DE69415318T2

DE69415318T2 - Biologischer Sterilisationsindikator, Testvorrichtung, die den gleichen enthält, und deren Verwendung

Info

Publication number: DE69415318T2
Application number: DE69415318T
Authority: DE
Inventors: Lewis P. Saint Paul Mn 55133-3427 Woodson
Original assignee: Minnesota Mining and Manufacturing Co
Current assignee: 3M Co
Priority date: 1993-05-20
Filing date: 1994-05-19
Publication date: 1999-08-12
Anticipated expiration: 2014-05-20
Also published as: ES2125460T3; JPH08510646A; JP3558635B2; DE69415318D1; EP0699241B1; WO1994028164A1; EP0699241A1; AU676743B2; CA2161685A1; AU6953694A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen biologischen Indikator, der sich die Immobilisierung zunutze macht, um die Thermostabilität des im Indikator enthaltenen Biomaterials (z. B. Mikroorganismus oder Enzym) zu erhöhen. Der biologische Indikator kann verwendet werden, um die Wirksamkeit einer Sterilisation entweder mit oder ohne Testpackmaterialien oder -vorrichtungen abzulesen.

Hintergrund der Erfindung

Biologische Indikatoren, die zur Bestimmung der Wirksamkeit einer Sterilisation verwendet werden, sind in der Technik wohlbekannt. Bei herkömmlichen biologischen Indikatoren wird ein Testorganismus, der gegenüber dem eingesetzten Sterilisationsverfahren resistenter ist als die meisten Organismen, die durch natürliche Kontamination vorhanden sein würden, auf einen Träger aufgebracht und zusammen mit den zu sterilisierenden Gegenständen einem Sterilisationscyclus unterworfen. Nach Beendigung des Sterilisationscyclus wird der Träger in Nährmedium inkubiert, um zu bestimmen, ob einer der Testorganismen das Sterilisationsverfahren überlebt hat.
Mehrere Verfahren wurden vorgeschlagen, um die Wirksamkeit von Sterilisationsgeräten unter Verwendung biologischer Indikatoren zu testen. Die Association for the Advancement of Medical Instrumentation (AAMI) hat Empfehlungen veröffentlicht, um sowohl Ethylenoxid- als auch Dampfsterilisatoren zu bewerten. Zum Qualifikationstest eines Ethylenoxidsterilisators emp fiehlt die AAMI, einen biologischen Indikator in den Zylinder einer Kunststoffspritze zu bringen. Ein Kunststoff-Intratrachealtubus, ein Stück Latexschlauch und zwei der Spritzen werden in die Mitte eines Stapels zusammengelegter Operationshandtücher gelegt. Dann wird der Stapel in ein Wickelmaterial eingewickelt. Der resultierende Testpack ist so gestaltet, daß er die Parameter der Ethylenoxid-Sterilisation einem strengen Test unterziehen kann.
Die Empfehlungen der AAMI für einen Testpack zur Verwendung bei Dampfsterilisatoren mit Schwerkraftverdrängung oder mit Vorvakuum beinhalten die Verwendung eines geeigneten biologischen Indikators in einem Testpack mit 14 bis 16 Handtüchern. Die Handtücher werden zusammengelegt und gestapelt. Der biologische Indikator sollte in die geometrische Mitte des Packs zwischen das siebte und achte Handtuch gelegt werden.
Testpacks, die biologische Indikatoren und andere Materialien enthalten, sollen alle Parameter, die zur Bewertung der Wirksamkeit von Ethylenoxid- und Dampfsterilisatoren notwendig sind, einem strengen Test unterziehen. Eine Forderung an beide Typen von AAMI-Testpacks ist die Behinderung des Stroms des Sterilisationsmittels zum biologischen Indikator, um die Geschwindigkeit der Sterilisation, die die Beladung erfährt, besser simulieren zu können. Der AAMI-Testpack für Ethylenoxid- und Dampfsterilisationscyclen erfüllt zwar effektiv seinen Verwendungszweck, sein Aufbau ist jedoch arbeitsintensiv, und der resultierende Pack ist voluminös. Im Lichte dieser Einschränkungen wenden sich mehrere kommerziell erhältliche Produkte der Notwendigkeit eines einzigen, im voraus zusammengesetzten und standardisierten Sterilisationstestpacks zu. Zu den beispielhaften Produkten gehören der "1278 AttestTM EO Pack" und der "1276 AttestTM Steam Pack", beide kommerziell erhältlich von 3M, sowie die Vorrichtungen, die in den US-Patenten Nr. 4,739,881, 4,828,797, 4,839,291, 4,636,472, 4,918,003 und in den Europäischen Patenten Nr. 421,760, 419,282 und 255,229 offenbart sind.
EP-A-0 371 682 beschreibt biologische Indikatoren, die einen Träger umfassen, auf dem das Biomaterial absorbiert wird.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt erstmals eine einfache biologische Indikatorvorrichtung bereit, die ohne Handtücher, Spritzen oder andere voluminöse Testpackmaterialien verwendet werden kann, und ergibt Sterilisationsbewertungen, die denen der Vorrichtungen des Standes der Technik gleichwertig oder besser als diese sind.
Die vorliegende Erfindung stellt einen biologischen Indikator bereit, umfassend:
(a) einen äußeren Behälter mit flüssigkeitsundurchdringlichen Wänden, wobei der Behälter wenigstens eine Öffnung enthält;
(b) enthaltend innerhalb dieses äußeren Behälters eine nachweisbare Menge eines immobilisierten:
(1) lebensfähigen Testmikroorganismus oder
(2) einer anderen Quelle eines aktiven Testenzyms, von dem bekannt ist, daß es zur Überwachung einer Sterilisation geeignet ist;
wobei der Mikroorganismus oder das Enzym in im wesentlichen getrockneter Form in einem solchen Ausmaß immobilisiert worden ist, daß nach einem Sterilisationscyclus, der für in einem zur Überwachung der Sterilisation verwendeten Testpack enthaltene Testmikroorganismen subletal ist, eine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß jedoch nach einem Sterilisationscyclus, der für die in einem zur Überwachung der Sterilisation verwendeten Testpack enthaltenen Testmikroorganismen letal ist, keine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann.
Insbesondere umfaßt die Immobilisierung
(1) das Adsorbieren an ein wasserunlösliches Trägermaterial;
(2) das Umsetzen mit einem wasserunlöslichen Trägermaterial, das in der Lage ist, kovalente oder ionische Bindungen zu dem Testmikroorganismus oder Testenzym zu bilden;
(3) das Einschließen des Mikroorganismus oder Enzyms in einer vernetzten Polymergelmatrix, die nichtionische polymerbildende Materialien umfaßt, die gegenüber dem Mikroorganismus oder Enzym unreaktiv sind;
(4) das Umsetzen mit einem Vernetzungsmittel, das in der Lage ist, intra- oder intermolekulare Vernetzungen innerhalb der Testmikroorganismen oder des Testenzyms zu bilden; oder
(5) das Mikroverkapseln des Testmikroorganismus oder -enzyms;
oder irgendeine Kombination davon.
Die Erfindung stellt weiterhin einen Testpack zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Sterilisationscyclus in einer Sterilisationskammer bereit, der den biologischen Indikator dieser Erfindung innerhalb eines zur Überwachung der Sterilisation verwendeten Testpacks umfaßt.
Außerdem stellt die Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Thermostabilität.
(1) eines lebensfähigen Mikroorganismus, der gewöhnlich zur Überwachung einer Sterilisation verwendet wird, oder
(2) einer anderen Quelle eines aktiven Testenzyms, von dem bekannt ist, daß es für die Überwachung einer Sterilisation geeignet ist,
innerhalb eines biologischen Indikators bereit, umfassend das Immobilisieren des Testmikroorganismus und/oder des aktiven Enzyms, wobei die Immobilisierung folgendes umfaßt:
(1) Adsorbieren an ein wasserunlösliches Trägermaterial;
(2) Umsetzen mit einem wasserunlöslichen Trägermaterial, das in der Lage ist, kovalente oder ionische Bindungen zu dem Testmikroorganismus oder Testenzym zu bilden;
(3) Einschließen des Mikroorganismus oder Enzyms in einer vernetzten Polymergelmatrix, die nichtionische polymerbildende Materialien umfaßt, die gegenüber dem Mikroorganismus oder Enzym unreaktiv sind;
(4) Umsetzen mit einem Vernetzungsmittel, das in der Lage ist, intra- oder intermolekulare Vernetzungen innerhalb der Testmikroorganismen oder des Testenzyms zu bilden; oder
(5) Mikroverkapseln des Testmikroorganismus Öder -enzyms;
oder irgendeine Kombination davon.
Im Stand der Technik sind mehrere Verfahren zum Immobilisieren verschiedener Mikroorganismen und Enzyme offenbart (z. B. US- Patent Nr. 4,663,287; Srivastava, Indian Journal of Biochemistry and Biophysics, Vol. 28, S. 109-113 (April 1991); Biotechnology and Applied Biochemistry, Vol. 13, S. 36-47 (1991); American Society for Microbiology News, Vol. 55, S. 67-70 (1989); Journal of Hygiene, Vol. 54(4), S. 487-508 (1956); Food Industries, März 1941, S. 64-65; Food Research, Vol. 14, S. 499-510 (1949); Journal of Bacteriology, Vol. 62, S. 81-96 (1951); Journal of Bacteriology, Vol. 68, S. 338-345 (1954); Journal of Applied Bacteriology, Vol. 37, S. 31-43 (1974). Keine dieser Literaturstellen offenbart jedoch die Verwendung der Immobilisierung zum Stabilisieren oder Schützen von Biomaterial in getrockneter Form in einem biologischen Indikator gegenüber bzw. vor den letalen oder inaktivierenden Wirkungen entweder einer Dampf- oder einer Ethylenoxidsterilisation. Die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung sind nützlich, um die Wirksamkeit eines Sterilisationscyclus entweder in Schwerkraft oder in Vorvakuum-Dampfsterilisatoren oder in Ethylenoxidsterilisatoren zu- bestimmen, und sie sind ausreichend genau, um AAMI-Standards zu erfüllen. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Vorrichtungen der vorliegenden Erfindung einmal verwendbar, im voraus zusammengefügt, klein, leicht zu verwenden und bequem zu handhaben.

Kurzbeschreibung der Figuren

Fig. 1 ist eine Querschnittsansicht einer Ausführungsform eines biologischen Indikators der vorliegenden Erfindung, wobei die Verschlußvorrichtung 26 entfernt ist.
Fig. 2 ist eine auseinandergezogene perspektivische Darstellung des biologischen Indikators von Fig. 1 einschließlich der Verschlußvorrichtung 26.
Fig. 3 ist eine Querschnittsansicht einer bevorzugten Ausführungsform eines Indikators der vorliegenden Erfindung, wobei sich der Verschluß 56 in der geschlossenen Position befindet.
Fig. 4 ist eine auseinandergezogene perspektivische Darstellung des Indikators von Fig. 3.
Fig. 5 ist eine auseinandergezogene Darstellung eines Testpacks einschließlich eines biologischen Indikators der Erfindung.
Fig. 6 ist eine perspektivische Darstellung des Testpacks von Fig. 5.

Ausführliche Beschreibung

Mikroorganismen, die in den biologischen Indikatoren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind die üblicherweise verwendeten Mikroorganismen, die im allgemeinen um ein Mehrfaches resistenter gegen das eingesetzte Sterilisationsverfahren sind als die meisten Organismen, die man bei einer natürlichen Kontamination antrifft. Günstige Ergebnisse wurden mit Bakterien und Pilzen erhalten, die sowohl im "Sporenzustand" als auch im "vegetativen" Zustand vorkommen. Die Bakterienspore wird als die resistenteste Form mikrobischen Lebens anerkannt. Sie ist die Lebensform der Wahl bei allen Tests zur Bestimmung der Sterilisationswirksamkeit von Vorrichtungen, Chemikalien und Verfahren. Sporen von Bacillus- und Clostridium-Arten sind die zur Überwachung von Sterilisationsverfahren unter Verwendung von gesättigtem Dampf, trockener Hitze, Gammastrahlung und Ethylenoxid am häufigsten verwendeten.
Zu den besonders bevorzugten Mikroorganismen gehören Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis und Bacillus pumilus. Bacillus stearothermophilus ist besonders geeignet zur Überwachung der Sterilisation unter Dampfsterilisationsbedingungen. Bacillus subtilis ist besonders geeignet zur Überwachung der Bedingungen einer Sterilisation mit Gas und trockener Hitze.
Bacillus pumilus ist besonders geeignet zur Überwachung einer Sterilisation mit Gammastrahlen.
In einer bevorzugten biologischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt der biologische Indikator eine Quelle eines aktiven immobilisierten Enzyms.
Die für die bevorzugte Ausführungsform geeigneten Enzyme sind Enzyme, zu denen extrazelluläre und intrazelluläre Enzyme gehören, deren Aktivität mit der Lebensfähigkeit wenigstens eines Mikroorganismus korreliert, der gewöhnlich zur Überwachung der Wirksamkeit einer Sterilisation verwendet wird. Die Verwendung solcher Enzyme zur Überwachung der Wirksamkeit einer Sterilisation ist im US-Patent Nr. 5,073,488 der Anmelderin beschrieben. Nachdem der Indikator einem Sterilisationscyclus unterzogen worden ist, wird das darin enthaltene immobilisierte Enzym mit einem wäßrigen Reaktionsgemisch eines Substrats für dieses Enzym gemischt. Dann wird das Reaktionsgemisch z. B. in einem Fluorometer oder einem Kolorimeter bewertet, um die Anwesenheit von enzymmodifiziertem Produkt zu bestimmen. Das Vorliegen von nachweisbarem enzymmodifiziertem Produkt oberhalb des Untergrunds innerhalb einer bestimmten Zeitspanne (je nach der Identität des Enzyms und des Substrats, ihren jeweiligen Konzentrationen und den Inkubationsbedingungen) zeigt ein Versagen der Sterilisation an. Das Fehlen von nachweisbarem enzymmodifiziertem Produkt innerhalb der bestimmten Zeitspanne zeigt einen Sterilisationscyclus an, der für den Testorganismus letal gewesen wäre und der daher ausreichend ist.
Zu den Enzymen, die sich als geeignet erwiesen haben, gehören hydrolytische Enzyme von sporenbildenden Mikroorganismen sowie Enzyme, die von Tieren oder Pflanzen, wie Mandeln, abgeleitet sind. Zu diesen Enzymen gehören β-D-Glucosidase, α-D-Glucosidase, Alkalische Phosphatase, Saure Phosphatase, Butyrat- Esterase, Caprylat-Esterase-Lipase, Myristat-Lipase, Leucin- Aminopeptidase, Valin-Aminopeptidase, Chymotrypsin, Phosphohydrolase, α-D-Galactosidase, β-D-Galactosidase, α-L-Arabinofuranosidase, N-Acetyl-β-glucosaminidase, β-D-Cellobiosidase, Alanin-Aminopeptidase, Prolin-Aminopeptidase, Tyrosin-Aminopeptidase, Phenylalanin-Aminopeptidase, β-D-Glucuronidase und Fettsäure-Esterase, die von sporenbildenden Mikroorganismen abgeleitet sind, wie Candida-, Bacillus-, Neurospora- und Clostridium-Mikroorganismenarten.
Bei der Quelle des aktiven Enzyms kann es sich handeln um:
1) das gereinigte isolierte Enzym, das von einem geeigneten Mikroorganismus abgeleitet ist;
2) einen Mikroorganismus, der das Enzym- natürlicherweise enthält oder dem es gentechnisch hinzugefügt wurde; oder
3) einen Mikroorganismus, dem das Enzym während der Sporenbildung oder des Wachstums hinzugefügt wurde, so daß das Enzym in den Mikroorganismus eingebaut oder mit diesem assoziiert ist, z. B. ein Enzym, das während der Sporenbildung einer Spore hinzugefügt wird und das in die Spore eingebaut wird.
Vorteilhafterweise wird ein Mikroorganismus, der selbst üblicherweise zur Überwachung der Sterilisationsbedingungen verwendet wird, als Quelle des aktiven Enzyms verwendet. Mikroorganismen, die nach Beendigung des Sterilisationscyclus lebensfähig geblieben sind, werden mit Nährmedium inkubiert, um durch eine herkömmliche Technik zu bestätigen, ob die Sterilisationsbedingungen ausreichend waren, um alle Mikroorganismen im Indikator abzutöten, was anzeigt, daß die Sterilisationsbedingungen ausreichend waren, um alle Gegenstände im Sterilisator zu sterilisieren.
Mehrere verschiedene Mittel zum Immobilisieren des Mikroorganismus oder Enzyms (hier als "Biomaterial" bezeichnet) können verwendet werden. Eine besonders gut geeignete Technik besteht darin, den Mikroorganismus oder das Enzym chemisch zu immobilisieren, wobei man Verbindungen verwendet (hier als "Immobilisierungsmittel" bezeichnet), die 1) ionische und/oder kovalente Bindungen zu dem Mikroorganismus oder Enzym bilden und dadurch einen stabilen immobilisierten Komplex bilden; 2) die Moleküle des Biomaterials (hier als "Biomoleküle" bezeichnet) mit einer hygroskopischen oder hydrophilen Schicht zu überziehen, die sie vor Denaturierung schützt, oder sie darin einzuschließen; oder 3) die äußere Membran des Biomoleküls dehydratisieren, so daß ihre Thermostabilität erhöht wird.
Zu den Immobilisierungsmitteln, die zur Verwendung bei der Dampfsterilisation besonders gut geeignet sind, gehören Alditole, Di- und Trisaccharide und polymere Alkohole, die aus Polyvinylalkohol, Glycolen und Diolen ausgewählt sind. Zu den für die Ethylenoxidsterilisation geeigneten Immobilisierungsmitteln gehören Alditole, Monosaccharide einschließlich Aldosen und Ketosen, Polysaccharide, wie Di-, Tri-, Tetra-, Penta- und Hexasaccharide, Stärken, Cyclodextrine, Pectine, Guar Gum, Tragant, Gummi arabicum, Cellulosen und Kappa-Carrageen, Polylactame, wie Polyvinyllactame, sowie die oben beschriebenen polymeren Alkohole.
Die Alditole und Monosaccharide bestehen vorzugsweise aus 3 bis 6 Kohlenstoffatomen. Die Di- und Trisaccharide weisen vorzugsweise wenigstens 4 Kohlenstoffatome pro Saccharideinheit auf, und die anderen Polysaccharide weisen vorzugsweise 5 oder 6 Kohlenstoffatome pro Saccharideinheit auf. Vorzugsweise haben die Alditole und Saccharide Molekulargewichte zwischen etwa 100 und 100000 Dalton. Die Saccharide können reduzierende oder nichtreduzierende Saccharide sein. Bevorzugte polymere Alkohole haben Molekulargewichte zwischen etwa 200 und 100000 Dalton. Bevorzugte Polylactame haben Molekulargewichte von etwa 50 bis 100000 Dalton.
Zu den besonders bevorzugten. Alditolen gehören Glycerin, Threit, Ribit (allgemein als Adonit bekannt), Arabinit, Xylit, Allit, Glucit (allgemein als Sorbit bekannt), Mannit, Idit, Galactit (allgemein als Dulcit bekannt), Altrit, Erythrit, Inosit, Heptit, Octit, Nonit, Decit, Dodecit, Stracit und Polyalit.
Zu den besonders bevorzugten Aldosen gehören Glyceraldehyd, Threose, Erythrose, Ribose, Arabinose, Xylose, Lyxose, Allose, Altrose, Glucose, Mannose, Gulose, Idose, Galactose, Talose, Heptose, Octose, Nonitose, Decitose, Dodecitose, Rhamnose, Fucose, 2-Desoxyribose, Glucosamin, Galactosamin, 3-Dimethylamino-3,6-didesoxyaltose und 3-Amino-3-desoxyribose.
Zu den besonders bevorzugten Ketosen gehören Dihydroxyaceton, Erythrulose, Ribulose, Xylulose, Psicose, Fructose, Sorbose und Tagatose.
Zu den besonders bevorzugten Disacchariden gehören Arabinopyranobiose, Arabinofuranobiose, Cellobiose, Cellobiuronsäure, Chitobiose, Chondrosin, Galactobiose, Galacturonsäure, Gentobiose, Glucosylgalactose, Glucosylglucosamin, Hyalobiuronsäure, Inulobiose, Isomaltose, Kojibiose, Lactose, Laminarabiose, Maltose, Mannobiose, Melibiose, 4-Methylglucosylxylose, Nigerose, Planteobiose, Primaverose, Rutinose, Sophorose, Sucrose, Trehalose, Turanose, Vicianose und Xylobiose.
Zu den besonders bevorzugten Trisacchariden gehören Cellotriose, Gentianose, 6-O-Glucosylmaltose, Isokestose, Isomaltotriose, Isopanose, Kestose, Laminaratriose, Maltotriose, Melezitose, Neokestose, Neuraminolactose, Panose, Planteose, Raffinose und Umbelliferose.
Zu den besonders bevorzugten Tetrasacchariden gehören Cellotetraose, Maltotetraose und Stachyose. Ein besonders bevorzugtes Pentasaccharid ist Verbascose. Weitere bevorzugte Polysaccharide sind cyclische Oligosaccharide, wie Cyclomaltohexaose, Cyclomaltoheptaose und Cyclomaltooctaose, Cellulosen, wie Methylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Carboxymethylcellulose und Hydroxypropylcellulose, Gummen, Schleime, Pectine, Hemicellulosen, Lipopolysaccharide, Glycogen, Chitin und Stärke.
Zu den besonders bevorzugten polymeren Alkoholen gehören Polyvinylalkohol, Propylenglycol, Dipropylenglycol, Polyethylenglycol (MW 200 bis 100 000 Dalton), Polypropylenglycol (MW 200 bis 10000 Dalton), Etheralkohole, wie Polyethylenglycolether (MW 500 bis 50000 Dalton), Polypropylenglycolether (MW 500 bis 10000 Dalton), und Diole, wie 1,3-Butandiol, 1,5- Pentandiol, 1,6-Hexandiol, 1,7-Heptandiol, 1,8-Octandiol, 1,9- Nonandiol und 1,10-Decandiol.
Zu den besonders bevorzugten. Polyvinyllactamen gehören N-Vinyl-2-pyrrolidon, 5-Methyl-N-vinyl-2-pyrrolidon, 5-Ethyl- N-vinyl-2-pyrrolidon, 3,3-Dimethyl-N-vinyl-2-pyrrolidon, 3- Methyl-N-vinyl-2-pyrrolidon, 3-Ethyl-N-vinyl-2-pyrrolidon, 4- Methyl-N-vinyl-2-pyrrolidon, 4-Ethyl-N-vinyl-2-pyrrolidon, N- Vinyl-2-valerolactam und N-Vinyl-2-caprolactam.
Die Immobilisierungsverbindungen oder -mittel werden vorzugsweise als Beschichtungen über Mikroorganismen oder Enzymen, die sich auf herkömmlichen Trägern befinden, verwendet. Alternativ dazu werden Suspensionen der Testmikroorganismen oder Testenzyme in den Immobilisierungsmitteln hergestellt, und diese Suspensionen trägt man auf herkömmliche Trägerstreifen auf und läßt sie trocknen. Die Menge des auf das Biomaterial aufgetragenen Immobilisierungsmittels beträgt vorzugsweise etwa 1 · 10&supmin;&sup6; bis 1 · 10&supmin;¹² g/Spore oder Enzymeinheit, noch mehr bevorzugt etwa 1 · 10&supmin;&sup9; bis 1 · 10&supmin;¹¹ g/Spore oder Enzym einheit, und am meisten bevorzugt 9 · 10&supmin;¹&sup0; bis 1 · 10&supmin;¹&sup0; g/Spore oder Enzymeinheit. Vorzugsweise werden wäßrige Lösungen des Immobilisierungsmittels in Konzentrationen von 0,1 bis 98% (w/v), vorzugsweise 1 bis 70% (w/v) und am meisten bevorzugt 5 bis 50% (w/v) auf das Biomaterial aufgetragen. Vorzugsweise wird das Immobilisierungsmittel auch so auf das Biomaterial aufgetragen, daß das Substrat, welches das getrocknete Biomaterial trägt, Immobilisierungsmittel mit einem Beschichtungsgewicht von vorzugsweise etwa 1 · 10&supmin;¹ bis 1 · 10&supmin;&sup7; g/mm², noch mehr bevorzugt, etwa 1 · 10&supmin;&sup4; bis 1 · 10&supmin;&sup6; g/mm² und am meisten bevorzugt 9 · 10&supmin;&sup5; bis 1 · 10&supmin;&sup5; g/mm² umfaßt.
In der folgenden Tabelle sind besonders bevorzugte Konzentrationen mehrerer Immobilisierungsmittel in wäßriger Lösung aufgeführt, die verwendet werden sollen, um eigenständige biologische Indikatoren (BI) (d. h. ohne Verwendung von Handtüchern, Spritzen oder anderen Testpackmaterialien oder -vorrichtungen) und in herkömmlichen Testpacks zu verwendende biologische Indikatoren zur Verwendung in Dampf- und Ethylenoxid-Sterilisationscyclen herzustellen.
Zur Überwachung einer Dampfsterilisation unter Verwendung von Cyclen bei 121ºC (Schwerkraft) oder 132ºC (Vorvakuum):
Es kann sein, daß die Konzentration des Immobilisierungsmittels für biologische Indikatoren in Testpacks in stringenteren Dampfsterilisationscyclen (z. B. 121ºC oder 134ºC mit Vorvakuum) auf das Vier- bis Fünffache des oben angegebenen Wertes erhöht werden muß.
Für die Überwachung von Ethylenoxid-Sterilisation:
Die Adsorption des Mikroorganismus oder Enzyms an ein wasserunlösliches Trägermaterial ist ein weiteres Verfahren zum Immobilisieren des Biomoleküls. Geeignete Trägermaterialien binden über schwache Bindungskräfte, wie Salzbindungen, Wasserstoffbrückenbindungen und van-der-Waals-Kräfte, an den Mikroorganismus oder das Enzym und sind in der Lage, wenigstens 1 · 10² Mikroorganismen oder 0,1 Enzymeinheiten zu adsorbieren. Diese Trägermaterialiensind Calciumcarbonat, Dextranderivate (wie "Sephadex® G-Types", kommerziell erhältlich von Pharmacia), Hydroxyapatit und Silicagel.
Enzyme oder Mikroorganismen können auch durch wasserunlösliche Trägermaterialien, die Bindungen zu dem Biomolekül bilden, immobilisiert werden. Zu diesen Trägermaterialien gehören Gruppen, die mit funktionellen Gruppen auf den Molekülen des Biomaterials (oder den Biomolekülen) reagieren, wie die α- oder &epsi;-Gruppen von Lysin, Tyrosin, Histidin, Arginin oder Cystein, so daß sie an wenigstens 1 · 10² Mikroorganismen oder 0,1 Enzymeinheiten binden. Geeignete Trägermaterialien, die kovalente Bindungen an Biomoleküle bilden, weisen kovalent bindende Gruppen auf, wie Hydroxy-, Amino-, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppen. Zu den besonders geeigneten Trägermaterialien für diesen Immobilisierungstyp gehören Agarose, Cellulose, Dextran, Glas, Polyacrylamid-Copolymere, Polyaminostyrol, Collagen, Polyhydroxyalkylmethacrylat, Silica, Polyethylen, Polyester, Polystyrol, Nylon, Alkylanhydrid-Polymere, Polythiol/4-vinylpyridin, Gelatine, Polyvinylalkohol, Polyethylenterephthalat, Polyacrylnitril, Chitin, Polyurethan, Kohle, Silochrom, Titanoxid, Ferrit, Aluminiumoxid, magnetische Eisenteilchen.
Geeignete Trägermaterialien, die ionische Bindungen zu Biomolekülen bilden, weisen ebenfalls funktionelle Gruppen wie Hydroxy-, Amino-, Carboxy- oder Sulfonsäuregruppen auf. Besonders gut geeignete Trägermaterialien für diesen Immobilisierungstyp sind in Literaturstellen wie "Immobilized Enzymes and Cells", K. Mosbach, Academic Press, Inc. (1987), beschrieben; dazu gehören ionische Cellulosen, wie Aminoethyl-, Carboxymethyl-, Diethylaminoethyl- und Triethylaminoethylcellulosen, ionisches Polystyrol (wie die als "Amberlite" von Mallinckrodt Chemical Works, St. Louis, Missouri, erhältlichen), Dextran sulfat und "Sephadex® Ion Exchangers", wie Carboxymethyl-, Diethylaminoethyl-, quartär-Aminoethyl- und Sulfopropyl-substituierte "Sephadex® Ion Exchangers", die von Pharmacia kommerziell erhältlich sind.
Zum Immobilisieren unter Verwendung der Trägermaterialien wird der Mikroorganismus oder das Enzym in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert, der die Enzymaktivität nicht hemmt, mit dem Trägermaterial gemischt. Nach einer Inkubationszeit wird das unlösliche Trägermaterial mit adsorbiertem oder gebundenem Biomaterial durch Zentrifugation oder Filtration von dem Gemisch abgetrennt. Dann wird der gewonnene Feststoff als Träger für immobilisiertes Biomaterial in biologischen Indikatorvorrichtungen verwendet.
Ein weiteres Verfahren zum Immobilisieren von Enzymen oder Mikroorganismen besteht darin, das Biomaterial in einer chemisch vernetzten Polymergelmatrix einzuschließen. Das Gel besteht gewöhnlich aus nichtionischen polymerbildenden Materialien, die gegenüber Enzymen oder Mikroorganismen unreaktiv sind und die in der Lage sind, wenigstens 1 · 10² Mikroorganismen oder 0,1 Enzymeinheiten einzuschließen. Beispielhafte Gele sind Polyacrylamid-Gele, Polyacrylamidhydrazid-Gele, Calciumalginat-Gele, Kappa-Carrageen-Gele, Agar-Gele, Collagen, Cellulose-Gele, Chitrosan-Gele und Methacrylat-Gele.
Noch ein weiteres Mittel zum Immobilisieren von Mikroorganismen und Enzymen ist die Mikroverkapselung, bei der um das Biomolekül herum eine künstliche Membran geschaffen wird. Da der Membranbildungsvorgang nicht von dem besonderen Biomolekül in der Lösung abhängt, können mehrere membranbildende Materialien verwendet werden, um eine Vielzahl von Enzymen und Mikroorganismen einzukapseln. Beispielhafte Materialien, die zur Mikroverkapselung von Biomolekülen geeignet sind, sind Celluloseacetatbutyrat, Cellulosenitrat, Lipid-Polyamid, Polyethylenimin-Nylon, Nylon, Rinderserumalbumin, Polyvinylpyrrolidon, Poly(phthaloylpiperazin) und Epoxyharze. Typische Verkapselungsverfahren sind beschrieben in Journal of Molecular Catalysis, Vol. 11, S. 83 (1981); Biotechnology and Bioengineering, Vol. 17, S. 1157 (1975); Enzyme and Microbiological Technology, Vol. 4, S. 327 (1982); Enzyme and Microbiological Technology, Vol. 6, S. 135 (1984); Enzyme and Microbiological Technology, Vol. 3, S. 149 (1981); Methods in Enzymology, Vol. 112, S. 3-112 (1985); und US-Patent Nr. 4,147,767.
Die Vernetzung von Enzymen oder Mikroorganismen über ihre Aminosäureseitengruppen ist ein weiteres Immobilisierungsverfahren. Immobilisierungsmittel wie Dialdehyde, Diimidoester, Diisocyanate und Bisdiazoniumsalze werden verwendet, um eine intra- oder intermolekulare Vernetzung der Biomoleküle zu bilden. Diese Mittel müssen in der Lage sein, wenigstens 1 · 10² Mikroorganismen oder 0,1 Enzymeinheiten zu vernetzen. Geeignete Vernetzungsverfahren sind beschrieben in Annals New York Academy of Sciences, Vol. 542, S. 173-179 (1988); Annals New York Academy of Sciences, Vol. 434, S. 27-30 (1984); Biotechnology and Applied Biochemistry, Vol. 9(5), S. 389-400 (1987); Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 15(3), S. 265-278 (1987); Biotechnology Letters, Vol. 10(5), S. 325-330 (1988); Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 275(1), S. 23-32 (15. Nov. 1989); und ACTA Biochimica Polonica, Vol. 34(2), S. 145-156 (1987). Die Vernetzung stabilisiert die Konformationsstarrheit des Enzyms oder Biomoleküls und verhindert so, daß das Biomolekül denaturiert wird, etwa durch Wärme und Feuchtigkeit.
Um es zusammenzufassen: bei der praktischen Durchführung dieser Erfindung kann jedes der oben beschriebenen Immobilisierungsverfahren, d. h. chemische Immobilisierung, Adsorption oder Bindung an Träger, Einschluß, Verkapselung oder Vernetzung, oder irgendeine Kombination dieser Verfahren verwendet werden. Unabhängig von dem eingesetzten Immobilisierungsverfahren hängt das Ausmaß der Immobilisierung, die erforderlich ist, damit der biologische Indikator der vorliegenden Erfindung Ergebnisse liefert, die denen von AAMI-Testpacks äquivalent sind, von mehreren Faktoren ab. Zu diesen Faktoren gehören die Parameter des Sterilisationscyclus (z. B. Temperatur und Konzentration des Sterilisationsmittels), ob eine herkömmliche Kultur von Mikroorganismen oder Enzymsubstrate verwendet werden, um die Sterilität zu bewerten, und ob der biologische Indikator der Erfindung mit oder ohne Testpack verwendet wird.
Um eine Sterilisation mit einem eigenständigen biologischen Indikator der Erfindung (d. h. ohne Verwendung von Handtüchern, Spritzen oder anderen Testpackmaterialien oder -vorrichtungen) zu überwachen, wird der Mikroorganismus oder das Enzym vorzugsweise in einem solchen Ausmaß immobilisiert, daß nach einer Einwirkung eines Dampfsterilisationscyclus von 121ºC (Schwerkraft) während wenigstens 5 Minuten eine nachweisbare Menge des immobilisierten Biomaterials überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung dieses Sterilisationscyclus von bis zu 45 Minuten, vorzugsweise bis zu 30 Minuten, keine nachweisbare Menge des immobilisierten Biomaterials überleben bzw. aktiv bleiben kann. Zur Verwendung als eigenständiger biologischer Indikator in einem Dampfsterilisationscyclus von 132ºC (Vorvakuum) wird der Mikroorganismus oder das Enzym in einem solchen Ausmaß immobilisiert, daß nach einer Einwirkung des Cyclus während wenigstens 15 Sekunden, vorzugsweise wenigstens eine Minute, eine nachweisbare Menge des immobilisierten Biomaterials überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Cyclus während bis zu 15 Minuten, vorzugsweise bis zu 10 Minuten, keine nachweisbare Menge des Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann. Zur Verwendung als eigenständiger biologischer Indikator in einem Dampfsterilisationscyclus von 121ºC (Vorvakuum) wird der Mikroorganismus oder das Enzym vorzugsweise in einem solchen Ausmaß immobilisiert, daß nach einer Einwirkung des Cyclus während wenigstens 5 Minuten eine nachweisbare Menge des immobilisierten Biomaterials überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Cyclus während bis zu 15 Minuten keine nachweisbare Menge des Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann. Bei einem Dampfsterilisationscyclus von 134ºC (Vorvakuum) wird der Mikroorganismus oder das Enzym in der eigenständigen Vorrichtung vorzugsweise in einem solchen Ausmaß immobilisiert, daß nach einer Einwirkung des. Cyclus während wenigstens 2 Sekunden, vorzugsweise wenigstens 15 Sekunden, eine nachweisbare Menge des immobilisierten Biomaterials überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Cyclus während bis zu 10 Minuten, vorzugsweise bis zu 6 Minuten, keine nachweisbare Menge des Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann.
Zur Verwendung als eigenständiger biologischer Indikator in einem Ethylenoxidsterilisationscyclus wird der Mikroorganismus oder das. Enzym vorzugsweise in einem solchen Ausmaß immobilisiert, daß nach einer Einwirkung während wenigstens 15 Minuten eine nachweisbare Menge des immobilisierten Biomaterials überleben bzw.. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Ethylenoxidsterilisationscyclus während bis zu 250 Minuten keine nachweisbare Menge des Biomaterials überleben bzw. aktiv bleiben kann. Besonders bevorzugt bei einem Ethylenoxidsterilisationscyclus mit 600 mg Ethylenoxid pro Liter bei 54ºC und einer relativen Feuchtigkeit von 60% ist das Ausmaß der Immobilisierung ein solches, daß nach einer Einwirkung von wenigstens 20 Minuten eine nachweisbare Menge des Biomaterials überlebt bzw. aktiv bleibt, daß aber nach einer Einwirkung des Ethylenoxidcyclus während 60 Minuten, am meisten bevorzugt 40 Minuten, kein lebensfähiges oder aktives Biomaterial nachgewiesen wird. Bei einem Ethylenoxidsterilisationscyclus mit 800 mg Ethylenoxid pro Liter bei 37ºC und einer relativen Feuchtigkeit von 60% ist das Ausmaß der Immobilisierung noch mehr bevorzugt ein solches, daß nach einer Einwirkung von wenigstens 20 Minuten eine nachweisbare Menge des Biomaterials überlebt bzw. aktiv bleibt, daß aber nach einer Einwirkung des Cyclus während 120 Minuten, am meisten bevorzugt 90 Minuten, kein lebensfähiges oder aktives Biomaterial nachgewiesen wird.
Wenn der biologische Indikator dieser Erfindung nicht als eigenständige Vorrichtung, sondern zusammen mit herkömmlichen Testpackmaterialien (wie in einem kommerziell erhältlichen Testpack oder in einem AAMI-Testpack) verwendet wird, kann das Ausmaß der Immobilisierung reduziert werden, da die Testpackmaterialien das Biomaterial schützen, indem sie sich dem Sterilisationsmittel, das das immobilisierte Biomaterial erreicht, widersetzen.
Um eine Sterilisation mit einem biologischen Indikator der Erfindung zu überwachen, der sich innerhalb von Handtüchern, Spritzen oder anderen Testpackmaterialien oder -vorrichtungen befindet, wird der Mikroorganismus oder das Enzym vorzugsweise in einem solchen Ausmaß immobilisiert, daß das Biomaterial, wenn es in einer eigenständigen Vorrichtung getestet wird, die folgenden Überlebens-/Abtötungs-Merkmale aufweist. Vorzugsweise ist das Ausmaß der Immobilisierung ausreichend, so daß nach einer Einwirkung eines Dampfsterilisationscyclus von 121ºC während wenigstens 5 Minuten eine nachweisbare Menge des immobilisierten Biomaterials überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung von bis zu 15 Minuten keine nachweisbare Menge des immobilisierten Biomaterials überleben bzw. aktiv bleiben kann. Zur Verwendung zusammen mit Testpackmaterialien in einem Dampfsterilisationscyclus von 132ºC (Vorvakuum) wird der Mikroorganismus oder das Enzym in einer eigenständigen Vorrichtung vorzugsweise in einem solchen Ausmaß immobilisiert, daß nach einer Einwirkung des Cyclus während wenigstens 20 Sekunden eine nachweisbare Menge des immobilisierten Biomaterials überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Cyclus während bis zu 6 Minuten keine nachweisbare Menge des Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann. Zur Verwendung zusammen mit Testpackmaterialien in einem Dampfsterilisationscyclus von 121ºC oder 134ºC (Vorvakuum) wird der Mikroorganismus oder das Enzym in einer eigenständigen Vorrichtung vorzugsweise in einem solchen Ausmaß immobilisiert, daß nach einer Einwirkung des Cyclus während wenigstens 5 Sekunden eine nachweisbare Menge des immobilisierten Biomaterials überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Cyclus während bis zu 2 Minuten keine nachweisbare Menge des Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann.
Zur Verwendung zusammen mit Testpackmaterialien in einem Ethylenoxidsterilisationscyclus wird der Mikroorganismus oder das Enzym in einer eigenständigen Vorrichtung vorzugsweise in einem solchen Ausmaß immobilisiert, daß nach einer Einwirkung während wenigstens 15 Minuten eine nachweisbare Menge des immobilisierten Biomaterials überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer. Einwirkung des Ethylenoxidsterilisationscyclus während bis zu 90 Minuten keine nachweisbare Menge des Biomaterials überleben bzw. aktiv bleiben kann. Besonders bevorzugt bei einem Ethylenoxidsterilisationscyclus mit 600 mg Ethylenoxid pro Liter bei 54ºC und einer relativen Feuchtigkeit von 60% ist das Ausmaß der Immobilisierung ein solches, daß nach einer Einwirkung von wenigstens 15 Minuten eine nachweisbare Menge des Biomaterials überlebt bzw. aktiv bleibt, daß aber nach einer Einwirkung des Ethylenoxidcyclus während 50 Minuten kein lebensfähiges oder aktives Biomaterial nachgewiesen wird. Bei einem Ethylenoxidsterilisationscyclus mit 800 mg Ethylenoxid pro Liter bei 37ºC und einer relativen Feuchtigkeit von 60% ist das Ausmaß der Immobilisierung noch mehr bevorzugt ein solches, daß nach einer Einwirkung von wenigstens 15 Minuten eine nachweisbare Menge des Biomaterials überlebt bzw. aktiv bleibt, daß aber nach einer Einwirkung des Cyclus während 90 Minuten kein lebensfähiges oder aktives Biomaterial nachgewiesen wird.
Das Verfahren des Nachweises der Lebensfähigkeit von Mikroorganismen bei den oben beschriebenen Tests ist vorzugsweise das Heranwachsen einer. Kultur in Standardnährmedium nach 24 bzw. 48 Stunden Inkubation. Das Verfahren zum Nachweis der Enzymaktivität ist die Verwendung von Enzymsubstrat, wie es im US- Patent Nr. 5,073,488 beschrieben ist.
Der Aufbau des biologischen Indikators, in dem der immobilisierte Mikroorganismus oder das immobilisierte Enzym enthalten ist, ist für diese Erfindung nicht entscheidend. Vorzugsweise ist der biologische Indikator ein unitärer biologischer Indikator, d. h. ein Indikator, der sowohl das immobilisierte Biomaterial als auch ein Enzymsubstrat und/oder Nährmedium enthält. Beispielhafte Strukturen für solche Indikatoren sind offenbart in den US-Patenten Nr. 2,854,384, 3,346,464, 3,239,429, 3,440,144, 3,585,112, 3,661,717, 3,752,743, 3,846,242, 4,291,122, 4,304,869, 4,311,793, 4,416,984, 4,743,537, 4,596,773, 4,461,837, 4,528,268, 4,579,823, 4,580,682, 4,596,773, 4,717,661 und 4,885,253. Ein besonders bevorzugter Indikatoraufbau ist in der US-Anmeldung Serial Number 07/277,570 beschrieben. Jeder dieser biologischen Indikatoren wäre für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet, wenn das Enzym oder der Mikroorganismus so immobilisiert ist, wie es hier beschrieben ist.
Die folgende Beschreibung richtet sich auf die von der Anmelderin bevorzugten Ausführungsformen. Viele Variationen der folgenden Vorrichtungen sind möglich, die dennoch in den Umfang der vorliegenden Erfindung fallen.
Wir beziehen uns nun auf die Fig. 1 und 2. Gezeigt ist ein bevorzugter biologischer Indikator mit einem äußeren Behälter 10 in der Form eines zylindrischen Rohrs mit flüssigkeitsundurchlässigen Wänden 12, die vorzugsweise nicht gasadsorbierend sind, und einem offenen Ende 14. Der äußere Behälter 10 enthält einen Träger 16, wie einen Streifen Filterpapier, der eine vorbestimmte Menge aktives Enzym und/oder eine vorbestimmte Anzahl lebensfähiger Mikroorganismen trägt. Der äußere Behälter 10 umfaßt auch einen normalerweise versiegelten, durch Druck zu öffnenden inneren Behälter 18, wie eine zerbrechbare Glasampulle, der ein wäßriges Nährmedium und/oder ein geeignetes Enzymsubstrat, das in einer wäßrigen gepufferten Lösung 20 gelöst oder suspendiert ist, enthält. Das wäßrige Nährmedium ist bei einer Inkubation in der Lage, das Wachstum lebensfähiger Mikroorganismen zu fördern, wenn es mit ihnen in Kontakt gebracht wird, und enthält vorzugsweise einen Indikator für mikrobielles Wachstum, der die Farbe der Lösung verändert, wenn lebensfähige Mikroorganismen vorhanden sind, was einen unzureichenden Cyclus anzeigt. Das Enzymsubstrat kann mit aktivem Enzym reagieren, so daß ein lumineszierendes, fluoreszierendes, farbiges oder radioaktives Material entsteht. Der innere Behälter 18 befindet sich vorzugsweise enganliegend innerhalb des äußeren Behälters 10, so daß nur sehr wenig des Volumens des äußeren Behälters frei bleibt. Der innere Behälter 18 ist durch den Filterpapierträger 16 von der Wand 12 des äußeren Behälters. 10 getrennt. Das offene Ende 14 des äußeren Behälters 10 ist mit einem gasdurchlässigen, halbporösen Verschlußteil 22, wie einer Folie, versehen. Das Verschlußteil 22 kann dicht mit dem offenen Ende 14 des äußeren Behälters 10 verbunden werden, z. B. durch Verschweißen oder Verkleben oder mit Hilfe einer Verschlußvorrichtung 26, wie einer Kappe (in Fig. 1 nicht gezeigt), die drei hindurchführende Öffnungen 28 aufweist. Während der Sterilisation mit einem gasförmigen Sterilisationsmittel durchdringt das gasförmige Sterilisationsmittel das Verschlußteil 22 und tritt durch das Innere des äußeren Behälters 10, so daß es mit dem immobilisierten Biomaterial auf dem Träger 16 in Kontakt kommt.
Wie in Fig. 2 gezeigt, kann die Vorrichtung von Fig. 1 leicht zusammengefügt werden, indem man in das offene Ende 14 des äußeren Behälters 10 nacheinander den Träger 16 und den inneren Behälter 18 einsetzt und das offene Ende 14 des äuße ren Behälters 10 mit dem Verschlußteil 22 dicht verschließt, indem man das Verschlußteil 22 über das offene Ende 14 schiebt und dann die Verschlußvorrichtung 26 über das Verschlußteil 22 schiebt, so daß es dicht über den äußeren Behälter, 10 gesteckt ist.
Der äußere Behälter 10 besteht aus einem Material, das die hohen Temperaturen aushält, die in Dampfsterilisatoren auftreten. Herkömmliche Dampfsterilisatoren erreichen im allgemeinen Temperaturen in der Größenordnung von 121ºC bis 135ºC. Außerdem müssen die Wände des Behälters 10 für Flüssigkeiten im wesentlichen undurchlässig sein. Der äußere Behälter 10 ist vorzugsweise durchscheinend (einschließlich "transparent"), so daß eine Änderung der Fluoreszenz oder der Farbe visuell beobachtet werden kann, ohne daß man die Indikatorvorrichtung zerlegt. Vorzugsweise ist der äußere Behälter 10 außerdem ausreichend verformbar, so daß der durch Druck zu öffnende innere Behälter 18 zerbricht, wenn der äußere Behälter 10 durch äußeren Druck verformt wird. Der äußere Behälter 10 kann durch Spritzgießen oder Extrudieren geeigneter Materialien einschließlich Polycarbonat, Polypropylen, Polyamiden, Polymethylpentenen und verschiedener Polyester hergestellt werden.
Die Verschlußvorrichtung 26 kann aus jedem Material hergestellt werden, das die Sterilisationstemperaturen aushält. Wie im Falle des äußeren Behälters 10 gehören zu den geeigneten Materialien Polycarbonat, Polypropylen, Polyamide, Polymethylpentene und verschiedene Polyester, wobei Polypropylen bevorzugt ist.
Die immobilisierten Enzyme und/oder die Mikroorganismen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, befinden sich normalerweise auf einem geeigneten Träger 16. Es wird jedoch in Betracht gezogen, daß sich das immobilisierte Biomaterial auch auf den Innenwänden des äußeren Behälters 10 oder den Außenwänden des inneren Behälters 18 befinden kann oder daß das immobilisierte Biomaterial, wenn es sich in einem festen Träger befindet, lediglich in dem äußeren Behälter 10 enthalten ist und kein Träger 16 notwendig ist. Der Träger 16 ist vorzugsweise wasseraufsaugend, wie Filterpapier, und sollte das Wachstum der Mikroorganismen oder die Aktivität des Enzyms nicht hemmen. Flächige Materialien, wie Tuch, Polypropylen-, Rayon- oder Nylonvlies, und mikroporöse polymere Materialien sind besonders bevorzugt. Es können jedoch auch Metallfoliensubstrate, zum Beispiel aus Aluminium oder rostfreiem Stahl, sowie Substrate aus Glas (z. B. Glaskügelchen oder Glasfasern), Porzellan oder Kunststoff verwendet werden. Außerdem kann der Enzymträger aus einer Kombination von Materialien aufgebaut sein, wie Papier, das an einem Kunststoff- oder Glasrückenstreifen befestigt ist.
Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, ist es wünschenswert, daß der äußere Behälter 10 eine vorbestimmte Menge immobilisiertes Biomaterial enthält. Isoliertes Enzym wird unter Verwendung allgemeiner Verfahren der Proteinreinigung erhalten, wie Salzfraktionierung, Chromatographie und Elektrophorese, wie es beschrieben ist, in Colowick, S., und Kaplan, N. O. (Hrsg.)., Methods in Enzymology, Academic Press, New York, Vol. I-VII (1957-1964). Vorzugsweise liegt die Anfangskonzentration des zu immobilisierenden isolierten Enzyms zwischen etwa 0,001 und 10 000 Enzymeinheiten, noch mehr bevorzugt zwischen etwa 0,001 und 1000 Enzymeinheiten, und am meisten bevorzugt zwischen etwa 0,1 und 100 Enzymeinheiten. Wenn ein immobilisierter Mikroorganismus verwendet wird, ist es ebenfalls wünschenswert, von einer vorbestimmten ungefähern Zahl von Mikroorganismen auszugehen. Wenn der Mikroorganismus Bacillus stearothermophilus oder Bacillus subtilis ist, beträgt die bevorzugte Anzahl etwa 1 · 10² bis 1 · 10&sup8; Mikroorganismen. Wenn der Mikroorganismus B. stearothermophilus ist, sind etwa 1 · 10² bis 1 · 10&sup7; Mikroorganismen besonders bevorzugt. Wenn B. subtilis eingesetzt wird, sind etwa 1 · 10&sup6; bis 1 · 10&sup8; Mikroorganismen bevorzugt. Dann wird das Enzym oder der Mikro organismus gemäß den hier beschriebenen Verfahren immobilisiert. Dann wird vorzugsweise eine Suspension mit einer bekannten volumetrischen Konzentration an immobilisiertem Mikroorganismus oder Enzym hergestellt, und ein vorbestimmtes Volumen dieser Suspension wird verwendet, um den Träger 16 (z. B. Filterpapier) anzufeuchten. Vorzugsweise werden wenigstens 1 · 10² immobilisierte Mikroorganismen oder 0,1 Einheiten immobilisiertes Enzym auf den Träger 16 aufgebracht. Der getrocknete Träger wird dann im äußeren Behälter 10 verwendet.
Der innere Behälter 18 enthält eine wäßrige Lösung 20 mit Nährmedium und/oder einem geeigneten Enzymsubstrat. Die Typen von Nährmedien, die in der vorliegenden Erfindung in geeigneter Weise eingesetzt werden, sind in der Technik allgemein bekannt. Allgemein bekannte Indikatoren für mikrobielles Wachstum, die in Gegenwart von lebensfähigen Mikroorganismen ihre Farbe ändern, sind vorzugsweise in wenigstens einem der Behälter vorhanden. Das Wachstumsindikatormaterial ist vorzugsweise in dem wäßrigen Nährmedium löslich und verleiht ihm (beim Wachstum von Mikroorganismen) eine Farbe, so daß eine Farbänderung leicht durch die durchscheinenden Wände des äußeren Behälters beobachtet werden kann. Wenn auch ein Enzymsubstrat vorhanden ist, wird das Wachstumsindikatormaterial außerdem vorzugsweise so ausgewählt, daß es nicht die Farbe oder Lumineszenz eines enzymmodifizierten Produkts stört.
Wenn Enzymsubstrat vorhanden ist, so ist es vorzugsweise im inneren Behälter 18 in einer gepufferten wäßrigen Lösung vorhanden. Der wäßrige Puffer wirkt als Reaktionsmedium für das System aus restlichem aktiven Enzym und dem Enzymsubstrat, nachdem der innere Behälter zerbrochen wurde. Die ionischen Bedingungen der gepufferten Lösung sollten so sein, daß das Enzym und das Enzymsubstrat nicht beeinflußt werden. Vorzugsweise wählt man einen isotonen Puffer, wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl-Lösung oder Acetatpuffer.
Während das Enzymsubstrat normalerweise in dem durch Druck zu öffnenden inneren Behälter 18 enthalten ist, wird auch in Betracht gezogen, daß das Enzymsubstrat in trockener Form zusammen mit dem Enzymträger 16 im äußeren Behälter 10 enthalten sein könnte. Tatsächlich könnten das aktive Enzym und sein Substrat in trockener Form in demselben Träger 16 vorhanden sein. Bei diesem Aufbau würde der innere Behälter 18 vorzugsweise das wäßrige Reaktionsmedium tragen, das notwendig ist, damit das aktive Enzym und sein Substrat miteinander reagieren.
Der innere Behälter 18, der die wäßrige Lösung 20 des Enzymsubstrats enthält und/oder der das wäßrige Nährmedium enthält, besteht aus einem Material, das für Gase und Flüssigkeiten undurchlässig ist und das sich durch Anwendung von Druck öffnen läßt (d. h. "durch Druck zu öffnen ist"), so daß das Enzymsubstrat und/oder Nährmedium in den äußeren Behälter 10 eindringen kann. Der innere Behälter 18 besteht vorzugsweise aus einem zerbrechbaren Material, wie Glas, so daß sich der innere Behälter 18 durchbrechen oder zertrümmern läßt, wenn der äußere Behälter 10 verformt wird. In einer anderen Ausführungsform kann der innere Behälter 18 mit einem Stopfen verschlossen werden, so daß der Stopfen bei Anwendung von Druck ausgestoßen wird und der Inhalt des inneren Behälters 18 freigesetzt wird. In noch einer anderen Ausführungsform kann die Verschlußvorrichtung. 26 eine Ampullenzertrümmerungsvorrichtung enthalten, wie sie im US-Patent Nr. 4,304,869 gezeigt ist, wobei der Verschluß Klappen aufweist, die vom Boden der Verschlußvorrichtung herabhängen und die beim Herunterdrücken der Verschlußvorrichtung dazu dienen, die Ampulle zu zertrümmern. Ähnlich kann die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung auch in einem System verwendet werden, das einen Ampullenzertrümmerungsstift aufweist, der sich im Boden des äußeren Behälters 10 befindet.
Der äußere Behälter 10 weist wenigstens eine Öffnung auf, damit das Sterilisationsmittel (z. B. Dampf, Ethylenoxid) eindringen kann. Diese Öffnung ist normalerweise geschlossen oder mit einem gasdurchlässigen halbporösen Mittel verstopft. Zu den geeigneten Mitteln gehören das Verschlußteil 22, das aus faserigen Materialien wie Baumwolle, Glaswolle, Tuch, Vliesen aus Polypropylen, Rayon, Polypropylen/Rayon, Nylon, Glas oder anderen Fasern, Filterpapieren, mikroporösen hydrophoben und hydrophilen Folien, offenzelligen polymeren Schaumstoffen und semipermeablen Kunststoffolien, wie sie im US-Patent Nr. 3,346,464 beschrieben sind, besteht.
Eine bevorzugte Ausführungsform eines Sterilisationsindikators der vorliegenden Erfindung ist in den Fig. 3 und 4 gezeigt. Die Vorrichtung umfaßt einen äußeren Behälter 40 mit flüssigkeitsundurchlässigen und vorzugsweise nicht gasadsorbierenden Wänden 42 und einem offenen. Ende 44. Der äußere Behälter 40 umfaßt einen durch Druck zu öffnenden inneren Behälter 48, der eine wäßrige Lösung 50 eines geeigneten Enzymsubstrats und/oder ein wäßriges Nähemedium enthält. Das offene Ende 44 des äußeren Behälters 40 ist mit einem gasdurchlässigen, halbporösen Verschlußteil 52 bedeckt. Damit endet die Ähnlichkeit mit der in Fig. 1 abgebildeten Vorrichtung. Bei der Vorrichtung der Fig. 3 und 4 befindet sich der Träger 46 am unteren, geschlossenen Ende des äußeren Behälters 40, und eine Sperre 47 befindet sich wie ein Stopfen zwischen dem Träger 46 und dem durch Druck zu öffnenden inneren Behälter 48. Die Sperre 47 besteht vorzugsweise aus Vliesen aus Fasern wie Baumwolle, Rayon, Polypropylen, Polypropylen/Rayon-Gemischen, Nylon oder Glas. Am meisten bevorzugt besteht die Sperre 47 aus einem Polypropylenvlies, wie "Thinsulate® 200-B Brand Thermal Insulation", kommerziell erhältlich von 3M, St. Paul, MN.
Die Sperre 47 dient dazu, den Träger 46 gegenüber dem inneren Behälter 48 zu isolieren, so daß kalte Flecken vermieden wer den, wo sich der innere Behälter 48 über dem Träger 46 befinden kann. Die Existenz kalter Flecken kann dazu führen, daß sich auf dem Träger 46 ein Kondensat sammelt. Das Kondensat kann die Aktivität des auf dem Träger 46 vorhandenen Enzyms beeinflussen. Die Sperre 47 ist vorzugsweise aus einem hydrophoben Material hergestellt, so daß sich wachsende Mikroorganismen und/oder enzymmodifiziertes Produkt um den Träger herum konzentrieren und nicht schnell in den Bereich des Behälters hineindiffundieren, der sich auf der anderen Seite der Sperre befindet. Das Aufrechterhalten einer höheren Konzentration an wachsenden Mikroorganismen und/oder enzymmodifiziertem Produkt im unteren Teil des Indikators ermöglicht es, das Produkt, ob es nun lumineszent oder farbig ist, nach einer kürzeren Inkubationszeit nachzuweisen, als wenn der Träger 46 mit dem gesamten Inhalt des inneren Behälters 48 umgesetzt würde.
Der Verschluß 56 umfaßt ein Oberteil 57 und davon herabhängende Seitenwände 59. Der Verschluß hat einen hohlen Körper, der unten offen ist, wobei der Innendurchmesser des Verschlusses etwa gleich dem Außendurchmesser des äußeren Behälters 40 ist, so daß der Verschluß 56 fest über das offene Ende 44 des äußeren Behälters 40 gesteckt werden kann. In die Seitenwände 59 sind vorzugsweise mehrere Fenster 58 hineingeschnitten. Wenn die Indikatorvorrichtung in eine zu sterilisierende Beladung eingebracht wird, wird der Verschluß 56 so über die Öffnung im äußeren Behälter gesteckt, daß die äußeren Seitenwände 42 des äußeren Behälters die Fenster 58 nicht blockieren. In einer solchen Position kann Sterilisationsmittel im Sterilisator in den äußeren Behälter 40 eindringen, indem es durch die Fenster 58 strömt. Nach Beendigung des Sterilisationscyclus kann der Verschluß vollständig eingeführt werden, indem man ihn herunterdrückt, so daß die Seitenwände 42 des äußeren Behälters dicht gegen die Innenfläche des Oberteils 57 gedrückt werden und dadurch die Fenster 58 blockieren. Dann ist das Innere des äußeren Behälters 40 gegenüber der äußeren Umgebung abgeschlossen.
Bei der Verwendung wird der in den Fig. 3 und 4 abgebildete biologische Indikator zusammen mit mehreren Gegenständen, die zum Beispiel durch Dampf oder Ethylenoxidgas sterilisiert werden sollen, in eine Sterilisationskammer gebracht. Wenn sich der Indikator im Sterilisator befindet, ist der Verschluß 56 in der offenen Position, so daß die Fenster 58 offen sind und das Sterilisationsmittel eindringen kann. Wenn das Sterilisationsmittel in die Kammer eingeleitet wird, dringt das Sterilisationsmittel durch das Verschlußteil 52 und gelangt durch die Sperre 47, so daß es das auf dem Träger 46 vorhandene Enzym inaktiviert und die Mikroorganismen abtötet. Am Ende des Sterilisationscyclus wird das Sterilisationsmittel durch gefilterte Luft ersetzt. Der Sterilitätsindikator wird aus dem Sterilisator genommen, der Verschluß 56 wird vollständig eingeführt, um die Fenster 58 zu blockieren, und die Glasampulle 48 wird zum Beispiel durch Fingerdruck aufgebrochen, so daß die wäßrige Lösung des Enzymsubstrats und/oder das Nährmedium mit dem Enzymträger 46 in Kontakt kommt. Dann wird der Indikator in eine geeignete Inkubationsumgebung gebracht.
Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird das Auftreten einer Farbänderung oder Lumineszenz durch die durchscheinenden Wände 42 des äußeren Behälters 40 hindurch beobachtet oder spektrophotometrisch gemessen und zeigt an, daß der Sterilisationscyclus nicht das gesamte auf dem Träger 46 vorhandene Enzym inaktiviert oder alle Mikroorganismen abgetötet hat, und zeigt somit an, daß der Sterilisationscyclus vielleicht unzureichend war, um die Gegenstände im Sterilisator vollständig zu sterilisieren. Das Fehlen jeder Farbänderung oder Lumineszenz zeigt an, daß der Sterilisationscyclus ausreichend war, um das gesamte Enzym auf dem Träger 46 zu inaktivieren oder alle Testmikroorganismen abzutöten, und somit ausreichend war, um die Gegenstände im Sterilisator zu sterilisieren.
Der biologische Indikator dieser Erfindung kann in jedem Typ üblicherweise verwendeter Testpackmaterialien oder -vorrichtun gen verwendet werden. Beispielhafte Testpacks sind der "1278 AttestTM EO Pack" und der "1276 AttestTM Steam Pack", beide kommerziell erhältlich von 3M, sowie die in den US-Patenten Nr. 4,739,881, 4,828; 797, 4,839,291, 4,636,472, 4,918,003 sowie in den Europäischen Patenten Nr. 421 760, 419 282 und 255 229 offenbarten Vorrichtungen. Der biologische Indikator dieser Erfindung kann auch in Kunststoffspritzen, Handtuchpacks oder anderen Testpackvorrichtungen, wie sie von der AAMI, dem British Department of Health Standards, den DIN-Standards und dem Committee of European Normalization empfohlen werden, verwendet werden. Die Anmelderin hat gefunden, daß die Verwendung von immobilisiertem Biomaterial Testpacks ergibt, die diese Standards unter strengeren Sterilisationsbedingungen leicht nachbilden können, wie bei Dampfsterilisationscyclen mit 121ºC (Schwerkraft und Vorvakuum) sowie 132ºC und 134ºC (Vorvakuum). Dies gilt insbesondere, wenn Enzymaktivität verwendet wird, um die Sterilisationswirksamkeit zu bewerten, wie es im US-Patent Nr. 5,073,488 beschrieben ist.
Die Fig. 5 und 6 zeigen einen bevorzugten Testpack 100, der den biologischen Indikator 11 dieser Erfindung enthält. Der Testpack 100 ist ähnlich dem im US-Patent Nr. 4,918,003 offenbarten und besteht aus einer Box 1021 die zum Beispiel die Gesamtabmessungen 134 mm mal 140 mm mal 28 mm haben kann. Die Box besteht aus unlackiertem gebleichtem Sulfatpapier.
Die Box enthält einen offenen Behälter 108, der ebenfalls aus gebleichtem Sulfatpapier besteht und der auf seinen Außenflächen mit einer dampfundurchlässigen thermoplastischen Beschichtung 110, wie einem Polypropylenlaminat, beschichtet ist. Der Behälter 108 ist so dimensioniert, daß er nur geringfügig kleiner ist als die Box 102.
Im Behälter 108 sind zwei Stapel mit Blättern, 112 und 114, aus halbporösem Material enthalten, die durch einen Stapel mit Blättern 116, ebenfalls aus halbporösem Material, voneinander getrennt sind. Jeder der Stapel aus halbporösem Material ist vorzugsweise aus Filterpapier mit einer ungefähren flächenbezogenen Masse von 97 kg (214 pound) pro 280 m² (3000 ft²) und einer ungefähren Dicke von 1 mm pro Blatt gebildet. Die Stapel 112 und 114 umfassen vorzugsweise 20 bis 55 Blätter Filterpapier.
Der halbporöse Stapel 116 kann aus ungefähr 16 Blättern Filterpapier bestehen, wobei eine Fläche 118 von 13 mm mal 49 mm aus der Mitte jedes Blattes herausgeschnitten ist, um den biologischen Indikator 11 dieser Erfindung aufzunehmen. Die Höhe dieses zentralen Kerns beträgt im zusammengebauten und trockenen Zustand ungefähr 10 mm.
In der Praxis wird der Testpack der Anmelderin geöffnet, indem man die Lasche 122 der Box öffnet, die oberen halbporösen Blätter werden entfernt, und der von einer Metallspiralfeder 120, vorzugsweise aus Edelstahl, umgebene biologische Indikator 11 wird in den Hohlraum im mittleren Teil des Stapels gebracht. Die Spiralfeder 120 reduziert den Druck der Filterpapierstapel auf den biologischen Indikator 11 während des Sterilisationscyclus, um den inneren Behälter 18 nicht vorzeitig zu zerdrücken. Dann werden die oberen Blätter wieder zurückgelegt, und die Box verschlossen. Dann wird die Box in einen Sterilisator mit einer normalen Beladung gebracht und einem herkömmlichen Cyclus unterworfen.
Wenn das Sterilisationsmittel aufgrund der Gegenwart von Lufttaschen im Sterilisator oder aufgrund von unzureichender Zeit, Temperatur etc. des Sterilisationscyclus nicht durch die porösen und halbporösen Stapel dringen kann, wird verhindert, daß das Sterilisationsmittel die Mikroorganismen im biologischen Indikator abtötet oder das Enzym inaktiviert.
Sobald der Sterilisationscyclus beendet ist, wird der Testpack 100 aus dem Sterilisator genommen, die Lasche 122 der Box wird geöffnet, und die Stapel mit Blättern werden entfernt, um einen raschen Zugang zum biologischen Indikator 11 zu erhalten. Dann wird der biologische Indikator mit der Nährlösung und/oder dem Enzymsubstrat inkubiert, um eine Farbänderung oder Fluoreszenz zu offenbaren.
Der Testpack der vorliegenden Erfindung bildet die Dampfdurchlässigkeitseigenschaften des im AAMI-Standard beschriebenen biologischen Standard-Testpack nach und offenbart eine fehlende Sterilität im wesentlichen unter denselben Bedingungen wie der Standard-AAMI-Testpack.
Der biologische Indikator und der Testpack der vorliegenden Erfindung wurden in erster Linie unter Bezugnahme auf Sterilisationsmedien wie Ethylenoxid, eine Vielzahl von Dampfsterilisationscyclen (einschließlich 121ºC mit Vorvakuum und Schwerkraft sowie 132ºC und 134ºC mit Vorvakuum) und dergleichen beschrieben. Der Indikator ist jedoch nicht auf diese Verwendungen beschränkt und kann ebenso verwendet werden, um die Wirksamkeit anderer Sterilisationsmedien anzuzeigen, wie trockener Hitze, Strahlung, Propylenoxid, Methylbromid, Ozon, Chlordioxid, Formaldehyd sowie anderer gasförmiger und flüssiger Mittel.
Die Erfindung wird anhand der folgenden, nicht einschränkenden Beispiele erläutert.

Beispiele

Beispiel 1

Dieses Beispiel zeigt, daß die biologischen Indikatoren dieser Erfindung, die immobilisierte Sporen und Enzyme umfassen, ohne Verwendung einer herkömmlichen Testpackvorrichtung Ergebnisse der Sterilisationswirksamkeit liefern können, die sowohl unter den Bedingungen einer Sterilisationseinwirkung von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft) als auch. 132ºC (270ºF) (Vorvakuum) mit denen herkömmlicher biologischer Indikatoren (BIs) in einem AAMI-Testpack mit sechzehn Handtüchern vergleichbar sind.

Herstellung von Sporenstreifen

Bacillus stearothermophilus, der von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, als "ATCC 7953" kommerziell erhältlich ist, wurde über Nacht ungefähr 16 Stunden lang bei 58ºC in tryptischem Sojanährmedium gezüchtet. Diese Kultur wurde verwendet, um die Oberflächen von Agar zu beimpfen, der in Platten enthalten war, die aus 8 g/l Nährbrühe, 4 g/l Hefeextrakt, 0,1 g/l Manganchlorid und 20 g/l Agar mit einem pH von 7,2 bestand. Die beimpften Platten wurden 72 Stunden bei 58ºC inkubiert. Sporen wurden von den Platten entnommen und in sterilem destilliertem Wasser suspendiert. Die Sporen wurden von vegetativen Trümmern abgetrennt, indem man die Suspension 20 Minuten bei 4ºC mit 7000 U/min zentrifugierte. Der Überstand wurde abgegossen, und die Sporen wurden in sterilem destilliertem Wasser resuspendiert. Diese Reinigungsprozedur wurde mehrmals wiederholt.
Die Bacillus stearothermophilus-Sporen wurden in einer Population von 7,5 · 10&sup5; Sporen pro Streifen auf Streifen von Filterpapier von 6,35 · 9,52 mm (1/4 · 3/8 inch), die von Schleicher & Schuell, Inc., Keene, NH, als "S&S #903 Grade Filter Paper" kommerziell erhältlich sind, aufgetragen und getrocknet. Dies wurde erreicht, indem man eine Suspension der Sporen in Wasser mit einer Konzentration von 7,5 · 10&sup7; Sporen/ml herstellte und 10 ul dieser Suspension auf jeden Filterpapierstreifen pipettierte und den Streifen unter Umgebungsbedingungen trocknen ließ.

Immobilisierung von Sporen

Das folgende Verfahren zur Immobilisierung der auf den Sporenstreifen vorhandenen Sporen und sporengebundenen Enzyme wurde eingesetzt. Die Streifen mit Sporen von Bacillus stearothermophilus wurden mit einer der folgenden wäßrigen Lösungen eines chemischen Immobilisators beschichtet: "D-Sorbit", kommerziell erhältlich von Pfizer, New York, NY, oder "Polyethylenglycol", kommerziell erhältlich als "Carbowax® PEG-1450" von der Union Carbide Corporation, Danbury, CT, in prozentualen Konzentrationen (w/v), die in den Tabellen 1 und 2 näher angegeben sind, so daß man Beschichtungsgewichte von ungefähr 2,75 · 10&supmin;&sup5; bis 3,75 · 10&supmin;&sup5; g/mm² pro Einzelstreifen erhielt. Dies wurde erreicht, indem man 50 ul eines der Immobilisatoren auf den Sporenstreifen pipettierte und die beschichteten Sporenstreifen 24 Stunden unter Umgebungsbedingungen trocknen ließ.

Zusammenbau von Vorrichtungen der Erfindung

Vorrichtungen wurden so aufgebaut, wie es in den Fig. 3 und 4 gezeigt ist, mit dem immobilisierten Sporenstreifen 46 auf dem Boden der äußeren Kammer des Gläschens 42 und einer Sperre 47 zwischen der enzymsubstrathaltigen Ampulle 48 und dem Sporenstreifen. Eine Scheibe aus geblasenem Polypropylen-Mikrofasermaterial mit einem Durchmesser von 1,75 cm (11/16 inch) und einem Gewicht von 200 g/m², kommerziell erhältlich, als "Thinsulate® 200-B Brand Thermal Insulation" von 3M, St. Paul, MN, wurde als Sperre 47 verwendet. Die Ampulle 48 enthielt 0,67 ml Nährmedium, das aus 17 g bakteriologischem Pepton und 0,17 g L-Alanin bestand, sowie 0,1 g des Enzymsubstrats 4- Methylumbelliferyl-α-D-glucosid, das von der Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, kommerziell erhältlich ist, und 0,03 g Bromkresolpurpur als pH-Indikatorfarbstoff pro Liter destilliertes Wasser. Der pH-Wert des Enzymsubstrats und des Nährmediums wurde mit 1,0 N Natriumhydroxid auf 7,6 eingestellt. Der äußere Behälter 42 und der Verschluß 56 bestanden aus Polypro pylen. Der äußere Behälter 42 war 5,08 cm (2,0 inch) lang mit einem Außendurchmesser von 89 mm (0,335 inch) und einem Innendurchmesser von 85 mm (0,303 inch). Der Verschluß 56 war 1,66 cm (0,510 inch) lang mit einem Innendurchmesser von 1,07 mm (0,328 inch). Die innere Ampulle 48 bestand aus Glas und war 3,96 cm (1,56 inch) lang mit einem Außendurchmesser von 6,5 mm (0,258 inch) und einer Wanddicke von 2,5 mm (0,010 inch). Das Verschlußteil 52 war ein Stück Nahtmaterial "Monatec 5111-067" mit einem Durchmesser von 1,27 cm (0,5 inch), das von Monadnock Paper Mills, Inc., Bennington, NH, kommerziell erhältlich ist.

Zusammenbau herkömmlicher Testpacks

Die Leistungsfähigkeit von Chargen der oben beschriebenen biologischen Indikatorvorrichtungen mit sechs bis acht Einheiten wurde mit herkömmlichen Dampftestpacks der Association for the Advancement of Medical Instrumentation (AAMI) und mit herkömmlichen biologischen Indikatoren, die nicht in Testpacks enthalten sind, verglichen. Jeder AAMI-Handtuchpack bestand aus 16 frisch gewaschenen "Drellhandtüchern", die von der American Linen Supply Co., Minneapolis, MN, kommerziell erhältlich sind, in gutem Zustand, von denen jedes ungefähr 40,6 · 66 cm (16 · 26 inch) maß. Jedes Handtuch wurde der Länge nach zu Dritteln zusammengelegt und der Breite nach zur Hälfte zusammengelegt. Dann wurden die Handtücher aufeinandergelegt, wobei die Faltungen einander gegenüber lagen, so daß ein Stapel von ungefähr 23 · 23 15 cm (9 · 9 · 6 inch) entstand. In jeden Handtuchstapel wurden vier "AttestTM 1262/1262P Biological Indicators" (Chargen-Nr. 057, Dez. 91) oder vier "AttestTM 1291 Rapid Readout Biological Indicators" (Chargen- Nr. 085, Dez. 91), die von 3M, St. Paul, MN, kommerziell erhältlich sind, zwischen das achte und neunte Handtuch des Stapels von unten gelegt. Die Testpacks wurden mit Autoklavenband befestigt.

Vergleichstest

Die Vorrichtungen der Erfindung und Kontrollen (die aus einem herkömmlichen AttestTM 1262/1262P Biological Indicator und einem biologischen Kontrollindikator bestanden, die hergestellt wurden, wie es oben beschrieben ist, aber ohne Immobilisierung), die nicht in AAMI-Testpacks enthalten waren und in Metallinstrumentenschalen gelegt wurden, sowie die herkömmlichen biologischen AAMI-Testpacks wurden in einem Schwerkraftverdrängungs- und vakuumunterstützten Dampfsterilisator, der als "Amsco EagleTM Model 3000" von der American Sterilizer Company, Erie, PA, kommerziell erhältlich ist, 16, 18, 20, 22 und 24 Minuten lang einem Cyclus von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft) (Tabelle 1) sowie 0, 1,5, 3,0 und 10,0 Minuten lang einem Cyclus von 132ºC (270ºF) (Vorvakuum), 2 Pulse (Tabelle 2) unterzogen. Nach der Einwirkung wurden die herkömmlichen biologischen Indikatoren aus dem AAMI-Testpack mit sechzehn Handtüchern entnommen. Die inneren Ampullen sowohl der Indikatoren dieser Erfindung als auch der herkömmlichen biologischen Indikatoren wurden zertrümmert, und die Einheiten wurden bei 60ºC inkubiert. Für die Vorrichtungen, die ein Enzymsubstrat verwenden, um ein Überleben von Sporen anzuzeigen (d. h. alle der Erfindung sowie die herkömmlichen Testpacks einschließlich des 1291er "AttestTM Biological Indicator (BI)", wurde ein "AttestTM 190 Auto-Reader", der von 3M, St. Paul, MN, kommerziell erhältlich ist, verwendet, um die α-Glucosidase- Aktivität fluorometrisch abzulesen, indem die 4-Methylumbelliferyl-Fluoreszenz nach 4 bzw. 8 Stunden Inkubation gemessen wurde. Das Sporenwachstum, wie es durch eine Farbänderung angezeigt wird, die vom pH-Indikator hervorgerufen wird, wurde für alle Einheiten nach 24, 48 bzw. 168 Stunden Inkubation visuell bestimmt.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 angegeben. In den Tabellen der Beispiele steht BI für "biologischer Indikator". Tabelle 1 Einwirkung von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft) - Zahl der positiven von 6 oder 8 getesteten Einheiten Tabelle 1 (Fortsetzung)
Das Symbol (---) zeigt an, daß kein Immobilisator verwendet wurde oder daß keine Ablesungen vorgenommen wurden. Tabelle 2 Einwirkung von 132ºC (270ºF) (Vorvakuum) - Zahl der positiven von 6 getesteten Einheiten
Das Symbol (---) zeigt an, daß kein Immobilisator verwendet wurde oder daß keine Ablesungen vorgenommen wurden.
Die oben vorgelegten Daten zeigen, daß die biologischen Indikatoren der Erfindung, die mit D-Sorbit und Polyethylenglycol immobilisierte Sporen und sporengebundene Enzyme verwenden, Ergebnisse über das Überleben/Abtöten und über die Ablesezuverlässigkeit liefern können, die mit denen von herkömmlichen biologischen Indikatoren, die in AAMI-Testpacks verwendet werden, vergleichbar sind. Die biologischen Indikatoren der Erfindung liefern einen schnellen und bequemen Nachweis der Sterilisationswirksamkeit, ohne daß Testpackmaterialien oder -vorrichtungen verwendet werden müssen.

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt, daß biologische Indikatoren der Erfindung, die immobilisierte α-Glucosidase umfassen, Ergebnisse der Sterilisationswirksamkeit liefern, die bei Sterilisationseinwirkungen von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft) und 132ºC (270ºF) (Vorvakuum) mit denen herkömmlicher biologischer Indikatoren in einem AAMI-Testpack mit sechzehn Handtüchern vergleichbar sind.

Herstellung von Enzymstreifen

Lyophilisierte, gereinigte α-Glucosidase (Chargen-Nr. 001) von Bacillus stearothermophilus mit einer spezifischen Aktivität von 100 Einheiten/mg wurde von Unitika Ltd., Kyoto, Japan, erhalten. Die α-Glucosidase (0,1 g) wurde in 1 ml sterilem destilliertem Wasser suspendiert. Die Enzymsuspension wurde 24 Stunden lang gegen 1. 1 steriles destilliertes Wasser dialysiert, wobei eine "Spectra/Por® Molecularporous Membrane", die von Spectrum Medical Industries Inc., Los Angeles, CA, kommerziell erhältlich ist, mit einer Molekulargewichtsgrenze von 3500 Dalton verwendet wurde. Die dialysierte Enzymsuspension wurde bei 4.00 aufbewahrt, bis sie gebraucht wurde. Verdünnungen von dialysierter α-Glucosidase wurden in sterilem destilliertem Wasser hergestellt, so daß man Endkonzentrationen an Enzym von 750 bzw. 1500 Einheiten/ml erhielt. Diese Verdünnungen von α- Glucosidase wurden auf Streifen von Filterpapier von 6,35 · 28,58 mm (1/4 · 3/8 inch), die von Schleicher & Schuell, Inc., Keene, NH, als "S&S #903 Grade Filter Paper" kommerziell erhältlich sind, aufgetragen und getrocknet. Dies wurde erreicht, indem man 100 ul jeder Suspension auf jeden Filterpapierstreifen pipettierte und den Streifen unter Umgebungsbedingungen trocknen ließ.

Immobilisierung des Enzyms

Das folgende Verfähren zur Immobilisierung des Enzyms wurde eingesetzt. Streifen mit α-Glucosidase wurden mit den folgenden wäßrigen Lösungen eines chemischen Immobilisators beschichtet: "D-Sorbit", kommerziell erhältlich von Pfizer, New York, NY, und Polyethylenglycol, kommerziell erhältlich als "Carbowax® PEG-1450" von der Union Carbide Corporation, Danbury, CT, in prozentualen Konzentrationen (w/v), die in den Tabellen 3 und 4 näher angegeben sind, so daß man Beschichtungsgewichte von ungefähr 2,75 · 10' Æ5 bis 3,75 · 10&supmin;&sup5; g/mm² pro Einzelstreifen erhielt. Dies wurde erreicht, indem man 50 ul der obigen Lösung von Immobilisatorverbindungen auf den enzymbeschichteten Streifen pipettierte. Man ließ die immobilisierten Enzymstreifen 24 Stunden unter Umgebungsbedingungen trocknen, und dann wurden Vorrichtungen zusammengebaut.

Zusammenbau von Vorrichtungen

Vorrichtungen wurden unter Verwendung des immobilisierten Enzymstreifens so aufgebaut, wie es in den Fig. 3 und 4 gezeigt und in Beispiel 1 beschrieben ist.
Zehn Chargeneinheiten der oben beschriebenen biologischen Indikatorvorrichtung (in Metallinstrumentenschalen gelegt) und herkömmliche biologische Indikatoren in Dampftestpacks der Association for the Advancement of Medical Instrumentation (AAMI) wurden einem Sterilisationscyclus unterzogen, wie er in Beispiel 1 beschrieben ist.
Die Vorrichtungen der Erfindung und die herkömmlichen biologischen AAMI-Testpacks wurden in dem in Beispiel 1 beschriebenen Sterilisator gleichzeitig 16, 18 bzw. 20 Minuten lang einem Cyclus von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft) (Tabelle 1) sowie 0, 1,5 bzw. 3,0 Minuten lang einem Cyclus von 132ºC (270ºF) (Vorvakuum), 2 Pulse (Tabelle 2), unterzogen. Nach der Einwirkung wurden die herkömmlichen biologischen Indikatoren aus den AAMI-Testpacks entnommen, die inneren Ampullen sowohl der Vorrichtungen der Erfindung als auch der herkömmlichen biologischen Indikatoren wurden zertrümmert, und die Einheiten wurden bei 60ºC inkubiert. Die Enzymaktivität und das Sporenwachstum wurden so gemessen, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Bei den Vorrichtungen der Erfindung konnte kein Sporenwachstum gemessen werden, da sie gereinigtes Enzym und keine Sporen verwendeten, um ein Versagen der Sterilisation nachzuweisen.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 und 4 angegeben. Tabelle 3 Einwirkung von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft) - Zahl der positiven von 10 getesteten Einheiten
Das Symbol (---) zeigt an, daß kein Immobilisator verwendet wurde oder daß keine Ablesungen vorgenommen wurden. Tabelle 4 Einwirkung von 132ºC (270ºF) (Vorvakuum) - Zahl der positiven von 10 getesteten Einheiten
Das Symbol (---) zeigt an, daß kein Immobilisator verwendet wurde oder daß keine Ablesungen vorgenommen wurden.
Die oben vorgelegten Daten zeigen, daß die biologischen Indikatoren der Erfindung, die mit D-Sorbit und PEG-1450 immobilisierte α-Glucosidase verwenden, eine Ablesung über das Überleben/Abtöten liefern können, die mit der von herkömmlichen biologischen Indikatoren, die in AAMI-Testpacks verwendet werden, vergleichbar sind.

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt die Korrelation zwischen den biologischen Indikatoren dieser Erfindung und herkömmlichen biologischen Indikatoren in einem AAMI-Testpack mit sechzehn Handtüchern, um die Wirksamkeit von Sterilisationscyclen von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft) und 132ºC (270ºF) (Vorvakuum) zu bestimmen.
Bacillus stearothermophilus, der von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, als "ATCC 7953" kommerziell erhältlich ist, wurde so gezüchtet, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
Die Bacillus stearothermophilus-Sporen wurden auf Filterpapier aufgetragen, getrocknet und immobilisiert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, aber in einer Population von 1 · 10&sup5; Sporen pro Streifen. Dies wurde erreicht, indem man eine Suspension der Sporen in Wasser mit einer Konzentration von 1 · 10&sup7; Sporen/ml herstellte und 10 ul dieser Suspension auf jeden Filterpapierstreifen pipettierte und den Streifen unter Umgebungsbedingungen trocknen ließ.
Vorrichtungen, wie sie in den Fig. 1 und 2 gezeigt sind, wurden unter Verwendung des immobilisierten Sporenstreifens aufgebaut, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, außer daß die. Vorrichtung keine Sperre 47 enthielt.
Drei Chargeneinheiten der Vorrichtungen, die immobilisierte Bacillus stearothermophilus-Sporen enthielten, und Kontrollen (AttestTM 1262/1262P und der gemäß Beispiel 1 hergestellte biologische Kontrollindikator), die nicht in Testpacks enthalten waren und die in Metallinstrumentenschalen gelegt wurden, sowie herkömmliche biologische Indikatoren in AAMI-Dampftestpacks (hergestellt, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist) wurden Dampfsterilisationscyclen von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft) (Tabelle 5) und 132ºC (270ºF) (Vorvakuum) (Tabelle 6) unterzogen, und das Sporenwachstum wurde bewertet, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 5 und 6 angegeben. Tabelle 5 Einwirkung von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft) - Zahl der positiven von 3 getesteten Einheiten
Das Symbol (---) zeigt an, daß kein Immobilisator verwendet wurde oder daß keine Ablesungen vorgenommen wurden. Tabelle 6 Einwirkung von 132ºC (270ºF) (Vorvakuum) - Zahl der positiven von 3 getesteten Einheiten
Die Vorrichtungen dieser Erfindung waren so gestaltet, daß sie bei einer Einwirkung von Dampfcyclen von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft) und 132ºC (270ºF) (Vorvakuum) eine mikrobielle Herausforderung ergaben, die gleich oder größer ist als die mikrobielle Herausforderung, die AAMI-Testpacks mit biologischem Indikator ergeben. Die oben vorgelegten Daten zeigen, daß die Erfindung, die mit D-Sorbit und PEG-1450 immobilisierte Sporen verwendet, diese Anforderungen erreicht und übertrifft.

Beispiel 4

Dieses Beispiel zeigt die Wirkung verschiedener Konzentrationen der Immobilisierungsmittel D-Sorbit und PEG-1450 auf die Zeiten des Überlebens/Abtötens für immobilisierte Bacillusstearothermophilus-ATCC-7953-Sporen und sporengebundenes Enzym bei Einwirkungen von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft).
Alle Sporen wurden auf Nähragarmedium gezüchtet, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
Die Bacillus-stearothermophilus-Sporen wurden aufgetragen, getrocknet und immobilisiert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
Vorrichtungen wurden aufgebaut, wie es in den Fig. 3 und 4 gezeigt und in Beispiel 1 beschrieben ist.
Drei Chargeneinheiten der oben beschriebenen Vorrichtungen und des biologischen Kontrollindikators, der gemäß Beispiel 1 hergestellt wurde, wurden in Metallinstrumentenschalen gelegt und 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 bzw. 25 Minuten lang einem Dampfsterilisationscyclus von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft) unterzogen, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die inneren Ampullen der Vorrichtungen wurden zertrümmert, und die Einheiten wurden bei 60ºC inkubiert. Die Enzymaktivität und das Sporenwachstum wurden so bewertet, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Enzymaktivität ist in Tabelle 7 angegeben, und das Sporenwachstum ist in Tabelle 8 angegeben. Tabelle 7 Einwirkung von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft) - Zahl der positiven von 3 getesteten Einheiten Tabelle 8 Einwirkung von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft) - Zahl der positiven von 3 getesteten Einheiten
Die oben vorgelegten Daten zeigen, daß die Immobilisierung von Sporen und sporengebundenen Enzymen mit wachsenden Konzentrationen an D-Sorbit und PEG-1450 die Einwirkungszeit erhöht, die erforderlich ist, um die Sporen auf dem Sporenstreifen abzutöten und das Enzym zu zerstören.

Beispiel 5

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung von D-Sorbit zur Verstärkung der Leistungsfähigkeit des Überlebens/Abtötens des sporengebundenen Enzyms und der Sporen, wenn man sie in herkömmlichen Testpacks (wie sie in Fig. 5 gezeigt sind) bei einer Einwirkung von 132ºC (270ºF) (Vorvakuum) verwendet.
Alle Sporen wurden auf Nähragarmedium gezüchtet, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
Suspensionen von Bacillus stearothermophilus-Sporen und D-Sorbit in Wasser mit den in Tabelle 11 angegebenen Gewichtsprozentkonzentrationen wurden hergestellt. Dies wurde erreicht, indem man gewaschene Bacillus stearothermophilus-Sporen in einer Konzentration von 7,5 · 107 Sporen/ml in 10%igen und 20%igen (w/v) Lösungen von D-Sorbit suspendierte. Die Suspensionen wurden gemischt und in einer Population von 7,5 · 10&sup5; Sporen pro Streifen auf Streifen von Filterpapier von 6,35 · 9,52 mm (1/4 · 3/8 inch), die von Schleicher & Schuell, Inc., Keene, NH, als "S&S #903 Grade Filter Paper" kommerziell erhältlich sind, aufgetragen und getrocknet. Dies wurde erreicht, indem man 10 ul Suspension auf jeden Filterpapierstreifen pipettierte und den Streifen unter Umgebungsbedingungen trocknen ließ.
Vorrichtungen wurden aufgebaut, wie es in den Fig. 3 und 4 gezeigt und in Beispiel 1 beschrieben ist.
Drei Chargeneinheiten der oben beschriebenen Vorrichtungen und von herkömmlichen biologischen Indikatoren ("AttestTM Rapid Readout Biological Indicator 1291" (Chargen-Nr. 085, Dezember 1991)) wurden in "AttestTM 1276 Test Packs" gebracht, die von 3M, St. Paul, MN, kommerziell erhältlich sind.
Die Testpacks, die die biologischen Indikatoren der Erfindung verwendeten, und die herkömmlichen biologischen Indikatorpacks wurden 055, 1 bzw. 4 Minuten lang einem Dampfsterilisationscyclus von 132ºC (270ºF) (Vorvakuum), 2 Pulse, unterzogen, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die biologischen Indikatoren wurden aus den Testpacks entnommen, die inneren Ampullen wurden zertrümmert, und jede Einheit wurde bei 60ºC inkubiert. Die Enzymaktivität und das Sporenwachstum wurden so bewertet, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 angegeben. Tabelle 9 Einwirkung von 132ºC (270ºF) (Vorvakuum) - Zahl der positiven von 3 getesteten Einheiten
Die oben vorgelegten Daten zeigen, daß Bacillus stearothermophilus-Sporen und sporengebundenes Enzym, α-Glucosidase, die mit relativ geringen Konzentrationen von D-Sorbit immobilisiert sind, die Überlebenszeit für Sporen in herkömmlichen Testpacks so erhöhen können, daß sie die Leistungsfähigkeit herkömmlicher biologischer Indikatoren in diesen Testpacks übersteigen. Durch eine erhöhte Sporenüberlebenszeit wird die Leistungsfähigkeit des Testpacks verbessert, da ein größerer Teil des Sterilisationscyclus überwacht werden kann.

Beispiel 6

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung anderer immobilisierender Verbindungen zum Immobilisieren von Bacillus stearothermophilus-Sporen. Die folgende Liste von Verbindungen (und Quellen) wurde verwendet:
"myo-Erythrit", Sigma® Chemical Co., St. Louis, MO
"Adonit", Sigma® Chemical Co.
"Dulcit", Sigma® Chemical Co.
"D-Mannit", Sigma® Chemical Co.
"Xylit", Sigma® Chemical Co.
"D-Arabinit", Sigma® Chemical Co.
"D-(+)-Cellobiose", Sigma® Chemical Co.
"Sucrose", Sigma® Chemical Co.
"meso-Inosit", Sigma® Chemical Co.
"Glycerin", Aldrich Chem. Co., Inc., Milwaukee, WI
"Polyvinylalkohol (PVA)", Aldrich Chem. Co., Inc.
"Trehalose", Sigma® Chemical Co.
"Lactose", Sigma® Chemical Co.
"Raffinose", Sigma® Chemical Co.
"Melezitose", Sigma® Chemical Co.
"Maltose", Sigma® Chemical. Co.
Bacillus stearothermophilus, der als "ATCC 7953" kommerziell erhältlich ist, wurde so gezüchtet, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
Die Bacillus stearothermophilus-Sporen wurden in einer Population von 1 · 10&sup5; Sporen pro Streifen aufgetragen, getrocknet und mit einem der oben aufgeführten chemischen Immobilisatoren immobilisiert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
Vorrichtungen wurden unter Verwendung des immobilisierten Sporenstreifens aufgebaut, wie es in den Fig. 1 und 2 gezeigt und in Beispiel 3 beschrieben ist.
Drei Chargeneinheiten der oben beschriebenen Vorrichtungen (in Metallinstrumentenschalen gelegt) und herkömmliche biologische Indikatoren in AAMI-Dampftestpacks (wie in Beispiel 1 beschrieben) wurden gleichzeitig 15, 18, 21, 24, 27 bzw. 30 Minuten lang einem Dampfsterilisationscyclus von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft) unterzogen, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die inneren Ampullen der biologischen Indikatoren wurden zertrümmert, und die Einheiten wurden bei 56ºC inkubiert. Das Sporenwachstum wurde so bewertet, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, und die Ergebnisse sind in Tabelle 10 angegeben. Tabelle 10 Einwirkung von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft) - Zahl der positiven von 3 getesteten Einheiten Tabelle 10 Einwirkung von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft) - Zahl der positiven von 3 getesteten Einheiten Tabelle 10 Einwirkung von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft) - Zahl der positiven von 3 getesteten Einheiten Tabelle 10 Einwirkung von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft) - Zahl der positiven von 3 getesteten Einheiten
Die oben vorgelegten Daten zeigen die Verwendung einer Vielzahl immobilisierender Verbindungen, um biologische Indikatoren zu erhalten, die Zeitpunkte des Überlebens/Abtötens und eine Ablesezuverlässigkeit haben, die mit denen von herkömmlichen biologischen Indikatoren, die in Testpacks verwendet werden, vergleichbar sind.

Beispiel 7

Dieses Beispiel zeigt mehrere Enzyme, die mit Bacillus stearothermophilus assoziiert sind und die für die praktische Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind. In diesem Beispiel wurde ein Enzymsubstrat-Kit verwendet, der als "API- XYMTM System" von API Analytab Products-, Plainview, NY, kommerziell erhältlich ist. Dieser Kit bestand aus 19 verschiedenen dehydratisierten chromogenen enzymatischen Substraten, die einzeln in eine Reihe von Mikroansätzen abgepackt waren. Durch die Zugabe einer wäßrigen Probe zu jedem Mikroansatz wird das Substrat rehydratisiert. Der Testkit wurde während einer gewünschten Zeitspanne inkubiert, und die Reaktionen wurden nach der Zugabe der mit dem System mitgelieferten Detektorreagentien visuell abgelesen.
Bacillus stearothermophilus-Sporen "ATCC 7953" wurden so gezüchtet, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
Die Bacillus stearothermophilus-Sporen wurden in einer Population von 1 · 10&sup5; Sporen pro Streifen auf Streifen von Filterpapier aufgetragen und getrocknet, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Dies wurde erreicht, indem man eine Suspension der Sporen in Wasser mit einer Konzentration von 1 · 10&sup7; Sporen/ml herstellte und 10 ul dieser Suspension auf jeden Filterstreifen pipettierte und den Streifen unter Umgebungsbedingungen trocknen ließ. Die Sporen wurden immobilisiert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, wobei man "D-Sorbit" in einer prozentualen Konzentration von 30% (w/v) verwendete.
Vorrichtungen wurden unter Verwendung der Sporenstreifen aufgebaut, wie es in den Fig. 3 und 4 gezeigt und in Beispiel 1 beschrieben ist.
Drei Chargeneinheiten der Vorrichtung der Erfindung wurden im Sterilisator 15 bzw. 30 Minuten lang einem Cyclus von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft) unterzogen, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Nach der Einwirkung wurden die Sporenstreifen aseptisch entfernt und in jeden Mikroansatz im Enzymsubstrat- Kit übergeführt, und 100 ul steriles tryptisches Sojanährmedium wurde in jeden Napfgegeben. Ein Kit enthielt die immobilisierten Sporenstreifen, die. 15 Minuten lang behandelt worden waren, ein zweiter Kit enthielt die immobilisierten Sporenstreifen, die 30 Minuten lang behandelt worden waren, und der dritte Kit enthielt unbehandelte immobilisierte Sporenstreifen.
Die Kits wurden 7,5 Stunden lang bei 56ºC inkubiert. Nach der Inkubation wurden die mit dem API-XYMTM-System erhältlichen Detektorreagentien A und B hinzugefügt, um das Substrat zu entwickeln. Der Nachweis einer Farbe in einem Mikroansatz zeigt jeweils die Gegenwart aktiver Enzyme an. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 angegeben. Tabelle 11
0 = keine Farbentwicklung
1 = schwache Entwicklung
2, 3, 4 = mit der Zahl zunehmende mittlere Farbentwicklung
5 = starke Farbentwicklung
Die oben vorgelegten Daten zeigen mehrere Enzyme, die natürlicherweise in Bacillus stearothermophilus-Sporen vorkommen und die eine ausreichende Aktivität besitzen, um für die praktische Durchführung der Erfindung geeignet zu sein. Alle bewerteten Enzyme, die natürlicherweise in Bacillus stearothermophilus vorkommen, zeigten nach einem ineffektiven Sterilisationscyclus von 15 Minuten eine nachweisbare Aktivität, aber nach einer Einwirkung von 30 Minuten keine Aktivität mehr. Mehrere Enzyme kommen nicht natürlicherweise in Bacillus stearothermophilus vor und zeigten im behandelten oder unbehandelten Zustand keine Aktivität.

Beispiel 8

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung verschiedener Chemikalien zum Immobilisieren von Bacillus subtilis-Sporen. Die folgenden immobilisierenden Verbindungen (mit ihren Quellen aufgeführt) wurden verwendet:
"myo-Erythrit", Sigma® Chemical Co., St. Louis, MO
"Adonit", Sigma
"Dulcit", Sigma
"D-Mannit", Sigma
"Xylit", Sigma
"Polyol-P", Pfizer, New York, NY
"D-Arabinit", Sigma
"D-(+)-Cellobiose", Sigma
"Sucrose", Sigma
"myo-Inosit", Sigma
"Glycerin", Aldrich Chem. Co., Inc., Milwaukee, WI
"Dipropylenglycol", Aldrich
"Polyvinylalkohol", Aldrich
"Polyvinylpyrrolidon K = 90", GAF® Chem. Co., Wayne, NJ
"Trehalose", Sigma
"L-Sorbose", Sigma
"Lactose", Sigma
"D-Glucose", Sigma
"Raffinose", Sigma
"Melezitose", Sigma
"D-Fructose", Sigma
"L-Arabinose", Sigma
"Stärke"
"Sorbit", Pfizer
"Cyclodextrin", American Maize-Product Co., Hammond, Indiana
"D-Ribose", Sigma
"Pectin", Sigma
"Guar Gum", Sigma
"Tragant", Sigma
"Gummi arabicum", Sigma
"Kappa-Carrageen", Sigma
"Maltose", Sigma
"Polyethylenglycol (Carbowaxs® PEG-1450)", Union Carbide
Bacillus subtilis "ATCC 9372" wurde 16 Stunden lang bei. 37ºC in tryptischem Sojanährmedium gezüchtet. Diese Kultur wurde verwendet, um die Oberfläche von Agarplatten zu beimpfen, die aus 8 g/l Nährbrühe, 0,011 g/l Mangansulfat und 20 g/l Agar mit einem pH von 7,2 bestanden. Die Platten wurden 6 Tage lang bei 37ºC inkubiert, und die Sporen wurden von den Platten abgekratzt und in sterilem destilliertem Wasser suspendiert. Die Sporen wurden von vegetativen Trümmern abgetrennt, indem man die Suspension 20 Minuten bei 4ºC mit 7000 U/min zentrifugierte. Der Überstand wurde abgegossen, und die Sporen wurden in sterilem destilliertem Wasser resuspendiert. Diese Reinigungsprozedur wurde mehrmals wiederholt.
Die Bacillus subtilis-Sporen wurden in einer Population von 1 · 10&sup6; Sporen pro Streifen auf Filterpapierstreifen von 6,35 · 28,58 mm (1/4 · 3/8 inch) aufgetragen und getrocknet, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Streifen mit Sporen von Bacillus subtilis wurden mit einer Lösung eines der oben aufgeführten Immobilisatoren mit den in Tabelle 12 näher an gegebenen prozentualen Konzentrationen (w/v) beschichtet, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist, und trocknen gelassen.
Vorrichtungen wurden unter Verwendung der immobilisierten Sporenstreifen aufgebaut, wie es in den Fig. 1 und 2 gezeigt und in Beispiel 3 beschrieben ist.
Drei Chargeneinheiten der oben beschriebenen Vorrichtungen und der gemäß Beispiel 1 hergestellten Kontrolle, beide in Metallinstrumentenschalen gelegt, sowie herkömmlicher biologischer Indikatoren ("AttestTM Rapid Readout 1264 Biological Indicator") in "AttestTM 1278 Test Packs" (Chargen-Nr. 215, Juni 1992), die Vob 3M, St. Paul, MN, kommerziell erhältlich sind, wurden 30 Minuten lang bei 54ºC und 60% relativer Feuchtigkeit vorkonditioniert und dann 15, 18, 21, 24, 27 bzw. 30 Minuten lang bei 54ºC und 60% relativer Feuchtigkeit in einem Ethylenoxidsterilisator des Typs "Joslyn EO Bier Vessel", der von Joslyn Valve, Macedon, NY, kommerziell erhältlich ist, 600 mg/l Ethylenoxid ausgesetzt.
Nach der Einwirkung wurden die inneren Ampullen der Vorrichtungen der Erfindung aseptisch entfernt, und in das äußere Gefäß jeder Einheit wurden 0,67 ml einer Lösung von 17 g/l bakteriologischem Pepton, 0,17 g/l L-Alanin und 0,03 g/l Triphenyltetrazoliumchlorid gegeben. Die herkömmlichen biologischen Indikatoren wurden aus den Testpacks entnommen, und ihre inneren Ampullen wurden zertrümmert. Alle Einheiten wurden bei 37ºC inkubiert. Das Sporenwachstum, wie es durch eine Farbänderung angezeigt wurde, die durch den pH-Indikator hervorgerufen wurde, wurde nach 24, 48 bzw. 168 Stunden Inkubation visuell bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 angegeben. Tabelle 12 Einwirkung von Ethylenoxid - Zahl der positiven von 3 getesteten Einheiten Tabelle 12 Einwirkung von Ethylenoxid - Zahl der positiven von 3 getesteten Einheiten Tabelle 12 Einwirkung von Ethylenoxid - Zahl der positiven von 3 getesteten Einheiten Tabelle 12 Einwirkung von Ethylenoxid - Zahl der positiven von 3 getesteten Einheiten Tabelle 12 Einwirkung von Ethylenoxid - Zahl der positiven von 3 getesteten Einheiten Tabelle 12 Einwirkung von Ethylenoxid - Zahl der positiven von 3 getesteten Einheiten Tabelle 12 Einwirkung von Ethylenoxid - Zahl der positiven von 3 getesteten Einheiten
Die Daten zeigen, daß immobilisierte Bacillus subtilis-Sporen, die ohne herkömmliche Testpacks verwendet werden, Indikatoren für Ethylenoxid-Sterilisation ergeben, deren Zeiten des Überlebens/Abtötens genauso gut oder besser sind als die von herkömmlichen biologischen Indikatoren für Ethylenoxid in herkömmlichen Testpacks. Das Überleben von Sporen nach Einwirkungen von 30 Minuten zeigt jedoch die Notwendigkeit an, die Immobilisatorkonzentration zu senken, damit der Indikator der Erfindung herkömmliche biologische Indikatortestpacks simulieren kann.

Beispiel 9

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung der in Tabelle 13 aufgeführten Verbindungen (Polyole und verwandte Verbindungen benötigen eine breite Beschreibung für immobilisierende Verbindungen, die für Ethylenoxid geeignet sind) zum Immobilisieren von Bacillus subtilis-Sporen und ihrem Exoenzym β- Glucosidase.
Sporen von Bacillus subtilis "ATCC 9372" wurden so gezüchtet, wie es in Beispiel 8 beschrieben ist. Die Bacillus subtilis- Sporen wurden so aufgetragen, getrocknet und immobilisiert, wie es in Beispiel 8 beschrieben ist, aber in einer Population von 1 · 10&sup7; Sporen pro Streifen.
Vorrichtungen wurden unter Verwendung der immobilisierten Sporenstreifen zusammengebaut, wie es in den Fig. 3 und 4 gezeigt und in Beispiel 1 beschrieben ist.
Drei Chargeneinheiten dieser Vorrichtungen wurden zusammen mit den Chargeneinheiten herkömmlicher biologischer Indikatoren, "AttestTM Ethylene Oxide Biological Indicator 1264" in "1278 AttestTM Test Packs" (Chargen-Nr. 215, Juni 1992), die von 3M, St. Paul, MN, kommerziell erhältlich sind, in Metallinstrumentenschalen gelegt. Die Indikatoren der Erfindung und die herkömmlichen biologischen Indikatoren in Testpacks wurden 30 Minuten lang bei 54ºC und 60% relativer Feuchtigkeit vorkonditioniert. Dann wurden die Vorrichtungen 20, 30, 60 bzw. 120 Minuten lang bei 54ºC und 60% relativer Feuchtigkeit in einem "Joslyn EO Bier Vessel", der von Joslyn Valve, Macedon, NY, kommerziell erhältlich ist, 600 mg/l Ethylenoxid ausgesetzt.
Nach der Einwirkung wurden die inneren Ampullen der Vorrichtungen der Erfindung aseptisch entfernt, und in jede Einheit wurden 0,67 ml einer Lösung von 17 g/l bakteriologischem Pepton, 0,17 g/l L-Alanin, 0,03 g/l Triphenyltetrazoliumchlorid und 0,1 g/l 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucosid, das von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, kommerziell erhältlich ist, gegeben. Die herkömmlichen biologischen Indikatoren wurden aus den Testpacks entnommen, und ihre inneren Ampullen wurden zertrümmert. Alle Einheiten wurden bei 37ºC inkubiert. Ein "AttestTM 190 Auto-Reader", der von 3M kommerziell erhältlich ist, wurde verwendet, um die β-Glucosidase-Aktivität fluorometrisch abzulesen, indem die 4-Methylumbelliferyl-Fluoreszenz nach 8 Stunden Inkubation gemessen wurde. Das Sporenwachstum, wie es durch eine Farbänderung angezeigt wird, die vom pH- Indikator hervorgerufen wird, wurde nach 24, 48 bzw. 168 Stunden Inkubation visuell bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 angegeben. Tabelle 13 Einwirkung von Ethylenoxid - Zahl der positiven von 3 getesteten Einheiten Tabelle 13 Einwirkung von Ethylenoxid - Zahl der positiven von 3 getesteten Einheiten
Die Daten zeigen, daß immobilisierte Bacillus subtilis-Sporen, die ohne herkömmliche Testpacks verwendet werden, Indikatoren für Ethylenoxid-Sterilisation ergeben, deren Zeiten des Überlebens/Abtötens genauso gut oder besser sind als die von herkömmlichen biologischen Indikatoren für Ethylenoxid in herkömmlichen Testpacks. Das Überleben von Sporen nach Einwirkungen von 30 Minuten zeigt jedoch die Notwendigkeit an, die Immobilisatorkonzentration zu senken, damit der Indikator der Erfindung herkömmliche biologische Indikatortestpacks simulieren kann.

Beispiel 10

Dieses Beispiel zeigt, daß biologische Indikatoren dieser Erfindung, die durch Adsorption auf unlösliche Trägermaterialien immobilisierte α-Glucosidase umfassen, Ergebnisse der Sterilisationswirksamkeit liefern, die bei Einwirkungen von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft) mit denen herkömmlicher biologischer Indikatoren in AAMI-Testpacks mit sechzehn Handtüchern vergleichbar sind.

Herstellung des Enzyms

Gereinigte α-Glucosidase (Chargen-Nr. 001) von Bacillus stearothermophilus wurde von Unitika Ltd., Kyoto, Japan, erhalten. Lyophilisierte α-Glucosidase (10 000 Einheiten) mit einer spezifischen Aktivität von 100 Einheiten/mg Protein wurde in 1 ml sterilem destilliertem Wasser suspendiert. Diese Suspension wurde 24 Stunden lang gegen 1 l steriles destilliertes Wasser dialysiert, wobei eine "Spectra/Por® Molecularporous Membrane", die von Spectrum Medical Industries Inc.,. Los Angeles, CA, kommerziell erhältlich ist, mit einer Molekulargewichtsgrenze von 3500 Dalton verwendet wurde. Die dialysierte Enzymsuspension wurde bei 4ºC aufbewahrt, bis sie gebraucht wurde. Verdünnungen von dialysierter α-Glucosidase wurden in sterilem destilliertem Wasser hergestellt, so daß man 50 ml Suspension mit einer Enzymkonzentration von 200 Einheiten/ml erhielt.

Immobilisierung des Enzyms

Die Immobilisierung des Enzyms durch Adsorption an die Trägermaterialien "DEAE-Sephadex® A-50", "cm-Sephadex® C-50", beide von Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ, kommerziell erhältlich, "Silica Gel 60 Angstroms", von American Scientific Products, McGraw Park, IL, kommerziell erhältlich, Hydroxyapatit und Calciumcarbonat, beide von EM Science, Cherry Hill, NJ, kommerziell erhältlich, wurde durch das folgende Verfahren erreicht.
Die fünf Trägermaterialien wurden durch Suspension in geeigneten Pufferlösungen wie folgt äquilibriert. DEAE-Sephadex, 0,5 g, Silicagel, 1 g, Hydroxyapatit, 1 g, und Calciumcarbonat, 1 g, wurden jeweils getrennt in 100 ml Lösung von 0,01 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,3, suspendiert und 2 Tage lang unter Umgebungsbedingungen äquilibriert. cm-Sephadex, 0,5 g, wurde in 100 ml 0,01 M Natriumacetatpuffer, pH 4,6, suspendiert und 2 Tage lang äquilibriert. Dann wurden die äquilibrierten Trägermaterialien 30 Minuten bei 4ºC mit 7000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Die Sedimente der Trägermaterialien wurden dann resuspendiert, indem man 10 ml α-Glucosidase-Lösung, 200 Einheiten/ml, hinzufügte und unter Verwendung eines Schwingschüttlers 1 Stunde lang unter Umgebungsbedingungen vorsichtig mischte.
Der Enzym/Träger-Komplex wurde durch Zentrifugation mit 7000 U/min bei 4ºC während 15 Minuten sedimentiert. Der Überstand wurde dekantiert und aufbewahrt. Man ließ den Enzym/Träger-Komplex 4 Tage lang unter Umgebungsbedingungen trocknen. Der getrocknete Enzym/Träger-Komplex wurde bei 4ºC aufbewahrt, bis er benötigt wurde.
Die Messung der Menge der auf den fünf Trägermaterialien immobilisierten α-Glucosidase wurde wie folgt durch Bestimmung des Wertes der Enzymaktivität in Einheiten, die im Überstand verblieb, der nach der Immobilisierung der α-Glucosidase auf dem Trägermaterial gewonnen wurde, durchgeführt.
In einem Reagensglas wurden 900 ul 20 mM p-Nitrophenyl-α-D- glucopyranosid, das von der Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, kommerziell erhältlich, ist, in sterilem destilliertem Wasser mit 100 ul einer 1 : 100-Verdünnung des Überstandes in destilliertem Wasser gemischt. Nach 15 Minuten bei 30ºC wurden 1000 ul 0,2 M Natriumcarbonat in das Reagensglas gegeben, um die Enzym-Substrat-Reaktion abzubrechen. Die Erhöhung der Extinktion bei 400 nm aufgrund der Bildung des Substratprodukts p-Nitrophehol wurde gegenüber Kontrollen bestimmt, bei denen das Enzym weggelassen wurde. Ein molarer Extinktionskoeffizient von 18,1 cm² pro umol wurde verwendet, um die Menge des im Überstand enthaltenen Substratprodukts zu berechnen. Eine Einheit der Enzymaktivität ist definiert als die Menge α-Glucosidase, die bei 30ºC 1 umol p-Nitrophenol pro Minute bildet. Die im Überstand enthaltenen Enzymeinheiten wurden von 2000 Einheiten abgezogen, was die im getrockneten Enzym/Träger- Komplex enthaltenen Enzymeinheiten ergab. Die Enzymeinheiten in den getrockneten Enzym/Träger-Produkten sind in Tabelle 14 angegeben.

Zusammenbau von Vorrichtungen

Vorrichtungen wurden so aufgebaut, wie es in den Fig. 3 und 4 gezeigt und in Beispiel 1 beschrieben ist, außer daß 0,1 g des getrockneten Enzym/Träger-Produkts in den äußeren Behälter 40 gegeben wurden, bevor man die Sperre 47 im äußeren Behälter plazierte.
Drei Chargeneinheiten der Vorrichtungen der Erfindung, die aus immobilisierter α-Glucosidase bestanden, wurden in Metallin strumentenschalen gelegt. Drei "AttestTM Biological Indicators 1262/1262P" und drei "AttestTM Rapid Readout Biological Indicators 1291", die von 3M, St. Paul, MN, kommerziell erhältlich sind, wurden in AAMI-Dampftestpacks zwischen das achte und neunte Handtuch des Stapels von unten gelegt. Die Testpacks wurden mit Autoklavenband befestigt.
Die Vorrichtungen der Erfindung und die herkömmlichen biologischen AAMI-Testpacks wurden in einem Dampfsterilisator des Typs "Amsco EagleTM Model 3000" 16, 18 bzw. 20 Minuten lang einem Cyclus von 250ºF (132ºC) (Schwerkraft) unterzogen. Nach der Einwirkung wurden die herkömmlichen biologischen Indikatoren aus den AAMI-Testpacks mit den sechzehn Handtüchern entnommen. Die inneren Ampullen der Vorrichtungen der Erfindung und der herkömmlichen biologischen Indikatoren wurden zertrümmert, und die Einheiten wurden bei 60ºC inkubiert. Ein "AttestTM 190 Auto-Reader" wurde verwendet, um die α-Glucosidase-Aktivität abzulesen, indem die 4-Methylumbelliferyl- Fluoreszenz nach 4 bzw. 8 Stunden Inkubation gemessen wurde. Tabelle 14 Durch Adsorption auf Träger immobilisiertes Enzym
Die oben vorgelegten Daten zeigen, daß die biologischen Indikatoren der Erfindung, die durch Adsorption auf verschiedene wasserunlösliche Trägermaterialien immobilisierte α-Glucosidase verwenden, Ergebnisse über das Überleben/Abtöten liefern können, die mit denen von herkömmlichen biologischen Indikatoren in AAMI-Testpacks vergleichbar sind.

Beispiel 11

Dieses Beispiel zeigt die Verwendung des chemischen Immobilisators D-Sorbit zur Verstärkung der Leistungsfähigkeit des Überlebens/Abtötens des sporengebundenen Enzyms und der Sporen, wenn man sie mit und ohne herkömmliche Testpacks (wie sie in den Fig. 5 und 6 gezeigt sind) in einem Vorvakuum- Dampfsterilisationscyclus (121ºC) der European Sterilization Equipment Company verwendet.
Bacillus stearothermophilus-Sporen wurden gezüchtet, auf Filterpapier aufgetragen und mit "D-Sorbit" immobilisiert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Biologische Indikatoren dieser Erfindung wurden so aufgebaut, wie es in den Fig. 3 und 4 gezeigt und in Beispiel 1 beschrieben ist.

Zusammenbau von Testpacks

Testpacks wurden so aufgebaut, wie es in den Fig. 5 und 6 gezeigt ist. Der Testpack 100 bestand aus einer Box 102 mit Gesamtabmessungen von 134 mm (5,36 inch) mal 140 mm (5,60 inch) mal 28 mm (1,12 inch). Die Box bestand aus unlackiertem gebleichtem Sulfatpapier.
Die Box enthielt einen offenen Behälter 108, der ebenfalls aus gebleichtem Sulfatpapier bestand und der auf seinen Außenflächen mit einer dampfundurchlässigen thermoplastischen Beschichtung 110 aus Polypropylenlaminat beschichtet war. Der Behälter 108 war so dimensioniert, daß er nur geringfügig kleiner war als die Box 102.
Im Behälter 108 waren zwei Stapel mit Blättern, 112 und 114, aus halbporösem Material enthalten, die durch einen Stapel mit Blättern 116, ebenfalls aus halbporösem Material, voneinander getrennt waren. Jeder Stapel aus halbporösem Material war aus Filterpapier mit einer ungefähren flächenbezogenen Masse von 97 kg (214 pound) pro 280 m² (3000 ft²) und einer ungefähren Dicke von 1 mm pro Blatt gebildet. Die Stapel 112 und 114 umfaßten 36 Blätter Filterpapier.
Der halbporöse Stapel 116 bestand aus 16 Blättern Filterpapier, wobei eine Fläche 118 von 13 mm mal 49 mm aus der Mitte jedes Blattes herausgeschnitten war, um den biologischen Indikator 11 dieser Erfindung aufzunehmen. Die Höhe dieses zentralen Kerns betrug im zusammengebauten und trockenen Zustand ungefähr 10 mm.
Der Testpack wurde geöffnet, indem man die Lasche 122 der Box öffnete, die oberen halbporösen Blätter wurden entfernt, und ein von einer Metallspiralfeder 120, vorzugsweise aus Edelstahl, umgebenerherkömmlicher biologischer Indikator oder ein biologischer Indikator dieser Erfindung wurden in den Hohlraum im mittleren Teil des Stapels gebracht. Dann wurden die oberen Blätter wieder zurückgelegt, und die Box verschlossen.

Vergleichstest

Die Vorrichtungen der Erfindung, die allein und in den oben beschriebenen Testpacks verwendet wurden, und Kontrollen, die aus herkömmlichen "AttestTM 1262 Biological Indicators" und "AttestTM 1291 Rapid Readout Biological Indicators" in den oben beschriebenen Testpacks bestanden, wurden in Metallinstrumentenschalen gelegt und in einem Schwerkraftverdrängungs- und vakuumunterstützten Dampfsterilisator, der als "GetingeTM PACs 2000 High Vacuum Sterilizer" von GetingeTM International, Inc., Lakewood, NJ, kommerziell erhältlich ist, 6, 6,5, 7 bzw. 15 Minuten lang einem Sterilisationscyclus von 121ºC (250ºF) (Schwerkraft), 3 negative Pulse, unterzogen. Die Einstellungen am Sterilisator waren so, wie es in Tabelle 16 angegeben ist.
Der Cyclus ist ein Vorvakuumcyclus der European Sterilization Equipment Company. Nach der Einwirkung wurden die biologischen Indikatoren so bewertet, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 17 angegeben. Tabelle 16 GetingeTM PACs 2000 High Vacuum Sterilizer Tabelle 17 Einwirkung von 121ºC (Vorvakuum) - Zahl der positiven von 3 getesteten Einheiten
Das Symbol (---) zeigt an, daß kein Immobilisator verwendet wurde oder daß keine Ablesungen vorgenommen wurden.
Die Vorrichtungen dieser Erfindung waren so gestaltet, daß sie bei einer Einwirkung von Dampfsterilisationscyclen (einschließlich European-Sterilisationscyclen) eine mikrobielle Herausforderung ergaben, die gleich oder größer ist als die mikrobielle Herausforderung, die herkömmliche Testpacks ergeben. Die in Tabelle 17 angegebenen Daten zeigen, daß die biologischen Indikatoren dieser Erfindung (mit und ohne Testpacks) diese Anforderungen erreichen und übertreffen.

Beispiel 12

Beispiel 12 zeigt die Verwendung des chemischen Immobilisators D-Sorbit zur Verstärkung der Leistungsfähigkeit des Überlebens/Abtötens des sporengebundenen Enzyms und der Sporen, wenn man sie mit und ohne herkömmliche Testpacks (wie sie in den Fig. 5 und 6 gezeigt sind) in einem Vorvakuum-Dampfsterilisationscyclus (134ºC (272ºF)) der European Sterilization Equipment Company verwendet.
Bacillus stearothermophilus, der von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, als "ATCC 7953" kommerziell erhältlich ist, wurde so gezüchtet, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Bacillus stearothermophilus-Sporen wurden auf Filterpapier aufgetragen, getrocknet und immobilisiert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Vorrichtungen mit biologischen Indikatoren wurden unter Verwendung des immobilisierten Sporenstreifens so aufgebaut, wie es in Beispiel 1 beschrieben und in den Fig. 3 und 4 gezeigt ist.
Drei Chargeneinheiten der Vorrichtungen, die immobilisierte Bacillus-stearothermophilus-Sporen enthielten und die allein und in den in Beispiel 13 beschriebenen Testpacks verwendet wurden, sowie herkömmliche "AttestTM 1262 Biological Indicators" und "AttestTM 1291 Rapid Readout Biological Indicators" in den in Beispiel 13 beschriebenen herkömmlichen Dampftestpacks wurden in Metallinstrumentenschalen gelegt. Sie wurden in einem Schwerkraftverdrängungs- und vakuumunterstützten Sterilisator, der als "GetingeTM PACs 2000 High Vacuum Sterilizer" von Getinge International, Inc., Lakewood, NJ, kommerziell erhältlich ist, 0, 2, 4, 6, 8, 10 bzw. 12 Sekunden lang einem Sterilisationscyclus von 134ºC (272ºF) (Vorvakuum), 3 negative Pulse, 4 positive Pulse, unterzogen.
Die Einstellungen am Sterilisator waren so, wie es in Tabelle 18 angegeben ist. Den Cyclus ist ein Vorvakuumcyclus der European Sterilization Company. Nach der Einwirkung wurden die biologischen Indikatoren so bewertet, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 angegeben. Tabelle 18 GetingeTM PACs 2000 High Vacuum Sterilizer Tabelle 19 Einwirkung von 134ºC (272ºF) (Vorvakuum) - Zahl der positiven von 3 getesteten Einheiten
Das Symbol (---) zeigt an, daß kein Immobilisator verwendet wurde oder daß keine Ablesungen vorgenommen wurden.
Die Daten in Tabelle 19 oben zeigen, daß die biologischen Indikatoren der Erfindung, die mit D-Sorbit immobilisierte Sporen und sporengebundenes Enzym verwenden (mit und ohne Testpacks), eine größere mikrobielle Herausforderung ergeben als herkömmliche biologische Indikatoren, die in herkömmlichen Dampfsterilisations-Testpacks verwendet werden.
Das folgende sind Warenzeichen:
"1278 AttestTM EO Pack"
"1276 AttestTM Steam Pack"
"AttestTM 1262/1262P Biological Indicator"
"Amsco EagleTM Model 3000"
"AttestTM Biological Indicator"
"AttestTM 190 Auto-Reader"
"AttestTM 1276 Test Pack"
"API-XYMTM System"
"AttestTM 1264 Biological Indicator".
"AttestTM 1278 Test Pack"
"AttestTM Ethylene Oxide Biological Indicator 1264"
"AttestTM 1262 Biological Indicator"
"GetingeTM PACs 2000 High Vacuum Sterilizer"
"GetingeTM International, Inc."
"AttestTM 1291 Biological Indicator"
"Sephadex® G-Types"
"Sepharose® Ion Exchanger"
"Sephadex® Ion Exchanger"
"Thinsulate® 200-B Brand Thermal Insulation"
"Carbowax® PEG-1450"
"Spectra/Por® Molecularporous Membrane"
"Percolle®"
"Sigma® Chemical Co."
"GAF® Chem. Co."
"DEAE-Sephadex® A-50"
"CM-Sephadex® C-50"

Claims

1. Biologischer Indikator, umfassend:

(a) einen äußeren Behälter mit flüssigkeitsundurchdringlichen Wänden, wobei der Behälter wenigstens eine Öffnung enthält;

(b) enthaltend innerhalb dieses äußeren Behälters eine nachweisbare Menge:

(1) eines lebensfähigen Testmikroorganismus, der zur Überwachung eines Sterilisationscyclus geeignet ist, oder

(2) einer anderen Quelle eines aktiven Testenzyms, das zur Überwachung des Sterilisationscyclus geeignet ist;

wobei der Testmikroorganismus oder das Testenzym in im wesentlichen getrockneter Form in einem solchen Ausmaß chemisch immobilisiert worden ist, daß nach einer Einwirkung des Sterilisationscyclus, der für den Testmikroorganismus subletal ist, wenn er in einem zur Überwachung der Sterilisation verwendeten Testpack enthalten ist, eine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann und daß nach einer Einwirkung des Sterilisationscyclus, der für die Testmikroorganismen letal ist, wenn sie in dem zur Überwachung der Sterilisation verwendeten Testpack ent halten sind, keine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, wobei die Immobilisierung unter Verwendung eines Immobilisierungsmittels durchgeführt wird, das 1) ionische und/oder kovalente Bindungen zu dem Mikroorganismus oder Enzym bildet, wodurch ein stabiler immobilisierter Komplex entsteht, 2) die Moleküle des Biomaterials mit einer hygroskopischen oder hydrophilen Schicht, die vor Denaturierung schützt, umhüllt oder einschließt oder 3) die äußere Membran des Biomoleküls dehydratisiert, um seine Thermostabilität zu erhöhen.

2. Biologischer Indikator, umfassend:

(b) enthaltend innerhalb dieses äußeren Behälters eine nachweisbare Menge:

wobei der Testmikroorganismus oder das Testenzym in im wesentlichen getrockneter Form in einem solchen Ausmaß immobilisiert worden ist, daß nach einer Einwirkung des Sterilisationscyclus, der für den Testmikroorganismus subletal ist, wenn er in einem zur Überwachung der Sterilisation verwendeten Testpack enthalten ist, eine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann und daß nach einer Einwirkung des. Sterilisationscyclus, der für die Testmikroorganismen letal ist, wenn sie in dem zur Überwachung der Sterilisation verwendeten Testpack enthalten sind, keine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, wobei die Immobilisierung folgendes umfaßt:

(1) Adsorbieren an ein wasserunlösliches Trägermaterial, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Dextranderivat, Silicagel, Hydroxyapatit und Calciumcarbonat besteht;

(2) Umsetzen mit einem wasserunlöslichen Trägermaterial, das in der Lage ist, kovalente oder ionische Bindungen zu dem Testmikroorganismus oder Testenzym zu bilden;

(3) Einschließen des Mikroorganismus oder Enzyms in einer vernetzten Polymergelmatrix, die nichtionische polymerbildende Materialien umfaßt, die gegenüber dem Mikroorganismus oder Enzym unreaktiv sind;

(4) Umsetzen mit einem Vernetzungsmittel, das in der Lage ist, intra- oder intermolekulare Vernetzungen innerhalb der Testmikroorganismen oder des Testenzyms zu bilden; oder

(5) Mikroverkapseln des Testmikroorganismus oder -enzyms;

oder irgendeine Kombination davon.

3. Testpack zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Sterilisationscyclus in einer Sterilisationskammer, das den biolo gischen Indikator gemäß Anspruch 1 oder 2 innerhalb eines Testpackmaterials oder einer Vorrichtung umfaßt.

4. Verfahren zur. Erhöhung der Thermostabilität lebensfähiger Testmikroorganismen, die zur Überwachung einer Sterilisation geeignet sind, oder aktiver Testenzyme, die zur Überwachung einer Sterilisation geeignet sind, innerhalb eines biologischen Indikators, umfassend das Immobilisieren von wenigstens 1 · 10² der Testmikroorganismen oder wenigstens 0,1 Einheiten des Testenzyms in im wesentlichen getrockneter Form innerhalb des Indikators, wobei die Immobilisierung folgendes umfaßt:

(1) chemisches Immobilisieren unter Verwendung eines Immobilisierungsmittels, das 1) ionische und/oder kovalente Bindungen zu dem Mikroorganismus oder Enzym bildet, wodurch ein stabiler immobilisierter Komplex entsteht, 2) die Moleküle des Biomaterials mit einer hygroskopischen oder hydrophilen Schicht, die vor Denaturierung schützt, umhüllt oder einschließt oder 3) die äußere Membran des Biomoleküls dehydratisiert, um seine Thermostabilität zu erhöhen;

(2) Adsorbieren an ein wasserunlösliches Trägermaterial, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Dextranderivat, Silicagel, Hydroxyapatit und Calciumcarbonat besteht;

(3) Umsetzen mit einem wasserunlöslichen Trägermaterial, das in der Lage ist, kovalente oder ionische Bindungen zu dem Testmikroorganismus oder Testenzym zu bilden;

(4) Einschließen des Mikroorganismus oder Enzyms in einer vernetzten Polymergelmatrix, die nichtionische polymerbildende Materialien umfaßt, die gegenüber dem Mikroorganismus oder Enzym unreaktiv sind;

(5) Umsetzen mit einem Vernetzungsmittel, das in der Lage ist, intra- oder intermolekulare Vernetzungen innerhalb der Testmikroorganismen oder des Testenzyms zu bilden; oder

(6) Mikroverkapseln des Testmikroorganismus oder -enzyms;

oder irgendeine Kombination davon.

5. Verfahren zur Erhöhung der Thermostabilität lebensfähiger Testmikroorganismen, die zur Überwachung einer Sterilisation geeignet sind, oder aktiver Testenzyme, die zur Überwachung einer Sterilisation geeignet sind, innerhalb eines biologischen Indikators, umfassend das Immobilisieren des Testmikroorganismus oder des Testenzyms in im wesentlichen getrockneter Form innerhalb des Indikators in einem solchen Ausmaß, daß nach einer Einwirkung des Sterilisationscyclus, der für den Testmikroorganismus subletal ist, wenn er in einem zur Überwachung der Sterilisation verwendeten Testpack enthalten ist, eine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann und daß nach einer Einwirkung des Sterilisationscyclus, der für die Testmikroorganismen letal ist, wenn sie in dem zur Überwachung der Sterilisation verwendeten Testpack enthalten sind, keine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, wobei die Immobilisierung folgendes umfaßt:

(1) chemisches Immobilisieren unter Verwendung eines Immobilisierungsmittels, das 1) ionische und/oder kovalente Bindungen zu dem Mikroorganismus oder En zym bildet, wodurch ein stabiler immobilisierter Komplex entsteht, 2) die Moleküle des Biomaterials mit einer hygroskopischen oder hydrophilen Schicht, die vor Denaturierung schützt, umhüllt oder einschließt oder 3) die äußere Membran des Biomoleküls dehydratisiert, um seine Thermostabilität zu erhöhen;

(6) Mikroverkapseln des Testmikroorganismus oder -enzyms;

oder irgendeine Kombination davon.

6. Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Sterilisationscyclus, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Durchführen des Sterilisationscyclus mit einer nachweisbaren Menge eines Testmikroorganismus, der zur Überwachung des Sterilisationscyclus geeignet ist, oder eines Testenzyms, das zur Überwachung des Sterilisationscyclus geeignet ist, wobei der Testmikroorganismus oder das Testenzym in im wesentlichen getrockneter Form in einem solchen Ausmaß immobilisiert worden ist, daß nach einer Einwirkung des Sterilisationscyclus, der für den Testmikroorganismus subletal ist, wenn er in einem zur Überwachung der Sterilisation verwendeten Testpack enthalten ist, eine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann und daß nach einer Einwirkung des Sterilisationscyclus, der für die Testmikroorganismen letal ist, wenn sie in dem zur Überwachung der Sterilisation verwendeten Testpack enthalten sind, keine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, wobei die Immobilisierung folgendes umfaßt:

(6) Mikroverkapseln des Testmikroorganismus oder -enzyms;

oder irgendeine Kombination davon;

(b) nach dem Ende des Sterilisationscyclus das Inkubieren

(1) von lebensfähigem immobilisiertem Testmikroorganismus, falls vorhanden, mit einem wäßrigen Nährmedium, das das Wachstum der lebensfähigen immobilisierten Mikroorganismen zu fördern vermag, und einem Detektormaterial, das sich als Reaktion auf das Wachstum der Mikroorganismen nachweisbar verändern kann; bzw.

(2) von aktivem immobilisiertem Testenzym mit einer wirksamen Menge eines Enzymsubstrats, das mit aktivem Enzym unter Bildung eines nachweisba ren, enzymmodifizierten Produkts zu reagieren vermag;

wobei die Inkubation während einer Zeit und unter Bedingungen erfolgt, die ausreichen, um das Wachstum des Mikroorganismus oder die Reaktion des aktiven Enzyms mit dem Enzymsubstrat zu fördern.

7. Biologischer Indikator gemäß Anspruch 1, wobei der Sterilisationscyclus ein Dampfcyclus ist und der Testmikroorganismus oder das Testenzym mit einem Immobilisierungsmittel immobilisiert ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alditolen, Disacchariden, Trisacchariden und polymeren Alkoholen, die aus der aus Polyvinylalkohol, Glycolen und Diolen bestehenden Gruppe ausgewählt sind, besteht.

8. Testpack gemäß Anspruch 3, wobei der Sterilisationscyclus ein Dampfcyclus ist und der Testmikroorganismus oder das Testenzym mit einem Immobilisierungsmittel immobilisiert ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alditolen, Disacchariden, Trisacchariden und polymeren Alkoholen, die aus der aus Polyvinylalkohol, Glycolen und Diolen bestehenden Gruppe ausgewählt sind, besteht.

9. Verfahren zur Erhöhung der Thermostabilität von Mikroorganismen oder Enzymen gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei der Sterilisationscyclus ein Dampfcyclus ist und der Testmikroorganismus oder das Testenzym mit einem Immobilisierungsmittel immobilisiert ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alditolen, Disacchariden, Trisacchariden und polymeren Alkoholen, die aus der aus Polyvinylalkohol, Glycolen und Diolen bestehenden Gruppe ausgewählt sind, besteht.

10. Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Sterilisationscyclus gemäß Anspruch 6, wobei der Sterilisationscyclus ein Dampfcyclus ist und der Testmikroorganismus oder das Testenzym mit einem Immobilisierungsmittel immobilisiert ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alditolen, Disacchariden, Trisacchariden und polymeren Alkoholen, die aus der aus Polyvinylalkohol, Glycolen und Diolen bestehenden Gruppe ausgewählt sind, besteht.

11. Biologischer Indikator gemäß Anspruch 1, wobei der Sterilisationscyclus ein Ethylenoxidcyclus ist und der Testmikroorganismus oder das Testenzym mit einem Immobilisierungsmittel immobilisiert ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alditolen, Monosacchariden, Polysacchariden, Polylactamen und polymeren Alkoholen, die aus der aus Polyvinylalkohol, Glycolen und Diolen bestehenden Gruppe ausgewählt sind, besteht.

12. Testpack gemäß Anspruch 3, wobei der Sterilisationscyclus ein Ethylenoxidcyclus ist und der Testmikroorganismus oder das Testenzym mit einem Immobilisierungsmittel immobilisiert ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alditolen, Monosacchariden, Polysacchariden, Polylactamen und polymeren Alkoholen, die aus der aus Polyvinylalkohol, Glycolen und Diolen bestehenden Gruppe ausgewählt sind, besteht.

13. Verfahren zur Erhöhung der Thermostabilität von Mikroorganismen oder Enzymen gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei der Sterilisationscyclus ein Ethylenoxidcyclus ist und der Testmikroorganismus oder das Testenzym mit einem Immobilisierungsmittel immobilisiert ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alditolen, Monosacchariden, Polysacchariden, Polylactamen und polymeren Alkoholen, die aus der aus Polyvinylalkohol, Glycolen und Diolen bestehenden Gruppe ausgewählt sind, besteht.

14. Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Sterilisationscyclus gemäß Anspruch 6, wobei der Sterilisationscyclus ein Ethylenoxidcyclus ist und der Testmikroorganismus oder das Testenzym mit einem Immobilisierungsmittel immobilisiert ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alditolen, Monosacchariden, Polysacchariden, Polylactamen und polymeren Alkoholen, die aus der aus Polyvinylalkohol, Glycolen und Diolen bestehenden Gruppe ausgewählt sind, besteht.

15. Biologischer Indikator gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Testmikroorganismus oder das Testenzym in einem solchen Ausmaß immobilisiert worden ist, daß nach einer Einwirkung eines Dampfsterilisationscyclus von 121ºC (Schwerkraft) außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während wenigstens 5 Minuten eine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Dampfsterilisationscyclus außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während bis zu 15 Minuten keine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann.

16. Testpack gemäß Anspruch 3, wobei der Testmikroorganismus oder das. Testenzym in einem solchen Ausmaß immobilisiert worden ist, daß nach einer Einwirkung eines Dampfsterilisationscyclus von 121ºC (Schwerkraft) außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während wenigstens 5 Minuten eine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Dampfsterilisationscyclus außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während bis zu 15 Minuten keine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann.

17. Verfahren zur Erhöhung der Thermostabilität von Mikroorganismen oder Enzymen gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei der Testmikroorganismus oder das Testenzym in einem solchen Ausmaß immobilisiert worden ist, daß nach einer Einwirkung eines Dampfsterilisationscyclus von 121ºC (Schwerkraft) außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während wenigstens 5 Minuten eine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Dampfsterilisationscyclus außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während bis zu 15 Minuten keine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann.

18. Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Sterilisationscyclus gemäß Anspruch 6, wobei der Testmikroorganismus oder das Testenzym in einem solchen Ausmaß immobilisiert worden ist, daß nach einer Einwirkung eines Dampfsterilisationscyclus von 121ºC (Schwerkraft) außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während wenigstens 5 Minuten eine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Dampfsterilisationscyclus außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während bis zu 15 Minuten keine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann.

19. Biologischer Indikator gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Testmikroorganismus oder das Testenzym in einem solchen Ausmaß immobilisiert worden ist, daß nach einer Einwirkung eines Dampfsterilisationscyclus von 132ºC (Vorvakuum) außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während wenigstens 20 Sekunden eine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Dampfsterilisationscyclus außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während bis zu 6 Minuten keine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann.

20. Testpack gemäß Anspruch 3, wobei der Testmikroorganismus oder das Testenzym in einem solchen Ausmaß immobilisiert worden ist, daß nach einer Einwirkung eines Dampfsterilisationscyclus von 132ºC (Vorvakuum) außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während wenigstens 20 Sekunden eine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Dampfsterilisationscyclus außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während bis zu 6 Minuten keine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann.

21. Verfahren zur Erhöhung der Thermostabilität von Mikroorganismen oder Enzymen gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei der Testmikroorganismus oder das Testenzym in einem solchen Ausmaß immobilisiert worden ist, daß nach einer Einwirkung eines Dampfsterilisationscyclus von 132ºC (Vorvakuum) außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während wenigstens 20 Sekunden eine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Dampfsterilisationscyclus außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während bis zu 6 Minuten keine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann.

22. Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Sterilisationscyclus gemäß Anspruch 6, wobei der Testmikroorganis mus oder das Testenzym in einem solchen Ausmaß immobilisiert worden ist, daß nach einer Einwirkung eines Dampfsterilisationscyclus von 132ºC (Vorvakuum) außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während wenigstens 20 Sekunden eine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Dampfsterilisationscyclus außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während bis zu 6 Minuten keine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann.

23. Biologischer Indikator gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Testmikroorganismus oder das Testenzym in einem solchen Ausmaß immobilisiert worden ist, daß nach einer Einwirkung eines Dampfsterilisationscyclus von 121ºC oder 134ºC (Vorvakuum) außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während wenigstens 5 Sekunden eine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Dampfsterilisationscyclus außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während bis zu 2 Minuten keine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann.

24. Testpack gemäß Anspruch 3, wobei der Testmikroorganismus oder das Testenzym in einem solchen Ausmaß immobilisiert worden ist, daß nach einer Einwirkung eines Dampfsterilisationscyclus von 121ºC oder 134ºC (Vorvakuum) außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während wenigstens 5 Sekunden eine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Dampfsterilisationscyclus außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während bis zu 2 Minuten keine nachweis bare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann.

25. Verfahren zur Erhöhung der Thermostabilität von Mikroorganismen oder Enzymen gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei der Testmikroorganismus oder das Testenzym in einem solchen Ausmaß immobilisiert worden ist, daß nach einer Einwirkung eines Dampfsterilisationscyclus von 121ºC oder 134ºC (Vorvakuum) außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während wenigstens 5 Sekunden eine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Dampfsterilisationscyclus außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während bis zu 2 Minuten keine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann.

26. Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Sterilisationscyclus gemäß Anspruch 6, wobei der Testmikroorganismus oder das Testenzym in einem solchen Ausmaß immobilisiert worden ist, daß nach einer Einwirkung eines Dampfsterilisationscyclus von 121ºC oder 134ºC (Vorvakuum) außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während wenigstens 5 Sekunden eine nachweisbare Menge des immobilisierten. Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Dampfsterilisationscyclus außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während bis zu 2 Minuten keine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann.

27. Biologischer Indikator gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Testmikroorganismus oder das Testenzym in einem solchen Ausmaß immobilisiert worden ist, daß nach einer Einwirkung eines Ethylenoxidsterilisationscyclus außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während wenigstens 15 Minuten eine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Dampfsterilisationscyclus außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während bis zu 90 Minuten keine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann.

28. Testpack gemäß Anspruch 3, wobei der Testmikroorganismus oder das Testenzym in einem solchen Ausmaß immobilisiert worden ist, daß nach einer Einwirkung eines Ethylenoxidsterilisationscyclus außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während wenigstens 15 Minuten eine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Dampfsterilisationscyclus außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während bis zu 90 Minuten keine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann.

29. Verfahren zur Erhöhung der Thermostabilität von Mikroorganismen oder Enzymen gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei der Testmikroorganismus oder das Testenzym in einem solchen Ausmaß immobilisiert worden ist, daß nach einer Einwirkung eines Ethylenoxidsterilisationscyclus außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während wenigstens 15 Minuten eine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Dampfsterilisationscyclus außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während bis zu 90 Minuten keine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann.

30. Verfahren zur Bestimmung der Wirksamkeit eines Sterilisationscyclus gemäß Anspruch 6, wobei der Testmikroorganismus oder das Testenzym in einem solchen Ausmaß immobilisiert worden ist, daß nach einer Einwirkung eines Ethylenoxidsterilisationscyclus außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während wenigstens. 15 Minuten eine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann, daß aber nach einer Einwirkung des Dampfsterilisationscyclus außerhalb des Testpackmaterials oder der Vorrichtung während bis zu 90 Minuten keine nachweisbare Menge des immobilisierten Mikroorganismus oder Enzyms überleben bzw. aktiv bleiben kann.