる酵素基質と反応するキャリアｌｔ
ｌ含有する外側容器に好ましくは半込明であり（＠透明
“全含む）、このため螢光と色彩の変化はインジケータ
装置を分解することなく可視的に観察される。また、好
ましくは、外側容器１０は十分に変形可能であり、この
ため外部圧力を使用して外側容器１０を変形する時に圧
力開放できる内側容器１８が破Ｉｌ嘔れる。ポリカーボ
ネート、ポリプロピレン、ポリアミｒ１ポリメチルペン
テン及び種々のポリエステルを含む適当な材料を射出成
形し又は押出すことにエフ容器１０ｔ−表造できる、こ
れらの材料は蒸気又は乾熱滅菌サイクルに対して十分に
耐熱性、ガス状滅菌培地に非吸収性、液体不透過性、半
透明性又は透明性そして変形可能である。

滅菌温度に耐性である任意の材料ρλら閉鎖装置２６４
ａ造できる。容器１０の場合の工うに、好適な材料はポ
リカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリメ
チルペンテン及び種々のボリエステルを含み、ポリプロ
ピレンが好適である。

本発明に使用される活性分離酵素及び／又は微生物は通
常には適当なキャリア１６上に保持される。し７Ｉ為し
ながら、この酵素及び／又は微生物は外側容器１０の内
壁又は内側容器１８の外壁により保持されることが意図
される。し７）ｈしながら、好ましくは、分離酵素及び
／又は微生物は同一の又は別の＃素キャリアに保持され
る。この酵素キャリアは好ましくは水吸収性、例えｄ％
濾紙でありそして微生物成長又ｉｒ、ｍ素活性″Ｉｔ阻
害すべきではない。シート状材料、例えは、布、不織ポ
リプロピレン、レーヨン又はナイロン、セして微孔性重
合体材料が特に好適である。しかしながら、金属ホイル
資質、例えは、アルミニウム又はステンレス鋼、遍びに
ガラス（例えは、ガラスピーズ又はガラス繊維）、磁器
、又はグラスチックの物質を使用できる。更に、プラス
チック又はガラス裏張クストリップに同着された厭の工
うな材料の組合わせからこの酵素キャリアを製造できる
。

再現性１１−罹災にする九めに、外側容器１０は予め決
めた量の活性酵素を含有することが望ましい。

これはタンパク質稍剣の一般的方法、例えば、ここで参
照として挿入する、ｃｏｌｏｗｉｃｋ、　８及びＫａｐ
１＆ｎ　＃ｐｒｅｓｓ　Ｉニューヨーク、第１−■巻、
（１９５７−１９６４）に記載される工うに、塩分側、
クロマトグラフィー及び鬼気泳動を使用して分離酵素で
容易に行なわれる。好ましくは分離酵素の初期濃度は約
Ｉ　Ｘ　１０−”から５　Ｘ　１０−”単位の間、更に
好ましくは約Ｉ　Ｘ　１０−８から５　Ｘ　１０−３単
位の酵素、そして最も好ましくは約ｉ　ｘ　ｉ　ｏ−’
から１×１０−３単位の間である。微生物を使用する場
合には、同様に予め決・めた大体の数の微生物を使用す
ることが望ましい。これは公知の容量胞子濃度′ｔ−有
する胞子懸濁！ｔ−１０！！！すること、小さい、予め
決めた容量の懸濁液を用いてキャリア１６（例えば、濾
紙）を湿らすこと、そしてキャリアを乾燥することに工
って細菌又はカビ類の胞子にｚ５行なわれる。この方法
にキャリア上に含まれる胞子の大体の数を容易に計算す
ることができる。

勿論、他の方法も使用できる。微生物を酵素の供源とし
て使用する場合にに、使用される微生物集団はこの微生
物中の酵素の活性に応じて異なる。

この酵素は培養条件及び微生物の系統選択に工っで異な
るが、微生物集団を調節することに工つて場合には、こ
の微生物は滅菌条件をモニタするために通常に使用漬れ
るｔのでなければならない。

これらの通常に使用される微生物は天然の汚染で見られ
る大抵のＷＪｊ！Ａ体より一般に数倍滅菌工程に対して
耐性である。好適な微生＊はＢａｃｉｌｌｕｓは、十分
な酵素を生ずるのに必要な微生物の数は約Ｉ　Ｘ　１０
８からＩ　Ｘ　１０”の微生物にＬ９供され微生物を活
性酵素の供瀞として使用する場合には、滅菌条件がイ／
７ケータ甲のすべての微生物を殺すのに十分であつ九か
ど５かを確認するために、検出可能な酵素変性生成物を
生ずるのに必要な時間の後に装置の培養を続けることが
でき、滅菌条件が滅菌器中のすべての物品ｔ″滅菌るの
に十分であったことを示す。微生物の成長が酵素試験の
結果ヲ礒關するため従来の方式で使用される含む、 別法として、分離酵素を使用し、又に活性酵素の供源と
して使用嘔れる微生物が天然の汚染体より滅菌条件に＝
９耐性でない場合には、滅菌条件−ｐ 全モニタするために通常に使用される別の俵生物金答器
１０内に含有できる。この装置では、分離酵素又は有用
な酵素が得られる微生物を便用して培８＆！後一般に約
１０分から３時間以内に酵素活性の説示が得られ、そし
て通常に使用される微生物を少なくとも約２４時間栄養
培地中で更に培養して酵素活性結果′に確認する、 適当な酵素基質の水浴液に正常には圧力開放できる内ｌ
１ｍ容器１８に含まれる。しかしながら、乾燥形の酵素
基質に酵素キャリア１６と共に外側容器１０内に含まれ
よう。実際に、活性酵素とその基質は同じキャリア１６
中に乾燥形で存在できよう。この構造では、内側容器１
８は好ましくは活性Ｓ累とその基質が反応するのに必要
な水性栄養培地金保頁する。

≦２ 好ましくに、滅菌をモニタするため通常に使用でｎる微
生物が装置中に含まれ（活性酵素の供源として、又は活
性酵素の供源の外に）そして従来の方法にエフ微生物生
存の確認が望まれる時には、内側容器１８は酵素基質の
水溶液及び栄養成長培地を含む。好ましくは、この栄養
成長培地は大抵の螢光発生及び呈色性酵素基質と相和性
であシそして酵素に対して競争的阻害剤で線ない。不発
明にπ用に便用される型式の栄養培地は当朶者に周知で
ある。好適な栄養培地の例は大豆−カゼイン温浸プロス
、流体チオグリコラート及びテキストローストリプトン
＜、　Ｄｉｆｃｏ　Ｌａ１）ＯｒｌＬｔＯｒｉｅＢ＋工
ｎｃ　）のＸ溶液である。グルコースなしで、変性し友
トリプシン処理大豆プロスペースが特に適している。

汚染を避けるために、この水性栄養培地は通常には内側
容器中に配置された後に滅菌される。生存微生物の存在
で色彩全変化す通常に公知の微生物成長イン７ケータは
好ましくは容器の少なくとも一つに存在する。この成長
インジケータ物質は好ましくは水性栄養培地に溶解性で
あり、そしてそれに色彩を付与しく微生物の成長で）、
このため色彩の変化を外側容器の半透明壁を通して容易
に観察できる。更に、好ましくは成長インジケータ物質
が＃素質性生成物の色彩又は発光を阻署しない工うにこ
の物質全選択する。本発明に使用できる成長インジケー
タ物質は当業名に周知でありそして一増感性染料インゾ
ケータ（例えは、ブロムチモールブルー　ブロムクレゾ
ール紫、フェノールレッド等）、酸化還元染料インジケ
ータ（例えは、メチレンブルー等）を含む。この物質は
通常には微生物成長の現象、例えば声、酸化還元電位等
における変化に応じて色彩で変化する。

酵素基質のＸ浴液を含み、そして／又は７に性栄養培地
を含む内側容器１８は気体と液体に不透過性である材料
から作られそしてそこに圧力の適用で開放して（即ち、
“圧力開放できる″）酵素基質及び／又は栄養培地が外
側容器に入ること許すことができる。この内側容器は好
ましくは壊れ易い材料、例えば、ガラスのものであり、
そして前記のように、好ましくは外側容器と接触関係で
外側容器内にきつちシと保持され、外１ｍｍ量器変形式
れる時に内９１谷器の破壊又は破砕金許す。別の具体例
では、内側容器をプラグで＠刺でき、このプラグを圧力
の適用で追い出すと内側容器の内容物全放出する。なお
別の具体例では、米国特許第４，３０４．８６９号に示
される工９に、閉鎖装置がアンプル破砕装置を内包し、
そこではこの閉鎖装置はその底部からのタデを有し、こ
れは閉鎖装置の沈下でアンプルを破砕するのに役立つ。

同様に本発明の装置は外側容器１０の底部に配置された
アンプル破砕ビン？！−有するシステムに使用できる。

この活性酵素含有外側容器１Ｇは甲に少なくとも一つの
開口に！して滅菌剤（例えば、蒸気、エチレンオキシド
）が滅菌中油性酵素の供源と接触することを許す。この
開口は通常ににガス透過性、細菌不浸透性装置で閉鎖さ
れ又は栓をされる。好適な装置は繊維材料、例えば綿、
ガラスウール、布；ポリプロピレン、レーヨン、ポリプ
ロピレン／レーヨン、ナイロン、ガラス又は他の繊維か
ら作った不織ウェブ、ｌＩ！紙、微孔性、＊＊＊及び装
本性フィルム、開放セル化重合体フオーム、及び半透過
性プラスチックフィルム、例えは米国特許第３．３４６
．６４４号に記載式れるものから作られる閉鎖部材２２
を含む。繊維状及びセル状材料はこの材料が滅菌ガスを
容易に透過するので好適である。好適な閉鎖部材の材料
は疎水性材料、例えば、ナイロンクエプ、微孔性疎水性
フィルム又はガラス繊維不織ウェブ金倉む。商品名”Ｃ
ｅ：ＬｇａｒｄＲＫ−４４２Ｍｉｃｒｏｐｏｒｏｕａ　
Ｆｉｌｍ　”として０ｅｌａｎｅｓｅ８ｅｐａｒａｔｉ
ｏｎａ　ＰｒｏｄｕｃｔａｓＣｈａｒ：ＬｏｔｔｅｓＮ
ｏｒｔｈ　０ａｒＯ１１ｎａ。

から市販の微孔性疎水性フィルムが特に適している。実
際に、繊維状又はセル状閉鎖部材は細菌及びカビ類に対
してフィルターとして役立ちそして約０．５ミクロン以
上の孔径を有すべきではない（例えば、約Ｏ，Ｓ　ミク
ロンよシ大きい寸法を有する粒子の通過を阻止すること
ができる）。別法として、この閉鎖装置はここで参照と
して挿入する米国特許第４．４６１，８３７号及び１９
８８．９．２７出願した共通に譲渡さｎ几米国特許出願
第２４ン、９８２号に記載されるように、細菌不浸透性
である曲がりくねった通路でも工い。

本発明の滅菌インクケータの好適具体例を第６図及び第
４図に例示する。この装置に実質上ガス非吸収性かつ液
体不透過性壁４２と開放端部４４を有する外側容器４０
を含む。この外側容器４０は圧力開放できる内側容器４
８全含み、これは好ましくは水性栄養培地と混合した、
好適な酵素基質の水溶液５（ｌ含有する。外ｌＢｌ容器
４０の開放端部４４はガス透過性、細菌不浸透性閉鎖部
材５２により覆われる。ここで、第１１８￥Ｊに示した
装置との類Ｏｔ江が終わる。第６及び第４図の装置では
、酵素キャリア４６μ外側谷器４０の底部閉鎖端部に配
置さｎ１セして障壁４７が酵素寄ヤリア４６と圧力開放
てきる内側容器４８の間にプラグのように配置される。

障壁４Ｔは好ましくは螢光発生酵素基質と共に使用のた
め非螢光性である材料、例えは、綿、レーヨン、ポリプ
ロピレン、ポリプロピレン／レーヨン混和物、ナイロン
又はガラスの工うな繊維から作られた不織ウェブから表
造される。最も好適な障壁４７は３　Ｍ　、　ｓｔ、Ｐ
ａｕｌｅ皿から市販の・Ｔｈ１ｎａｕｌａｔｅＲ２００
−Ｂ　ｂｒａｎｄＴｈｅｒｍａｌ工ｎｓｕ：Ｌａｔｉｏ
ｎ　”のようなポリプロピレン不織ウェブから作られる
。

障壁４７は内側容器４８７０λら酵素キャリア４６を分
離する丸めに役立ち、７）為＜シてアンプル４８がキャ
リア４６の上に配置される場合に冷スポットを排除する
。冷スポットの存在は酵素キャリア上で凝縮が集まるこ
と全引起こす。凝縮物はキャリア４６上に含まれる酵素
の活性に影響する。障壁４７は好ま、シくは＃７Ｘ性材
料から作られ、このため酵素変性主成物が酵素キャリア
の周りで凝縮しそして障壁の反対［１，上にある容器の
区域中ｒｃ急速に拡散しない。インジケータの低部分に
高績度の酵素変性主成物金保つことは酵素変性主成物が
発光性又は着色性の何れにせよ、キャリア４６が内側容
器４８の全内容物と反応しｆｃ場合よりも短時間の培養
後に酵素変性主成物が検出されることを可能にする。一
般に、例１に示し７′ｃ工うに、障壁４７を組込む好適
な装置はｆＪ１０分以内に滅菌効能に関して信頼し得る
情報を供する。このｖ４壁金利゛用しない類僚の装置＆
は信頼し得る滅菌効能情報を供するのに約２時間装する
。

閉鎖装置５６はトップ５７及びたれ下がる側壁５９から
なる。この開鎖装置は底部で開く中壁がデーを■し、閉
鎖装置の内径は外側容器４０の外側直径に大体等しく、
このため閉鎖ｇｃ置５６は外側容器４０の開放端部の上
に摩擦して接触される。

＠壁５６内には好ましくは複数の窓５８が切られる。イ
ン７ケータが滅菌されるべき装入物中に置かれる時に、
外側容器の外部Ｓｌｌ壁が窓５８をブロックしない＝う
な方式で閉鎖装置５６が外側容器中の開口の上に＆かれ
る。この位置では、滅菌器中の滅菌剤が窓５８′ｆｔ通
して流れることに＝つで容器４０に入る。滅菌サイクル
の完了時に、画鋲装置全押下けることによって十分に挿
入させて外側容器のｆ１９壁全トップ５Ｔの内部表面と
接触させ、これによって窓５８をブロックでき°る。次
に容器４０の内部を外部環境から密封する。

第５図及び第６図は本発明の滅菌インクケータの別の好
適具体例全売す。この装置は、第６図及び第４図の装置
のように、ガス非吸収性かつ液体不透過性壁Ｔ２及び開
放［Ｂｒ３を有する外側容器７０；好ましくμ栄養成長
培地と混会し九、酵素基質の７Ｘ溶液を含有する外側容
器７０内の圧力開放できる内側８′ａ７Ｂ：及びキャッ
プ８６により外［容器の開放端部の上に保持される、ガ
ス透過性、細菌不浸透性閉鎖部材８２ｍ−含む。外側容
器ＴＯ内の酵素キャリア７７は例えば、接着剤又は熱シ
ーリングにニジウィックストリップＴ６に結合される。

このウィックストリップ７６は任意の水吸収性材料、例
えば濾紙、布又はレーヨンから作られる、別に、プラス
チック又はガラス裏張スト〜Ｖツノに固着させた紙のよ
うに材料の組付せてこのウィックストリップヲ衷造でき
る。好ましくはポリエチレン塗被紙からこのウィックス
トリップ７６’ｅＦｌ製する。好ましくは、ウィックス
トリップの寸法とウィックストリップ上で酵素キャリア
の配置は内部容器が破壊された時に、甲の液体が外側容
器の低部分内で７１為つ酵素キャリア７７の下に含まれ
るようなものである。＃累基質水溶液はグ紮キャリア７
７までウィックストリップ７７で上に進む。ｒ！１１．
素質性生成物は酵素キャリア上で＠縮しそしてその存在
はキャリアが内側容器７８中に存在する全溶液にさらさ
れた場合Ｌ９も短い時間で検出される。

使用時にに、第６図及び第４図に示した滅菌インクケー
タを例えば、蒸気又はエチレンオキシドガスにぶり滅菌
されるべき多数の物品と共に滅菌器に入れる。このイン
クケータが滅菌器中にある時には、窓５８が開いて滅菌
剤が入ることができる工うに閉鎖装ｆ１５Ｂは開放位置
にある。ｆ＃、菌剤が罠に導入される時には、滅菌剤は
閉鎖部材５２を透過しそして障壁４７に通過して酵素を
不活性化しそしてキャリア４６上に存在する試験微生物
を殺す。滅菌サイクルの最後に、滅菌剤を濾過された空
気と交換する。滅菌インジケータを滅菌器から引出し、
窓５８ｔ−ブロックするように閉鎖装置５６會十分に挿
入し、そして例えば、指圧によりガラスアンプル４８を
破壊して酸素基質の水溶液と栄養成長培地が酵素キャリ
ア４６と接触することを引起こす。次にこのインクケー
タを好適な培養環境に置く（例えば、インクケータを約
１０分から２時間約５６°Ｇで培養する）。滅菌剤で不
活性化されない酵素はその基質と反応して、好ましくは
看已した又は螢光性の＃素質性生成物を生ずる。色彩又
は螢光における変化の発生は外側容器４０の半透明壁４
２′ｔ−通して観察され又は分光測光法で測定され、そ
してこの滅菌サイクルがキャリア４６上のすべての活性
酵素を不活性化しなかったことを示す。活性酵素がある
ことは試験微生物の生存及び結果の副生物全予想しそし
てこの滅菌サイクルが多分滅菌器中の物品全完全に滅菌
するのに多分不十分であったことを示す。色彩又は螢光
における変化がないことはこの滅菌サイクルがキャリア
４６上の酵素のすべてを不活性化するのに十分であつ几
こと、そしてそれ故に、滅菌器中の物品を滅菌するのに
十分であったことを示す。装置を史に培養して（約２４
カ為ら４８時間の間５６℃で）、試験微生物生存の先の
予想を成長な方法は不発明で記載した装置の特に設計さ
れた蛍光計である。蛍光計は低レベルの螢光主成物とバ
ックグラウンド又は螢光なしの間で可視的に差別しょう
とする時に生ずる主観的解釈を排除する。

−足の培養時間内に最少量の螢光生成物を検出するよう
に蛍光計を目盛シ調整できる。

本発明の装置に使用のため設計された特に好適な蛍光計
は内部の酵素キャリアが３６５　ｎｍ波長の紫外線で照
射され、そしてホトダイオードが４６０ｎｍ＠長餉域で
結果の螢光を検出できるように、インジケータの外側容
器を配置する間、周辺光をブロックする工うに設計され
た呈〃為らなる。

この蛍光計は少なくとも１．ＯＸ　１０−５Ｍ　４−メ
チルウムペリフエロンを検出するように目盛調整される
。

非螢光又は陰性の装置から螢光陽性の装ａを差別する幾
つかの方法上使用できる。第一のアプローチでは、ｌＸ
１０”−’Ｍ４−メチルウムペリフエロンに１９庄じた
螢光に等しい螢″ｙｔ、閾値限界を蛍光計に硲立する。

酵素キャリアが例えば、１５分間５６℃で基質と反応す
るにまかせれｍ後に十分な活性＃素と共に試験試料が閾
値限界を越えるように十分に基質を変換する時に、蛍光
計は例えば、赤色光を照射することに↓り陽性試料を示
す。例えば、１５分の培養後に、酵素と七の基質の反応
にエフ生じた螢光生成物が閾値限界を越えない場合には
、蛍光計は例えは、緑色光で陰性又は非螢光性試料を示
す。

第二のアプローチでは、蛍光計は培養時間の初期螢光を
測定する。装置で試験される特定の酵素に対して最適の
温度に螢光計器を加熱する。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓから得られた＃素α−Ｄ−グルコシダーゼの場合に
は、温度は５６℃である。培養時間の間、螢光計は螢光
をモニタし続けそして例えば、赤色光にエフ初期螢光エ
ク強度で少なくとも５％増加が検出される時に、陽性の
螢光性試料を示す。５％以下の増児が蓚定した培養時間
内で起こる場合には、例えは緑色光を活性化することに
より陰性の又は非螢光試料を示す。

本発明の滅菌インジケータ全土としてエチレンオキシド
、蒸気等の滅菌媒体に関連して記載した。

し炉しながら、このインジケータはこれらの用途に限定
されず、そして他の滅菌媒体、例えば、乾熱、放射線、
プロピレンオキシド、臭化メチル、オゾン、二誠化塩木
、ホルムアルデヒｒ１そして他のガス状及び液体試剤の
効能？示すために同様に使用できる。

不発明を下記の非限定例で例示し、ここですべての百分
率は特記しない限９重量百分率である。

例１ 本例は本発明の酵素的検出法の螢光の結果と従来の胞子
生存検出法の結果間の関連を示す。本例はまたアンプル
４８と酵素キャリア４６の間に障壁４７を利用する第６
図及び第４図に示した装置で得られるエフ短時間の読取
時間を例示する。

Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ７ｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ（）
１１ｅＯｔｉＯｎｍＲＯＯｋＶｉｌｌｅｓＭａｒｙｌａ
ｎｄから１ｌＡＴＣＣ７９５６”として市販の大豆ブロ
スに５８℃で夜通しく１６時間ノ成長させた。この培地
上使用してｐｉ−１７，２−ＣＢ＆／ｉｌの栄養プロス
、４＆／ｌの酵母抽出物、０．１ｆｌ／ｌ；の塩化マン
ガン及び２０ｙ／ノの寒天からなる寒天皿の表面に接穂
した。皿を７２時間５８℃で培養した。胞子を皿２７）
らカムきＢｊＩ９そして滅菌蒸＠水に懸濁させた。７　
ｏ　００　ｒｐｍ　：Ｃｎつ２０分間４℃で懸ＦＩＡ′
ｒｉ、を遠心分離することにエフ植物性汚物から胞子を
分離した。上澄みｔ流出させそして胞子を滅菌蒸留水に
再懸濁した。この洗浄工程を数回繰返した。ディスク当
９１．６　Ｘ　１０’胞子の集団で、５ｃｈｌｅｉＱｈ
ｓｒ　＆　８Ｃｈｕｌｌ＋Ｉｎ（！、ＫｅｅｎｉＮＨ’
ＩＰら＠Ｅｉ＆Ｓす９０３０ｒａｄｅ　Ｆ’１ｌｔｅｒ
　Ｐａｐｅｒ”として市販の直径６．６５襲（１／４イ
ンチ）の濾紙ディスクの上にこれはＩ　Ｘ　１０８胞子
／ｄの濃度で水中のＢａｃｉｌｌｕｓと、／？！ｒ濾紙
ディスクの上にこの懸濁液１０μＢをピペットで移すこ
とそしてデイクスを乾燥するにまかせることにＬ９行な
われる。

２型式の装置を下記の工うに構成し′た。第１のｇｃ撹
を第６図及び第４図のように、外側容器４０の底部上に
胞子塗被ストリツ：７″４６そして酵素基質含有アンプ
ル４８と胞子スｉ　ＩＪツゾの間に＃壁４７で構成し友
。３　Ｍ　、　Ｓｔ、　Ｐａｕｌ、ＭＮから”　Ｔｈ１
ｎｓｕｌａｔｅ（商品名）２００ブランドＴｈｅｒｍａ
ｌ工ｎ５ｕｌａｔｉｏｎ　’として市販の、２０Ｃｌ／
平万メートルの重量をＮスル、承りプロピレンプローン
ミクロ繊維材料（７）［径ｉ　、７５１ｍ　（”／１６
インチ）のディスクを障壁４７として使用し友。アンプ
ル４８は栄養培地ｏ、６７＊ｉ含有し、こｎは微生物学
用ペプトン１７１、Ｌ−アラニン０．１７ｇ、運びにＮ
、Ｎ−ジメチルホルムアミド２００μＪＩＣ溶解させた
、８１ｇｍａ　ＣｈＯｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、ａ
ｔ、Ｌｏｕｉｅ、ＭＯ，、から市販の４−メチルウムベ
リフエリルーα−Ｄ−グルコシド０．１ｇ及び水リット
ル当！００．０３．９のブロモクレゾールパージルーイ
ンジケータ染料からなる。酵素基質と栄養培地溶液のｐ
Ｈｔ−ｏ、ＩＮＸａ化ナトサナトリウム６に調節した。

外側容器４０とキャップ５６の両方はポリプロピレン製
である。外仰１容器に長さす、０８　ｍ　（、２，０イ
ンチ）、外径８５．１鵬（０，３３５インナノそして内
径７７．０ａ　（Ｌ］、３０３インチンでめった。キャ
ップは長さ１．２７５ｃｍ（０，５１０インナノ、内ｔ
Ｋ８３．３騙（０，３２８インチ）であった。内部アン
プル４８はガラス製で、長さ６．９６偽（１，５６イン
ナノ、外径６５．５語（０，２５８インチ）そして壁厚
２．５訪（、０，０１０インナノであった。閉鎖部材５
２　ＩＳ’、　Ｃｅ１ａｎｅａｅ　１３ａｐａｒａｔｉ
ｏｎ　Ｐｒｏ（ｌｕｏｆ；１０ｈａｒ’１Ｏｔｔｕ、Ｎ
、９．から＠Ｃｅｌｅｇａｒｄ　（商品名］に一４４２
微孔件フィルム”として市販の、直径１．２７ＩＳ　（
１／２インチノのポリグロビレン片であった。

紀２の装置は障壁４７が省略さＩした以外第１の装置と
同じでらつ１ζ。

両型式の装置の５ユニットバッチ全金属器具トレーに置
きそして０．５．１．０．１，５．２．０．２．５及び
６．０分の間、Ａｍｅｒｉｃａｎ　８ｔｅｒｉｌｉｚａ
ｒ　Ｏｏｍｐａｎｙ。

Ｉｒ１ｓ、ＦＡ、から＠Ａｍ５ｃｏ　Ｉ［ｉａｇｌｅ　
（商品名）モデル２０１３滅菌器″として市販の、重力
質位蒸気滅菌器で１６２℃に暴露した。暴露後に、酵素
基質と栄養培地を含有する内部アンプルを破砕しそして
二二ツ）ｔ−５６℃で培養した。紫外線（λ−３６６ｎ
ｍ　）　を使用して培養の１０分、２０分、３０分、６
０分、１２０分、１８０分そして２４０分後に螢光を可
視でａ５！取るために容器に照射し友。

巣に、紫色Ｂ＞ら黄色へ色彩変化に工９示嘔れる胞子成
長を５６°Ｃで２４時間の培養後に可視で沖」定しｔｏ 結果を第１表に報告する。

第１表のデータに活性α−Ｄ−グルコシダーゼの存在が
生存胞子の検出ニジずつと更に迅速に本発明の方法に工
９検出できることを示す。このデータはｖ、、文中で活
性酵素の検出全使用して装置中で結果の胞子成長を予想
できることを示す。

第１表のデータは装ｆｉ１（アンプルと胞子ストリツプ
の間に障壁を有する〕全便用すると２４時間の培養後に
胞子成長を示すすべてのユニットに対して１０分後に検
出できることを示す。！［１１２（障壁材料なしで）を
使用すると、２４時間の培養後に胞子成長全売すすべて
のユニットで酵素活性を検出する友めに２時間の培養が
必要である。

例２ クイック７６上の酵素キャリア７７？Ｉ−用いて、第５
虐に示すように製置’ｒ：ｍ立て７２：６例１に従って
調製した一つの胞子ストＩＪツｆｔ″、厚さ０．１０眉
のポリエチレン塗被紙、６．３５鵡×２８．５１：ｌ鵡
の一喝に熱シールした。アンプル７８は工Ｃ工Ａｍｅｒ
ｉｃａ、工ｎｃ、、Ｗｉｌｌｉｎｇｔｏｎ＋Ｄｅ’ｌａ
ｗａｒｅ　＞ら”、　Ｔｗｅａｎ（商品名）８０ポリオ
キシエチレンソルビタンモノオレエート”として市販の
、５ｄｌｌの非イオン性界面活性剤を含み、胞子キャリ
ア、遍びに例１の溶液に存在する酵素基質、栄養剤及び
指示薬を湿潤することを助ける。外側容器、キャップ及
び内部アン２″′ルは例１の装置に便用したものと同じ
である。閉鎖部材は滅菌グレード植厭であった。

装置の５：Ｊ−ニットバッチを金属器具トレーに置き、
そして０．５．１．０．１．ｂ、２．０．２．５及び６
．０分間、Ａｍｅ　ｒｉ　ＣＩＬｎ　８ｔｏ　ｒ　１１
１ｇ　ｅ　ｒ　ＯＯｍｐａ　ｎ７　ｍ　ＪＣｒ　ｉ　Ｌ
；３　＊ＰＡから＠Ａｍａｃｏ　Ｅａｇｌｅ（＠品名）
モデル滅菌器６滅茜器°として市販の重力変位蒸気滅抛
器で１６２℃に暴露した。暴露後に内部アンプルを破砕
しそしてこの装ｆｔ’に５６℃で培養した。紫外線（λ
−３６６ｎｍ　）を使用して培養の１０分、２０分、３
０分、６０分、１２０分、１８０分そして２４０分後に
可視胱示螢光の九め容器に照射した。更に、紫色〃為ら
黄色へ色彩変化にエフ示される工うに、胞子庄長’ｔ−
ｊ＠養の２４時間後に９視で測足した◎ 結果を第■表に報告する。

第１表 ０．５５５５５５５５５ １．０５５５５５５５５ １．５５５５５５５５５ ２．０　　　　０　　　　０　　　　　ＣＬ、　　　　
０　　　　４普　　　５費　　　５憂　　　　　０２．
５００００００００ ３、ｏｏｏｏｏｏｏｏ。

畳−つ又はそれ以上のにせの陽性反応を示し、これは限
界の滅菌サイクルで胞子不活性化に枕いて！Ｓ２＠酵素
活性の結果であると思わｎる。

第１表のデータは標準の２４時間胞子成長に比較して本
発明の装置と醇索検出法１！：便用すると胞子生存のず
つと迅速な検出が得られることｔ示す。

例６ 本例は不発明の笑施に有用である、Ｂａｃｉｌｌｕ８全
例示する。この例ではＡＰ工Ａｍａｌｙｔａｂ　Ｐ　ｒ
ｏ＋ｌｕｃ　ｔ８　＃１’ｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹから
”　ＡＰＩ−ＸＹＭ　（商品名）システム“として市販
の、酵素基質を使用した。このキットは個々に一遵のマ
イクロカプセルにパックされた、１９の異なる脱水した
、呈色性酵素基質からなる。各マイクロカプセルへ水性
試料の添ｍは再不和する。試験キットを所望の間隔で培
養レセしてシステ・ムと共に供給された検出剤の添Ｗ後
に反応が可視化される。

例１の装置１に孟９段造し次装置を例１で使用した蒸気
滅菌器で１６２℃で１分又は３分の間暴露した。この装
置で使用し九時にＢａｃｉｌｌｕｓそして３分後に殺菌
される。暴露後に酵素基質キット中の各マイクロカプセ
ルに胞子ストクツｆｔ無菌的に移しそして滅菌蒸留水５
０μＡｔ−各ウェルに辺えた。一つのキットは１分間暴
露した胞子ス）　Ｕツブを含み、第２キツトは６分間暴
露した胞子ストリップ金倉みそして第３４’ツトニ暴藉
しない胞子ス？　ＩＪツブを含んだ。

未暴露ストリップ金含有するキク）ｔ−５時間５６℃で
培養した。暴露した胞子ス）　ＩＪツーＪ″を含むスト
リソ２Ｐｅフ時間５６℃で培養するにまかせた。培養後
に各キットのマイクロ刀プセル中で生ずる酵素反応の発
色のＬめに検出剤Ａ及びＢ（”ＭニーＸＹＭ　（商品名
）システム１と共に市販ノ１［えた。

各キットの各マイクロ刀ゾセルで色彩の検出金第鳳表に
相合する。多数の酵素が１分暴露後に容易に検出できる
活性全売しそして３分暴露後活性を示さず又は実質上減
少し九＠性を示した。酵素の幾つかはｓ　Ｂ、ｓｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉ’ｌｕｓ　Ｉｃ固有ではなくそ
して未暴露状態で検出できる活性を足場なかった。未暴
露状態で検出できる活性を示さない幾つかの他の酵素（
ミリステー）　ＩＪパーゼ、バリンアミノペプチダーゼ
、キモトリプシン及びβ−ゲルコニダーゼを含む】は明
らかに熱に暴露により活性化される。１分の暴露後に検
出できる活性を示しそして６分のａｍ後に活性を示さず
又は減少し九活性全売す酵素が、酵素活性が未暴露状態
で検出されない場合でさえ、本発明で有用に使用できる
と思われる。

第１表 胞子ストリップ暴露 ミリステートリパーゼ ロイシンアミノペデテダーゼ バリンアミノペプチダーゼ システィンアミノペプチダーゼ トリデシン ＋１ ＶＷ ＋５ ＶＷ α−ガラクトシタ“−ゼ ＋５ ＋５ β−グルコシダーゼ Ｎ−アセチル−β−グルクサミニダーゼα−マンノシダ
ーゼ α−７コシダーゼ ＋４ ＶＷ −発色なし ＶＷ−非常に弱い発色 ＋１−弱い発色 ＋２．３．４−中間の発色（数の増加と共に発色が増大
する） ＋５−強い発色 第１表はアルカリホスファターゼ、ブチレートエステラ
ーゼ、カブリレートエステラーゼリパーゼ、ミリステー
トリパーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、バリンアミ
ノペプチダーゼ、キモトリプシン、酸ホスファターゼ、
ホスフオヒｒロラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−グ
ルクロニダーゼ、及びα−グルコシダーゼ、β−グルコ
シダー数の酵素が、胞子の成長が検出される前に、検出
されるべき亜致死滅菌暴露に続いて十分な活性ｔＭする
ことを示す。

例４ キャリア当り１．ｏ　ｘ　１０７　７．５　Ｘ　１０５
１、ＯＸ　１０６１．７　Ｘ　１０’　　２．８　Ｘ　
１０３胞子の濃度で、日ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ｅＬＴ：
１ｅＬ　Ｂｃｈｕｅｌｌ、工ｎｃ　、Ｋｅｅｎ　、ＮＥ
Ｉから＠８＆８す５９１　Ａ　Ｇｒａｄｅ　Ｆｉｌｔｅ
ｒ　Ｐａｐｅｒ　”として市販のｕｖ１紙から作った、
６．３５Ｘ　２８．５８謹（ｌ／４　’　３／８インチ
クのキャリア上に、例１に従って調製しｆｃＢａｃｉｌ
ｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ胞子金
塗被しそして乾燥した。第３図及び第４図に示しそして
例１で装置１として記載したように、胞子ストリップを
使用して装置を組立てた。

装置の６ユニツトバツチを金属器具トレーに置きそして
１．０．１．５．２．０．２．５及び６．０分の間Ａｍ
ｅ　ｒ　ｉ　Ｃａ　８　ｔ　ｅｒ　Ｌ　Ｎ　１Ｚ　ｅｒ
　Ｏ０ｍｐＨ１ｎ７　＋　ＥＪｒ　ｉ　ｅ　ＩＰＡから
”　Ａｍ５ｃｏ　Ｅａｇｌｅ　（ｈ品名〕モデル２０１
３蒸気滅菌器“として市販の重力変位蒸気滅菌器で１６
２℃に暴露し次。暴露後内部アンプル′ｊｋ破砕しそし
て装置全５６℃で培養した。紫外＃（λ−６６６ｎｍ　
）　ｆｆｉ使用して、１０分、２０分、３０分、６０分
、１２０分、１８０分、２４０分、６００分そして６６
０分の培養後に、螢光を可視で検出するために容器を照
射した。史に、紫色から黄色へ色彩変化により示される
ように、２４時間の培養後に、 胞子成長を可視で測定した。

結果を第■表に報告する。

第■表は低い胞子集団でさえ、胞子生存体は有機体の成
長が検出される前に十分に酵素活性（即ち、螢光）によ
り予想されたことを示す。

例　　５ 胞子を使用する装置に対して読取時間を比較する。

下記の系統を試験した。　ＡＩｎｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ
ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｂ１ｏｎ、　Ｒｏｃｋ
ｖｌｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄから市販の’　Ａ’ｒ
：ｃｃ　８００５　”　；三つの異なる市販の生物学的
インジケータ、’　ＡＴＴｇ８Ｔ（商品名）生物学的イ
ンジケータ’　　５　Ｍ、　　ＳＬ、　Ｐａｕｌ、　Ｍ
Ｎ、　’　ＰｒｏｏｆＰＬＵ８（商品名）生物学的／化
学的インジケーターＡｍｅｒ１ｃａｏ　８Ｌｅｒｉ１１
ｚｅｒ　（”ｏ、、　ｇｒｉｅ、　ＰＡ及びｗＡｓｓｅ
ｒｔ（商品名）生物学的／化学的インジケーター８ｕｒ
ｇｊｃｏｔ、　ＳｍＳｍ１ｂｂｔｏ、　ＮＹに含まれる
微生物を成長させることから得られる胞子；　Ｎａｔｌ
ｏｎＣｏｌｌｅｃｔ、１ｏｎ　ｏｆ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１
Ｊｕｒｅｓ、　Ｃｏ１１ｎｄ、ａｌｅ。

Ｌｏｎｄｏｎ、　Ｅｎｇｌａｎｄ、から市販の”　ＮＣ
ＴＣ１０００６雪；５分間１２１°Ｇに暴露後トリプシ
ン処理大豆プロスでＨｙｇｉｅｎｅ　Ｉｎａｔ、１Ｌｕ
ｔｅ　ｏｆ　Ｈａｍｂｕｒｇ、　Ｈａｍｂｕｒｇ。

ａｅ　ｒｍａｎｙによシ供給されるアースストリップを
培養することによシ得られた’　Ｇｅｒｍａｎ　Ｅａｒ
ｔｈθｐｏｒ８　’（この５分間暴露を使用して地中に
存在するすぺての植物性有機体を殺してＢ、　ａｔｅａ
ｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのみがとどまる）；及び
８ｔ、ａｂｅｎａ　Ｉｎａｔ、ＨｕｔｅｆｏｒＦａｌｋ
ｅｈｅｌｅｅ、　０ａｌｏ、　Ｎｏｒｗａｙによシ製造
された胞子ストリップから分離されたスカジナビアン系
統。

すべての胞子を例１に記載したように栄養寒天培地上で
成長させた。Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌｌｌｌＡＢ、　Ｕｐｐａａｌａ、　Ｓｗｅｄｅ
ｎからＰｅｒｃｏｌｌ　（商品名）として市販の、密度
勾配で４℃で５時間ｉ　ｉ、ｏ　ｏ　。

ｒｐｍでこの胞子を遠心分離した。遠心分離後に、胞子
を滅菌蒸留水に再懸濁させた。Ｇｅｒｍａｎｇａｒｔｈ
ｓｐｏｒｅでは、遠心分離中に細胞の二つの別の層が密
度勾配で分離された。相接触顕微鏡を使用して底部相が
主として胞子であることが判明しそして上部相が少数の
胞子と共に主として植物性細胞と植物性汚物であった。

両方の層を別々に試験した。

キャリア当り少なくとも１ｘ１ｏ’の集団で、濾紙（’
Ｓ＆８５９１Ａグレード濾紙つの６．６５　Ｘ２８．５
８　ｓｎ　（”／ａ　ｘ３／ｓインチ）ストリップの上
に胞子を塗被しかつ乾燥し喪。例１、装置１におけるよ
うに装置ｔ−組立てたが、ただし’　ＡＴＣＣ８００５
’胞子を使用する装置の一バッチで、’Ａ’ｒＣＣ８０
０５―胞子上のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの酵素活性を
検出するために、使用した酵素基質は４−メチルウムベ
リフエリルーα−Ｄ−／ルコシドの代シに、Ｎ、Ｎ−ジ
メチルホルムアミド２００μｌ中に溶解した０、１ｇ／
ＪＪのＳｉｇｍａから市販の４−メチルウムペリフエリ
ルーβ−Ｄ−ガラクトシドであった。これらのユニット
バッチを・Ａｍａｃｏ　Ｅａｇｌｅ　（商品名）モデル
２０１６蒸気滅菌器蕾で１．０．１．５．２．０．２．
５及び６．０分１６２０Ｃに暴露した。暴露後に内部ア
ンプルを破砕しそしてこのユニットを５６℃で培養した
。紫外線（λ＝　６６ｔ５　ｎｍ　）を使用して１０分
、２０分、６０分、６０分、１２０分、１８０分そして
２４０分の培養後に蛍光を可視で説示するため容器に照
射した。更に、紫色から黄色へ色彩変化によシ示される
ように、２４時間の培養後に胞子成長を可視で測定した
。

第Ｖ表は試験したＢ、　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
１１ｕ８のすべての系統が胞子生存に関連した酵素活性
（αＤ−グルコシダーゼ又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
の何れか）を有したことを示す。胞子が生存した殆どの
ユニットで、培養の２時間以内に蛍光が検出されそして
多くのユニットで培養１０分後に蛍光が検出された。殆
どＧｅｒｍａｎ　ｇａｒｔｈａｐｏｒｅからの植物性細
胞からきる細胞の層はまた亜致死暴露に続いて酵素残存
を有した。これは植物性細胞に関連したα−Ｄ−グルコ
シダーゼが本発明で使用できることを示す。スカンジナ
ビアン系統を有する幾つかのユニットは酵素残存を有し
ていて更に培養で有機体の成長はなかった。これは前に
観察されそして限界的サイクルで起こる。この酵素は胞
子よシ僅かに長く活性のままであシ、そしてすイクルの
多くをモニタすることによって余分の安全限界を供し滅
菌器中で物品の滅菌を確実にする。

例　　６ 蛍光読取時間を比較するため種々の材料上にＢａｃｉｌ
ｌｕθｓシｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｊｌｕａ胞子を塗
被した。

例１に記載したように、Ｂ、　ｓｌ、ｅａｒｏｂｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕ１３胞子が得られ、そしてエタノールに
懸濁させ、下記の材料に６．６５　ｘ　２８．５８　Ｋ
ｌ　（”／４　ｘ３／８インチ）ス）　ＩＪツゾ尚り大
体Ｉ　Ｘ　１０’胞子を置いた：Ｋｅｎｄａｌｌ　Ｆｉ
ｂｅｒ　Ｐｒｏｄｕｃｅｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎから’　
Ｎｏｖｏｎｅ　ｔｔ、ｅＲ不織織物す１４９−１９０−
として市販のポリゾロｔレン／レーヨン不織つエデ；　
Ｋｅｍｄａｌｌ　ＦｉｂｅｒＰｒｏｄｕｃｔｓ　Ｄｉｖ
ｉｓｉｏｎ、　Ｂｏａｔｏｎ、　ＭＡから”Ｎｏｖｏｎ
ｅｔＦ、ｅ（闇品名）不織織物す１４９−０００−とじ
て市販のナイロン不織ウェブ；　Ｃｅ１ａｎｅ６ｅ　５
ｅｐａｒａｂｉｏｎＰｒｏｄｕｃｔ１ｏｎｓ、　Ｃｈａ
ｒｌｏｔｂｅ、　ＮＯから”　ＣｅｌａｇａｒｄＲ微孔
性疎水性フィルム２５００　’として市販の微孔性疎水
性フィルム；　Ｃｅ１ａｎｅｓｅ　３ｅｐａｒａＬｉｏ
ｎｌｌｌＰｒｏｄｕｃ　Ｌｓから’　Ｃｅｌｇａｒｄ　
（商品名）微孔性親水性フィルム５４０１　”とし−ご
市販の微孔性親水性フィルム；　Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、　
Ｍ＋１ａｌｌｉ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｒｌｃｈｍｏｎｄ
。

ＶＡから市販のアルミニウムホイル；　８ｃｈｌｅ４ｃ
ｈｅｒ＆　８ｃｈｕｅｌｌから”Ｓ＆５９０５グレード
濾紙１として市販の濾紙：そしてＭａｎｎｉｎｇ　Ｐａ
ｐｅｒ　Ｃｏｍｐａｎｙ。

Ｄｌｖｉａｉｏｎ　ｏｆ　Ｈａｍｍｅｒｍｉｌｌ　Ｐａ
ｐｅｒ　Ｃｏ、、　Ｔｒｏｙ、　ＮＹから°Ｍａｎｎｉ
ｇｌａ８す１２６７不織ガラス繊維紙―として市販のガ
ラス繊維不織ウェブ。

懸濁させた胞子１０μｔ１即ちＩ　Ｘ　１０’の胞子を
また例１に記載したものと同じ寸法のポリプロピレン容
器に入れた。

例１、装置１１１に従って、そして第６図及び第４図に
示したように胞子ストリップを使用する装置だ を組立とよ、ただしＣｒｏｗｎ　Ｚｅｌｌｅｒｂａｃｋ
　Ｃｏｒｐ。

Ｃａｍａ８．　　Ｗａｓｈｊｎｇｔｏｎ　　から　”　
　０．５　０　　ｇ　Ｃｅｌｅ日しｒａ（商品名）不織
ポリプロピレン自として市販のポリプロピレン不織スク
リムの直径１　、７５１１　（ｌｌ／１６インチ）片を
胞子ストリップ４６と外側容器の底部の間に挾んだ。こ
のスクリムはウィックとして作用して疎水性ナイロンウ
ェブ、微孔性疎水性フィルム、アルミニウムホイル又は
ガラス繊維不織ウェブを通して栄養培地を引出すので、
アンプル４８が破砕された時にこのサンドインチは栄養
培地で胞子ストリップを確実に湿潤する。胞子塗被容器
を使用する装置を例１、装置１に従って組立てたが、た
だしこの装置は胞子ストリップ又は障壁を含まなかった
。このインジケータの６ユニツトバツチ全１．０．１．
５．２．０．２．５及び６．０分間１６２℃に’　Ａｍ
５ｃｏ　Ｅａｇｌｅ　（商品名）モデル２０１６蒸気滅
菌器”に暴露した。暴露後に酵素基質溶液と栄養培地を
含むアンプルを破砕し、装置を５６℃で培養しそして１
時間に対して１５分そして６時間まで毎時、τＪｌｂｒ
ａｖ１ｏ１ｅｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔａ、　Ｉｎｃ、　５ａ
ｖＧａｂｒｉｅ１．　ＣＡ、から曹Ｂｌａｃｋ−Ｒａｙ
　（商品名）ランプ１モデルＵＶＬ−２１として市販の
長波長紫外ｍｃλ＝３６６）を使用して蛍光を調べた。

培養を２４時間続け、そして成長（黄色）又は非成長（
紫色）に対して装ｆ！ｔを説示した。

結果を第■表に報告する。

蒸気暴露に生き残ったキャリア上に塗被された胞子を有
するすべてのインジケータで、胞子生存（酵素活性によ
る）は１５以内に検出された。胞子が容器上に直接に塗
被されたインジケータは、活性α−Ｄ−グルコシダーゼ
が存在し、それ故に胞子が生存するすべての場合を検出
するために２時間まで必要とした。信頼し得る読取シま
でこの増大した時間は胞子塗被容器インジケータにおい
て、培地の全体容ｆを蛍光についてモニア℃なければな
らない墨の結果である。対照的に、胞子ストリップ及び
アンプルと胞子ストリップの間の障壁を使用する装置で
は、蛍光について胞子ストＩＪッグのみを見る。この障
壁は少量の培地と酵素基質が胞子キャリアと接触するこ
とを許す半透過性膜として作用する。酵素基質とキャリ
アの何れかの部分上の酵素の反応はアンプルの全内容物
と酵素の反応より、ずっと短い時間で見られる。

例　　７ ン処理大豆プロスで６７℃で夜通しく１６時間）成長さ
せた。この培地を使用して、８ｇ／Ｊ）の栄養プロス、
０．０１１　ｇ／、、ｅ硫酸マンガン及び２０ｇ／ｉの
寒天からなる寒天皿の表面に−７，２で接種した。この
皿を６日間６７℃で培養し、皿から胞子をかきとシそし
て滅菌蒸留水に懸濁させた。

この懸濁液を７０００　ｒｐｍでかつ２０分間４°Ｃで
遠心分離することによって植物性汚物から胞子を分離し
た。上澄みを流出させそして胞子を滅菌蒸留水に再懸濁
させた。この洗浄工程を数回繰返した。

朋−８＆５５９１Ａグレ一ド濾紙１ストリップ上に１．
０　Ｘ　１０Ｂの集団で塗被しだ。第６図及び第４図に
示し、かつ例１、装置１で記載したようにこれらの胞子
ス）　ＩＪツデを使用して、装置を組立てた。これらの
装置の６ユニツトバツチを６０分間５４°Ｃと５０％相
対湿度で予め調整した。この装置を’　Ａｓ５ｏｃ１ａ
ｔｉｏｎ　ｆｏｒｔｈｅ　Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏ
ｆＭｅ＋Ｈｃａｌ　Ｉａ日１＋ｒｕｍｅｎｂａｔ、ｉｏ
ｎ、　５ｔａｎｄａｒｄ　ｆｏｒ　ＢＩＥＲ／ＥＯＧａ
１ｌ　ｖｅ日５ａｌＢＩ　ＡＡＭＩ　ＢＥｏｖ−３／８
２に従った変型した、５　Ｍ　Ｃｏ、、　ＳＬ、　Ｐ’
ａｕｌ、　Ｍｉｎｎｅｓｏｂａ　、から市販の”　５Ｌ
ｅｒｌ−Ｖａｃ　（’１ｌｆ３品名）４００Ｂガス滅菌
器でエチレンオキシド６００’Ａ９／１３に５４°Ｃ及
び５０％相対湿度で、１５．６０．６０、及び１２０分
間暴露した。暴露後に、内部アンプルを装置から取出し
、そして内部アンプルに含まれるものと同じであるが、
ただしブロモクレゾールパープル−指示薬染料の代ジに
０．０５　ｇ　／−１３の２．６．５−トリフェニルテ
トラゾリウムクロリド（ＩＣ’ＮＰｈａｒｍａｃｅｕｔ
＋１ｃａｌ　Ｉｎｃ、、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　０ｈｌ
ｏから市販）及び４−メチルウムベリフエリルーα−Ｄ
−グルコシドの代りに０．１ｇ／−ｅの４−メチルウム
ベリフエリルーβ−Ｄ−グルコシド（Ｓｉｇｍａ　カラ
市ｆｆ１）を含む溶液０．６７　ｍｌを外側容器の中に
ピペットで入れた。この装置を６７°Ｃで培養した。紫
外線（λ＝　６６６　ｎｍ　）を使用して培養の６０分
、６０分、９０分、１２０分、１８０分、２４０分そし
て６００分後蛍光を可視で検出するため装置に照射した
。更に、無色から赤色へ色彩変化によシ示されるように
、胞子成長を培養の２４及び１６８後に可視で測定した
。結果’ｔ”第■表に報告する。

第■表 ０５　６　！、６６５６　　６　６ ６０００００３脣　　５％　　　６４　　０　　０６０
０００００３費　　６簀　　００ 簀−つ又はそれ以上のにせの陽性反応を示し、これは限
界滅菌サイクルで胞子不活性化に続いて残留酵素活性の
結果であると思われる。

第１１１表は胞子が１５分のエチレンオキシド暴露で生
き残る装置では４−メチルウムペリフエリルーβ−Ｄ−
グルコシドと活性β−Ｄ−グルコシダーゼの反応から生
じた蛍光が９０分の培養後可視で検出されたことを示す
。この酵素は１２０分のエチレンオキシド暴露後に完全
に不活性化され、１２０分のエチレンオキシド暴露が完
全でかつ有効な滅菌サイクルであることを示す。若干の
残留酵素活性は６０分及び６０分の限界滅菌サイクルに
おいて６時間及び４時間後に検出された。

例　　８ 例７に記載したように得られた”　ＡＴＣＣ９５７２’
ａＳ＆＋８５９１人グレード濾紙１メグレード濾紙１ス
トリツプ上０’の集団で塗被した。第６図及び第４図に
示しかつ例１、装置１に記載したようにこれらのストリ
ップを使用して装置を組立てた。装置の６ユニツトバツ
チを６０分間５０％相対湿度と５４°Ｃで予め調節した
。この装置を例７に記載したように変型したーＳｔ、ｅ
ｒａ−Ｖａｃ　（商品名）　４００　Ｂガス滅菌６書で
６００■／、！３のエチレンオキシドで５４°Ｃと５０
％相対湿度で１５．６０．６０及び１２０分間暴露した
。暴露後に胞子ストリップを装置から取出しそしてＤｙ
ｎａｂｅｃｈ　ＬａｂｏｒａＬｏｒｊｅ８゜Ｉｎｃ、、
　Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、　Ｖｊｒｇｉｎｉａから−Ｄ
ｙｎａｂｅｃｈＭｉｃｒｏ　Ｆ’ＬＵＯＲ（商品名）シ
ステム−として市販の９６ウコルマイクロタイタ一皿中
の個々のウェルに移した。各ウェルは１７ｇ／ノの微生
物学的ペプトン、０．１７ｇ／−１３のＬ−アラニン、
０．０６ｇ／沼のトリフェニルテトラゾリウムクロリド
及び０．１Ｆｌ／Ｊｊの４−メチルウムペリフエリルー
β−Ｄグルコシドの溶液２００μｌ！を含んだ。血中で
６陰性対照ウエルは胞子ストリップなしで栄養培地と酵
素基質の溶液を含んだ。この皿を６７℃で培養しそして
５　Ｍ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　ｓｔ、　Ｐａｕｌ、　Ｍｉ
ｎｎｅ８ｏｔａから’　３Ｍ　Ｆｌａｏｒｏ　Ｆａｓｔ
　（商品名）９６蛍光計１として市販の蛍光計で０．６
０．１２０．１８０及び２４０分の培養後に各ウェルの
蛍光を測定した。６ウエルに対する相対蛍光の平均とし
て、この結果を第１表に報告する。

第１表 平均相対蛍光 ５０　　　　４０９　　　６２１　　　６２５　　　６
７５　　　４６Ｂ陰性対照　　２７８　　２１５　　１
９５　　１９１　　　１８６例７の結果はＢａｃｉｌｌ
ｕｓ　ａｕｂｂｉｌｊｌｉ胞子は本例で記載される１５
分エチレンオキシド暴露に生存し、そして少なくとも６
０分暴露後に殺菌されることを示す。１５分間暴露され
た胞子ス）　ＩＪッゾを含むウェルによシ示されるよう
に、酵素β−Ｄ−グルフシダーゼの活性、従ってルユａ
ｕｂｌ、１１１１ｉ１微生物の生存は６時間の培養後陰
性対照のバックグラウンドレベル蛍光の少なくとも２．
５倍の相対蛍光における増加によシロ時間の培養後に示
される。同様に暴露されない対照では、単に１時間の培
養後に陰性対照のバックグラウンドレベル蛍光の２．５
倍以上の相対蛍光の増加は酵素活性と胞子生存を示す。

しかしながら、少なくとも６０分間エチレンオキシド滅
滅菌暴露されたスト’Ｊッデは６時間の培養後に陰性対
照の２．５倍以下の相対蛍光値を有した。かくして、た
だ残留酵素活性と胞子生存の欠除を示す。

ＭＺ図は！Ｗ表で報告した結果のグラフ表示である。こ
の図ではラインＡは１５分間暴露した装置を表わし、ラ
インＢは６０分間暴露した装置を表わし、ラインＣは６
０分間暴露した装置を表わし、ラインＤは１２０分間暴
露した装置を表わし、そしてラインＥは陰性対照を表わ
す。

例　　９ 例７に記載したように得られた′ＡＴＣＣ９６７２’−
ド濾紙６の６．６５　Ｘ、２８．５８　”　（”／４　
×３／［１（７チ）上に１．ＯＸ　１０８の集団で塗被
した。第６図及び第４図に示しかつ例１、装置１に記載
したようＫ、これらの胞子ストリップを使用して装置を
組立てた。装置の３ユニツトバツチを６０分間５４％相
対湿度と共に５４℃に予め調節した。次に例７に記載し
たように変型した。　　’　Ｓ　ｌ、ｅｒｉ−Ｖａｃ（
商品名）４００Ｂガス滅菌器°でエチレンオキシド６０
０ｎＱ／−ｅに５４℃及び５０％相対湿度で１５．６０
．６０及び１２０分間暴露した。暴露後玉つの同一の未
暴露胞子ストリップと共に、胞子ストリップを装置から
取出し、そしてＩ）ｙｎａｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔ、ｏ
ｒｉｅａｊＩｎｃ、、　Ａ］、ｅｘａｎｄｒｉａ、　Ｖ
ｅｒｇｌｎｉａから’　Ｄｙｎａｔ、ｅｃｈ　Ｍｉｃｒ
ｏ　ＦＬＵＯＲ（商品名）システム春として市販の、９
６ウエルミクロタイタープレート中の個々のウェルに移
した。各ウェルは１７９７Ｊ３の微生物学用ペプトン、
０．１７　ｇ／ぶＬ−アラニン、０．０５ｇ／−１３の
トリフェニルテトラゾリウムクロリド及び８ｉｇｍａか
ら市販の０．１ｇ／−ｅのメチルウムベリフエリルーα
−Ｄ−アラビノフラノシドの溶液２００　ｍｌを含んだ
。プレート中の６陰性対照ウエルは胞子ストリップなし
で栄養培地と酵素基質の溶液を含んだ。この皿を３７°
Ｃで培養しそして５　Ｍ　Ｃｏｍａｎｙ、　８ｔ、、　
Ｐａｕｌ、　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａがら’　６Ｍ　Ｆｌａ
ｏｒｏ　ＦＡＳＴ　（商品名）として市販の、蛍光計で
０．６０．１２０．１８０そして２４０分の培養後に各
ウェルの蛍光を測定した。この結果を第８図で６ウエル
に対して相対蛍光の平均と記録し、そこでは平均相対蛍
光を１５．６０．６０及び１２０分間暴露した胞子を含
有するウェル、及び陰性の対照について培養時間に対し
てプロットした。図では、Ｆは１５分間暴露した装置を
表わし、Ｇは６０分間暴露した装置を表わし、Ｈは６０
分間暴露した装置を表わし、Ｊは１２０分間暴露した装
置を表わしセしてＫは陰性の対照を表わす。

例７の結果はＢ、　５ｕｂｔ、１ｌＨ１胞子が前記の型
式の１５分エチレンオキシＶ暴露に生存し、そして少な
くとも６０分暴露の後に殺菌されることを示す。

この例では、α−Ｄ−アラビノフラノシダーゼはなお１
２０分サイクルの後に残留活性を有し、これは完全でか
つ有効な滅菌サイクルと考えられる。

このレベルの蛍光はバックグラウンドレベルと考えられ
、そしてこのレベル以上に著しい増加は滅菌の失敗を示
す。例えば、６時間の培養後に、１５分間暴露したスｈ
　ＩＪツゾと１２０分間暴露したストリップ間で相対蛍
光単位（ＲＦＵ　）の差は２１６６である。この差は著
しくそして使用したエチレンオキシド条件に対して不完
全な滅菌サイクルであることを示す。しかしながら、６
０分間暴露したストリップと１２０分間暴露したストリ
ップ間の差は単に７４５　ＲＦＵである。この差は顕著
ではなくそして６０分の限界滅菌サイクルで酵素残留活
性を示す。

例１０ 例１に記載したように得られたＢａｃｊｌｌｕ８を１回
洗浄後、１　Ｘ　１０８胞子／ｄの集団で、蒸留水に懸
濁させた。下記の工程を使用して酵素α−Ｄ−グルコシ
ダ〜ゼを精製した。懸濁液（２００ｍ）を４℃で夜通し
、ＰＨ６，２で、ｌＱｍＭアセテート緩ｖＩ液と５　ｍ
Ｍ　ＣａＱ１２の溶液２Ｊに対して透析した。

次に遠心分離によシネ溶性残留物に＃Ｉｊｌ除いた。上
澄みを固体硫酸アンモニウムと共に分別した。フィルタ
ーパッドを含むデフチー漏斗上に２０−６０チ硫酸アン
モニウムからの沈殿物を回収した。

Ｗｈａｔｍａｎ　４１６１紙の２シート上に、Ｍａｎｖ
１１１８Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ　Ｐｒｏｄｕｏｔ　Ｇｒｏ
ｕｐ、　Ｌｏｍｐｏｃ、　ＣＡ、から市販の’Ｃｅ１ｉ
ｂθ（商品名）濾過助剤１の懸濁液（１ｏＯｇ／−６）
を通過させることによシこのフィルターパッドを調製し
た。濾過後に、このξＣｅｔｉ　ｌ、ｅ　（商品名）濾
過助剤１パツドを１０　ｍＭアセテート緩衝液と５　ｍ
Ｍ　ＣａＣＡ２の溶液２ｏ罰に、−６，２で、懸濁させ
、そして４°Ｃで４時間かきまぜた。１過により”　Ｃ
ｅｊｌｔｅ　（商品名）濾過助剤”全可溶性１′＃索か
ら取出した。４°Ｃで１υｍＭアセテート緩衝液と５　
ｍＭ　ＣａＣＡ２の溶液４１に対して夜通し淡褐色の酵
素溶液を透析した。この透析したＭ液を透析管から取出
しそして濾過して不溶物汚物を除去した。

透析１Ｉｆｔ、全ｐ）１６．２に調節しセして２容量の
冷ア七トン（−２０℃）をかきまぜながら加えた。この
アセトン−酵素Ｉ？ｌ！ｉを６時間−２０℃に保った。

４℃で重力濾過により淡褐色沈殿物を回収しそしてｐＨ
６，２で、１０ｍＭアセテート緩衝液と５　ｍＭＣａＣ
Ｊ２の溶液１０１ｄに溶解した。淡コハク色溶液を０．
１Ｍアセテート緩衝液、ｐＪ−１４，６の添加によシｐ
ｉ−１５，５に調節した。再び、この溶液を２容量の冷
アセトン（−２０°Ｃ）で処理しそして夜通し２００Ｃ
に保った。重力濾過によシ沈殿物を回収し、そして１０
　ｍＭアセテート緩衝液と５　ｍＭ　ＣａＣｊ２の溶液
、…６．２．１０１ｄＫ溶解した。各２４時間で完全な
緩衝液交換で、５０　ｍＭホスフェート緩衝液と５　ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡの直鎖４ノに対して、ｐＨ６，２（緩衝液
Ａ）、４８時間この淡コハク色溶液を透析した。

Ｐｈａｒｍａｃｊａ、　ｆｃ、、　Ｐｉａｃａｔａｗａ
ｙ、　ＮＪから市販の’　ＤＥＡＥ−５ｅｐｈａｄｅｘ
　（商品名）ビーズ１をパックしたカラムに透析した試
料５　ｒｕｌを装入し、そして５　Ｑ　ｍＭホスフェー
ト緩衝液と５　ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＦ１６−２で平衡
させた。ａ）緩衝液Ａ５ＱＱａｕ、そしてｂ）緩衝液Ａ
中で線状０〜Ｏ−８Ｍ　Ｎａｃｔ勾配の２００ゴで次々
にこのカラスを洗浄した。流速を約５　Ｆｌ！ｔ／６０
分に保った。生じた活性画分を回収しそして２４時間後
に完全な交換と共に、蒸留水４ぶに対して４８時間透析
した。親液性化画分を１５０吐ホスフエート緩衝液と５
　ｍＭ　Ｅ　ＴＡの溶液６−１Ｘ６．２Ｃ緩衝液Ｂ）に
懸濁させた。この懸濁液を１５Ｎ／６０分の大体の流速
で緩衝液Ｂと共に、ＰｈａｒｍａＣｊａ＋　Ｉｎｃ、か
ら市販の蕾８ｅｐｈａｄｅｘ　（商品名）Ｇ−１００ビ
ーズ署でパックされたカラムＣ２，５×’５０ｃ！Ｒ）
Ｋ通過させた。活性画分を回収しそして蒸留水４Ｊに対
して透析した。次にこの透析した画分を親液性化した。

’Ｓ＆５９０６グレード濾紙−の７個の６．５５　Ｘ２
８−５８　（’／ａｘ３／ｓ（７チ）ス）　’）ッ７″
に蒸留水中の０．０２　Ｍ精製α−Ｄ−グルコシダーゼ
の懸濁液で飽和させた。同一型式と寸法の７個の他の紙
ストリップに、蒸留水に懸濁させた例１に記載したよう
に得られた。　　Ｂ、　８ｔｅａｒｏＬｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕａ胞子（ｌＡＴＣＣ７９５５”　）のＩ　Ｘ　１
０’胞子／−溶液を飽和させた。すべてのキャリアスｔ
ｌツブを周辺温度（２０°Ｃ）で夜通し風乾した。

第６図及び第４図に示しかっ例１で装置１として記載し
たよりに、これらの胞子ストリップを使用して装置を組
立てた。０．５．１．０．１．５．２．０．２．５及び
６．０分間１６２℃と４６９−４　ｋｇ　／　ａｎ”（
５５ｐｓｉ）で−Ａｍｓｃｏ　Ｅａｇ４ｅ　（商品名）
モデル２ｎ１Ａ＠醒器「とし、て市販の重力変位蒸気滅
菌器にこれらの装置を暴露した。暴露後に＃素基質と栄
養培地を含む内部アンプルを破砕しそしてこのユニット
を２４時間５６℃で培養した。紫外線（λ＝３６６ｎｒ
ｎ）を使用して蛍光を可視で説示するため容器に照射し
友。６６６　ｎｍで、−６ＭＦｌｕｏｒｏ　ＦＡＳＴ　
（商品名）蛍光計１を使用して各装置の相対蛍光をまた
測定した。結果を第■表に記録する。

第■表の結果は精製した酵素を使用する装置はＢ、　ｓ
ｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｌｌｕｓを使用する装置と
同一の９視で観察される蛍光、及び大体同じの測定され
た蛍光を有することを示す。従って、本例はそれが得ら
れる胞子にしばられない、精製した酵素のみの活性が胞
子生存を検出するために有用であることを示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は閉鎖装置２６を取外して、本発明の滅昭インジ
ケータの一具体例の断面図である。 第２図は閉鎖装置２６を含めて、第１図の滅菌インジケ
ータの分解組立透視図である。 第６図は閉鎖装置５６を閉鎖位置で、本発明のインジケ
ータの一好適具体例の断面図である。 第４図は第６図の分解組立透視図である。 第５図は閉鎖装置８６を開放位置で、本発明の滅菌イン
ジケータの別の好適具体例の断面図である。 第６図は第５図の滅菌インジケータの分解組立透視図で
ある。 第７図は種々の時間に対して滅菌サイクルへ暴露後に本
発明の滅菌インジケータに対する相対蛍光対培養時間の
グラフ図である。 第８図はまた確々の時間に対して滅繭サイクルへ暴露後
に本発明の滅菌インジケータに対すう相対蛍光対培養時
間のグラフ図である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ａ）検出できる量の酵素を供する活性酵素の供源
   を滅菌サイクルに置き、この酵素が滅菌をモニターする
   ため通常に使用される少なくとも一つの微生物の生存度
   と相関する活性を有するものであること； ｂ）前記の滅菌サイクルに続いて、酵素基質と活性のま
   まである酵素の反応を促進するのに十分である時間の間
   と条件の下で、残留活性酵素と反応して検出できる酵素
   変性生成物を生ずることができる有効量の酵素基質シス
   テムと共に前記の酵素を培養すること； の工程を含むことを特徴とする、滅菌サイクルの有効性
   を迅速に測定する方法。
2. （２）ａ）液体不透過性かつ実質上ガス非吸収性壁を有
   する外側容器、この容器は中に少なくとも一つの開口を
   有すること；及び ｂ）前記の開口を覆うガス透過性、細菌不浸透性装置； を含む滅菌インジケータであつて、その活性が滅菌をモ
   ニターするために通常に使用される少なくとも一つの微
   生物の生存度と相関する、検出できる量の分離された活
   性酵素が前記の外側容器内に含まれることを特徴とする
   、前記の滅菌インジケータ。
3. （３）ａ）液体不透過性かつ実質上ガス非吸収性壁を有
   する外側容器、この容器は中に少なくとも一つの開口を
   有すること； ｂ）前記の開口を覆うガス透過性、細菌不浸透性装置； ｃ）検出できる濃度で活性酵素の供源が前記の外側容器
   内に含まれること、この酵素が滅菌をモニターするため
   に通常に使用される少なくとも一つの微生物の生存度と
   相関する活性を有すること；を含む滅菌インジケータで
   あつて、更に前記の外側容器内に、活性酵素と水溶液中
   で反応して検出できる酵素変性生成物を生ずることがで
   きる有効量の酵素基質が含まれることを特徴とする前記
   の滅菌インジケータ。