JP3558635B2 - テストパック材料または装置を用いたまたは用いない生物学的滅菌インジケーター - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、固定化を用いてインジケーター内に入れた生体適合物質（例えば、微生物または酵素）の熱安定性を向上させる生物学的インジケーターに関する。その生物学的インジケーターは、テストパック材料または装置を用いるかまたは用いずに滅菌効力を表示するのに使用され得る。
背景技術
滅菌効力を決定するのに用いられる生物学的インジケーターは当業者に公知である。従来の生物学的インジケーターでは、自然混入により存在するほとんどの微生物より、用いられる滅菌法に抵抗力のある試験微生物をキャリヤー上に被覆し、滅菌されるべき物品と共に滅菌サイクルを行う。滅菌サイクル完了後、そのキャリヤーを栄養培地に培養し、試験微生物が滅菌法後に生存するかどうかを決定する。
生物学的インジケーターを用いる滅菌装置の効力を試験する多くの方法が提案されてきた。ジ・アソシエーション・フォー・ジ・アドバンスメント・オブ・メディカル・インスツルメンテーション（The Association for the Advancement of Medical Instrumentation）（AAMI）は、酸化エチレンおよび蒸気滅菌剤の両方の評価に関する推奨方法を刊行している。酸化エチレン滅菌剤の定性試験に関して、AAMIは生物学的インジケーターをプラスチックシリンジのバレル内に入れることを推奨している。プラスチック気道管、ある長さのラテックス管、および上記シリンジ２本を折りたたんだ手術用タオルのスタックの中央に置く、そのスタックを包装材料で包装する。得られるテストパックは、酸化エチレン滅菌のパラメータを攻撃するように設計されている。
蒸気常圧置換および予備減圧滅菌剤に用いるテストパックに関するAAMIの推奨方法には、14〜16枚のタオルテストパック内に適当な生物学的インジケーターを用いる方法を含む。タオルを折りたたんで積み重ねる。生物学的インジケーターは、そのパックの幾何学的中心の第７番目および第８番目のタオルの間に置かれるべきである。
生物学的インジケーターおよび他の材料を含むテストパックにより、酸化エチレンおよび蒸気滅菌剤の効力を評価するのに必要な全パラメータを攻撃する目的を有する。両タイプのAAMIテストパックの１つの要求は、滅菌剤の生物学的インジケーターへの流動を防止し、その負荷をかけた滅菌速度をより正確に模擬試験することである。その目的に対しては有効であるが、酸化エチレンおよび蒸気滅菌サイクル用のAAMIテストパックの構造は、大きな労力を要し、得られるパックは大きくかさばる。これらの限界を考えて、多くの市販製品が、単一予備集成および標準化複合滅菌テストパックに対する要求に取り組んでいる。典型的製品には、「1278アテスト・EO・パック（AttestTM EO Pack）」および「1276アテスト・スチーム・パック（AttestTM Steam Pack）」が挙げられ、両方とも3M社から市販され、それら装置は米国特許第4,739,881号、同4,828,797号、同4,839,291号、同4,636,472号、同4,918,003号、および欧州特許第421,760号、同419,282号および同255,229号に開示されている。
発明の要旨
本発明により初めて、タオル、シリンジまたは他の大きなテストパック材料なしに使用し得る単一生物学的インジケーター装置を提供し、従来技術によるものと同等またはそれ以上の滅菌評価を提供する。
本発明により、
（ａ）少なくとも１つの開口部を有する液体不透過性壁を有する外装容器、
（ｂ）該外装容器内に含まれる検出可能量の固定化した
（１）生存能力のある試験微生物、または
（２）滅菌をモニターする（monitor）のに有用であることが公知の活性試験酵素、
を含む生物学的インジケーターを提供し、通常滅菌をモニターするのに用いられるテストパック内に含まれる試験微生物には致死量に近い滅菌サイクルの後も、その微生物または酵素は検出可能量の上記固定化微生物または酵素が生存しまたは活性な状態であり得る範囲に固定化される。通常滅菌をモニターするのに用いられるテストパック内に含まれる試験微生物には致死量である滅菌サイクルの後では、検出可能量の固定化微生物または酵素を生存しないかまたは活性な状態となり得ない。
本発明により更に、通常滅菌をモニターするのに用いられるテストパック内の本発明の生物学的インジケーターを含む滅菌槽内での滅菌サイクルの効力を同定するテストパックを提供する。
加えて、本発明により、試験微生物および／または活性酵素の固定化を含む生物学的インジケーター内の、
（１）通常滅菌をモニターするのに用いられる生存能力のある微生物、または
（２）滅菌をモニターするのに有用であることが既知のその他の活性試験酵素源、
の熱安定性を向上する方法を提供する。
従来の技術により、種々の微生物および酵素多くの方法が開示されている（例えば、米国特許第4,663,287号；スリバスタバ（Sribastava）のインディアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Indian Journal of Biochemistry and Biophysics）、第28巻、109〜113頁（1991年４月）；バイオテクノロジー・アンド・アプライド・バイオケミストリー（Biotechnology and Applied Biochemistry）、第13巻、36〜47頁（1991年）；アメリカン・ソサイエティー・フォー・ミクロバイオロジー・ニューズ（American Society for Microbiology News）、第55巻、67〜70頁（1989年）；ジャーナル・オブ・ハイジーン（Journal of Hygiene）、第54巻、487〜508頁（1956年）；フード・インダストリーズ（Food Industries）、1941年３月、64〜65頁；フード・リサーチ（Food Research）、第14巻、499〜510頁（1949年）；ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）、第68巻、338〜345頁（1954年）；ジャーナル・オブ・アプライド・バクテリオロジー（Journal of Applied Bacteriology）、第37巻、31〜43頁（1974年））。しかしながら、これら文献には、生物学的インジケーター内の乾燥状態の生体適合物質を安定化するかまたは、蒸気または酸化エチレンどちらかの致死作用または不活性化作用から保護するのに固定化を用いることは開示されていない。本発明の装置は、常圧または予備減圧蒸気滅菌剤または酸化エチレン滅菌剤の滅菌サイクルの効力を同定するのに有用であり、AAMI規格に適合するほど十分精密である。好ましい態様では、本発明の装置は、使い捨てで、予備集成してあり、小さく、使用が容易であり、取り扱いが便利である。
【図面の簡単な説明】
図１は、蓋装置26を外した状態の本発明の生物学的インジケーターの１つの態様の断面図である。
図２は、蓋装置26を含む図１の生物学的インジケーターの分解組み立て斜視図である。
図３は、蓋26した状態の本発明のインジケーターの好ましい態様の断面図である。
図４は、図３のインジケーターの分解組み立て斜視図である。
図５は、本発明の生物学的インジケーターを含むテストパックの分解組み立て図である。
図６は、図５のテストパックの斜視図である。
詳細な説明
本発明の生物学的インジケーターに使用され得る微生物類は、自然混入したほとんどの生物の一般に何倍もの用いられる滅菌法に対する抵抗力を有する従来より用いられている微生物類である。「胞子」および「生長」状態の両方で存在するバクテリアおよび菌類を用いて望ましい結果が得られた。バクテリア胞子が、微生物寿命の最も抵抗力のある形として推奨される。それは、装置、化合物および方法の滅菌効力を同定する全ての試験で選択される生物である。バチルス（Bacillus）およびクロストリジア（Clostridia）種からの胞子には、飽和蒸気、乾式熱、およびガンマ線および酸化エチレンを用いる滅菌法をモニターするのに最も一般的に用いられる。
特に好ましい微生物には、バチルスステアロサーモフィラス（Bacillus Stearothermophilus）、バチルスサチリス（Bacillus Subtilis）およびバチルスピュミルス（Bacillus Pumilus）を含む。バチルスステアロサーモフィラスは、蒸気滅菌条件下の滅菌をモニターするのに特に有用である。バチルスサチリスは、ガスおよび乾式熱滅菌条件をモニターするのに特に有用である。バチルスピュミルスは、ガンマ線滅菌をモニターするのに特に有用である。
本発明の好ましい生物学的態様では、生物学的インジケーターには活性固定化酵素源を含む。好ましい態様に好適な酵素は、該細胞および細胞内を酵素を含む酵素であり、その活性は通常滅菌効力をモニターするのに用いられる少なくとも１種の微生物の生存能力と相互関係がある。滅菌効力をモニターするのにそのような酵素を用いることが、一般譲渡された米国特許第5,073,488号に開示されている。そのインジケーターが滅菌サイクルを受けた後、含まれる固定化酵素をその酵素用の基質の水性混合物と混合する。その反応混合物を、例えば蛍光計または比色計により測定し、酵素変性物の存在を決定する。設定時間内でのバックグラウンド以上の検出可能な酵素変性物の存在（酵素および基質の同定、各濃度および培養条件に依存）は滅菌不足を示す。設定時間内での検出可能な酵素変性物の不足は、滅菌サイクルがその試験生物に対して致死量であり、従って適当であることを示す。
有用であることを見い出した酵素には、胞子形成微生物からの加水分解性酵素、そして動物または植物から誘導される酵素、例えばハタンキョウ（almond）類を含む。そのような酵素には、胞子形成微生物、例えば微生物のカンジダ（candida）、バチルス（Bacillus）、ニューロスポラ（Neurospora）およびクロストリジウム（Clostridium）種から誘導されるベータ−Ｄ−グルコシダーゼ、アルファ−Ｄ−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、ブチレートエステラーゼ、カプリレートエステラーゼリパーゼ、ミリステートリパーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、バリンアミノペプチダーゼ、チモトリプシン、ホスホヒドロラーゼ、アルファ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ、ベータ−Ｄ−セロビオシダーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、プロリンアミノペプチダーゼ、チロシンアミノペプチダーゼ、フェニルアラニンアミノペプチダーゼ、ベータ−Ｄ−グルクロニダーゼ、および脂肪酸エステラーゼを含む。
活性酵素源は、
（１）適当な微生物から誘導される精製単離酵素；
（２）その酵素が固有であり、遺伝子工学により加えられた微生物；または
（３）その酵素が胞子形成または生長中に加えられ、その酵素が導入されるか微生物、例えば胞子内に導入されるようになる胞子形成中に胞子に加えられる酵素と結合される微生物；であってもよい。
有利にも、それ自体従来から滅菌条件をモニターするのに用いられるものである微生物が、活性酵素源として用いられる。滅菌サイクルの完了後も生存能力を有する微生物は、栄養生長培地を用いて培養され、従来の技術により滅菌条件がインジケーター内の微生物の全てを殺すのに十分であったかどうかを確認し、その滅菌条件がその滅菌剤の項目の全てを滅菌するのに十分であったことを示す。
微生物または酵素を固定化する多くの異なる手段（本明細書中で「生体適合物質」の語により表される）を用いてもよい。１つの特に有用な技術は、化合物（本明細書中で「固定化剤」の語により表される）を用いて微生物または酵素を化学的に固定化することであり、それは１）安定性固定化錯体を形成する微生物とイオン結合および／または共有結合を形成し;2）生体適合物質の分子（本明細書中で「生体適合分子」の語により表される）を変性に対して保護する吸湿性または親水性層で被覆または閉じ込め；または３）その生体適合分子の外表膜を脱水してその熱安定性を向上させる。
蒸気滅菌に用いられる特に有用な固定化剤には、アルジトール類、二糖類および三糖類、および、ポリビニルアルコール、グリコール類およびジオール類から選択されるポリマーアルコール類を含む。酸化エチレン用の好適な固定化化合物には、アルジトール類；アルドース類およびケトース類を含む単糖類；多糖類、例えば二糖類、三糖類、四糖類、五糖類および六糖類、澱粉類、シクロデキストリン類、ペクチン類、グア（guar）ゴム、トラガカンタ（tragacantha）ゴム、アラビアゴム、セルロース類、カッパ・カラジーナン（Kappa carrageenan）；ポリラクタム類、例えばポリビニルラクタム類；および上記のポリマーアルコール類；を含む。
アルジトール類および単糖類は、好ましくは炭素原子３〜６個を含有する。二糖類および三糖類は好ましくは糖単位当たり炭素原子少なくとも４個を有し、その他の多糖類は好ましくは糖単位当たり炭素原子５または６個を有する。好ましくは、アルジトール類および糖類は、分子量約100〜100,000ダルトンを有する。その糖類は、還元糖類または非還元糖類であってもよい。貯蔵ポリマーアルコール類は、分子量約200〜100,000ダルトンを有する。好ましいポリラクタム類は、分子量約50〜100,000ダルトンを有する。
特に好ましいアルジトール類には、グリセロール、トレイトール、リビトール（アドニトールとして公知である）、アラビニトール、キシリトール、アリトール、グルシトール（ソルビトールとして公知である）、マニトール、イジトール、ガラクチトール（ズルシトールとして公知である）、アルトリトール、エリチトール、イノシトール、へプチトール、オクチトール、ノニトール、デシトール、ドデシトール、ストラシトール、およびポリアリトールを含む。
特に好ましいアルドース類には、グリセルアルデヒド、トレオース、エリトロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、ヘプトース、オクトース、ノニトース、デシトース、ドデシトース、ラムノース、フコース、２−デオキシリボース、グルコースアミン、ガラクトースアミン、３−ジメチルアミノ−3,6−ジデオキシアルトース、および３−アミノ−３−デオキシリボースを含む。
特に好ましいケトース類には、ジヒドロキシアセトン、エリトルロース、リバロース、キシロロース、プシコース、フルクトース、ソルボースおよびタガトースを含む。
特に好ましい二糖類には、アラビノピラノビオース、アラビノフラノビオース、セロビオース、セルビオウロン酸、チトビオース、コンドロシン、ガラクトビオース、ガラクトウロン酸、ゲントビオース、グルコシルガラクトース、グルコシルグルコースアミン、ヒアロビオウロン酸、イヌロビオース、イソマルトース、コージビオース、ラクトース、ラミナラビオース、マルトース、マノビオース、メリビオース、４−メチルグルコシルキシロース、ニゲロース、プランテオビオース、プリマベロース、ルチノース、ソホロース、スクロース、トレハロース、ツラノース、ビシアノース、およびキシロビオースを含む。
特に好ましい三糖類には、セロトリオース、ゲンタイアノース、６−Ｏ−グルコシルマルトース、イソケストース、イソマルトトリオース、イソパノース、ケストース、ラミナラトリオース、マルトトリオース、メレジトース、ネオケストース、ニューラミノラクトース、パノース、プランテオース、ラフィノース、およびウンベリフェロースを含む。
特に好ましい四糖類には、セロテトラオース、マルトテトラオース、およびスタチオースを含む。特に好ましい五糖類はベルバスコースである。その他の好ましい多糖類には、環状オリゴ糖類、例えばシクロマルトヘキサオース、シクロマルトペプタオースおよびシクロマルト−オクタノース；セルロース類、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロース；ガム類；粘質類；ペクチン類；ヘミセルロース類；リポ多糖類；グリコーゲン；キチン；および澱粉；を含む。
特に好ましいポリマーアルコール類には、ポリビニルアルコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール（分子量200〜100,000ダルトン）、ポリプロピレングリコール（分子量200〜10,000ダルトン）、エーテルアルコール類、例えばポリエチレングリコールエーテル（分子量500〜50,000ダルトン）、ポリプロピレングリコールエーテル（分子量500〜10,000ダルトン）、およびジオール類、例えば1,3−ブタンジオール、1,5−ペンタンジオール、1,6−ヘキサンジオール、1,7−ペプタンジオール、1,8−オクタンジオール、1,9−ノナンジオールおよび1,10−デカンジオールを含む。
特に好ましいポリビニルラクタム類には、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、５−メチル−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、５−エチル−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、3,3−ジメチル−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、３−メチル−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、３−エチル−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、４−メチル−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、４−エチル−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、Ｎ−ビニル−２−バレオラクタム、およびＮ−ビニル−２−カプロラクタムを含む。
固定化化合物または固定化剤は好ましくは、従来のキャリヤーに含まれる微生物または酵素上の被膜として用いられる。更に、固定化剤中の試験微生物または酵素の懸濁液を、従来のキャリヤーストップ上に被覆し、乾燥する。生体適合物質に塗布した固定化剤量は好ましくは、胞子または酵素単位当たり約１×10-6〜１×10-12g、より好ましくは約１×10-9〜１×10-11g、および最も好ましくは９×10-10〜１×10-10gである。好ましくは、濃度0.1〜98％w/v、より好ましくは１〜70％w/vおよび最も好ましくは５〜50％w/vの固定化剤の水溶液を、その生体適合物質に塗布する。また好ましくは、固定化剤を生体適合物質に塗布し、乾燥生体適合物質を運ぶ基質が、被覆重量好ましくは約１×10-1〜１×10-7g/mm2、より好ましくは約１×10-4〜１×10-6g/mm2、および最も好ましくは９×10-5〜１×10-5g/mm2で固定化剤を含む。
以下の表には、蒸気および酸化エチレン滅菌サイクル用の、独立型生物学的インジケーター（BI）（即ち、タオル、シリンジまたは他のテストパック材料または装置を用いずに）を作製するのに用いられる多くの水溶液中の固定化剤、および従来のテストパックに用いられる生物学的インジケーターの特に好ましい濃度を示す。
より苛酷な蒸気滅菌サイクル（例えば、121℃または134℃予備減圧）では、テストパックに入った生物学的インジケーター用の固定化剤濃度は、上記の４〜５倍に増加する必要がある。
水不溶性支持材料上の微生物または酵素の吸収は、生体適合分子を固定化する別の方法である。有用な支持材料は、弱い結合力、例えば塩−結合、水素結合およびファンデアワールス力により微生物または酵素に結合し、少なくとも微生物１×102または酵素0.1ユニットを吸収し得る。例示的支持材料には、アルミナ、ベントナイト、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムゲル、セルロース（例えば、アミノエチル、カルボキシメチル、ジエチルアミノ−エチル、パルミトイル、フェノキシアセチル、ホスフェート、トニン（tonnin）−アミノヘキシル、トニン−トリエチルアミノエチル、およびトリ−エチルアミノエチルセルロース）、クレー、コラーゲン、デキストラン類（例えば、硫酸デキストラン）、デキストラン誘導体（例えば、ファーマシア（Pharmacia）から市販の「セファデックス（SephadexR）Ｇ−タイプス（types）」）、多孔質シリカ、ヒドロキシアパタイト、カオリン、フェノールポリマー、シリカゲル、アガロース、ファーマシア（Pharmacia）から市販の「セファロース（SepharoseR）・イオン・エクスチェンジャーズ（Ion Exchangers）」（例えば、コンカナバリンＡ−セファロース（Sepharose））、ファーマシア（Pharmacia）から市販の「セファデックス（SephadexR）・イオン・エクスチャンジャーズ（Ion Exchangers）」、カーボン（例えば、活性炭、光沢炭、モレキュラーシーブ4A、ナイロンまたはゼオライトカーボン）、ステンレス鋼、サイロクロム（silochrome）、酸化チタン、ポリスチレンおよびポリプロピレンを含む。
また、酸素または微生物は、生体適合分子と結合する水不溶性支持材料によって固定化され得る。そのような支持材料には、生体適合物質（生体適合分子）の分子の官能基と反応する基、例えばリシン、チロシン、ヒスチジン、アルギニンまたはシステインのアルファ基またはイプシロン基を含有し、微生物少なくとも１×102または酵素0.1ユニットと結合する。生体適合分子と共有結合を形成する有用な支持材料は、共有結合基、例えばヒドロキシル、アミノ、カルボキシルまたはスルホン酸基を有する。このタイプの固定化に特に有用な支持材料には、アガロース、セルロース、デキストラン、ガラス、ポリアクリルアミドコポリマー、ポリアミノスチレン、コラーゲン、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、シリカ、ポリエチレン、ポリエステル、ポリスチレン、ナイロン、アルキルアルデヒドポリマー、ポリチオール/4−ビニルピリジン、ゼラチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンテレフタレート、ポリアクリロニトリル、キチン、ポリウレタン、カーボン、サイロクロム、チタニア、フェライト、アルミナ、磁性鉄粒子を含む。
また、生体適合分子とイオン結合を形成する有用な支持材料は、官能基、例えばヒドロキシル、アミノ、カルボキシルまたはスルホン酸基を有する。このタイプの固定化に特に有用な支持材料が、文献、例えば「インモビライズド・エンザイムズ・アンド・セルズ（Immobilized Enzymes and Cells）」、K.モスバック（Mosbach）、アカデミック・プレス（Academic Press）社（1987年）に開示されており、イオン性セルロース類、例えばアミノエチル、カルボキシルメチル、ジエチルアミノエチルおよびトリエチルアミノエチルセルロース、イオン性ポリスチレン（例えば、ミズーリー州セントルイス（St.Louis）のマリンクロッド・ケミカル・ワークス（Mallinckrodt Chemical Works）から市販の「アンバーライト（Amberlite）」）、硫酸デキストラン、および、「セファデックス（SephadexR）・イオン・エクスチェンジャーズ（Ion Exchangers）」、例えばファーマシア（Pharmacia）から市販のカルボキシルメチル、ジエチルアミノエチル、第４アミノエチルおよびスルホプロピル「セファデックス（SephadexR）・イオン・エクスチェンジャーズ（Ion Exchangers）」を含む。
その支持材料を用いて固定化するために、微生物または酵素を酵素活性を抑制しないpHで水性媒体中で支持材料と混合する。培養期間後、吸収または結合した生体適合物質を有する不溶性支持材料を遠心分離または濾過によりその混合物から分離する。続いて、回収した固形物を、生物学的インジケーター装置の固定化生体適合物質用のキャリヤーとして用いる。
酵素または微生物を固定化する他の方法は、化学的架橋ポリマーゲルマトリックス中に生体適合物質を閉じ込めることである。そのゲルは通常、非イオン性ポリマー形成物質から成り、それは酵素または微生物と非反応性であり、微生物少なくとも１×102または酵素0.1ユニットを閉じ込め得る。例示的ゲルには、ポリアクリルアミドヒドラジドゲル、アルギン酸カルシウムゲル、カッパカラジーナンゲル、寒天ゲル、コラーゲン、セルロースゲル、チトサンゲル、およびメタクリレートゲルを含む。
酵素および微生物を固定化する更なる手段は、マイクロカプセル封入（micro−encapsulation）であり、生体適合分子の回りに人工膜を形成する。その膜形成法は溶液中の特定の生体適合分子には依存しないので、様々な酵素および微生物を封入するのに多くの膜形成材料を用いてもよい。生体適合分子をマイクロカプセル封入し得る例示的材料には、酢酪酸セルロース、硝酸セルロース、脂質ポリアミド、ポリエチレンイミンナイロン、ナイロン、牛漿液アルブミン、ポリビニルピロリドン、ポリ（フタロイルペピラジン）およびエポキシを含む。カプセル封入の典型的方法が、ジャーナル・オブ・モレキュラー・キャタリシス（Journal of Molecular Catalysis）、第11巻、83頁（1981年）；バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Biotechnology and Bioengineering）、第17巻、1157頁（1975年）；エンザイム・アンド・ミクロバイオロジカル・テクノロジー（Enzymes and Microbiological Technology）、第４巻、327頁（1982年）；エンザイム・アンド・ミクロバイオロジカル・テクノロジー（Enzymes and Microbiological Technology）、第６巻、135頁（1984年）；エンザイム・アンド・ミクロバイオロジカル・テクノロジー（Enzymes and Microbiological Technology）、第３巻、149頁（1981年）；メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）、第112巻、３〜112頁（1985年）；および米国特許第4,147,767号に開示されている。
酵素および微生物のアミノ酸側基による架橋は、その他の固定化方法である。固定化剤、例えばジアルデヒド類、ジイミドエステル類、ジイソシアネート類、およびビスジアゾニウム塩を用いて、その生体適合分子の分子間または分子内架橋を形成する。これらの固定化剤は微生物少なくとも１×102または酵素0.1ユニットを架橋し得るものでなければならない。有用な架橋方法が、アンルズ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンス（Annals New York Academy of Science）、第542巻、173〜179頁（1988年）；アンルズ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンス（Annals New York Academy of Science）、第434巻、27〜30頁（1984年）；バイオテクノロジー・アンド・アプライド・バイオケミストリー（Biotechnology and Applied Biochemistry）、第９巻、第５号、389〜400頁（1987年）；アプライド・バイオケミストリー・アンド・バイオテクノロジー（Applied Biochemistry and Biotechnology）、第15巻、第３号、265〜278頁（1987年）；バイオテクノロジー・レターズ（Biotechnology Letters）、第10巻、第５号、325〜330頁（1988年）；アーカイブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Archives of Biochemistry and Biophysics）、第275巻、第１号、23〜32頁（1989年11月15日）；およびACTA・バイオチミカ・ポロニカ（Biochimica Polonica）、第34巻、第２号、145〜156頁（1987年）；に開示されている。架橋により、酵素または生体適合分子の配座剛性（conformational rigidity）を安定化し、その結果生体適合分子を熱および湿分などによる変質から保護する。
まとめると、上述のどの固定化方法、即ち化学的固定化、吸収または支持体との結合、閉じ込め、カプセル封入または架橋、またはこれらの方法の組合せを本発明の実施に用いてもよい。用いられる固定化方法に関して、本発明の生物学的インジケーターがAAMIテストパックと同等の結果を示すのに必要な固定化の程度は多くの要因に依存する。従来の微生物生長または酵素の使用を用いて無菌性を評価しようとしまいと、および本発明の生物学的インジケーターをテストパックを用いようと用いまいと、そのような要因には、滅菌サイクルパラメータ（例えば、温度および滅菌剤濃度）を含む。
本発明の独立型生物学的インジケーター（即ち、タオル、シリンジまたは他のテストパック材料または装置を用いずに）を用いる滅菌をモニターするために、微生物または酵素を、好ましくは121℃常圧の蒸気滅菌サイクルに少なくとも15分間暴露後も、検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり得、かつこの滅菌サイクルに少なくとも45分間以上、より好ましくは30分間以上暴露後では、検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しないかまたは活性な状態となり得ない程度に固定化する。独立型生物学的インジケーターとして132℃予備減圧の蒸気滅菌サイクルに用いることに関して、微生物または酵素を、好ましくはそのサイクルに少なくとも15秒間、より好ましくは少なくとも１分間暴露後も、検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり得、かつそのサイクルに15分間以上、より好ましくは10分間以上暴露後では、検出可能な量の微生物または酵素が生存しないかまたは活性な状態とはなり得ない程度に固定化する。独立型生物学的インジケーターとして121℃予備減圧の蒸気滅菌サイクルに用いることに関して、微生物または酵素を、好ましくはそのサイクルに少なくとも５分間暴露後も、検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり得、かつそのサイクルに15分間以上暴露後、検出可能な量の微生物または酵素を生存しないかまたは活性な状態であり得ない程度に固定化する。132℃予備減圧の蒸気滅菌サイクルにおいて、独立型装置内の微生物または酵素を好ましくはそのサイクルに少なくとも２秒間、より好ましくは少なくとも15秒間暴露後も、検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり得、かつそのサイクルに10分間以上、より好ましくは６分間以上暴露後では、検出可能な量の微生物または酵素が生存しないかまたは活性な状態となり得ない程度に固定化する。
独立型生物学的インジケーターとして酸化エチレン滅菌サイクルに用いることに関して、微生物または酵素を、好ましくは少なくとも15分間暴露後も、検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり得、かつ酸化エチレン滅菌サイクルに250分間以上暴露後では、検出可能な量の微生物または酵素が生存しないまたは活性な状態となり得ない程度に固定化する。より好ましくは酸化エチレン600mg/リットル、54℃および相対湿度60％の滅菌サイクルにおいて、滅菌の程度を、少なくとも20分間暴露後も検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり、酸化エチレンサイクルに60分間、最も好ましくは40分間暴露後には生存しないかまたは活性な状態の生体適合物質が検出されないようにする。酸化エチレン800mg/リットル、37℃および相対湿度60％の滅菌サイクルにおいて、滅菌の程度を、少なくとも20分間暴露後も検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり、そのサイクルに120分間、最も好ましくは90分間暴露後では、生存しないかまたは活性な状態の生体適合物質が検出されないようにすることが好ましい。
従来のテストパック材料（例えば、市販のテストパックまたはAAMIテストパック）を用いる以外は本発明の生物学的インジケーターを独立型装置として用いない場合、そのテストパック材料が固定化生体適合物質に到達する滅菌剤に攻撃することにより生体適合物質を保護するので、滅菌の程度を低減してもよい。
タオル、シリンジまたは他のテストパック材料または装置内に入れた本発明の生物学的インジケーターを用いて滅菌をモニターするために、微生物または酵素は好ましくは、独立型装置により評価される場合の生体適合物質が以下のような生／死特性を示すような程度に固定化される。好ましくは、その滅菌の程度は、121℃の蒸気滅菌サイクルに少なくとも５分間暴露後も、検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であるのに十分である。テストパック材料を132℃予備減圧の蒸気滅菌サイクルに用いることに関して、独立型装置内の微生物または酵素は好ましくは少なくとも20秒間暴露後も、検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり得、かつそのサイクルに６分間以上暴露後、検出可能な量の微生物または酵素が生存しないかまたは活性な状態となり得ない程度に固定化する。テストパック材料を121℃または134℃予備減圧の蒸気滅菌サイクルに用いることに関して、独立型装置内の微生物または酵素は好ましくはそのサイクルに少なくとも５秒間暴露後も、検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり得、かつそのサイクルに２分間以上暴露後、検出可能な量の微生物または酵素が生存しないかまたは活性な状態となり得ない程度に固定化する。
テストパック材料を酸化エチレン滅菌サイクルに用いることに関して、独立型装置内の微生物または酵素を、好ましくは少なくとも15分間暴露後も、検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり得、かつ酸化エチレン滅菌サイクルに90分間以上暴露後では、検出可能な量の生体適合物質が生存しないかまたは活性な状態となり得ない程度に固定化する。より好ましくは酸化エチレン600mg/リットル、54℃および相対湿度60％の酸化エチレン滅菌サイクルにおいて、滅菌の程度を、少なくとも15分間暴露後も検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり得、酸化エチレンサイクルに50分間暴露後には生存しないかまたは活性な状態の生体適合物質が検出されないようにする。酸化エチレン800mg/リットル、37℃および相対湿度60％の酸化エチレン滅菌サイクルにおいて、滅菌の程度を、少なくとも15分間暴露後も検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり得、かつそのサイクルに90分間暴露後には生存しないかまたは活性な状態の生体適合物質が検出されないようにすることが好ましい。
好ましくは、上記の試験における微生物の生存能力を検出する方法は、培養の24および48時間後の標準栄養培地内での生長である。酵素活性を検出する方法は、米国特許第5,073,488号に開示のような酵素基質の使用である。
固定化微生物または酵素を含有する生物学的インジケーターの構造は、本発明に対して重要なものではない。好ましくは、生物学的インジケーターは単一の生物学的インジケーター、即ち固定化生体適合物質および酵素基質および／または栄養生長培地を含むインジケーターである。そのようなインジケーターの例示的構造が、米国特許第2,854,384号、同3,346,464号、同3,239,429号、同3,440,144号、同3,585,112号、同3,661,717号、同3,752,743号、同3,846,242号、同4,291,122号、同4,304,869号、同4,311,793号、同4,416,984号、同4,743,537号、同4,596,773号、同4,461,837号、同4,528,268号、同4,579,823号、同4,580,682号、同4,596,773号、同4,717,661号および同4,885,253号に開示されている。特に好ましいインジケーター構造が、一般譲渡された米国特許出願第07/277,570号に開示されている。酵素または微生物が上記のように固定化される場合、これらの如何なる生物学的インジケーターも本発明の実施に有用である。
以下の記載は本出願人の好ましい態様を表す。本発明の範囲内であるにもかかわらず、以下の装置の多くの変形が可能である。
図１および図２に関して、気体吸収性である液体不透過性壁12および開口末端14を有する、円柱管形の外装容器10を有する好ましい生物学的インジケーターが示される。外装容器10には、キャリヤー16、例えば濾紙のストリップを含み、予め決められた量の活性酵素および／または予め決められた数の生存能力のある微生物を含む。また、外装容器10には、普通にシールされた圧力開封性性内装容器18、例えば折れ易いガラスアンプルを含み、水性栄養生長培地および／または緩衝水溶液20中に溶解または懸濁した好適な酵素基質を含む。水性栄養培地は、培養により接触時に生存能力のある微生物の生長を促進し得、好ましくは生存能力のある微生物が存在する場合に溶液の色を変化させ、不適当なサイクルを指摘する微生物生長インジケーターを含む。酵素基質は活性酵素と反応して、発光、着色または放射性材料を得る。内装容器18は、濾紙キャリヤー16により外装容器10の壁12から分離されている。外装容器10の開口末端14は、気体透過性半多孔性蓋部材22、例えばシートを用いて提供される。蓋部材22を、例えば、熱または接着剤シーリングにより、または蓋装置26、例えばキャップ（図１には外して示す）により外装容器10の開口末端14にシールし、それは３つの開口部を有する。気体滅菌剤を用いた滅菌の間に、気体滅菌剤は蓋部材22を透過し、外装容器10の内部を通過しキャリヤー16により固定化生体適合物質と接触する。
図２に示すように、キャリヤー16および内層容器18を開口末端14に続けて挿入し、外装容器10と密閉状態で、蓋部材22を開口末端14上に置き、次いで蓋装置26を蓋部材22上に置くことにより外装容器10の開口末端14を蓋部材22でシールすることにより、図１の装置は容易に組み立てられ得る。
外装容器10は、蒸気滅菌剤による高温に耐える材料から成る。常套の蒸気滅菌剤は一般に約121〜135℃の温度に達する。加えて、容器10の壁は実質的に液体不透過性でなければならない。外装容器10は好ましくは反透明（透明を含む）であり、蛍光または色の変化が、インジケーター装置を分解することなく目視で観察され得る。好ましくは、また、外装容器10は十分変形可能であり、外圧を用いて外装容器10を変形させると圧力開封性内層容器18は破壊する。外装容器10は、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド類、ポリメチルペンテン類および種々のポリエステル類を含む好適な材料を射出成形または押出することにより作製され得る。
蓋装置26は、滅菌温度に耐える如何なる材料から成ってもよい。外装容器10の場合、好適な材料にはポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド類、ポリメチルペンテン類および種々のポリエステル類を含むが、ポリメチルペンテン類が好ましい。
本発明に用いられる固定化酵素および／または微生物は通常、好適なキャリヤー16により運搬される。しかしながら、固定化生体適合物質が外装容器10の内壁、または内層容器18の外壁により運搬されること、また、固定化生体適合物質が固体支持体中に含まれる場合にはそれは単に外装容器10内に含まれキャリヤー16が必要なことが予期される。キャリヤー16は好ましくは吸水剤、例えば濾紙であり、微生物生長または酵素活性を抑制してはならない。シート状材料、例えば布、不織ポリプロピレン、レーヨンまたはナイロン、および微孔性ポリマー材料が特に好ましい。しかしながら、金属箔基材、例えばアルミニウムまたはステンレス鋼、そしてガラス基材（例えば、ガラスビーズまたはガラス繊維）、磁器またはプラスチックを用いてもよい。加えて、その酵素キャリヤーは材料の組合せ、例えばプラスチックまたはガラス支持体ストリップに固定された紙から作製されてもよい。
再現性を確実にするため、外装容器10には予め決められた量の固定化生体適合物質を含有することが好ましい。タンパク質精製の一般的方法、例えば塩分別、クロマトグラフィーおよび電気泳動を用いることにより単離酵素が得られ、それらはコロウィック（Colowick）,S.およびカプラン（Kaplan）,N.O.（著者）のメソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）、ニューヨーク（New York）のアカデミック・プレス（Academic Press）、第Ｉ巻〜第VII巻、（1957〜1964年）に開示されている。好ましくは、固定化される単離酵素の初期濃度は、酵素約0.001〜10,000ユニット、より好ましくは約0.01〜1,000ユニット、および最も好ましくは約0.1〜100ユニットである。固定化微生物を用いる場合、予め決められた数の微生物を用いて始めることが同様に好ましい。微生物がバチルスステアロサーモフィラス（Bacillus Stearothermophilus）またはバチルスサチリス（Bacillus Subtilis）である場合、好ましい数は微生物約１×102〜１×108である。微生物がバチルスステアロサーモフィラスである場合、微生物約１×102〜１×107が特に好ましい。微生物がバチルスサチリスである場合、微生物約１×106〜１×108が好ましい。その酵素または微生物を上述の方法に従って固定化する。好ましくは、既知の体積濃度の固定化微生物または酵素を有する懸濁液を調製し、予め決められた体積のこの懸濁液を用いてキャリヤー16（例えば、濾紙）を濡らす。好ましくは、固定化微生物少なくとも１×102または固定化酵素0.1ユニットをキャリヤー16上に置く。その乾燥キャリヤーを外装容器10に用いる。
内装容器18には、栄養生長培地の水溶液20および／または適当な酵素基質を含む。本発明に有用に用いられるそのタイプの栄養培地は、当業者に公知である。一般的に公知の微生物生長インジケーターは、生存能力のある微生物の存在により色が変化し、好ましくは容器の少なくとも１つに存在する。その生長インジケーター材料は好ましくは水性栄養培地に可溶であり、（微生物の生長により）水性栄養培地を着色し、そして色の変化は外装容器の半透明壁を通して容易に観察され得る。加えて、酵素基質も存在する場合、その生長インジケーター材料は好ましくは、如何なる酵素変性物の色またはルミネセンスを妨害しないように選択される。
存在する場合、酵素基質は好ましくは内装容器18内の緩衝水溶液中に含まれる。その水性緩衝剤は、内装容器を破壊した後、残存する活性酵素または酵素基質系用の反応培地として働く。緩衝液のイオン条件は、酵素および酵素基質が影響を受けないようにすべきである。好ましくは、等張緩衝液、例えばホスフェート緩衝塩水、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−HCl溶液、またはアセテート緩衝液が選択される。
酵素基質が通常、圧力開封性内装容器18内に含まれるのに対して、乾燥状態の酵素基質は酵素キャリヤー16と共に外装容器10内に含まれ得ることが予期される。事実、活性酵素およびその基質は同一キャリヤー16内に乾燥状態で存在し得る。この構造において、内装容器18は好ましくは活性酵素およびその基質が反応するのに必要な水性反応培地を運搬する。
酵素基質の水溶液20および／または水性栄養培地を含む内装容器18は、気体および液体不透過性であり、加圧して開封され（即ち、「圧力開封性（pressure openable）」）酵素基質および／または栄養培地を外装容器10に入れられ得る材料から成る。内装容器18は、好ましくは外装容器10を変形させた場合に内装容器18を破壊または破砕させるのに折れ易い材料、例えばガラスから成る。その他の態様では、内装容器18はプラグを用いてシールされてもよく、加圧によりそのプラグを外して内装容器18の内容物を放出する。更に他の態様では、米国特許第4,304,869号に開示のように、蓋装置26には、アンプル破砕装置を含んでもよく、その蓋は、蓋装置の下降によりアンプルを破砕する、蓋装置の底から垂れ下がったタブを有する。同様に、本発明のその装置を、外装容器10の底に配列されたアンプル破砕ピンを有するシステムに用いてもよい。
外装容器10は少なくとも１つの開口部を有し、滅菌剤（例えば、蒸気、酸化エチレン）の進入を可能とする。この開口部は、気体透過性半多孔性手段を用いて通常密閉されているか密栓されている。好適な手段には、繊維材料、例えば綿；ガラスウール；布；ポリプロピレン、レーヨン、ポリプロピレン／レーヨン、ナイロン、ガラスまたは他の繊維から作製された不織ウェブ；濾紙；微孔性の疎水性または親水性フィルム；連続気泡プラスチックフォーム；例えば米国特許第3,346,464号に開示のような半透過性プラスチックフィルム；から作製された蓋部材22を含む。
本発明の滅菌インジケーターの好ましい態様が、図３および図４に示されている。その装置には、液体不透過性および好ましくは気体非吸収性および開口末端44を有する外装容器40を含む。外装容器40には、圧力開封性内装容器48を含み、それは好適な酵素基質の水溶液50および／または水性栄養培地を含む。外装容器40の開口末端44は、気体透過性半多孔性蓋部材52により覆われている。それを用いて、図１に示される装置と同様の目的を果たす。図３および図４の装置において、キャリヤー46を外装容器40の閉鎖末端に置き、バリヤー47をキャリヤー46および圧力開封性内装容器48の間のプラグのように置く。バリヤー47は好ましくは繊維、例えば綿、レーヨン、ポリプロピレン、ポリプロピレン／レーヨン混合物、ナイロンまたはガラスの不織ウェブから作製される。最も好ましくは、バリヤー47はポリプロピレン不織ウェブ、例えばミネソタ州セントポール（St.Paul）の3Mから「シンシュレート（ThinsulateR）200−Ｂブランドのサーマル・インシュレーション（Thermal Insulation）」から構成される。
バリヤー47はキャリヤー46を内装容器48から分離し、従って内装容器48がキャリヤー46上に配置される場合にコールドスポットは排出される。コールドスポットの存在により、凝縮が起こりキャリヤー46上に集まる。凝縮物はキャリヤー46に含まれる酵素の活性に作用し得る。バリヤー47は好ましくは疎水性材料から作製され、それはキャリヤー周辺に生長微生物および／または酵素変性物を濃縮するが、バリヤーの反対側にある容器の領域内に急速には拡散しない。キャリヤー46を内装容器48の全含有物と反応する場合より短い培養時間後に検出されるのが発光であろうと着色であろうと、そのインジケーターの下部に高濃度の生長微生物および／または酵素変性物を保持することにより生成物を提供する。
蓋56は、上面57および付随する側壁59から成る。その蓋は底の空いた中空体であり、蓋の内径は外装容器40の外径とほぼ等しく、蓋56は外装容器40の開口末端44上に摩擦によりかみ合っている。側壁59内の切れ目は好ましくは多数の窓58である。インジケーター装置を滅菌されるべき負荷をかける場合、蓋56を外装容器の外部側壁42が窓58を塞がないように外装容器の開口部上に置く。そのような位置で、滅菌器内の滅菌剤は窓58を通る流れにより外装容器40に入る。滅菌サイクルの完了により、その蓋を押し下げて外装容器の側壁42が上面57の内側面とかみ合わせることにより十分挿入し、それにより窓58を塞ぐ。外装容器40の内部を外部環境からシールする。
使用中に図３および図４に示される生物学的インジケーターを、滅菌器槽内に多くの滅菌される項目、例えば蒸気または酸化エチレンガスと共に入れる。そのインジケーターが滅菌器内にある場合、窓58が空いて滅菌剤が入るように、蓋56を開放位置にする。滅菌剤をその槽内に導入する場合、滅菌剤は蓋部材52を透過してバリヤー47を通過して、キャリヤー46に存在する酵素を不活性化し試験微生物を殺す。滅菌サイクルの終わりに、滅菌剤を濾過空気と置換する。その無菌性インジケーターを滅菌器から引き出し、蓋56を十分挿入して窓58を塞ぎ、ガラスアンプル48を例えば、指圧により破砕し、酵素基質の水溶液および／または栄養生長培地を酵素キャリヤー46と接触させる。続いて、そのインジケーターを好適な培養環境内に置く。
適当な培養時間後、色またはルミネセンスの変化の発生が外装容器40の半透明壁42を通して分光測光的に観察されまたは測定され、滅菌サイクルによりキャリヤー46に存在する全活性酵素を不活性化せず、または全微生物を殺さなかったことを示し、それ故にその滅菌サイクルが完全に滅菌器内の項目を滅菌するのにはおそらく不十分であったことを示す。色またはルミネセンスに変化がないことにより、その滅菌サイクルがキャリヤー46の全活性酵素を不活性化し、または全微生物を殺すのに十分であったことを示し、それ故にその滅菌サイクルが滅菌器内の項目を滅菌するのに十分であったことを示す。
本発明の生物学的インジケーターを従来から用いられている如何なるタイプのテストパック材料または装置に用いてもよい。例示的テストパックには、共に3Mから市販されている「1278アテスト（AttestTM）EOパック（Pack）」および「1276アテスト・スチーム・パック（AttestTM Steam Pack）」を含み、それらの装置が米国特許第4,739,881号、同4,828,797号、同4,839,291号、同4,636,472号、同4,918,003号、および欧州特許第421,760号、同419,282号および同255,229号に開示されている。また、本発明の生物学的インジケーターを、AAMI、ブリティッシュ・デパートメント・オブ・ヘルス・スタンダーズ（British Department of Health Standards）、ジャーマン・インダストリアル・ノーム・スタンダーズ（German Industrial Norm Standards）およびコミッティー・オブ・ユーロピアン・ノーマライゼーション（Committee of European Normalization）により推奨されるプラスチックシリンジ、タオルパックまたは他のテストパック装置に用いてもよい。出願人は、固定化生体適合物質の使用により、より苛酷な滅菌条件、例えば121℃常圧および予備減圧および132℃および134℃予備減圧蒸気滅菌サイクルのこれらの規格に容易に応答し得るテストパックを提供することを見い出した。これは、米国特許第5,073,488号に開示のように酵素活性を用いて滅菌効力を評価する場合に顕著である。
図５および図６には、本発明の生物学的インジケーター11を含む好ましいテストパック100を示す。テストパック100は米国特許第4,918,003号に開示のものと同様であり、例えば全体寸法134mm×140mm×28mmを有するボックス102から成る。そのボックスはワニスを塗っていない漂白硫酸紙から作製されている。
そのボックスには、同様に漂白硫酸紙から作製されてた開放容器108を含み、それは外面に蒸気不透過性熱可塑性被膜110、例えばポリプロピレンラミネートを被覆されている。容器108は、ボックス102より僅かにだけ小さい寸法を有する。
半多孔性材料から成るシートスタック116により分離された半多孔性材料から成る２種のシートスタック112および114は、容器108内に含まれる。半多孔性材料から成る各スタックは好ましくは、坪量280m2（3,000ft2）当たり97kg（214ポンド）および厚さシート当たり約1mmを有する濾紙から作製される。スタック112および114は好ましくは濾紙20〜55枚を含む。その半多孔性スタック116は、本発明の生物学的インジケーター11を受容するために各シートの中央から面積13mm×49mmを切り抜いた濾紙約16枚から構成される。このセンター孔の高さは、組み立てて乾燥した場合、約10mmである。
実際、本出願人のテストパックはボックスフラップ122を開けることにより開放され、最上部半多孔性シートが除去され、好ましくはステンレス鋼製の金属コイルバネを回りに巻き付けた生物学的インジケーター11を、スタックの中央部のキャビティー内に入れる。コイルバネ120は、滅菌サイクル中の濾紙スタックの生物学的インジケーター11への圧縮力を低減し、内装容器18が早期破砕しないようにする。次いで、最上部シートを戻し、ボックスを閉じる。続いて、ボックスを標準負荷を有する滅菌器内に入れ、常套のサイクルを行う。
滅菌器内のエアポケットの存在または滅菌器サイクルの不十分な時間、温度等による多孔性および半多孔性スタックへの滅菌剤の透過不足により、滅菌剤が生物学的インジケーター内の微生物を殺し酵素を不活性化することを防止する。
一旦、滅菌サイクルが完了すると、テストパック100を滅菌器から取り出し、フラップ122を開けシートスタックを取り除いて、迅速に生物学的インジケーター11に接近する。生物学的インジケーターを栄養生長溶液および／または酵素基質を用いて培養し、色または蛍光の変化をしめす。
本発明のテストパックは、AAMI規格に記載された標準生物学的テストパックの蒸気透過性に応答し、標準AAMIテストパックと実質的に同一条件下での無菌性の不足を示す。
本発明の生物学的インジケーターおよびテストパックは、滅菌媒体、例えば酸化エチレン、（121℃予備減圧および常圧、および132℃および134℃予備減圧を含む）様々な蒸気滅菌サイクル等に関して主に説明されている。しかしながら、そのインジケーターは、これらの用途に限定されず、更に、その他の滅菌媒体、例えば乾式熱、放射線、酸化プロピレン、臭化メチル、オゾン、二酸化塩素、ホルムアルデヒド、および他の気体および液体薬剤の効力を表示するのに用いられてもよい。
本発明は以下の非限定例により説明される。
実施例
実施例１
本実施例は固定化した胞子及び酵素を含有し常套のテストパック装置を使用しない本発明の生物学的インジケーターがAAMI16タオルテストパックにおける常套の生物学的インジケーター（BIs）に比べて、121℃（125゜F）の常圧及び132℃（270゜F）予備減圧滅菌暴露の両方の条件で滅菌効力のある結果を提供することができることを例示する。
胞子ストリップの調製
メリーランド州ロックビル（Rockville）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）から「ATCC・7953」として市販入手可能なバチルスステアロサーモフィラス（Bacillus Stearothermophilus）を約16時間58℃でトリプシン大豆ブイヨン中で一晩成長させた。この培養液を用いて8g/リットルの栄養ブイヨン、4g/リットルのイーストエキス、0.1g/リットルの塩化マンガン、及び20g/リットルの寒天培養基からなるプレート中に含まれる寒天培養基表面にpH7.2で注射した。注射したプレートを58℃で72時間培養した。胞子をプレートから取り出し滅菌した蒸留水中に懸濁させた。胞子を7000rpm、４℃で20分間懸濁液を遠心分離することによって培養力のある残留物から分離した。上澄みを流し去り胞子を滅菌した蒸留水中に再懸濁させた。この洗浄操作を数回繰り返した。
バチルスステアロサーモフィラス胞子を、ニューハンプシャー州ケーン（Keene）のシュレイカー＆シュエル（Schleicher ＆ Schuell）から「Ｓ＆Ｓ ＃903・グレイド・フィルター・ペーパー（Grade Filter Paper）」として市販入手可能な6.35×9.52mm（1/4×3/8インチ）の濾紙のストリップ上にストリップに対して7.5×105胞子の割合で被覆形成し乾燥した。これは7.5×107胞子／ミリリットルの濃度で水中への胞子の懸濁液を調製し、この懸濁液10マイクロリットルを各濾紙ストリップ上に滴下しストリップを周囲条件下で乾燥することによって達成した。
胞子の固定化
胞子ストリップ上に含まれる胞子及び胞子の有する酵素を固定化する以下の方法を用いた。バチルスステアロサーモフィラスの奉仕ストリップを以下の化学薬品固定化水溶液：
表１及び２に記載するパーセント濃度（w/v）でのニューヨーク州ニューヨークのファイザー（Pfizer）から市販入手可能な「Ｄ−ソルビトール（Sorbitol）」、又はコネチカット州ダンバリー（Danbury）のユニオン・カーバイド・コーポレーション（Union Cabide Corporation）から「カーボワックス（Carbowax）PEG−1450」として市販入手可能な「ポリエチレングリコール」の１つで被覆し、個々のストリップに対して約2.75×10-5〜3.75×10-5g/mm2の被膜重量を得た。これは50マイクロリットルの固定化液の１つを胞子ストリップ上に滴下し被覆形成された胞子ストリップを周囲条件下で24時間乾燥することによって達成した。
発明の装置の組み立て
装置は図３及び４に例示するように、薬ビン42の外側の仕切りの底部上の固定化胞子ストリップ46と酵素基質含有アンプル48と胞子ストリップの間のバリヤー47とで構成されている。200g/m2の重量を有するポリプロピレンブロウンマイクロファイバー材料の1.75cm（11/16インチ）の直径のディスク（ミネソタ州セントポールの3Mから「シンシュレート（Thinsulate）200−Ｂ ブランド・サーマル・インシュレーション（brand Thermal Insulation）」として市販入手可能）をバリヤー47として使用した。アンプル48は17gの細菌学上のペプトン及び0.17gのＬ−アラニンからなる栄養培地0.67ミリリットルだけでなく、１リットルの蒸留水中に0.1gの酵素基質、４−メチルウンベリフェリル−アルファー−Ｄ−グルコシド（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル（Sigma Chemical）社から市販入手可能）、及び0.03gのブロモクレゾールパープルpH指示染料を含有した。酵素基質及び栄養培地のpHを1.0Nの水酸化ナトリウムで7.6に調節した。外装容器42及び蓋56をポリプロピレンから形成した。外装容器42は5.08cm（2.0インチ）の長さ、89mm（0.335インチ）の外径及び85mm（0.303インチ）の内径であった。蓋56は1.66cm（0.510インチ）の長さ、1.07mm（0.328インチ）の内径であった。内側のアンプル48をガラスで形成し、3.96cm（1.56インチ）の長さ、6.5mm（0.258インチ）の外径及び2.5mm（0.010インチ）の壁厚さであった。蓋部材52はニューハンプシャー州ベンニントン（Bennington）のモナードノック・ペーパー・ミルズ（Monadnock Paper Mills）社から市販入手可能な「モナテック（Monatec）5111−067」の縫い合わせストックの1.27cm（0.5インチ）の直径の片であった。
常套のテストパックの組み立て
６〜８ユニットバッチの上述の生物学的インジケーター装置の機能を、常套のアソシエーション・フォー・ジ・アドバンスメント・オブ・メディカル・インスツルメンテーション（Association for the Advancement of Medical Instrumentation）（AAMI）蒸気テストパック、およびテストパックに包まれない常套の生物学的インジケーターに対して比較した。各AAMIタオルパックは良好な状態に清潔に洗浄されたミネソタ州ミネアポリスのアメリカン・リネン・サプライ（American Linen Supply）社から市販入手可能な「ハックタオル」16枚からなり、各タオルは約40.6×66cm（16×26インチ）であった。各タオルを1/3の長さに折り半分の幅に折った。次にタオルを互いの折り目を反対にして互いの上に置き約23×23×15cm（９×９×６インチ）のスタックを形成した。各タオルのスタック中に、ミネソタ州セントポールの3Mから市販入手可能な４つの「アテスト（Attest）TM1262/1262P・バイオロジカル・インジケーターズ（Biological Indicators）」（ロッド＃057、91年12月）又は４つの「アテスト（Attest）TM1291・ラピッド・リードアウト・バイオロジカル・インジケーターズ（Rapid Readout Biological Indicators）」（ロッド＃085、91年12月）をスタックの下から８枚目と９枚目のタオルの間に置いた。テストパックをオートクレーブテープで確保した。
比較試験
AAMIテストパック内に含まれずかつ金属器具トレイ内に置いた本発明と対照（常套のアテストTM1262/1262Pバイオロジカル・インジケーターと固定化しないこと以外は上述のように形成された対照の生物学的インジケーター）の装置、及び常套のAAMI生物学的テストパックを16、18、20、22、及び24分間121℃（250゜F）常圧のサイクルに（表１）、及び０、1.5、3.0、及び10.0分間132℃（270゜F）予備減圧のサイクルに２パルス（表２）、常圧変更及び真空補助蒸気滅菌装置（ペンシルバニア州エリエ（Erie）のアメリカン・ステリライザー・カンパニー（American Sterilizer Company）から「アムスコ・イーグル・モデル（Amsco EagleTM Model）3000として市販入手可能）中で暴露した。暴露後、常套の生物学的インジケーターをAAMI16タオルテストパックから取り出した。本発明のインジケーターと常套の生物学的インジケーターの両方の内側アンプルを割りユニットを60℃で培養した。酵素基質を使用して胞子の生存（即ち、本発明及び常套のテストパックはすべて1291「アテストTM・バイオロジカル・インジケーター（BI）」を含んでいる）を表示する装置に対して、「アテストTM・190・オート−リーダー（Auto−Reader）」（ミネソタ州セントポールの3Mから市販入手可能）は４及び８時間培養後の４−メチルウンベリフェリル蛍光を測定することによってアルファー−グルコシダーゼ活性を蛍光定量法的に読み取るために使用した。胞子の成長はpH指示薬によってなされた色の変化によって表されるので、24、48及び168時間培養においてすべてのユニットに対して目視で同定した。
結果を表１及び２に報告する。実施例の表において、BIは「生物学的インジケーター」と表す。
上記に示すデータは、Ｄ−ソルビトール及びポリエチレングリコールで固定化した胞子及び胞子についた酵素を用いた本発明の生物学的インジケーターはAAMIテストパックにおいて使用される常套の生物学的インジケーターに比べて生／死及び読み出し確実な結果を提供することができることを示している。本発明の生物学的インジケーターはテストパック材料又は装置を使用する必要なく、滅菌効力の迅速かつ適当な同定を提供する。
実施例２
本実施例は、固定化したアルファー−グルコシダーゼを使用した本発明の生物学的インジケーターがAAMI16タオルテストパックにおける常套の生物学的インジケーターに比べて121℃（250゜F）常圧及び132℃（270゜F）予備減圧滅菌暴露で滅菌効力のある結果を提供することを例示する。
酵素ストリップの調製
バチルスステアロサーモフィラスをから誘導し100ユニット/mgの特定の活性を有する凍結乾燥（lyophilized）し、浄化したアルファー−グルコシダーゼ（ロット＃001）を、日本、東京のユニチカ社から得た。アルファー−グルコシダーゼ（0.1g）を１ミリリットルの滅菌した蒸留水に懸濁させた。酵素懸濁液を滅菌した蒸留水１リットルに対して24時間、カリフォルニア州ロサンゼルスのスペクトル・メディカル・インダストリーズ（Spectrum Medical Industries）社から市販入手可能な「スペクトラ／ポア・モレキュラーポーラス・メンブラン（Spectra/Por Molecularporous Membrane）」を用いて、3500ダルトンの分子量限界で透析した。透析した酵素懸濁液を４℃で必要になるまで保存した。透析したアルファー−グルコシダーゼの希釈液を滅菌した蒸留水で作り750〜1500ユニット／ミリリットルの最終濃度の酵素を得た。アルファー−グルコシダーゼのこれらの希釈液をニューハンプシャー州ケーンのシュレイカー＆シュエルから「Ｓ＆Ｓ ＃903・グレイド・フィルター・ペーパー」として市販入力可能な6.35×28.58mm（1/4×3/8インチ）の濾紙のストリップ上に被覆形成し乾燥した。これは各懸濁液100マイクロリットルを各濾紙ストリップ上に滴下しストリップを周囲条件下で乾燥することによって達成した。
酵素の固定化
以下の酵素の固定化方法を用いた。アルファー−グルコシダーゼのストリップを以下の化学薬品固定化水溶液：
表３及び４に記載するパーセント濃度（w/v）でのニューヨーク州ニューヨークのファイザーから市販入手可能な「Ｄ−ソルビトール」、及びコネチカット州ダンブリーのユニオン・カーバイド・コーポレーションからの「カーボワックス・PEG−1450」で被覆し、個々のストリップに対して約2.75×10-5〜3.75×10-5g/mm2の被膜重量を得た。これは上記固定化化合物の溶液50マイクロリットルを酵素を被覆形成したストリップ上に滴下することによって達成した。固定化した酵素ストリップを周囲条件下で24時間乾燥させ、装置を組み立てた。
装置の組み立て
装置は図３及び図４に例示し、実施例１に記載するように、固定化した酵素ストリップを用いて構成した。10ユニットバッチの上述の生物学的インジケーター装置（金属器具トレイ上に配置）とアソシエーション・フォー・ジ・アドバンス・オブ・メディカル・インスツルメンテーション（AAMI）蒸気テストパック中の常套の生物学的インジケーターを実施例１に記載するような滅菌サイクルに暴露した。
発明の装置と常套のAAMI生物学的テストパックを同時に16、18、及び20分間121℃（250゜F）常圧のサイクルに（表１）、及び０、1.5、及び3.0分間132℃（270゜F）予備減圧の２パルスサイクルに（表２）、実施例１に記載するような滅菌装置中で暴露した。暴露後、常套の生物学的インジケーターをAAMIテストパックから取り出し、本発明と常套の生物学的インジケーターの装置の両方の内側アンプルを割りユニットを60℃で培養した。酵素活性及び胞子成長を実施例１に記載するように測定した。胞子成長は本発明の装置で測定することができなかったので、浄化した胞子よりもむしろ酵素を使用して滅菌の外観を同定した。
結果を表３及び４に報告する。
上記に示すデータは、Ｄ−ソルビトール及びPEG−1450で固定化したアルファー−グルコシダーゼを用いた本発明の生物学的インジケーターはAAMIテストパックにおいて使用される常套の生物学的インジケーターに比べて生／死読み出しを提供することができることを示している。
実施例３
本実施例は、本発明の生物学的インジケーターとAAMI16タオルテストパックにおける常套の生物学的インジケーターとの間の相関性を例示して、121℃（250゜F）常圧及び132℃（270゜F）予備減圧の滅菌サイクルの効力を同定する。
メリーランド州ロックビル（Rockville）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）から［ATCC 7953」として市販入手可能なバチルスステアロサーモフィラスを実施例１のように成長させた。
バチルスステアロサーモフィラス胞子を１×105胞子／ストリップの割合であること以外は実施例１のように濾紙の上に被覆形成し、乾燥し固定化した。これは水中への胞子の懸濁液を１×107胞子／ミリリットルの濃度に調製し、この懸濁液10μｌを各濾紙ストリップ上に滴下しストリップを周囲条件下で乾燥することによって達成した。
図１及び２に例示するように、装置がバリヤー47を含有しないこと以外は実施例１に記載するように固定化した胞子ストリップを用いて装置を構成した。
テストパックに含まれずかつ金属器具トレイ内に置いた３ユニットバッチのバチルスステアロサーモフィラス胞子と対照（実施例１により形成されたアテストTM・1262/1262P及び対照の生物学的インジケーター）を含有する装置、及びAAMI蒸気テストパックにおける常套の生物学的インジケーター（実施例１に記載するように調製）を121℃（250゜F）常圧（表５）及び132℃（270゜F）予備減圧（表６）の蒸気滅菌サイクルに暴露し、実施例１に記載するように胞子成長に対して評価した。
結果を表５及び６に報告する。
本発明の装置は、121℃（250゜F）常圧及び132℃（270゜F）予備減圧の蒸気サイクルに暴露した時にAAMI生物学的インジケーターテストパックにより提供される微生物の攻撃以上の微生物の攻撃を提供するように設計されている。上述のデータはＤ−ソルビトール及びPEG−1450で固定化した胞子を用いた本発明はこれらの要求を達成しかつそれ以上に機能することを示している。
実施例４
本実施例は固定化剤、Ｄ−ソルビトール及びPEG−1450の濃度変更の、バチルスステアロサーモフィラスATCC 7953固定化胞子及び胞子の有する酵素に対する121℃（250゜F）常圧暴露での生／死時間における効力を例示する。
すべての胞子は実施例１に記載するように栄養寒天培地上で成長させた。
バチルスステアロサーモフィラス胞子を実施例１に記載するように被覆形成し、乾燥し固定化した。
装置は図３及び４に例示し実施例１に記載するように構成した。
３ユニットバッチの上述の装置と実施例１により形成された生物学的インジケーター対照を金属器具トレイ中に置き10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24及び25分間実施例１に記載するような121℃（250゜F）常圧蒸気滅菌サイクルに暴露した。装置の内側アンプルを割りユニットを60℃で培養した。酵素活性及び胞子成長を実施例１に記載するように評価した。酵素活性は表７に報告し胞子成長は表８に報告する。
上述のデータは胞子及び胞子の有する酵素の固定化はＤ−ソルビトール及びPEG−1450濃度の増加に伴って胞子ストリップ上の胞子を死滅及び酵素を消滅させるのに必要な暴露時間が増加することを示している。
実施例５
本実施例は、常套のテストパック（図５に示すような）に132℃（270゜F）予備減圧暴露で使用する場合に、Ｄ−ソルビトールの使用は胞子の有する酵素及び胞子の生／死機能を向上させることを例示する。
すべての胞子は実施例１に記載するように栄養寒天培地上で成長させた。
表11に示す重量％濃度でバチルスステアロサーモフィラス胞子とＤ−ソルビトールの水中への懸濁液を生成した。これは洗浄したバチルスステアロサーモフィラス胞子を7.5×107胞子／ミリリットルの濃度で10％及び20％w/vのＤ−ソルビトールの懸濁液中に懸濁させることによって達成した。懸濁液を混合し、ニューハンプシャー州ケーン（Keene）のシュレイカー＆シュエル（Schleicher ＆ Schuell）から「Ｓ＆Ｓ ＃903・グレイド・フィルター・ペーパー（Grade Filter Paper）」として市販入手可能な6.35×9.52mm（1/4×3/8インチ）の濾紙のストリップ上にストリップに対して7.5×105胞子の割合で被覆形成し乾燥した。これは懸濁液10マイクロリットルを各濾紙ストリップ上に滴下しストリップを周囲条件下で乾燥することによって達成した。
装置は図３及び４に例示し実施例１に記載するように構成した。
３ユニットバッチの上述の装置と常套の生物学的インジケーター（「アテストTM・ラピッド・リードアウト・バイオロジカル・インジケーター 1291」（ロッド＃085、91年12月））をミネソタ州セントポールの3Mから市販入手可能な「アテストTM・1276・テストパック」中に置いた。
本発明の生物学的インジケーターを使用したテストパック及び常套の生物学的インジケーターパックを0.5、１、及び４分間実施例１に記載するような132℃（270゜F）予備減圧蒸気滅菌サイクル２パルスに暴露した。生物学的インジケーターをテストパックから取り出し、内側アンプルを割り各ユニットを60℃で培養した。酵素活性及び胞子成長を実施例１に記載するように評価した。結果を表９に報告する。
上述のデータは比較的低濃度のＤ−ソルビトールで固定化したバチルスステアロサーモフィラス胞子及び胞子の有する酵素、アルファー−グルコシダーゼは常套のテストパックにおける胞子に対しての生存時間を増加させてこれらのテストパックにおける常套の生物学的インジケーターの機能を超越することができることを示している。増加した生存時間はより大きく滅菌サイクルを観察できるのでテストパックの機能を改良する。
実施例６
本発明は他の固定化化合物を使用してバチルスステアロサーモフィラス胞子を固定化することを例示する。以下の化合物（及び原料）リストを使用した。：
「ミオ−エリスリトール（myo−erythritol）」、ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社
「アドニトール（adonitol）」、シグマ・ケミカル社
「ズルシトール（dulcitol）」、シグマ・ケミカル社
「Ｄ−マニトール（mannitol）」、シグマ・ケミカル社
「キシリトール（xylitol）」、シグマ・ケミカル社
「Ｄ−アラビニトール（arabinitol）」、シグマ・ケミカル社
「Ｄ（＋）−セロビオトース（cellobiose）」、シグマ・ケミカル社
「スクロース（surose）」、シグマ・ケミカル社
「メソ−イノシトール（inositol）」、シグマ・ケミカル社
「グリセロール（glycerol）」、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミ．（Aldrich Chem.）社
「ポリビニルアルコール（PVA）」アルドリッチ・ケミ．社
「トレハロース（trehalose）」シグマ・ケミカル社
「ラクトース（lactose）」シグマ・ケミカル社
「ラフィノース（raffinose）」シグマ・ケミカル社
「メレジトース（melezitose）」シグマ・ケミカル社
「マルトース（maltose）」シグマ・ケミカル社
［ATCC 7953」として市販入手可能なバチルスステアロサーモフィラスを実施例１に記載するように成長させた。
バチルスステアロサーモフィラス胞子を１×105胞子／ストリップの割合で被覆形成し、乾燥し実施例１に記載するように上述の化学固定化剤の１つで固定化した。
装置は図１及び２に例示し実施例３に記載するように固定化した胞子ストリップを用いて構成した。
３ユニットバッチの上述の装置（金属器具トレイ上に配置）とAAMI蒸気テストパック中の常套の生物学的インジケーター（実施例１に記載）を実施例１に記載するように同時に15、18、21、24、27、及び30分間121℃（250゜F）常圧の蒸気滅菌サイクルに暴露した。生物学的インジケーターの内側アンプルを割りユニットを56℃で培養した。胞子成長を実施例１に記載するように評価し結果を表10に報告する。
上述のデータは固定化化合物を変更して使用することはテストパックを使用する常套の生物学的インジケーターに比べて生／死時間点及び読み出し確実性を有する生物学的インジケーターを提供するのとを示している
実施例７
本実施例は本発明の実施に有用なバチルスステアロサーモフィラスに関連する種々の酵素を例示する。本実施例ではニューヨーク州プラインビュー、APIアナリタブ・プロダクツ（Analytab Products）から［API−XYMTMシステム（System）」として市販入手可能な酵素基質キットを用いた。このキットは個々に一連のマイクロカプセルに封入された19の異なった脱水色原体酵素基質からなる。水性試料の各マイクロカプセルへの添加は基質を再水和させる。テストキットを必要な時間培養しシステムが有する検出試薬を添加した後反応を目視で読み取った。
バチルスステアロサーモフィラス胞子「ATCC 7953」を実施例１に記載するように成長させた。
バチルスステアロサーモフィラス胞子を実施例１に記載するように１×105胞子／ストリップの割合で濾紙ストリップの上に被覆形成し、乾燥した。これは水中への胞子の懸濁液を１×107胞子／ミリリットルの濃度に調製し、この懸濁液10マイクロリットルを各濾紙ストリップ上に滴下しストリップを周囲条件下で乾燥することによって達成した。胞子を実施例１に記載するように「Ｄ−ソルビトール」を30重量％／体積のパーセント濃度で使用することによって固定化した。
装置は図３及び４に例示し実施例１に記載するように胞子ストリップを用いて構成した。
３ユニットバッチの本発明の装置を実施例１に記載するように15、及び30分間121℃（250゜F）常圧のサイクルに滅菌装置中で暴露した。暴露後、胞子ストリップを無菌状態で取り出し、酵素基質キット中の各マイクロカプセルに移し、滅菌したトリプシン大豆ブイヨン100マイクロリットルを各穴に添加した。第１のキットは15分間暴露した固定化胞子ストリップを含有し、第２のキットは30分間暴露した固定化胞子ストリップを含有し、及び第３のキットは暴露しない固定化胞子ストリップを含有した。
キットを56℃で7.5時間培養した。培養後、API−XYMTMシステムとともに入手できる検出試薬Ａ及びＢを基質成長用に添加した。各マイクロカプセル内の色の検出は活性酵素の存在を示している。結果を表11に報告する。
上述のデータはバチルスステアロサーモフィラス胞子に固有の多くの酵素が発明の実施に有用であるほど十分な活性を有することを例示している。バチルスステアロサーモフィラス胞子に固有の評価した酵素はすべて15分間の効力的でない滅菌サイクルの後は検出可能な活性を示したが、30分間の暴露の後は活性を示さなかった。種々の酵素はバチルスステアロサーモフィラスに固有でなく暴露又は非暴露状態で活性を示さなかった。
実施例８
本実施例は異なった化合物を使用してバチルスサチリス胞子を固定化することを例示する。以下の固定化化合物（その原料とともにリスト）を使用した。：
「ミオ−エリスリトール（myo−erythrito−ｌ）」、ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社
「アドニトール（adonitol）」、シグマ社
「ズルシトール（dulcitol）」、シグマ社
「Ｄ−マニトール（mannitol）」、シグマ社
「キシリトール（xylitol）」、シグマ社
「ポリオール−Ｐ」、ニューヨーク州ニューヨークのファイザー社
「Ｄ−アラビニトール（arabinitol）」、シグマ社
「Ｄ（＋）−セロビオース（cellobiose）」、シグマ社
「スクロース（sucrose）」、シグマ社
「ミオ−イノシトール（inositol）」、シグマ社
「グリセロール（glycerol）」、ウィスコンシン州ミルウォーキー、アルドリッチ・ケミカル（Aldrich Chemical）社
「ジプロピレングリコール」、アルドリッチ社
「ポリビニルアルコール」アルドリッチ社
「ポリビニルピロリドン Ｋ−90」、ニュージャージー州ウェイン、ガフ・ケム（GAF Chem.）社
「トレハロース（trehalose）」シグマ社
「Ｌ−ソルボース（sorbose）」シグマ社
「ラクトース（lactose）」シグマ社
「Ｄ−グルコース（glucose）」シグマ社
「ラフィノース（raffinose）」シグマ社
「メレジトース（melezitose）」シグマ社
「Ｄ−フルクトース（fructose）」シグマ社
「Ｌ−アラビノース（arabinose）」シグマ社
「澱粉」
「ソルビトール（sorbitol）」、ファイザー社
「シクロデキストリン」、インディアナ州ハモンド、アメリカン・マイズ−プロダクト（American Maize−Product）社
「Ｄ−リボース」、シグマ社
「ペクチン」、シグマ社
「グア（guar）ゴム」、シグマ社
「トラガカンタ（tragacanta）ゴム」、シグマ社
「アラビアゴム」、シグマ社
「カッパ・カラジーナン（Kappa carrageenan）」、シグマ社
「マルトース（maltose）」シグマ社
「ポリエチレングリコール（カーボワックス・PEG−1450）」、ユニオン・カーバイド
［ATCC 9372」バチルスサチリスを16時間37℃でトリプシン大豆培地中で成長させた。この培養液を用いて8g/リットルの栄養ブイヨン、0.011g/リットルの硫酸マンガン、及び20g/リットルの寒天培養基からなるpH7.2の寒天培養基プレートの表面に注射した。プレートを37℃で６日間培養し胞子をプレートからスクラップし滅菌蒸留水に懸濁した。胞子を7000rpm、４℃で20分間懸濁液を遠心分離することによって培養力のある残留物から分離した。上澄みを流し去り胞子を滅菌した蒸留水中に再懸濁させた。この洗浄操作を数回繰り返した。
バチルスサチリス胞子を、実施例１に記載するように6.35×28.58mm（1/4×3/8インチ）の濾紙のストリップ上にストリップに対して１×106胞子の割合で被覆形成し乾燥した。バチルスサチリスの胞子ストリップを実施例12に記載するように表２に特定されたパーセント濃度（w/v）で先に挙げた固定化剤の１つの溶液で被覆し、乾燥させた。
装置は図１及び２に示し実施例３に記載するように固定化した胞子ストリップを用いて組み立てた。
３ユニットバッチの上述の装置と実施例１により形成された対照（共に金属器具トレイ上に配置）、及びミネソタ州セントポールの3Mから市販入手可能な「アテストTM・1278・テストパック」（ロッド＃215 1992年６月）中の常套の生物学的インジケーター（「アテストTM・ラピッド・リードアウト・1264・バイオロジカル・インジケーター」）を事前に54℃、相対湿度60％で30分間の条件に置きついで、15、18、21、24、27、及び30分間54℃、相対湿度60％で、「ジョスリン（Joslyn）EOビア・ベッセル（Bier Vessel）」エチレンオキサイド滅菌装置（ニューヨーク州マセドンのジョスリン・バルブ（Joslyn Valve）から市販入手可能）中で600mg/リットルのエチレンオキサイドに暴露した。
暴露後、本発明の装置の内側アンプルを無菌状態で取り出し、17g/リットルの細菌学上のペプトン、0.17g/リットルのＬ−アラニン及び0.03g/リットルのトリフェニルテトラゾリウムクロライドの溶液0.67ミリリットルを各ユニットの外側薬ビンに添加した。常套の生物学的インジケーターをテストパックから取り出し内側アンプルを割った。すべてのユニットを37℃で培養した。pH指示薬によって生成される色の変化により示されるように、胞子成長を24、48、及び168時間培養で目視同定した。
結果を表12に報告する。
データは常套のテストパックなしで使用した固定化バチルスサチリス胞子は常套のテストパックにおける常套のエチレンオキサイド生物学的インジケーターと同定度又はそれ以上に良好な生／死時間点を有するエチレンオキサイド滅菌インジケーターを提供することを示している。しかし、30分暴露後の胞子生存は、発明のインジケーターが常套の生物学的インジケーターテストパックを模擬試験するためには固定化剤濃度を減少させる必要があることを示している。
実施例９
本実施例は表13に挙げる化合物（ポリオール及び関連化合物はエチレンオキサイドとともに有用な固定化させる化合物用に幅広い種類を要する）を使用してバチルスサチリス胞子及びその酵素のベータ−グルコシダーゼを固定化するのとを例示する。
［ATCC 9372」バチルスサチリス胞子を実施例８に記載するように成長させた。バチルスサチリス胞子を１×107胞子／ストリップの割合であること以外は実施例８に記載するように被覆形成し、乾燥し、固定化した。
装置は図３及び４に示し実施例１に記載するように固定化胞子ストリップを用いて組み立てた。
３ユニットバッチのこれらの装置をミネソタ州セントポールの3Mから市販入手可能な「1278・アテストTM・テストパック」（ロッド＃215 1992年６月）中の常套の生物学的インジケーター「アテストTM・エチレン・オキサイド・バイオロジカル・インジケーター・1264」のユニットバッチといっしょに金属器具トレイ内に置いた。発明及びテストパック中の常套の生物学的インジケーターを事前に54℃、相対湿度60％で30分間の条件に置いた。ついで装置を、20、30、60、及び120分間54℃、相対湿度60％で、「ジョスリン・EO・ビア・ベッセル」（ニューヨーク州マセドンのジョスリン・バルブから市販入手可能）中の600mg/リットルのエチレンオキサイドに暴露した。
暴露後、本発明の装置の内側アンプルを無菌状態で取り出し、17g/リットルの細菌学上のペプトン、0.17g/リットルのＬ−アラニン及び0.03g/リットルのトリフェニルテトラゾリウムクロライド及び0.1g/リットルの４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルコシド（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社から市販入手可能）の溶液0.67ミリリットルを各ユニットに添加した。常套の生物学的インジケーターをテストパックから取り出し、その内側アンプルを割った。すべてのユニットを37℃で培養した。3Mから市販入手可能な「アテストTM・190・オート−リーダー」を用いて８時間培養後の４−メチルウンベリフェリル蛍光を測定することによってベータ−グルコシダーゼ活性を蛍光定量法的に読んだ。pH指示薬によって生成される色の変化により示されるので、胞子成長を24、48、及び168時間培養で目視同定した。
結果を表13に報告する。
データは常套のテストパックなしで使用した固定化バチルスサチリス胞子は常套のテストパックにおける常套のエチレンオキサイド生物学的インジケーターと同程度又はそれ以上に良好な生／死時間点を有するエチレンオキサイド滅菌インジケーターを提供することを示している。しかし、30分暴露後の胞子生存は、発明のインジケーターが常套の生物学的インジケーターテストパックを模擬試験するためには固定化剤濃度を減少させる必要があることを示している。
実施例10
本実施例は、不溶性支持体材料上への吸収によって固定化させたアルファー−グルコシダーゼを含有する本発明の生物学的インジケーターがAAMI16タオルテストパックにおける常套の生物学的インジケーターに比べて、125゜F（121℃）常圧暴露で滅菌の有効な結果を提供することを例示する。
酵素の調製
バチルスステアロサーモフィラスをからの浄化した「アルファー−グルコシダーゼ」（ロッド＃001）を日本国、東京のユニチカ社から得た。100ユニット/mgタンパク質の特定の活性を有する凍結乾燥されたアルファー−グルコシダーゼ（10,000ユニット）を１ミリリットルの滅菌した蒸留水に懸濁させた。この懸濁液を滅菌した蒸留水１リットルに対して24時間、カリフォルニア州ロサンゼルスのスペクトラム・メディカル・インダストリーズ社から市販入手可能な「スペクトラ／ポア・モレキュラーポロース・メンブラン」を用いて、3500ダルトンの分子量限界で透析した。透析した酵素懸濁液を４℃で必要になるまで保存した。透析したアルファー−グルコシダーゼの希釈液を滅菌した蒸留水で作り200ユニット／ミリリットルの酵素濃度で50ミリリットルの懸濁液を得た。
酵素の固定化
支持体材料「デア−セファデックス（DEAE−Sephadex）Ａ−50」、「CM−セファデックスＣ−50」（共にニュージャージー州ピスカタウェイのファーマシア・ファイン・ケミカルズ（Pharmacia Fine Chemicals）から市販入手可能）；「シリカ・ゲル（Silica Gel）60・オングストロームズ（Angstroms）」（イリノイ州マックグロウパークのアメリカン・サイエンティフィック・プロダクツ（American Scientific Products）から市販入手可能）；ヒドロキシルアパタイト及び炭酸カルシウム（共にニュージャージー州チェリーヒルのEM・サイエンス（Science）から市販入手可能）上への吸着による酵素の固定化は以下の方法によって達成した。
５つの支持体材料を以下のような適当な緩衝溶液への懸濁によって平衡にした。デア−セファデックス、0.5g;シリカ・ゲル、1g;ヒドロキシルアパタイト、1g;及び炭酸カルシウム、1gを別々の0.01Mの硫酸カリウム緩衝液pH7.3の溶液100ミリリットル中に懸濁し、２日間周囲条件で平衡にした。CM−セファデックス、0.5gを0.01Mの酢酸ナトリウム緩衝液pH4.6、100ミリリットル中に懸濁し、２日間平衡にした。平衡にした支持体材料を次に7000rpm、４℃で30分間遠心分離し、上澄みを捨てた。支持体材料のペレットを次に200ユニット／ミリリットルのアルファー−グルコシダーゼ溶液10ミリリットルを添加し、静かに１時間周囲条件下で回転式撹拌機を用いて混合することによって再度懸濁させた。
酵素／支持体錯体を7000rpm、４℃、15分間の遠心分離によってペレットさせた。上澄みを取り除き、保存した。酵素／支持体錯体を周囲条件で４日間乾燥させた。乾燥した酵素／支持体錯体を４℃で必要になるまで保存した。
５つの支持体材料上に固定化したアルファー−グルコシダーゼの量の測定を、以下のように支持体材料上へのアルファー−グルコシダーゼの固定化後に回収された上澄み中に残るユニットにおける酵素活性の量を同定することによって行った。
滅菌蒸留水中の20mMのｐ−ニトロフェニル−アルファー−Ｄ−グルコピラノシド（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社から市販入手可能）900マイクロリットルをテストチューブ内で上澄みの蒸留水での1:100希釈液100マイクロリットルと混合した。30℃で15分後、0.2Mの炭酸ナトリウムをテストチューブに入れ酵素−基質反応を終わらせた。基質生成物、ｐ−ニトロフェノールの発生による400nmでの吸着の増加は酵素を除去した対照と比べて決定した。18.1cm2/マイクロモルの分子吸光係数を用いて上澄み中に含まれる基質生成物の量を計算した。あるユニットの酵素活性は30℃で１分間に１マイクロモルのｐ−ニトロフェノールを形成するアルファー−グルコシダーゼの量として規定される。上澄み中に含まれる酵素のユニットを2,000ユニットから引くと乾燥した酵素／支持体錯体中に含まれる酵素のユニットが得られる。乾燥した酵素／支持体生成物中の酵素のユニットを表14に報告する。
装置の組み立て
装置は0.1gの乾燥した酵素／支持体生成物を外装容器中に置いた後にバリヤー47を外装容器内に配置した以外は図３及び４に例示し、実施例１に記載するするように構成した。
３ユニットバッチの固定化したアルファー−グルコシダーゼからなる本発明の装置を金属器具トレイ上に配置した。ミネソタ州セントポールの3Mから市販入手可能な３つの「アテストTM・バイオロジカル・インジケーターズ・1262/1262P」及び３つの「アテストTM・ラピッド・リードアウト・バイオロジカル・インジケーターズ・1291」をAAMI蒸気テストパック内にスタックの下から８枚目と９枚目のタオルの間に置いた。テストパックをオートクレーブテープで確保した。
発明の装置と常套のAAMI生物学的テストパックを16、18、及び20分間250゜F（132℃）常圧に「アムスコ・イーグルTM・モデル・3000」蒸気滅菌装置内で暴露した。暴露後、常套の生物学的インジケーターをAAMI16タオルテストパックから取り出した。本発明の装置と常套の生物学的インジケーターの内側アンプルを割りユニットを60℃で培養した。「アテストTM・190・オート−リーダー」を用いて４及び８時間培養後の４−メチルウンベリフェリル蛍光を測定することによってアルファー−グルコシダーゼの活性を読んだ。結果を表15に報告する。
上記に示す結果は、種々の水不溶性支持体キャリヤー上に吸着させることによって固定化したアルファー−グルコシダーゼを用いた本発明の生物学的インジケーターはAAMIテストパックにおける常套の生物学的インジケーターに比べて生／死結果を提供することができることを示している。
実施例11
本実施例は、常套のテストパック（図５及び６に示すように）にとともに及びこれらなしにヨーロッピアン・ステリリゼイション・イクイップメント・カンパニー（European Sterilization Equipment Company）予備減圧蒸気滅菌サイクル（121℃）に使用した場合に、固定化剤Ｄ−ソルビトールの使用は胞子の有する酵素及び胞子の生／死機能を向上させることを例示する。
バチルスステアロサーモフィラス胞子は実施例１に記載するように濾紙上に被覆形成し「Ｄ−ソルビトール」で固定化した。本発明の生物学的インジケーターを図３及び４に例示し実施例１に記載するように構成した。
テストパックの組み立て
テストパックを図５及び６に示すように構成した。テストパック100は全体で134mm（5.36インチ）×140mm（5.60インチ）×28mm（1.12インチ）の大きさを有する箱102を含有した。この箱はワニスを塗っていない漂白硫酸紙で作られていた。
この箱は、その外側表面上をポリプロピレンラミネートの蒸気非透過性熱可塑性被膜110で被覆された漂白硫酸紙で同じく作られた開口した容器108を有していた。容器108は箱102よりごく僅かに小さい大きさであった。
半多孔性材料の２スタックのシート112及び114が同様に半多孔性材料の１スタックのシート116で分離され、これが容器108中に含まれていた。半多孔性材料の各スタックを約214ポンド（7kg）/3,000平方フィート（280m）の基本重量と約1mm/シートの厚さを有する濾紙から形成した。スタック112及び114は36枚の濾紙を含有していた。半多孔性スタック116は各シートの中心から13mm×49mmの領域118が切断された16枚の濾紙からなり、本発明の生物学的インジケーター11を受けるようにした。この中心核の高さは組み立て及び乾燥した際に約10mmであった。
テストパックは箱のフラップ112を開けることによって開口され、表面の半多孔性シートを除去し、螺旋状の金属バネ120（好ましくはステンレススチールで作られている）によって取り囲んだ常套の生物学的インジケーター又は本発明の生物学的インジケーターをスタックの中心位置の穴内に置いた。表面シートを次いで再配置し箱を閉めた。
比較テスト
単独及び上述のテストパック中で使用される本発明の装置と、上述のテストパック中にある常套の「アテストTM1262・バイオロジカル・インジケーター」と「アテストTM・1291・ラピッド・リードアウト・バイオロジカル・インジケーター」からなる対照を金属トレイ中に置き、６、6.5、７、及び15分間121℃（250゜F）予備減圧滅菌サイクルに３ネガティブパルス、常圧変更及び真空補助滅菌装置内（ニュージャージー州レイクウッドのゲティングTM・インターナショナル（GetingeTM International）社からのゲッティングTM・パックス（GetingeTM PACs）2000ハイ・バキューム・ステリライザー（High Vacuum Sterilizer）」として市販入手可能）で暴露した。滅菌装置の設定は表16に示した。サイクルはヨーロピアン・ステリリゼーション・イクイップメント・カンパニー予備減圧サイクルである。暴露後、生物学的インジケーターを実施例１に記載するように評価した。結果を表17に報告する。
本発明の装置は、蒸気滅菌サイクル（ヨーロピアン・ステリリゼーションサイクルを含む）に暴露した時に常套のテストパックにより提供される微生物の攻撃以上の微生物の攻撃を提供するように設計されている。表17に報告するデータは本発明の生物学的インジケーターは（テストパック有りでもなしでも）これらの要求を達成しかつそれ以上に機能することを示している。
実施例12
実施例12は、常套のテストパック（図５及び６に示すように）とともに及びこれらなしにヨーロッピアン・ステリリゼイション・イクイップメント・カンパニー（European Sterilization Equipment Company）予備減圧蒸気滅菌サイクル（134℃（272゜F））に使用した場合に化学固定化剤Ｄ−ソルビトールの使用が胞子の有する酵素及び胞子の生／死機能を向上させることを例示する。
メリーランド州ロックビル（Rockville）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）から「ATCC 7953」として市販入手可能なバチルスステアロサーモフィラスは実施例１に記載するように成長させた。バチルスステアロサーモフィラス胞子を実施例１に記載するように濾紙上に被覆形成し、乾燥し、固定化した。生物学的インジケーター装置を実施例１に記載し図３及び４に例示するように固定化した胞子ストリップを用いて構成した。
３ユニットバッチの、単独及び実施例13に記載するようなテストパック中で使用される固定化したバチルスステアロサーモフィラス胞子を含有する装置と、実施例13に記載する常套の蒸気テストパック中にある常套の「アテストTM・1262・バイオロジカル・インジケーター」と「アテストTM・1291・ラピッド・リードアウト・バイオロジカル・インジケーター」を金属器具トレイ中に置いた。これらを０、２、４、６、８、10及び12秒間134℃（272゜F）予備減圧滅菌サイクルに３ネガティブパルス及び４ポジティブパルス、常圧変更及び真空補助滅菌装置内（ニュージャージー州レイクウッド、ゲティング・インターナショナル（Getinge International）社からのゲッティング・パックス（GetingeTM PACs）・2000・ハイ・バキューム・ステリライザー（High Vacuum Sterilizer）」として市販入手可能）で暴露した。滅菌装置の設定は表18に示した。サイクルはヨーロピアン・ステリリゼーション・カンパニー予備減圧サイクルである。暴露後、生物学的インジケーターを実施例１に記載するように評価した。結果を表19に報告する。
上記表19中のデータは（テストパック有りでもなしでも）Ｄ−ソルビトールで固定化した胞子及び胞子の有する酵素を用いた本発明の生物学的インジケーターは常套の蒸気滅菌テストパックに使用される常套の生物学的インジケーター以上の微生物の攻撃を提供することを示している。
以下は商標である。：
「1278・アテストTM・EO・パック」
「1276・アテストTM・スチーム・パック」
「アテストTM・1262/1262P・バイオロジカル・インジケーター」
「アムスコ・イーグルTM・モデル・3000」
「アテストTM・バイオロジカル・インジケーター」
「アテストTM・190・オート−リーダー」
「アテストTM・1276・テストパック」
［API−XYMTM・システム」
「アテストTM・1264・バイオロジカル・インジケーター」
「アテストTM・1278・テストパック」
「アテストTM・エチレン・オキサイド・バイオロジカル・インジケーター・1264」
「アテストTM・1262・バイオロジカル・インジケーター」
「ゲッティングTM・パックス・2000・ハイ・バキューム・ステリライザー」
「ゲッティングTM・インターナショナル社」
「アテストTM・1291・バイオロジカル・インジケーター」
「セファデックス・Ｇ−タイプ」
「セファローズ・イオン・エクスチェンジャー」
「セファデックス・イオン・エクスチェンジャー」
「チンシュレート・200−Ｂ・ブランド・サーマル・インシュレーション」
「カーボワックス・PEG−1450」
「スペクトラ／ポア・モレキュラーポローズ・メンブラン」
「パーコール」
「シグマ・ケミカル社」
「ガフ・ケム社」
「デア−セファデックス・Ａ−50」
「CM・セファデックス・Ｃ−50」
本発明は、固定化を用いてインジケーター内に入れた生体適合物質（例えば、微生物または酵素）の熱安定性を向上させる生物学的インジケーターに関する。その生物学的インジケーターは、テストパック材料または装置を用いるかまたは用いずに滅菌効力を表示するのに使用され得る。
背景技術
滅菌効力を決定するのに用いられる生物学的インジケーターは当業者に公知である。従来の生物学的インジケーターでは、自然混入により存在するほとんどの微生物より、用いられる滅菌法に抵抗力のある試験微生物をキャリヤー上に被覆し、滅菌されるべき物品と共に滅菌サイクルを行う。滅菌サイクル完了後、そのキャリヤーを栄養培地に培養し、試験微生物が滅菌法後に生存するかどうかを決定する。
生物学的インジケーターを用いる滅菌装置の効力を試験する多くの方法が提案されてきた。ジ・アソシエーション・フォー・ジ・アドバンスメント・オブ・メディカル・インスツルメンテーション（The Association for the Advancement of Medical Instrumentation）（AAMI）は、酸化エチレンおよび蒸気滅菌剤の両方の評価に関する推奨方法を刊行している。酸化エチレン滅菌剤の定性試験に関して、AAMIは生物学的インジケーターをプラスチックシリンジのバレル内に入れることを推奨している。プラスチック気道管、ある長さのラテックス管、および上記シリンジ２本を折りたたんだ手術用タオルのスタックの中央に置く、そのスタックを包装材料で包装する。得られるテストパックは、酸化エチレン滅菌のパラメータを攻撃するように設計されている。
蒸気常圧置換および予備減圧滅菌剤に用いるテストパックに関するAAMIの推奨方法には、14〜16枚のタオルテストパック内に適当な生物学的インジケーターを用いる方法を含む。タオルを折りたたんで積み重ねる。生物学的インジケーターは、そのパックの幾何学的中心の第７番目および第８番目のタオルの間に置かれるべきである。
生物学的インジケーターおよび他の材料を含むテストパックにより、酸化エチレンおよび蒸気滅菌剤の効力を評価するのに必要な全パラメータを攻撃する目的を有する。両タイプのAAMIテストパックの１つの要求は、滅菌剤の生物学的インジケーターへの流動を防止し、その負荷をかけた滅菌速度をより正確に模擬試験することである。その目的に対しては有効であるが、酸化エチレンおよび蒸気滅菌サイクル用のAAMIテストパックの構造は、大きな労力を要し、得られるパックは大きくかさばる。これらの限界を考えて、多くの市販製品が、単一予備集成および標準化複合滅菌テストパックに対する要求に取り組んでいる。典型的製品には、「1278アテスト・EO・パック（AttestTM EO Pack）」および「1276アテスト・スチーム・パック（AttestTM Steam Pack）」が挙げられ、両方とも3M社から市販され、それら装置は米国特許第4,739,881号、同4,828,797号、同4,839,291号、同4,636,472号、同4,918,003号、および欧州特許第421,760号、同419,282号および同255,229号に開示されている。
発明の要旨
本発明により初めて、タオル、シリンジまたは他の大きなテストパック材料なしに使用し得る単一生物学的インジケーター装置を提供し、従来技術によるものと同等またはそれ以上の滅菌評価を提供する。
本発明により、
（ａ）少なくとも１つの開口部を有する液体不透過性壁を有する外装容器、
（ｂ）該外装容器内に含まれる検出可能量の固定化した
（１）生存能力のある試験微生物、または
（２）滅菌をモニターする（monitor）のに有用であることが公知の活性試験酵素、
を含む生物学的インジケーターを提供し、通常滅菌をモニターするのに用いられるテストパック内に含まれる試験微生物には致死量に近い滅菌サイクルの後も、その微生物または酵素は検出可能量の上記固定化微生物または酵素が生存しまたは活性な状態であり得る範囲に固定化される。通常滅菌をモニターするのに用いられるテストパック内に含まれる試験微生物には致死量である滅菌サイクルの後では、検出可能量の固定化微生物または酵素を生存しないかまたは活性な状態となり得ない。
本発明により更に、通常滅菌をモニターするのに用いられるテストパック内の本発明の生物学的インジケーターを含む滅菌槽内での滅菌サイクルの効力を同定するテストパックを提供する。
加えて、本発明により、試験微生物および／または活性酵素の固定化を含む生物学的インジケーター内の、
（１）通常滅菌をモニターするのに用いられる生存能力のある微生物、または
（２）滅菌をモニターするのに有用であることが既知のその他の活性試験酵素源、
の熱安定性を向上する方法を提供する。
従来の技術により、種々の微生物および酵素多くの方法が開示されている（例えば、米国特許第4,663,287号；スリバスタバ（Sribastava）のインディアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Indian Journal of Biochemistry and Biophysics）、第28巻、109〜113頁（1991年４月）；バイオテクノロジー・アンド・アプライド・バイオケミストリー（Biotechnology and Applied Biochemistry）、第13巻、36〜47頁（1991年）；アメリカン・ソサイエティー・フォー・ミクロバイオロジー・ニューズ（American Society for Microbiology News）、第55巻、67〜70頁（1989年）；ジャーナル・オブ・ハイジーン（Journal of Hygiene）、第54巻、487〜508頁（1956年）；フード・インダストリーズ（Food Industries）、1941年３月、64〜65頁；フード・リサーチ（Food Research）、第14巻、499〜510頁（1949年）；ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Journal of Bacteriology）、第68巻、338〜345頁（1954年）；ジャーナル・オブ・アプライド・バクテリオロジー（Journal of Applied Bacteriology）、第37巻、31〜43頁（1974年））。しかしながら、これら文献には、生物学的インジケーター内の乾燥状態の生体適合物質を安定化するかまたは、蒸気または酸化エチレンどちらかの致死作用または不活性化作用から保護するのに固定化を用いることは開示されていない。本発明の装置は、常圧または予備減圧蒸気滅菌剤または酸化エチレン滅菌剤の滅菌サイクルの効力を同定するのに有用であり、AAMI規格に適合するほど十分精密である。好ましい態様では、本発明の装置は、使い捨てで、予備集成してあり、小さく、使用が容易であり、取り扱いが便利である。
【図面の簡単な説明】
図１は、蓋装置26を外した状態の本発明の生物学的インジケーターの１つの態様の断面図である。
図２は、蓋装置26を含む図１の生物学的インジケーターの分解組み立て斜視図である。
図３は、蓋26した状態の本発明のインジケーターの好ましい態様の断面図である。
図４は、図３のインジケーターの分解組み立て斜視図である。
図５は、本発明の生物学的インジケーターを含むテストパックの分解組み立て図である。
図６は、図５のテストパックの斜視図である。
詳細な説明
本発明の生物学的インジケーターに使用され得る微生物類は、自然混入したほとんどの生物の一般に何倍もの用いられる滅菌法に対する抵抗力を有する従来より用いられている微生物類である。「胞子」および「生長」状態の両方で存在するバクテリアおよび菌類を用いて望ましい結果が得られた。バクテリア胞子が、微生物寿命の最も抵抗力のある形として推奨される。それは、装置、化合物および方法の滅菌効力を同定する全ての試験で選択される生物である。バチルス（Bacillus）およびクロストリジア（Clostridia）種からの胞子には、飽和蒸気、乾式熱、およびガンマ線および酸化エチレンを用いる滅菌法をモニターするのに最も一般的に用いられる。
特に好ましい微生物には、バチルスステアロサーモフィラス（Bacillus Stearothermophilus）、バチルスサチリス（Bacillus Subtilis）およびバチルスピュミルス（Bacillus Pumilus）を含む。バチルスステアロサーモフィラスは、蒸気滅菌条件下の滅菌をモニターするのに特に有用である。バチルスサチリスは、ガスおよび乾式熱滅菌条件をモニターするのに特に有用である。バチルスピュミルスは、ガンマ線滅菌をモニターするのに特に有用である。
本発明の好ましい生物学的態様では、生物学的インジケーターには活性固定化酵素源を含む。好ましい態様に好適な酵素は、該細胞および細胞内を酵素を含む酵素であり、その活性は通常滅菌効力をモニターするのに用いられる少なくとも１種の微生物の生存能力と相互関係がある。滅菌効力をモニターするのにそのような酵素を用いることが、一般譲渡された米国特許第5,073,488号に開示されている。そのインジケーターが滅菌サイクルを受けた後、含まれる固定化酵素をその酵素用の基質の水性混合物と混合する。その反応混合物を、例えば蛍光計または比色計により測定し、酵素変性物の存在を決定する。設定時間内でのバックグラウンド以上の検出可能な酵素変性物の存在（酵素および基質の同定、各濃度および培養条件に依存）は滅菌不足を示す。設定時間内での検出可能な酵素変性物の不足は、滅菌サイクルがその試験生物に対して致死量であり、従って適当であることを示す。
有用であることを見い出した酵素には、胞子形成微生物からの加水分解性酵素、そして動物または植物から誘導される酵素、例えばハタンキョウ（almond）類を含む。そのような酵素には、胞子形成微生物、例えば微生物のカンジダ（candida）、バチルス（Bacillus）、ニューロスポラ（Neurospora）およびクロストリジウム（Clostridium）種から誘導されるベータ−Ｄ−グルコシダーゼ、アルファ−Ｄ−グルコシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、ブチレートエステラーゼ、カプリレートエステラーゼリパーゼ、ミリステートリパーゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、バリンアミノペプチダーゼ、チモトリプシン、ホスホヒドロラーゼ、アルファ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ベータ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルファ−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ、ベータ−Ｄ−セロビオシダーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、プロリンアミノペプチダーゼ、チロシンアミノペプチダーゼ、フェニルアラニンアミノペプチダーゼ、ベータ−Ｄ−グルクロニダーゼ、および脂肪酸エステラーゼを含む。
活性酵素源は、
（１）適当な微生物から誘導される精製単離酵素；
（２）その酵素が固有であり、遺伝子工学により加えられた微生物；または
（３）その酵素が胞子形成または生長中に加えられ、その酵素が導入されるか微生物、例えば胞子内に導入されるようになる胞子形成中に胞子に加えられる酵素と結合される微生物；であってもよい。
有利にも、それ自体従来から滅菌条件をモニターするのに用いられるものである微生物が、活性酵素源として用いられる。滅菌サイクルの完了後も生存能力を有する微生物は、栄養生長培地を用いて培養され、従来の技術により滅菌条件がインジケーター内の微生物の全てを殺すのに十分であったかどうかを確認し、その滅菌条件がその滅菌剤の項目の全てを滅菌するのに十分であったことを示す。
微生物または酵素を固定化する多くの異なる手段（本明細書中で「生体適合物質」の語により表される）を用いてもよい。１つの特に有用な技術は、化合物（本明細書中で「固定化剤」の語により表される）を用いて微生物または酵素を化学的に固定化することであり、それは１）安定性固定化錯体を形成する微生物とイオン結合および／または共有結合を形成し;2）生体適合物質の分子（本明細書中で「生体適合分子」の語により表される）を変性に対して保護する吸湿性または親水性層で被覆または閉じ込め；または３）その生体適合分子の外表膜を脱水してその熱安定性を向上させる。
蒸気滅菌に用いられる特に有用な固定化剤には、アルジトール類、二糖類および三糖類、および、ポリビニルアルコール、グリコール類およびジオール類から選択されるポリマーアルコール類を含む。酸化エチレン用の好適な固定化化合物には、アルジトール類；アルドース類およびケトース類を含む単糖類；多糖類、例えば二糖類、三糖類、四糖類、五糖類および六糖類、澱粉類、シクロデキストリン類、ペクチン類、グア（guar）ゴム、トラガカンタ（tragacantha）ゴム、アラビアゴム、セルロース類、カッパ・カラジーナン（Kappa carrageenan）；ポリラクタム類、例えばポリビニルラクタム類；および上記のポリマーアルコール類；を含む。
アルジトール類および単糖類は、好ましくは炭素原子３〜６個を含有する。二糖類および三糖類は好ましくは糖単位当たり炭素原子少なくとも４個を有し、その他の多糖類は好ましくは糖単位当たり炭素原子５または６個を有する。好ましくは、アルジトール類および糖類は、分子量約100〜100,000ダルトンを有する。その糖類は、還元糖類または非還元糖類であってもよい。貯蔵ポリマーアルコール類は、分子量約200〜100,000ダルトンを有する。好ましいポリラクタム類は、分子量約50〜100,000ダルトンを有する。
特に好ましいアルジトール類には、グリセロール、トレイトール、リビトール（アドニトールとして公知である）、アラビニトール、キシリトール、アリトール、グルシトール（ソルビトールとして公知である）、マニトール、イジトール、ガラクチトール（ズルシトールとして公知である）、アルトリトール、エリチトール、イノシトール、へプチトール、オクチトール、ノニトール、デシトール、ドデシトール、ストラシトール、およびポリアリトールを含む。
特に好ましいアルドース類には、グリセルアルデヒド、トレオース、エリトロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、アロース、アルトロース、グルコース、マノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、ヘプトース、オクトース、ノニトース、デシトース、ドデシトース、ラムノース、フコース、２−デオキシリボース、グルコースアミン、ガラクトースアミン、３−ジメチルアミノ−3,6−ジデオキシアルトース、および３−アミノ−３−デオキシリボースを含む。
特に好ましいケトース類には、ジヒドロキシアセトン、エリトルロース、リバロース、キシロロース、プシコース、フルクトース、ソルボースおよびタガトースを含む。
特に好ましい二糖類には、アラビノピラノビオース、アラビノフラノビオース、セロビオース、セルビオウロン酸、チトビオース、コンドロシン、ガラクトビオース、ガラクトウロン酸、ゲントビオース、グルコシルガラクトース、グルコシルグルコースアミン、ヒアロビオウロン酸、イヌロビオース、イソマルトース、コージビオース、ラクトース、ラミナラビオース、マルトース、マノビオース、メリビオース、４−メチルグルコシルキシロース、ニゲロース、プランテオビオース、プリマベロース、ルチノース、ソホロース、スクロース、トレハロース、ツラノース、ビシアノース、およびキシロビオースを含む。
特に好ましい三糖類には、セロトリオース、ゲンタイアノース、６−Ｏ−グルコシルマルトース、イソケストース、イソマルトトリオース、イソパノース、ケストース、ラミナラトリオース、マルトトリオース、メレジトース、ネオケストース、ニューラミノラクトース、パノース、プランテオース、ラフィノース、およびウンベリフェロースを含む。
特に好ましい四糖類には、セロテトラオース、マルトテトラオース、およびスタチオースを含む。特に好ましい五糖類はベルバスコースである。その他の好ましい多糖類には、環状オリゴ糖類、例えばシクロマルトヘキサオース、シクロマルトペプタオースおよびシクロマルト−オクタノース；セルロース類、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロース；ガム類；粘質類；ペクチン類；ヘミセルロース類；リポ多糖類；グリコーゲン；キチン；および澱粉；を含む。
特に好ましいポリマーアルコール類には、ポリビニルアルコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ポリエチレングリコール（分子量200〜100,000ダルトン）、ポリプロピレングリコール（分子量200〜10,000ダルトン）、エーテルアルコール類、例えばポリエチレングリコールエーテル（分子量500〜50,000ダルトン）、ポリプロピレングリコールエーテル（分子量500〜10,000ダルトン）、およびジオール類、例えば1,3−ブタンジオール、1,5−ペンタンジオール、1,6−ヘキサンジオール、1,7−ペプタンジオール、1,8−オクタンジオール、1,9−ノナンジオールおよび1,10−デカンジオールを含む。
特に好ましいポリビニルラクタム類には、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、５−メチル−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、５−エチル−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、3,3−ジメチル−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、３−メチル−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、３−エチル−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、４−メチル−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、４−エチル−Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、Ｎ−ビニル−２−バレオラクタム、およびＮ−ビニル−２−カプロラクタムを含む。
固定化化合物または固定化剤は好ましくは、従来のキャリヤーに含まれる微生物または酵素上の被膜として用いられる。更に、固定化剤中の試験微生物または酵素の懸濁液を、従来のキャリヤーストップ上に被覆し、乾燥する。生体適合物質に塗布した固定化剤量は好ましくは、胞子または酵素単位当たり約１×10-6〜１×10-12g、より好ましくは約１×10-9〜１×10-11g、および最も好ましくは９×10-10〜１×10-10gである。好ましくは、濃度0.1〜98％w/v、より好ましくは１〜70％w/vおよび最も好ましくは５〜50％w/vの固定化剤の水溶液を、その生体適合物質に塗布する。また好ましくは、固定化剤を生体適合物質に塗布し、乾燥生体適合物質を運ぶ基質が、被覆重量好ましくは約１×10-1〜１×10-7g/mm2、より好ましくは約１×10-4〜１×10-6g/mm2、および最も好ましくは９×10-5〜１×10-5g/mm2で固定化剤を含む。
以下の表には、蒸気および酸化エチレン滅菌サイクル用の、独立型生物学的インジケーター（BI）（即ち、タオル、シリンジまたは他のテストパック材料または装置を用いずに）を作製するのに用いられる多くの水溶液中の固定化剤、および従来のテストパックに用いられる生物学的インジケーターの特に好ましい濃度を示す。
また、酸素または微生物は、生体適合分子と結合する水不溶性支持材料によって固定化され得る。そのような支持材料には、生体適合物質（生体適合分子）の分子の官能基と反応する基、例えばリシン、チロシン、ヒスチジン、アルギニンまたはシステインのアルファ基またはイプシロン基を含有し、微生物少なくとも１×102または酵素0.1ユニットと結合する。生体適合分子と共有結合を形成する有用な支持材料は、共有結合基、例えばヒドロキシル、アミノ、カルボキシルまたはスルホン酸基を有する。このタイプの固定化に特に有用な支持材料には、アガロース、セルロース、デキストラン、ガラス、ポリアクリルアミドコポリマー、ポリアミノスチレン、コラーゲン、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、シリカ、ポリエチレン、ポリエステル、ポリスチレン、ナイロン、アルキルアルデヒドポリマー、ポリチオール/4−ビニルピリジン、ゼラチン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンテレフタレート、ポリアクリロニトリル、キチン、ポリウレタン、カーボン、サイロクロム、チタニア、フェライト、アルミナ、磁性鉄粒子を含む。
また、生体適合分子とイオン結合を形成する有用な支持材料は、官能基、例えばヒドロキシル、アミノ、カルボキシルまたはスルホン酸基を有する。このタイプの固定化に特に有用な支持材料が、文献、例えば「インモビライズド・エンザイムズ・アンド・セルズ（Immobilized Enzymes and Cells）」、K.モスバック（Mosbach）、アカデミック・プレス（Academic Press）社（1987年）に開示されており、イオン性セルロース類、例えばアミノエチル、カルボキシルメチル、ジエチルアミノエチルおよびトリエチルアミノエチルセルロース、イオン性ポリスチレン（例えば、ミズーリー州セントルイス（St.Louis）のマリンクロッド・ケミカル・ワークス（Mallinckrodt Chemical Works）から市販の「アンバーライト（Amberlite）」）、硫酸デキストラン、および、「セファデックス（SephadexR）・イオン・エクスチェンジャーズ（Ion Exchangers）」、例えばファーマシア（Pharmacia）から市販のカルボキシルメチル、ジエチルアミノエチル、第４アミノエチルおよびスルホプロピル「セファデックス（SephadexR）・イオン・エクスチェンジャーズ（Ion Exchangers）」を含む。
その支持材料を用いて固定化するために、微生物または酵素を酵素活性を抑制しないpHで水性媒体中で支持材料と混合する。培養期間後、吸収または結合した生体適合物質を有する不溶性支持材料を遠心分離または濾過によりその混合物から分離する。続いて、回収した固形物を、生物学的インジケーター装置の固定化生体適合物質用のキャリヤーとして用いる。
酵素または微生物を固定化する他の方法は、化学的架橋ポリマーゲルマトリックス中に生体適合物質を閉じ込めることである。そのゲルは通常、非イオン性ポリマー形成物質から成り、それは酵素または微生物と非反応性であり、微生物少なくとも１×102または酵素0.1ユニットを閉じ込め得る。例示的ゲルには、ポリアクリルアミドヒドラジドゲル、アルギン酸カルシウムゲル、カッパカラジーナンゲル、寒天ゲル、コラーゲン、セルロースゲル、チトサンゲル、およびメタクリレートゲルを含む。
酵素および微生物を固定化する更なる手段は、マイクロカプセル封入（micro−encapsulation）であり、生体適合分子の回りに人工膜を形成する。その膜形成法は溶液中の特定の生体適合分子には依存しないので、様々な酵素および微生物を封入するのに多くの膜形成材料を用いてもよい。生体適合分子をマイクロカプセル封入し得る例示的材料には、酢酪酸セルロース、硝酸セルロース、脂質ポリアミド、ポリエチレンイミンナイロン、ナイロン、牛漿液アルブミン、ポリビニルピロリドン、ポリ（フタロイルペピラジン）およびエポキシを含む。カプセル封入の典型的方法が、ジャーナル・オブ・モレキュラー・キャタリシス（Journal of Molecular Catalysis）、第11巻、83頁（1981年）；バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Biotechnology and Bioengineering）、第17巻、1157頁（1975年）；エンザイム・アンド・ミクロバイオロジカル・テクノロジー（Enzymes and Microbiological Technology）、第４巻、327頁（1982年）；エンザイム・アンド・ミクロバイオロジカル・テクノロジー（Enzymes and Microbiological Technology）、第６巻、135頁（1984年）；エンザイム・アンド・ミクロバイオロジカル・テクノロジー（Enzymes and Microbiological Technology）、第３巻、149頁（1981年）；メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）、第112巻、３〜112頁（1985年）；および米国特許第4,147,767号に開示されている。
酵素および微生物のアミノ酸側基による架橋は、その他の固定化方法である。固定化剤、例えばジアルデヒド類、ジイミドエステル類、ジイソシアネート類、およびビスジアゾニウム塩を用いて、その生体適合分子の分子間または分子内架橋を形成する。これらの固定化剤は微生物少なくとも１×102または酵素0.1ユニットを架橋し得るものでなければならない。有用な架橋方法が、アンルズ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンス（Annals New York Academy of Science）、第542巻、173〜179頁（1988年）；アンルズ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンス（Annals New York Academy of Science）、第434巻、27〜30頁（1984年）；バイオテクノロジー・アンド・アプライド・バイオケミストリー（Biotechnology and Applied Biochemistry）、第９巻、第５号、389〜400頁（1987年）；アプライド・バイオケミストリー・アンド・バイオテクノロジー（Applied Biochemistry and Biotechnology）、第15巻、第３号、265〜278頁（1987年）；バイオテクノロジー・レターズ（Biotechnology Letters）、第10巻、第５号、325〜330頁（1988年）；アーカイブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Archives of Biochemistry and Biophysics）、第275巻、第１号、23〜32頁（1989年11月15日）；およびACTA・バイオチミカ・ポロニカ（Biochimica Polonica）、第34巻、第２号、145〜156頁（1987年）；に開示されている。架橋により、酵素または生体適合分子の配座剛性（conformational rigidity）を安定化し、その結果生体適合分子を熱および湿分などによる変質から保護する。
まとめると、上述のどの固定化方法、即ち化学的固定化、吸収または支持体との結合、閉じ込め、カプセル封入または架橋、またはこれらの方法の組合せを本発明の実施に用いてもよい。用いられる固定化方法に関して、本発明の生物学的インジケーターがAAMIテストパックと同等の結果を示すのに必要な固定化の程度は多くの要因に依存する。従来の微生物生長または酵素の使用を用いて無菌性を評価しようとしまいと、および本発明の生物学的インジケーターをテストパックを用いようと用いまいと、そのような要因には、滅菌サイクルパラメータ（例えば、温度および滅菌剤濃度）を含む。
本発明の独立型生物学的インジケーター（即ち、タオル、シリンジまたは他のテストパック材料または装置を用いずに）を用いる滅菌をモニターするために、微生物または酵素を、好ましくは121℃常圧の蒸気滅菌サイクルに少なくとも15分間暴露後も、検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり得、かつこの滅菌サイクルに少なくとも45分間以上、より好ましくは30分間以上暴露後では、検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しないかまたは活性な状態となり得ない程度に固定化する。独立型生物学的インジケーターとして132℃予備減圧の蒸気滅菌サイクルに用いることに関して、微生物または酵素を、好ましくはそのサイクルに少なくとも15秒間、より好ましくは少なくとも１分間暴露後も、検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり得、かつそのサイクルに15分間以上、より好ましくは10分間以上暴露後では、検出可能な量の微生物または酵素が生存しないかまたは活性な状態とはなり得ない程度に固定化する。独立型生物学的インジケーターとして121℃予備減圧の蒸気滅菌サイクルに用いることに関して、微生物または酵素を、好ましくはそのサイクルに少なくとも５分間暴露後も、検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり得、かつそのサイクルに15分間以上暴露後、検出可能な量の微生物または酵素を生存しないかまたは活性な状態であり得ない程度に固定化する。132℃予備減圧の蒸気滅菌サイクルにおいて、独立型装置内の微生物または酵素を好ましくはそのサイクルに少なくとも２秒間、より好ましくは少なくとも15秒間暴露後も、検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり得、かつそのサイクルに10分間以上、より好ましくは６分間以上暴露後では、検出可能な量の微生物または酵素が生存しないかまたは活性な状態となり得ない程度に固定化する。
独立型生物学的インジケーターとして酸化エチレン滅菌サイクルに用いることに関して、微生物または酵素を、好ましくは少なくとも15分間暴露後も、検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり得、かつ酸化エチレン滅菌サイクルに250分間以上暴露後では、検出可能な量の微生物または酵素が生存しないまたは活性な状態となり得ない程度に固定化する。より好ましくは酸化エチレン600mg/リットル、54℃および相対湿度60％の滅菌サイクルにおいて、滅菌の程度を、少なくとも20分間暴露後も検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり、酸化エチレンサイクルに60分間、最も好ましくは40分間暴露後には生存しないかまたは活性な状態の生体適合物質が検出されないようにする。酸化エチレン800mg/リットル、37℃および相対湿度60％の滅菌サイクルにおいて、滅菌の程度を、少なくとも20分間暴露後も検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり、そのサイクルに120分間、最も好ましくは90分間暴露後では、生存しないかまたは活性な状態の生体適合物質が検出されないようにすることが好ましい。
従来のテストパック材料（例えば、市販のテストパックまたはAAMIテストパック）を用いる以外は本発明の生物学的インジケーターを独立型装置として用いない場合、そのテストパック材料が固定化生体適合物質に到達する滅菌剤に攻撃することにより生体適合物質を保護するので、滅菌の程度を低減してもよい。
タオル、シリンジまたは他のテストパック材料または装置内に入れた本発明の生物学的インジケーターを用いて滅菌をモニターするために、微生物または酵素は好ましくは、独立型装置により評価される場合の生体適合物質が以下のような生／死特性を示すような程度に固定化される。好ましくは、その滅菌の程度は、121℃の蒸気滅菌サイクルに少なくとも５分間暴露後も、検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であるのに十分である。テストパック材料を132℃予備減圧の蒸気滅菌サイクルに用いることに関して、独立型装置内の微生物または酵素は好ましくは少なくとも20秒間暴露後も、検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり得、かつそのサイクルに６分間以上暴露後、検出可能な量の微生物または酵素が生存しないかまたは活性な状態となり得ない程度に固定化する。テストパック材料を121℃または134℃予備減圧の蒸気滅菌サイクルに用いることに関して、独立型装置内の微生物または酵素は好ましくはそのサイクルに少なくとも５秒間暴露後も、検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり得、かつそのサイクルに２分間以上暴露後、検出可能な量の微生物または酵素が生存しないかまたは活性な状態となり得ない程度に固定化する。
テストパック材料を酸化エチレン滅菌サイクルに用いることに関して、独立型装置内の微生物または酵素を、好ましくは少なくとも15分間暴露後も、検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり得、かつ酸化エチレン滅菌サイクルに90分間以上暴露後では、検出可能な量の生体適合物質が生存しないかまたは活性な状態となり得ない程度に固定化する。より好ましくは酸化エチレン600mg/リットル、54℃および相対湿度60％の酸化エチレン滅菌サイクルにおいて、滅菌の程度を、少なくとも15分間暴露後も検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり得、酸化エチレンサイクルに50分間暴露後には生存しないかまたは活性な状態の生体適合物質が検出されないようにする。酸化エチレン800mg/リットル、37℃および相対湿度60％の酸化エチレン滅菌サイクルにおいて、滅菌の程度を、少なくとも15分間暴露後も検出可能な量の固定化生体適合物質が生存しまたは活性な状態であり得、かつそのサイクルに90分間暴露後には生存しないかまたは活性な状態の生体適合物質が検出されないようにすることが好ましい。
好ましくは、上記の試験における微生物の生存能力を検出する方法は、培養の24および48時間後の標準栄養培地内での生長である。酵素活性を検出する方法は、米国特許第5,073,488号に開示のような酵素基質の使用である。
固定化微生物または酵素を含有する生物学的インジケーターの構造は、本発明に対して重要なものではない。好ましくは、生物学的インジケーターは単一の生物学的インジケーター、即ち固定化生体適合物質および酵素基質および／または栄養生長培地を含むインジケーターである。そのようなインジケーターの例示的構造が、米国特許第2,854,384号、同3,346,464号、同3,239,429号、同3,440,144号、同3,585,112号、同3,661,717号、同3,752,743号、同3,846,242号、同4,291,122号、同4,304,869号、同4,311,793号、同4,416,984号、同4,743,537号、同4,596,773号、同4,461,837号、同4,528,268号、同4,579,823号、同4,580,682号、同4,596,773号、同4,717,661号および同4,885,253号に開示されている。特に好ましいインジケーター構造が、一般譲渡された米国特許出願第07/277,570号に開示されている。酵素または微生物が上記のように固定化される場合、これらの如何なる生物学的インジケーターも本発明の実施に有用である。
以下の記載は本出願人の好ましい態様を表す。本発明の範囲内であるにもかかわらず、以下の装置の多くの変形が可能である。
図１および図２に関して、気体吸収性である液体不透過性壁12および開口末端14を有する、円柱管形の外装容器10を有する好ましい生物学的インジケーターが示される。外装容器10には、キャリヤー16、例えば濾紙のストリップを含み、予め決められた量の活性酵素および／または予め決められた数の生存能力のある微生物を含む。また、外装容器10には、普通にシールされた圧力開封性性内装容器18、例えば折れ易いガラスアンプルを含み、水性栄養生長培地および／または緩衝水溶液20中に溶解または懸濁した好適な酵素基質を含む。水性栄養培地は、培養により接触時に生存能力のある微生物の生長を促進し得、好ましくは生存能力のある微生物が存在する場合に溶液の色を変化させ、不適当なサイクルを指摘する微生物生長インジケーターを含む。酵素基質は活性酵素と反応して、発光、着色または放射性材料を得る。内装容器18は、濾紙キャリヤー16により外装容器10の壁12から分離されている。外装容器10の開口末端14は、気体透過性半多孔性蓋部材22、例えばシートを用いて提供される。蓋部材22を、例えば、熱または接着剤シーリングにより、または蓋装置26、例えばキャップ（図１には外して示す）により外装容器10の開口末端14にシールし、それは３つの開口部を有する。気体滅菌剤を用いた滅菌の間に、気体滅菌剤は蓋部材22を透過し、外装容器10の内部を通過しキャリヤー16により固定化生体適合物質と接触する。
図２に示すように、キャリヤー16および内層容器18を開口末端14に続けて挿入し、外装容器10と密閉状態で、蓋部材22を開口末端14上に置き、次いで蓋装置26を蓋部材22上に置くことにより外装容器10の開口末端14を蓋部材22でシールすることにより、図１の装置は容易に組み立てられ得る。
外装容器10は、蒸気滅菌剤による高温に耐える材料から成る。常套の蒸気滅菌剤は一般に約121〜135℃の温度に達する。加えて、容器10の壁は実質的に液体不透過性でなければならない。外装容器10は好ましくは反透明（透明を含む）であり、蛍光または色の変化が、インジケーター装置を分解することなく目視で観察され得る。好ましくは、また、外装容器10は十分変形可能であり、外圧を用いて外装容器10を変形させると圧力開封性内層容器18は破壊する。外装容器10は、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド類、ポリメチルペンテン類および種々のポリエステル類を含む好適な材料を射出成形または押出することにより作製され得る。
蓋装置26は、滅菌温度に耐える如何なる材料から成ってもよい。外装容器10の場合、好適な材料にはポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアミド類、ポリメチルペンテン類および種々のポリエステル類を含むが、ポリメチルペンテン類が好ましい。
本発明に用いられる固定化酵素および／または微生物は通常、好適なキャリヤー16により運搬される。しかしながら、固定化生体適合物質が外装容器10の内壁、または内層容器18の外壁により運搬されること、また、固定化生体適合物質が固体支持体中に含まれる場合にはそれは単に外装容器10内に含まれキャリヤー16が必要なことが予期される。キャリヤー16は好ましくは吸水剤、例えば濾紙であり、微生物生長または酵素活性を抑制してはならない。シート状材料、例えば布、不織ポリプロピレン、レーヨンまたはナイロン、および微孔性ポリマー材料が特に好ましい。しかしながら、金属箔基材、例えばアルミニウムまたはステンレス鋼、そしてガラス基材（例えば、ガラスビーズまたはガラス繊維）、磁器またはプラスチックを用いてもよい。加えて、その酵素キャリヤーは材料の組合せ、例えばプラスチックまたはガラス支持体ストリップに固定された紙から作製されてもよい。
再現性を確実にするため、外装容器10には予め決められた量の固定化生体適合物質を含有することが好ましい。タンパク質精製の一般的方法、例えば塩分別、クロマトグラフィーおよび電気泳動を用いることにより単離酵素が得られ、それらはコロウィック（Colowick）,S.およびカプラン（Kaplan）,N.O.（著者）のメソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology）、ニューヨーク（New York）のアカデミック・プレス（Academic Press）、第Ｉ巻〜第VII巻、（1957〜1964年）に開示されている。好ましくは、固定化される単離酵素の初期濃度は、酵素約0.001〜10,000ユニット、より好ましくは約0.01〜1,000ユニット、および最も好ましくは約0.1〜100ユニットである。固定化微生物を用いる場合、予め決められた数の微生物を用いて始めることが同様に好ましい。微生物がバチルスステアロサーモフィラス（Bacillus Stearothermophilus）またはバチルスサチリス（Bacillus Subtilis）である場合、好ましい数は微生物約１×102〜１×108である。微生物がバチルスステアロサーモフィラスである場合、微生物約１×102〜１×107が特に好ましい。微生物がバチルスサチリスである場合、微生物約１×106〜１×108が好ましい。その酵素または微生物を上述の方法に従って固定化する。好ましくは、既知の体積濃度の固定化微生物または酵素を有する懸濁液を調製し、予め決められた体積のこの懸濁液を用いてキャリヤー16（例えば、濾紙）を濡らす。好ましくは、固定化微生物少なくとも１×102または固定化酵素0.1ユニットをキャリヤー16上に置く。その乾燥キャリヤーを外装容器10に用いる。
内装容器18には、栄養生長培地の水溶液20および／または適当な酵素基質を含む。本発明に有用に用いられるそのタイプの栄養培地は、当業者に公知である。一般的に公知の微生物生長インジケーターは、生存能力のある微生物の存在により色が変化し、好ましくは容器の少なくとも１つに存在する。その生長インジケーター材料は好ましくは水性栄養培地に可溶であり、（微生物の生長により）水性栄養培地を着色し、そして色の変化は外装容器の半透明壁を通して容易に観察され得る。加えて、酵素基質も存在する場合、その生長インジケーター材料は好ましくは、如何なる酵素変性物の色またはルミネセンスを妨害しないように選択される。
存在する場合、酵素基質は好ましくは内装容器18内の緩衝水溶液中に含まれる。その水性緩衝剤は、内装容器を破壊した後、残存する活性酵素または酵素基質系用の反応培地として働く。緩衝液のイオン条件は、酵素および酵素基質が影響を受けないようにすべきである。好ましくは、等張緩衝液、例えばホスフェート緩衝塩水、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−HCl溶液、またはアセテート緩衝液が選択される。
酵素基質が通常、圧力開封性内装容器18内に含まれるのに対して、乾燥状態の酵素基質は酵素キャリヤー16と共に外装容器10内に含まれ得ることが予期される。事実、活性酵素およびその基質は同一キャリヤー16内に乾燥状態で存在し得る。この構造において、内装容器18は好ましくは活性酵素およびその基質が反応するのに必要な水性反応培地を運搬する。
酵素基質の水溶液20および／または水性栄養培地を含む内装容器18は、気体および液体不透過性であり、加圧して開封され（即ち、「圧力開封性（pressure openable）」）酵素基質および／または栄養培地を外装容器10に入れられ得る材料から成る。内装容器18は、好ましくは外装容器10を変形させた場合に内装容器18を破壊または破砕させるのに折れ易い材料、例えばガラスから成る。その他の態様では、内装容器18はプラグを用いてシールされてもよく、加圧によりそのプラグを外して内装容器18の内容物を放出する。更に他の態様では、米国特許第4,304,869号に開示のように、蓋装置26には、アンプル破砕装置を含んでもよく、その蓋は、蓋装置の下降によりアンプルを破砕する、蓋装置の底から垂れ下がったタブを有する。同様に、本発明のその装置を、外装容器10の底に配列されたアンプル破砕ピンを有するシステムに用いてもよい。
外装容器10は少なくとも１つの開口部を有し、滅菌剤（例えば、蒸気、酸化エチレン）の進入を可能とする。この開口部は、気体透過性半多孔性手段を用いて通常密閉されているか密栓されている。好適な手段には、繊維材料、例えば綿；ガラスウール；布；ポリプロピレン、レーヨン、ポリプロピレン／レーヨン、ナイロン、ガラスまたは他の繊維から作製された不織ウェブ；濾紙；微孔性の疎水性または親水性フィルム；連続気泡プラスチックフォーム；例えば米国特許第3,346,464号に開示のような半透過性プラスチックフィルム；から作製された蓋部材22を含む。
本発明の滅菌インジケーターの好ましい態様が、図３および図４に示されている。その装置には、液体不透過性および好ましくは気体非吸収性および開口末端44を有する外装容器40を含む。外装容器40には、圧力開封性内装容器48を含み、それは好適な酵素基質の水溶液50および／または水性栄養培地を含む。外装容器40の開口末端44は、気体透過性半多孔性蓋部材52により覆われている。それを用いて、図１に示される装置と同様の目的を果たす。図３および図４の装置において、キャリヤー46を外装容器40の閉鎖末端に置き、バリヤー47をキャリヤー46および圧力開封性内装容器48の間のプラグのように置く。バリヤー47は好ましくは繊維、例えば綿、レーヨン、ポリプロピレン、ポリプロピレン／レーヨン混合物、ナイロンまたはガラスの不織ウェブから作製される。最も好ましくは、バリヤー47はポリプロピレン不織ウェブ、例えばミネソタ州セントポール（St.Paul）の3Mから「シンシュレート（ThinsulateR）200−Ｂブランドのサーマル・インシュレーション（Thermal Insulation）」から構成される。
バリヤー47はキャリヤー46を内装容器48から分離し、従って内装容器48がキャリヤー46上に配置される場合にコールドスポットは排出される。コールドスポットの存在により、凝縮が起こりキャリヤー46上に集まる。凝縮物はキャリヤー46に含まれる酵素の活性に作用し得る。バリヤー47は好ましくは疎水性材料から作製され、それはキャリヤー周辺に生長微生物および／または酵素変性物を濃縮するが、バリヤーの反対側にある容器の領域内に急速には拡散しない。キャリヤー46を内装容器48の全含有物と反応する場合より短い培養時間後に検出されるのが発光であろうと着色であろうと、そのインジケーターの下部に高濃度の生長微生物および／または酵素変性物を保持することにより生成物を提供する。
蓋56は、上面57および付随する側壁59から成る。その蓋は底の空いた中空体であり、蓋の内径は外装容器40の外径とほぼ等しく、蓋56は外装容器40の開口末端44上に摩擦によりかみ合っている。側壁59内の切れ目は好ましくは多数の窓58である。インジケーター装置を滅菌されるべき負荷をかける場合、蓋56を外装容器の外部側壁42が窓58を塞がないように外装容器の開口部上に置く。そのような位置で、滅菌器内の滅菌剤は窓58を通る流れにより外装容器40に入る。滅菌サイクルの完了により、その蓋を押し下げて外装容器の側壁42が上面57の内側面とかみ合わせることにより十分挿入し、それにより窓58を塞ぐ。外装容器40の内部を外部環境からシールする。
使用中に図３および図４に示される生物学的インジケーターを、滅菌器槽内に多くの滅菌される項目、例えば蒸気または酸化エチレンガスと共に入れる。そのインジケーターが滅菌器内にある場合、窓58が空いて滅菌剤が入るように、蓋56を開放位置にする。滅菌剤をその槽内に導入する場合、滅菌剤は蓋部材52を透過してバリヤー47を通過して、キャリヤー46に存在する酵素を不活性化し試験微生物を殺す。滅菌サイクルの終わりに、滅菌剤を濾過空気と置換する。その無菌性インジケーターを滅菌器から引き出し、蓋56を十分挿入して窓58を塞ぎ、ガラスアンプル48を例えば、指圧により破砕し、酵素基質の水溶液および／または栄養生長培地を酵素キャリヤー46と接触させる。続いて、そのインジケーターを好適な培養環境内に置く。
適当な培養時間後、色またはルミネセンスの変化の発生が外装容器40の半透明壁42を通して分光測光的に観察されまたは測定され、滅菌サイクルによりキャリヤー46に存在する全活性酵素を不活性化せず、または全微生物を殺さなかったことを示し、それ故にその滅菌サイクルが完全に滅菌器内の項目を滅菌するのにはおそらく不十分であったことを示す。色またはルミネセンスに変化がないことにより、その滅菌サイクルがキャリヤー46の全活性酵素を不活性化し、または全微生物を殺すのに十分であったことを示し、それ故にその滅菌サイクルが滅菌器内の項目を滅菌するのに十分であったことを示す。
本発明の生物学的インジケーターを従来から用いられている如何なるタイプのテストパック材料または装置に用いてもよい。例示的テストパックには、共に3Mから市販されている「1278アテスト（AttestTM）EOパック（Pack）」および「1276アテスト・スチーム・パック（AttestTM Steam Pack）」を含み、それらの装置が米国特許第4,739,881号、同4,828,797号、同4,839,291号、同4,636,472号、同4,918,003号、および欧州特許第421,760号、同419,282号および同255,229号に開示されている。また、本発明の生物学的インジケーターを、AAMI、ブリティッシュ・デパートメント・オブ・ヘルス・スタンダーズ（British Department of Health Standards）、ジャーマン・インダストリアル・ノーム・スタンダーズ（German Industrial Norm Standards）およびコミッティー・オブ・ユーロピアン・ノーマライゼーション（Committee of European Normalization）により推奨されるプラスチックシリンジ、タオルパックまたは他のテストパック装置に用いてもよい。出願人は、固定化生体適合物質の使用により、より苛酷な滅菌条件、例えば121℃常圧および予備減圧および132℃および134℃予備減圧蒸気滅菌サイクルのこれらの規格に容易に応答し得るテストパックを提供することを見い出した。これは、米国特許第5,073,488号に開示のように酵素活性を用いて滅菌効力を評価する場合に顕著である。
図５および図６には、本発明の生物学的インジケーター11を含む好ましいテストパック100を示す。テストパック100は米国特許第4,918,003号に開示のものと同様であり、例えば全体寸法134mm×140mm×28mmを有するボックス102から成る。そのボックスはワニスを塗っていない漂白硫酸紙から作製されている。
そのボックスには、同様に漂白硫酸紙から作製されてた開放容器108を含み、それは外面に蒸気不透過性熱可塑性被膜110、例えばポリプロピレンラミネートを被覆されている。容器108は、ボックス102より僅かにだけ小さい寸法を有する。
半多孔性材料から成るシートスタック116により分離された半多孔性材料から成る２種のシートスタック112および114は、容器108内に含まれる。半多孔性材料から成る各スタックは好ましくは、坪量280m2（3,000ft2）当たり97kg（214ポンド）および厚さシート当たり約1mmを有する濾紙から作製される。スタック112および114は好ましくは濾紙20〜55枚を含む。その半多孔性スタック116は、本発明の生物学的インジケーター11を受容するために各シートの中央から面積13mm×49mmを切り抜いた濾紙約16枚から構成される。このセンター孔の高さは、組み立てて乾燥した場合、約10mmである。
実際、本出願人のテストパックはボックスフラップ122を開けることにより開放され、最上部半多孔性シートが除去され、好ましくはステンレス鋼製の金属コイルバネを回りに巻き付けた生物学的インジケーター11を、スタックの中央部のキャビティー内に入れる。コイルバネ120は、滅菌サイクル中の濾紙スタックの生物学的インジケーター11への圧縮力を低減し、内装容器18が早期破砕しないようにする。次いで、最上部シートを戻し、ボックスを閉じる。続いて、ボックスを標準負荷を有する滅菌器内に入れ、常套のサイクルを行う。
滅菌器内のエアポケットの存在または滅菌器サイクルの不十分な時間、温度等による多孔性および半多孔性スタックへの滅菌剤の透過不足により、滅菌剤が生物学的インジケーター内の微生物を殺し酵素を不活性化することを防止する。
一旦、滅菌サイクルが完了すると、テストパック100を滅菌器から取り出し、フラップ122を開けシートスタックを取り除いて、迅速に生物学的インジケーター11に接近する。生物学的インジケーターを栄養生長溶液および／または酵素基質を用いて培養し、色または蛍光の変化をしめす。
本発明のテストパックは、AAMI規格に記載された標準生物学的テストパックの蒸気透過性に応答し、標準AAMIテストパックと実質的に同一条件下での無菌性の不足を示す。
本発明の生物学的インジケーターおよびテストパックは、滅菌媒体、例えば酸化エチレン、（121℃予備減圧および常圧、および132℃および134℃予備減圧を含む）様々な蒸気滅菌サイクル等に関して主に説明されている。しかしながら、そのインジケーターは、これらの用途に限定されず、更に、その他の滅菌媒体、例えば乾式熱、放射線、酸化プロピレン、臭化メチル、オゾン、二酸化塩素、ホルムアルデヒド、および他の気体および液体薬剤の効力を表示するのに用いられてもよい。
本発明は以下の非限定例により説明される。
実施例
実施例１
本実施例は固定化した胞子及び酵素を含有し常套のテストパック装置を使用しない本発明の生物学的インジケーターがAAMI16タオルテストパックにおける常套の生物学的インジケーター（BIs）に比べて、121℃（125゜F）の常圧及び132℃（270゜F）予備減圧滅菌暴露の両方の条件で滅菌効力のある結果を提供することができることを例示する。
胞子ストリップの調製
メリーランド州ロックビル（Rockville）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）から「ATCC・7953」として市販入手可能なバチルスステアロサーモフィラス（Bacillus Stearothermophilus）を約16時間58℃でトリプシン大豆ブイヨン中で一晩成長させた。この培養液を用いて8g/リットルの栄養ブイヨン、4g/リットルのイーストエキス、0.1g/リットルの塩化マンガン、及び20g/リットルの寒天培養基からなるプレート中に含まれる寒天培養基表面にpH7.2で注射した。注射したプレートを58℃で72時間培養した。胞子をプレートから取り出し滅菌した蒸留水中に懸濁させた。胞子を7000rpm、４℃で20分間懸濁液を遠心分離することによって培養力のある残留物から分離した。上澄みを流し去り胞子を滅菌した蒸留水中に再懸濁させた。この洗浄操作を数回繰り返した。
バチルスステアロサーモフィラス胞子を、ニューハンプシャー州ケーン（Keene）のシュレイカー＆シュエル（Schleicher ＆ Schuell）から「Ｓ＆Ｓ ＃903・グレイド・フィルター・ペーパー（Grade Filter Paper）」として市販入手可能な6.35×9.52mm（1/4×3/8インチ）の濾紙のストリップ上にストリップに対して7.5×105胞子の割合で被覆形成し乾燥した。これは7.5×107胞子／ミリリットルの濃度で水中への胞子の懸濁液を調製し、この懸濁液10マイクロリットルを各濾紙ストリップ上に滴下しストリップを周囲条件下で乾燥することによって達成した。
胞子の固定化
胞子ストリップ上に含まれる胞子及び胞子の有する酵素を固定化する以下の方法を用いた。バチルスステアロサーモフィラスの奉仕ストリップを以下の化学薬品固定化水溶液：
表１及び２に記載するパーセント濃度（w/v）でのニューヨーク州ニューヨークのファイザー（Pfizer）から市販入手可能な「Ｄ−ソルビトール（Sorbitol）」、又はコネチカット州ダンバリー（Danbury）のユニオン・カーバイド・コーポレーション（Union Cabide Corporation）から「カーボワックス（Carbowax）PEG−1450」として市販入手可能な「ポリエチレングリコール」の１つで被覆し、個々のストリップに対して約2.75×10-5〜3.75×10-5g/mm2の被膜重量を得た。これは50マイクロリットルの固定化液の１つを胞子ストリップ上に滴下し被覆形成された胞子ストリップを周囲条件下で24時間乾燥することによって達成した。
発明の装置の組み立て
装置は図３及び４に例示するように、薬ビン42の外側の仕切りの底部上の固定化胞子ストリップ46と酵素基質含有アンプル48と胞子ストリップの間のバリヤー47とで構成されている。200g/m2の重量を有するポリプロピレンブロウンマイクロファイバー材料の1.75cm（11/16インチ）の直径のディスク（ミネソタ州セントポールの3Mから「シンシュレート（Thinsulate）200−Ｂ ブランド・サーマル・インシュレーション（brand Thermal Insulation）」として市販入手可能）をバリヤー47として使用した。アンプル48は17gの細菌学上のペプトン及び0.17gのＬ−アラニンからなる栄養培地0.67ミリリットルだけでなく、１リットルの蒸留水中に0.1gの酵素基質、４−メチルウンベリフェリル−アルファー−Ｄ−グルコシド（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル（Sigma Chemical）社から市販入手可能）、及び0.03gのブロモクレゾールパープルpH指示染料を含有した。酵素基質及び栄養培地のpHを1.0Nの水酸化ナトリウムで7.6に調節した。外装容器42及び蓋56をポリプロピレンから形成した。外装容器42は5.08cm（2.0インチ）の長さ、89mm（0.335インチ）の外径及び85mm（0.303インチ）の内径であった。蓋56は1.66cm（0.510インチ）の長さ、1.07mm（0.328インチ）の内径であった。内側のアンプル48をガラスで形成し、3.96cm（1.56インチ）の長さ、6.5mm（0.258インチ）の外径及び2.5mm（0.010インチ）の壁厚さであった。蓋部材52はニューハンプシャー州ベンニントン（Bennington）のモナードノック・ペーパー・ミルズ（Monadnock Paper Mills）社から市販入手可能な「モナテック（Monatec）5111−067」の縫い合わせストックの1.27cm（0.5インチ）の直径の片であった。
常套のテストパックの組み立て
６〜８ユニットバッチの上述の生物学的インジケーター装置の機能を、常套のアソシエーション・フォー・ジ・アドバンスメント・オブ・メディカル・インスツルメンテーション（Association for the Advancement of Medical Instrumentation）（AAMI）蒸気テストパック、およびテストパックに包まれない常套の生物学的インジケーターに対して比較した。各AAMIタオルパックは良好な状態に清潔に洗浄されたミネソタ州ミネアポリスのアメリカン・リネン・サプライ（American Linen Supply）社から市販入手可能な「ハックタオル」16枚からなり、各タオルは約40.6×66cm（16×26インチ）であった。各タオルを1/3の長さに折り半分の幅に折った。次にタオルを互いの折り目を反対にして互いの上に置き約23×23×15cm（９×９×６インチ）のスタックを形成した。各タオルのスタック中に、ミネソタ州セントポールの3Mから市販入手可能な４つの「アテスト（Attest）TM1262/1262P・バイオロジカル・インジケーターズ（Biological Indicators）」（ロッド＃057、91年12月）又は４つの「アテスト（Attest）TM1291・ラピッド・リードアウト・バイオロジカル・インジケーターズ（Rapid Readout Biological Indicators）」（ロッド＃085、91年12月）をスタックの下から８枚目と９枚目のタオルの間に置いた。テストパックをオートクレーブテープで確保した。
比較試験
AAMIテストパック内に含まれずかつ金属器具トレイ内に置いた本発明と対照（常套のアテストTM1262/1262Pバイオロジカル・インジケーターと固定化しないこと以外は上述のように形成された対照の生物学的インジケーター）の装置、及び常套のAAMI生物学的テストパックを16、18、20、22、及び24分間121℃（250゜F）常圧のサイクルに（表１）、及び０、1.5、3.0、及び10.0分間132℃（270゜F）予備減圧のサイクルに２パルス（表２）、常圧変更及び真空補助蒸気滅菌装置（ペンシルバニア州エリエ（Erie）のアメリカン・ステリライザー・カンパニー（American Sterilizer Company）から「アムスコ・イーグル・モデル（Amsco EagleTM Model）3000として市販入手可能）中で暴露した。暴露後、常套の生物学的インジケーターをAAMI16タオルテストパックから取り出した。本発明のインジケーターと常套の生物学的インジケーターの両方の内側アンプルを割りユニットを60℃で培養した。酵素基質を使用して胞子の生存（即ち、本発明及び常套のテストパックはすべて1291「アテストTM・バイオロジカル・インジケーター（BI）」を含んでいる）を表示する装置に対して、「アテストTM・190・オート−リーダー（Auto−Reader）」（ミネソタ州セントポールの3Mから市販入手可能）は４及び８時間培養後の４−メチルウンベリフェリル蛍光を測定することによってアルファー−グルコシダーゼ活性を蛍光定量法的に読み取るために使用した。胞子の成長はpH指示薬によってなされた色の変化によって表されるので、24、48及び168時間培養においてすべてのユニットに対して目視で同定した。
結果を表１及び２に報告する。実施例の表において、BIは「生物学的インジケーター」と表す。
実施例２
本実施例は、固定化したアルファー−グルコシダーゼを使用した本発明の生物学的インジケーターがAAMI16タオルテストパックにおける常套の生物学的インジケーターに比べて121℃（250゜F）常圧及び132℃（270゜F）予備減圧滅菌暴露で滅菌効力のある結果を提供することを例示する。
酵素ストリップの調製
バチルスステアロサーモフィラスをから誘導し100ユニット/mgの特定の活性を有する凍結乾燥（lyophilized）し、浄化したアルファー−グルコシダーゼ（ロット＃001）を、日本、東京のユニチカ社から得た。アルファー−グルコシダーゼ（0.1g）を１ミリリットルの滅菌した蒸留水に懸濁させた。酵素懸濁液を滅菌した蒸留水１リットルに対して24時間、カリフォルニア州ロサンゼルスのスペクトル・メディカル・インダストリーズ（Spectrum Medical Industries）社から市販入手可能な「スペクトラ／ポア・モレキュラーポーラス・メンブラン（Spectra/Por Molecularporous Membrane）」を用いて、3500ダルトンの分子量限界で透析した。透析した酵素懸濁液を４℃で必要になるまで保存した。透析したアルファー−グルコシダーゼの希釈液を滅菌した蒸留水で作り750〜1500ユニット／ミリリットルの最終濃度の酵素を得た。アルファー−グルコシダーゼのこれらの希釈液をニューハンプシャー州ケーンのシュレイカー＆シュエルから「Ｓ＆Ｓ ＃903・グレイド・フィルター・ペーパー」として市販入力可能な6.35×28.58mm（1/4×3/8インチ）の濾紙のストリップ上に被覆形成し乾燥した。これは各懸濁液100マイクロリットルを各濾紙ストリップ上に滴下しストリップを周囲条件下で乾燥することによって達成した。
酵素の固定化
以下の酵素の固定化方法を用いた。アルファー−グルコシダーゼのストリップを以下の化学薬品固定化水溶液：
表３及び４に記載するパーセント濃度（w/v）でのニューヨーク州ニューヨークのファイザーから市販入手可能な「Ｄ−ソルビトール」、及びコネチカット州ダンブリーのユニオン・カーバイド・コーポレーションからの「カーボワックス・PEG−1450」で被覆し、個々のストリップに対して約2.75×10-5〜3.75×10-5g/mm2の被膜重量を得た。これは上記固定化化合物の溶液50マイクロリットルを酵素を被覆形成したストリップ上に滴下することによって達成した。固定化した酵素ストリップを周囲条件下で24時間乾燥させ、装置を組み立てた。
装置の組み立て
装置は図３及び図４に例示し、実施例１に記載するように、固定化した酵素ストリップを用いて構成した。10ユニットバッチの上述の生物学的インジケーター装置（金属器具トレイ上に配置）とアソシエーション・フォー・ジ・アドバンス・オブ・メディカル・インスツルメンテーション（AAMI）蒸気テストパック中の常套の生物学的インジケーターを実施例１に記載するような滅菌サイクルに暴露した。
発明の装置と常套のAAMI生物学的テストパックを同時に16、18、及び20分間121℃（250゜F）常圧のサイクルに（表１）、及び０、1.5、及び3.0分間132℃（270゜F）予備減圧の２パルスサイクルに（表２）、実施例１に記載するような滅菌装置中で暴露した。暴露後、常套の生物学的インジケーターをAAMIテストパックから取り出し、本発明と常套の生物学的インジケーターの装置の両方の内側アンプルを割りユニットを60℃で培養した。酵素活性及び胞子成長を実施例１に記載するように測定した。胞子成長は本発明の装置で測定することができなかったので、浄化した胞子よりもむしろ酵素を使用して滅菌の外観を同定した。
結果を表３及び４に報告する。
実施例３
本実施例は、本発明の生物学的インジケーターとAAMI16タオルテストパックにおける常套の生物学的インジケーターとの間の相関性を例示して、121℃（250゜F）常圧及び132℃（270゜F）予備減圧の滅菌サイクルの効力を同定する。
メリーランド州ロックビル（Rockville）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）から［ATCC 7953」として市販入手可能なバチルスステアロサーモフィラスを実施例１のように成長させた。
バチルスステアロサーモフィラス胞子を１×105胞子／ストリップの割合であること以外は実施例１のように濾紙の上に被覆形成し、乾燥し固定化した。これは水中への胞子の懸濁液を１×107胞子／ミリリットルの濃度に調製し、この懸濁液10μｌを各濾紙ストリップ上に滴下しストリップを周囲条件下で乾燥することによって達成した。
図１及び２に例示するように、装置がバリヤー47を含有しないこと以外は実施例１に記載するように固定化した胞子ストリップを用いて装置を構成した。
テストパックに含まれずかつ金属器具トレイ内に置いた３ユニットバッチのバチルスステアロサーモフィラス胞子と対照（実施例１により形成されたアテストTM・1262/1262P及び対照の生物学的インジケーター）を含有する装置、及びAAMI蒸気テストパックにおける常套の生物学的インジケーター（実施例１に記載するように調製）を121℃（250゜F）常圧（表５）及び132℃（270゜F）予備減圧（表６）の蒸気滅菌サイクルに暴露し、実施例１に記載するように胞子成長に対して評価した。
結果を表５及び６に報告する。
実施例４
本実施例は固定化剤、Ｄ−ソルビトール及びPEG−1450の濃度変更の、バチルスステアロサーモフィラスATCC 7953固定化胞子及び胞子の有する酵素に対する121℃（250゜F）常圧暴露での生／死時間における効力を例示する。
すべての胞子は実施例１に記載するように栄養寒天培地上で成長させた。
バチルスステアロサーモフィラス胞子を実施例１に記載するように被覆形成し、乾燥し固定化した。
装置は図３及び４に例示し実施例１に記載するように構成した。
３ユニットバッチの上述の装置と実施例１により形成された生物学的インジケーター対照を金属器具トレイ中に置き10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24及び25分間実施例１に記載するような121℃（250゜F）常圧蒸気滅菌サイクルに暴露した。装置の内側アンプルを割りユニットを60℃で培養した。酵素活性及び胞子成長を実施例１に記載するように評価した。酵素活性は表７に報告し胞子成長は表８に報告する。
実施例５
本実施例は、常套のテストパック（図５に示すような）に132℃（270゜F）予備減圧暴露で使用する場合に、Ｄ−ソルビトールの使用は胞子の有する酵素及び胞子の生／死機能を向上させることを例示する。
すべての胞子は実施例１に記載するように栄養寒天培地上で成長させた。
表11に示す重量％濃度でバチルスステアロサーモフィラス胞子とＤ−ソルビトールの水中への懸濁液を生成した。これは洗浄したバチルスステアロサーモフィラス胞子を7.5×107胞子／ミリリットルの濃度で10％及び20％w/vのＤ−ソルビトールの懸濁液中に懸濁させることによって達成した。懸濁液を混合し、ニューハンプシャー州ケーン（Keene）のシュレイカー＆シュエル（Schleicher ＆ Schuell）から「Ｓ＆Ｓ ＃903・グレイド・フィルター・ペーパー（Grade Filter Paper）」として市販入手可能な6.35×9.52mm（1/4×3/8インチ）の濾紙のストリップ上にストリップに対して7.5×105胞子の割合で被覆形成し乾燥した。これは懸濁液10マイクロリットルを各濾紙ストリップ上に滴下しストリップを周囲条件下で乾燥することによって達成した。
装置は図３及び４に例示し実施例１に記載するように構成した。
３ユニットバッチの上述の装置と常套の生物学的インジケーター（「アテストTM・ラピッド・リードアウト・バイオロジカル・インジケーター 1291」（ロッド＃085、91年12月））をミネソタ州セントポールの3Mから市販入手可能な「アテストTM・1276・テストパック」中に置いた。
本発明の生物学的インジケーターを使用したテストパック及び常套の生物学的インジケーターパックを0.5、１、及び４分間実施例１に記載するような132℃（270゜F）予備減圧蒸気滅菌サイクル２パルスに暴露した。生物学的インジケーターをテストパックから取り出し、内側アンプルを割り各ユニットを60℃で培養した。酵素活性及び胞子成長を実施例１に記載するように評価した。結果を表９に報告する。
実施例６
本発明は他の固定化化合物を使用してバチルスステアロサーモフィラス胞子を固定化することを例示する。以下の化合物（及び原料）リストを使用した。：
「ミオ−エリスリトール（myo−erythritol）」、ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社
「アドニトール（adonitol）」、シグマ・ケミカル社
「ズルシトール（dulcitol）」、シグマ・ケミカル社
「Ｄ−マニトール（mannitol）」、シグマ・ケミカル社
「キシリトール（xylitol）」、シグマ・ケミカル社
「Ｄ−アラビニトール（arabinitol）」、シグマ・ケミカル社
「Ｄ（＋）−セロビオトース（cellobiose）」、シグマ・ケミカル社
「スクロース（surose）」、シグマ・ケミカル社
「メソ−イノシトール（inositol）」、シグマ・ケミカル社
「グリセロール（glycerol）」、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミ．（Aldrich Chem.）社
「ポリビニルアルコール（PVA）」アルドリッチ・ケミ．社
「トレハロース（trehalose）」シグマ・ケミカル社
「ラクトース（lactose）」シグマ・ケミカル社
「ラフィノース（raffinose）」シグマ・ケミカル社
「メレジトース（melezitose）」シグマ・ケミカル社
「マルトース（maltose）」シグマ・ケミカル社
［ATCC 7953」として市販入手可能なバチルスステアロサーモフィラスを実施例１に記載するように成長させた。
バチルスステアロサーモフィラス胞子を１×105胞子／ストリップの割合で被覆形成し、乾燥し実施例１に記載するように上述の化学固定化剤の１つで固定化した。
装置は図１及び２に例示し実施例３に記載するように固定化した胞子ストリップを用いて構成した。
３ユニットバッチの上述の装置（金属器具トレイ上に配置）とAAMI蒸気テストパック中の常套の生物学的インジケーター（実施例１に記載）を実施例１に記載するように同時に15、18、21、24、27、及び30分間121℃（250゜F）常圧の蒸気滅菌サイクルに暴露した。生物学的インジケーターの内側アンプルを割りユニットを56℃で培養した。胞子成長を実施例１に記載するように評価し結果を表10に報告する。
実施例７
本実施例は本発明の実施に有用なバチルスステアロサーモフィラスに関連する種々の酵素を例示する。本実施例ではニューヨーク州プラインビュー、APIアナリタブ・プロダクツ（Analytab Products）から［API−XYMTMシステム（System）」として市販入手可能な酵素基質キットを用いた。このキットは個々に一連のマイクロカプセルに封入された19の異なった脱水色原体酵素基質からなる。水性試料の各マイクロカプセルへの添加は基質を再水和させる。テストキットを必要な時間培養しシステムが有する検出試薬を添加した後反応を目視で読み取った。
バチルスステアロサーモフィラス胞子「ATCC 7953」を実施例１に記載するように成長させた。
バチルスステアロサーモフィラス胞子を実施例１に記載するように１×105胞子／ストリップの割合で濾紙ストリップの上に被覆形成し、乾燥した。これは水中への胞子の懸濁液を１×107胞子／ミリリットルの濃度に調製し、この懸濁液10マイクロリットルを各濾紙ストリップ上に滴下しストリップを周囲条件下で乾燥することによって達成した。胞子を実施例１に記載するように「Ｄ−ソルビトール」を30重量％／体積のパーセント濃度で使用することによって固定化した。
装置は図３及び４に例示し実施例１に記載するように胞子ストリップを用いて構成した。
３ユニットバッチの本発明の装置を実施例１に記載するように15、及び30分間121℃（250゜F）常圧のサイクルに滅菌装置中で暴露した。暴露後、胞子ストリップを無菌状態で取り出し、酵素基質キット中の各マイクロカプセルに移し、滅菌したトリプシン大豆ブイヨン100マイクロリットルを各穴に添加した。第１のキットは15分間暴露した固定化胞子ストリップを含有し、第２のキットは30分間暴露した固定化胞子ストリップを含有し、及び第３のキットは暴露しない固定化胞子ストリップを含有した。
キットを56℃で7.5時間培養した。培養後、API−XYMTMシステムとともに入手できる検出試薬Ａ及びＢを基質成長用に添加した。各マイクロカプセル内の色の検出は活性酵素の存在を示している。結果を表11に報告する。
実施例８
本実施例は異なった化合物を使用してバチルスサチリス胞子を固定化することを例示する。以下の固定化化合物（その原料とともにリスト）を使用した。：
「ミオ−エリスリトール（myo−erythrito−ｌ）」、ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社
「アドニトール（adonitol）」、シグマ社
「ズルシトール（dulcitol）」、シグマ社
「Ｄ−マニトール（mannitol）」、シグマ社
「キシリトール（xylitol）」、シグマ社
「ポリオール−Ｐ」、ニューヨーク州ニューヨークのファイザー社
「Ｄ−アラビニトール（arabinitol）」、シグマ社
「Ｄ（＋）−セロビオース（cellobiose）」、シグマ社
「スクロース（sucrose）」、シグマ社
「ミオ−イノシトール（inositol）」、シグマ社
「グリセロール（glycerol）」、ウィスコンシン州ミルウォーキー、アルドリッチ・ケミカル（Aldrich Chemical）社
「ジプロピレングリコール」、アルドリッチ社
「ポリビニルアルコール」アルドリッチ社
「ポリビニルピロリドン Ｋ−90」、ニュージャージー州ウェイン、ガフ・ケム（GAF Chem.）社
「トレハロース（trehalose）」シグマ社
「Ｌ−ソルボース（sorbose）」シグマ社
「ラクトース（lactose）」シグマ社
「Ｄ−グルコース（glucose）」シグマ社
「ラフィノース（raffinose）」シグマ社
「メレジトース（melezitose）」シグマ社
「Ｄ−フルクトース（fructose）」シグマ社
「Ｌ−アラビノース（arabinose）」シグマ社
「澱粉」
「ソルビトール（sorbitol）」、ファイザー社
「シクロデキストリン」、インディアナ州ハモンド、アメリカン・マイズ−プロダクト（American Maize−Product）社
「Ｄ−リボース」、シグマ社
「ペクチン」、シグマ社
「グア（guar）ゴム」、シグマ社
「トラガカンタ（tragacanta）ゴム」、シグマ社
「アラビアゴム」、シグマ社
「カッパ・カラジーナン（Kappa carrageenan）」、シグマ社
「マルトース（maltose）」シグマ社
「ポリエチレングリコール（カーボワックス・PEG−1450）」、ユニオン・カーバイド
［ATCC 9372」バチルスサチリスを16時間37℃でトリプシン大豆培地中で成長させた。この培養液を用いて8g/リットルの栄養ブイヨン、0.011g/リットルの硫酸マンガン、及び20g/リットルの寒天培養基からなるpH7.2の寒天培養基プレートの表面に注射した。プレートを37℃で６日間培養し胞子をプレートからスクラップし滅菌蒸留水に懸濁した。胞子を7000rpm、４℃で20分間懸濁液を遠心分離することによって培養力のある残留物から分離した。上澄みを流し去り胞子を滅菌した蒸留水中に再懸濁させた。この洗浄操作を数回繰り返した。
バチルスサチリス胞子を、実施例１に記載するように6.35×28.58mm（1/4×3/8インチ）の濾紙のストリップ上にストリップに対して１×106胞子の割合で被覆形成し乾燥した。バチルスサチリスの胞子ストリップを実施例12に記載するように表２に特定されたパーセント濃度（w/v）で先に挙げた固定化剤の１つの溶液で被覆し、乾燥させた。
装置は図１及び２に示し実施例３に記載するように固定化した胞子ストリップを用いて組み立てた。
３ユニットバッチの上述の装置と実施例１により形成された対照（共に金属器具トレイ上に配置）、及びミネソタ州セントポールの3Mから市販入手可能な「アテストTM・1278・テストパック」（ロッド＃215 1992年６月）中の常套の生物学的インジケーター（「アテストTM・ラピッド・リードアウト・1264・バイオロジカル・インジケーター」）を事前に54℃、相対湿度60％で30分間の条件に置きついで、15、18、21、24、27、及び30分間54℃、相対湿度60％で、「ジョスリン（Joslyn）EOビア・ベッセル（Bier Vessel）」エチレンオキサイド滅菌装置（ニューヨーク州マセドンのジョスリン・バルブ（Joslyn Valve）から市販入手可能）中で600mg/リットルのエチレンオキサイドに暴露した。
暴露後、本発明の装置の内側アンプルを無菌状態で取り出し、17g/リットルの細菌学上のペプトン、0.17g/リットルのＬ−アラニン及び0.03g/リットルのトリフェニルテトラゾリウムクロライドの溶液0.67ミリリットルを各ユニットの外側薬ビンに添加した。常套の生物学的インジケーターをテストパックから取り出し内側アンプルを割った。すべてのユニットを37℃で培養した。pH指示薬によって生成される色の変化により示されるように、胞子成長を24、48、及び168時間培養で目視同定した。
結果を表12に報告する。
実施例９
本実施例は表13に挙げる化合物（ポリオール及び関連化合物はエチレンオキサイドとともに有用な固定化させる化合物用に幅広い種類を要する）を使用してバチルスサチリス胞子及びその酵素のベータ−グルコシダーゼを固定化するのとを例示する。
［ATCC 9372」バチルスサチリス胞子を実施例８に記載するように成長させた。バチルスサチリス胞子を１×107胞子／ストリップの割合であること以外は実施例８に記載するように被覆形成し、乾燥し、固定化した。
装置は図３及び４に示し実施例１に記載するように固定化胞子ストリップを用いて組み立てた。
３ユニットバッチのこれらの装置をミネソタ州セントポールの3Mから市販入手可能な「1278・アテストTM・テストパック」（ロッド＃215 1992年６月）中の常套の生物学的インジケーター「アテストTM・エチレン・オキサイド・バイオロジカル・インジケーター・1264」のユニットバッチといっしょに金属器具トレイ内に置いた。発明及びテストパック中の常套の生物学的インジケーターを事前に54℃、相対湿度60％で30分間の条件に置いた。ついで装置を、20、30、60、及び120分間54℃、相対湿度60％で、「ジョスリン・EO・ビア・ベッセル」（ニューヨーク州マセドンのジョスリン・バルブから市販入手可能）中の600mg/リットルのエチレンオキサイドに暴露した。
暴露後、本発明の装置の内側アンプルを無菌状態で取り出し、17g/リットルの細菌学上のペプトン、0.17g/リットルのＬ−アラニン及び0.03g/リットルのトリフェニルテトラゾリウムクロライド及び0.1g/リットルの４−メチルウンベリフェリル−ベータ−Ｄ−グルコシド（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社から市販入手可能）の溶液0.67ミリリットルを各ユニットに添加した。常套の生物学的インジケーターをテストパックから取り出し、その内側アンプルを割った。すべてのユニットを37℃で培養した。3Mから市販入手可能な「アテストTM・190・オート−リーダー」を用いて８時間培養後の４−メチルウンベリフェリル蛍光を測定することによってベータ−グルコシダーゼ活性を蛍光定量法的に読んだ。pH指示薬によって生成される色の変化により示されるので、胞子成長を24、48、及び168時間培養で目視同定した。
結果を表13に報告する。
実施例10
本実施例は、不溶性支持体材料上への吸収によって固定化させたアルファー−グルコシダーゼを含有する本発明の生物学的インジケーターがAAMI16タオルテストパックにおける常套の生物学的インジケーターに比べて、125゜F（121℃）常圧暴露で滅菌の有効な結果を提供することを例示する。
酵素の調製
バチルスステアロサーモフィラスをからの浄化した「アルファー−グルコシダーゼ」（ロッド＃001）を日本国、東京のユニチカ社から得た。100ユニット/mgタンパク質の特定の活性を有する凍結乾燥されたアルファー−グルコシダーゼ（10,000ユニット）を１ミリリットルの滅菌した蒸留水に懸濁させた。この懸濁液を滅菌した蒸留水１リットルに対して24時間、カリフォルニア州ロサンゼルスのスペクトラム・メディカル・インダストリーズ社から市販入手可能な「スペクトラ／ポア・モレキュラーポロース・メンブラン」を用いて、3500ダルトンの分子量限界で透析した。透析した酵素懸濁液を４℃で必要になるまで保存した。透析したアルファー−グルコシダーゼの希釈液を滅菌した蒸留水で作り200ユニット／ミリリットルの酵素濃度で50ミリリットルの懸濁液を得た。
酵素の固定化
支持体材料「デア−セファデックス（DEAE−Sephadex）Ａ−50」、「CM−セファデックスＣ−50」（共にニュージャージー州ピスカタウェイのファーマシア・ファイン・ケミカルズ（Pharmacia Fine Chemicals）から市販入手可能）；「シリカ・ゲル（Silica Gel）60・オングストロームズ（Angstroms）」（イリノイ州マックグロウパークのアメリカン・サイエンティフィック・プロダクツ（American Scientific Products）から市販入手可能）；ヒドロキシルアパタイト及び炭酸カルシウム（共にニュージャージー州チェリーヒルのEM・サイエンス（Science）から市販入手可能）上への吸着による酵素の固定化は以下の方法によって達成した。
５つの支持体材料を以下のような適当な緩衝溶液への懸濁によって平衡にした。デア−セファデックス、0.5g;シリカ・ゲル、1g;ヒドロキシルアパタイト、1g;及び炭酸カルシウム、1gを別々の0.01Mの硫酸カリウム緩衝液pH7.3の溶液100ミリリットル中に懸濁し、２日間周囲条件で平衡にした。CM−セファデックス、0.5gを0.01Mの酢酸ナトリウム緩衝液pH4.6、100ミリリットル中に懸濁し、２日間平衡にした。平衡にした支持体材料を次に7000rpm、４℃で30分間遠心分離し、上澄みを捨てた。支持体材料のペレットを次に200ユニット／ミリリットルのアルファー−グルコシダーゼ溶液10ミリリットルを添加し、静かに１時間周囲条件下で回転式撹拌機を用いて混合することによって再度懸濁させた。
酵素／支持体錯体を7000rpm、４℃、15分間の遠心分離によってペレットさせた。上澄みを取り除き、保存した。酵素／支持体錯体を周囲条件で４日間乾燥させた。乾燥した酵素／支持体錯体を４℃で必要になるまで保存した。
５つの支持体材料上に固定化したアルファー−グルコシダーゼの量の測定を、以下のように支持体材料上へのアルファー−グルコシダーゼの固定化後に回収された上澄み中に残るユニットにおける酵素活性の量を同定することによって行った。
滅菌蒸留水中の20mMのｐ−ニトロフェニル−アルファー−Ｄ−グルコピラノシド（ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社から市販入手可能）900マイクロリットルをテストチューブ内で上澄みの蒸留水での1:100希釈液100マイクロリットルと混合した。30℃で15分後、0.2Mの炭酸ナトリウムをテストチューブに入れ酵素−基質反応を終わらせた。基質生成物、ｐ−ニトロフェノールの発生による400nmでの吸着の増加は酵素を除去した対照と比べて決定した。18.1cm2/マイクロモルの分子吸光係数を用いて上澄み中に含まれる基質生成物の量を計算した。あるユニットの酵素活性は30℃で１分間に１マイクロモルのｐ−ニトロフェノールを形成するアルファー−グルコシダーゼの量として規定される。上澄み中に含まれる酵素のユニットを2,000ユニットから引くと乾燥した酵素／支持体錯体中に含まれる酵素のユニットが得られる。乾燥した酵素／支持体生成物中の酵素のユニットを表14に報告する。
装置の組み立て
装置は0.1gの乾燥した酵素／支持体生成物を外装容器中に置いた後にバリヤー47を外装容器内に配置した以外は図３及び４に例示し、実施例１に記載するするように構成した。
３ユニットバッチの固定化したアルファー−グルコシダーゼからなる本発明の装置を金属器具トレイ上に配置した。ミネソタ州セントポールの3Mから市販入手可能な３つの「アテストTM・バイオロジカル・インジケーターズ・1262/1262P」及び３つの「アテストTM・ラピッド・リードアウト・バイオロジカル・インジケーターズ・1291」をAAMI蒸気テストパック内にスタックの下から８枚目と９枚目のタオルの間に置いた。テストパックをオートクレーブテープで確保した。
発明の装置と常套のAAMI生物学的テストパックを16、18、及び20分間250゜F（132℃）常圧に「アムスコ・イーグルTM・モデル・3000」蒸気滅菌装置内で暴露した。暴露後、常套の生物学的インジケーターをAAMI16タオルテストパックから取り出した。本発明の装置と常套の生物学的インジケーターの内側アンプルを割りユニットを60℃で培養した。「アテストTM・190・オート−リーダー」を用いて４及び８時間培養後の４−メチルウンベリフェリル蛍光を測定することによってアルファー−グルコシダーゼの活性を読んだ。結果を表15に報告する。
実施例11
本実施例は、常套のテストパック（図５及び６に示すように）にとともに及びこれらなしにヨーロッピアン・ステリリゼイション・イクイップメント・カンパニー（European Sterilization Equipment Company）予備減圧蒸気滅菌サイクル（121℃）に使用した場合に、固定化剤Ｄ−ソルビトールの使用は胞子の有する酵素及び胞子の生／死機能を向上させることを例示する。
バチルスステアロサーモフィラス胞子は実施例１に記載するように濾紙上に被覆形成し「Ｄ−ソルビトール」で固定化した。本発明の生物学的インジケーターを図３及び４に例示し実施例１に記載するように構成した。
テストパックの組み立て
テストパックを図５及び６に示すように構成した。テストパック100は全体で134mm（5.36インチ）×140mm（5.60インチ）×28mm（1.12インチ）の大きさを有する箱102を含有した。この箱はワニスを塗っていない漂白硫酸紙で作られていた。
この箱は、その外側表面上をポリプロピレンラミネートの蒸気非透過性熱可塑性被膜110で被覆された漂白硫酸紙で同じく作られた開口した容器108を有していた。容器108は箱102よりごく僅かに小さい大きさであった。
半多孔性材料の２スタックのシート112及び114が同様に半多孔性材料の１スタックのシート116で分離され、これが容器108中に含まれていた。半多孔性材料の各スタックを約214ポンド（7kg）/3,000平方フィート（280m）の基本重量と約1mm/シートの厚さを有する濾紙から形成した。スタック112及び114は36枚の濾紙を含有していた。半多孔性スタック116は各シートの中心から13mm×49mmの領域118が切断された16枚の濾紙からなり、本発明の生物学的インジケーター11を受けるようにした。この中心核の高さは組み立て及び乾燥した際に約10mmであった。
テストパックは箱のフラップ112を開けることによって開口され、表面の半多孔性シートを除去し、螺旋状の金属バネ120（好ましくはステンレススチールで作られている）によって取り囲んだ常套の生物学的インジケーター又は本発明の生物学的インジケーターをスタックの中心位置の穴内に置いた。表面シートを次いで再配置し箱を閉めた。
比較テスト
単独及び上述のテストパック中で使用される本発明の装置と、上述のテストパック中にある常套の「アテストTM1262・バイオロジカル・インジケーター」と「アテストTM・1291・ラピッド・リードアウト・バイオロジカル・インジケーター」からなる対照を金属トレイ中に置き、６、6.5、７、及び15分間121℃（250゜F）予備減圧滅菌サイクルに３ネガティブパルス、常圧変更及び真空補助滅菌装置内（ニュージャージー州レイクウッドのゲティングTM・インターナショナル（GetingeTM International）社からのゲッティングTM・パックス（GetingeTM PACs）2000ハイ・バキューム・ステリライザー（High Vacuum Sterilizer）」として市販入手可能）で暴露した。滅菌装置の設定は表16に示した。サイクルはヨーロピアン・ステリリゼーション・イクイップメント・カンパニー予備減圧サイクルである。暴露後、生物学的インジケーターを実施例１に記載するように評価した。結果を表17に報告する。
実施例12
実施例12は、常套のテストパック（図５及び６に示すように）とともに及びこれらなしにヨーロッピアン・ステリリゼイション・イクイップメント・カンパニー（European Sterilization Equipment Company）予備減圧蒸気滅菌サイクル（134℃（272゜F））に使用した場合に化学固定化剤Ｄ−ソルビトールの使用が胞子の有する酵素及び胞子の生／死機能を向上させることを例示する。
メリーランド州ロックビル（Rockville）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）から「ATCC 7953」として市販入手可能なバチルスステアロサーモフィラスは実施例１に記載するように成長させた。バチルスステアロサーモフィラス胞子を実施例１に記載するように濾紙上に被覆形成し、乾燥し、固定化した。生物学的インジケーター装置を実施例１に記載し図３及び４に例示するように固定化した胞子ストリップを用いて構成した。
３ユニットバッチの、単独及び実施例13に記載するようなテストパック中で使用される固定化したバチルスステアロサーモフィラス胞子を含有する装置と、実施例13に記載する常套の蒸気テストパック中にある常套の「アテストTM・1262・バイオロジカル・インジケーター」と「アテストTM・1291・ラピッド・リードアウト・バイオロジカル・インジケーター」を金属器具トレイ中に置いた。これらを０、２、４、６、８、10及び12秒間134℃（272゜F）予備減圧滅菌サイクルに３ネガティブパルス及び４ポジティブパルス、常圧変更及び真空補助滅菌装置内（ニュージャージー州レイクウッド、ゲティング・インターナショナル（Getinge International）社からのゲッティング・パックス（GetingeTM PACs）・2000・ハイ・バキューム・ステリライザー（High Vacuum Sterilizer）」として市販入手可能）で暴露した。滅菌装置の設定は表18に示した。サイクルはヨーロピアン・ステリリゼーション・カンパニー予備減圧サイクルである。暴露後、生物学的インジケーターを実施例１に記載するように評価した。結果を表19に報告する。
以下は商標である。：
「1278・アテストTM・EO・パック」
「1276・アテストTM・スチーム・パック」
「アテストTM・1262/1262P・バイオロジカル・インジケーター」
「アムスコ・イーグルTM・モデル・3000」
「アテストTM・バイオロジカル・インジケーター」
「アテストTM・190・オート−リーダー」
「アテストTM・1276・テストパック」
［API−XYMTM・システム」
「アテストTM・1264・バイオロジカル・インジケーター」
「アテストTM・1278・テストパック」
「アテストTM・エチレン・オキサイド・バイオロジカル・インジケーター・1264」
「アテストTM・1262・バイオロジカル・インジケーター」
「ゲッティングTM・パックス・2000・ハイ・バキューム・ステリライザー」
「ゲッティングTM・インターナショナル社」
「アテストTM・1291・バイオロジカル・インジケーター」
「セファデックス・Ｇ−タイプ」
「セファローズ・イオン・エクスチェンジャー」
「セファデックス・イオン・エクスチェンジャー」
「チンシュレート・200−Ｂ・ブランド・サーマル・インシュレーション」
「カーボワックス・PEG−1450」
「スペクトラ／ポア・モレキュラーポローズ・メンブラン」
「パーコール」
「シグマ・ケミカル社」
「ガフ・ケム社」
「デア−セファデックス・Ａ−50」
「CM・セファデックス・Ｃ−50」
Claims (11)
- （ａ）少なくとも１つの開口部を有する液体不透過性壁を有する外装容器、
（ｂ）該外装容器内に含まれる検出可能量の
（１）滅菌サイクルをモニターするのに有用である生存能力のある試験微生物、または
（２）滅菌サイクルをモニターするのに有用であるその他の活性試験酵素源、を含む生物学的インジケーターであって、試験微生物または酵素が、通常滅菌をモニターするのに用いられるテストパック内に含まれる場合に試験微生物には致死量に近い滅菌サイクルへの暴露後も、検出可能な量の該固定化微生物または酵素が生存しまたは活性な状態であり得、かつ通常滅菌をモニターするのに用いられるテストパック内に含まれる場合に試験微生物には致死量である滅菌サイクルへの暴露後では、検出可能量の固定化微生物または酵素が生存しないかまたは活性な状態となり得ない程度に前記微生物または酵素を化学的に固定化した生物学的インジケーター。 - （ａ）少なくとも１つの開口部を有する液体不透過性壁を有する外装容器、
（ｂ）該外装容器内に含まれる検出可能量の
（１）滅菌サイクルをモニターするのに有用である生存能力のある試験微生物、または
（２）滅菌サイクルをモニターするのに有用であるその他の活性試験酵素源、を含む生物学的インジケーターであって、試験微生物または酵素が、通常滅菌をモニターするのに用いられるテストパック内に含まれる場合に試験微生物には致死量に近い滅菌サイクルへの暴露後も、検出可能な量の該固定化微生物または酵素が生存しまたは活性な状態であり得、かつ通常滅菌をモニターするのに用いられるテストパック内に含まれる場合に試験微生物には致死量である滅菌サイクルへの暴露後では、検出可能量の固定化微生物または酵素が生存しないかまたは活性な状態となり得ない程度に前記微生物または酵素を化学的に固定化し、該固定化が、
（１）水不溶性支持材料上での吸収；
（２）試験微生物または試験酵素への共有結合またはイオン結合を形成し得る水不溶性支持材料との反応；
（３）微生物または酵素を、微生物または酵素と非反応性である非イオン性ポリマー形成材料を含む架橋ポリマーゲルマトリックス内に閉じ込めること；
（４）微生物または酵素との間で分子間または分子内架橋を形成し得る架橋剤との反応；
（５）試験微生物または酵素をマイクロカプセル封入すること；
またはそれらの組合せ
を含む生物学的インジケーター。 - テストパック材料または装置内に請求項１または２記載の生物学的インジケーターを含む、滅菌槽内での滅菌サイクルの効力を決定するテストパック。
- 生物学的インジケーター内の試験微生物少なくとも１×102または試験酵素少なくとも0.1ユニットを固定化することを含む、生物学的インジケーター内の滅菌をモニターするのに有用な生存能力のある試験微生物または活性試験酵素の熱安定性改良方法であって、該固定化が、
（１）化学的に固定化する工程；
（２）水不溶性支持材料上で吸収する工程；
（３）試験微生物または試験酵素への共有結合またはイオン結合を形成し得る水不溶性支持材料と反応させる工程；
（４）該微生物または酵素を、微生物または酵素と非反応性である非イオン性ポリマー形成材料を含む架橋ポリマーゲルマトリックス内に閉じ込める工程；
（５）試験微生物または試験酵素内で分子間または分子内架橋を形成し得る架橋剤と反応させる工程；
（６）試験微生物または酵素をマイクロカプセル封入する工程；
またはそれらの組合せを含む方法。 - （ａ）試験微生物または酵素が、通常滅菌をモニターするのに用いられるテストパック内に含まれる場合に試験微生物には致死量に近い滅菌サイクルへの暴露後も、検出可能な量の該固定化微生物または酵素が生存しまたは活性な状態であり得、かつ通常滅菌をモニターするのに用いられるテストパック内に含まれる場合に試験微生物には致死量である滅菌サイクルへの暴露後では、検出可能量の固定化微生物または酵素が生存しないかまたは活性な状態となり得ない程度に固定化されることを含む、滅菌サイクルをモニターするのに有用な検出可能な量の試験微生物または試験酵素を該滅菌サイクルに暴露する工程であって、該固定化が、
（１）化学的に固定化する工程；
（２）水不溶性支持材料上で吸収する工程；
（３）試験微生物または試験酵素への共有結合またはイオン結合を形成し得る水不溶性支持材料と反応させる工程；
（４）該微生物または酵素を、微生物または酵素と非反応性である非イオン性ポリマー形成材料を含む架橋ポリマーゲルマトリックス内に閉じ込める工程；
（５）試験微生物または試験酵素内で分子間または分子内架橋を形成し得る架橋剤と反応させる工程；
（６）試験微生物または酵素をマイクロカプセル封入する工程；
またはそれらの組合せを含む試験微生物または試験酵素を該滅菌サイクルに暴露する工程；
（ｂ）滅菌サイクル完了後に、
（１）生存能力のある固定化試験微生物の生長を促進し得る水性栄養培地、および微生物の生長に対する応答の検出可能な変化を受け得る検出器材料を有する生存能力のある固定化試験微生物；または
（２）活性酵素と反応して検出可能な酵素変性物を生成し得る有効量の酵素基質を有する活性固定化試験酵素；
を培養する工程；
の段階から成る滅菌サイクルの効力を決定する方法であって、該培養が微生物の生長または活性酵素の酵素基質との反応を促進するのに十分な時間および条件で行われる滅菌サイクルの効力を決定する方法。 - 滅菌サイクルが蒸気サイクルであり、試験微生物または酵素が、アルジトール類、二糖類、三糖類、および、ポリビニルアルコール、グリコール類およびジオール類から成る群から選択されるポリマーアルコール類から成る群から選択される固定化剤を用いて固定化される請求項１記載の生物学的インジケーター、または請求項３記載のテストパック、また請求項４に記載の微生物または酵素の熱安定性改良方法、または請求項５記載の滅菌サイクルの効力を決定する方法。
- 滅菌サイクルが酸化エチレンサイクルであり、試験微生物または酵素が、アルジトール類、二糖類、多糖類、ポリラクタム類、および、ポリビニルアルコール、グリコール類およびジオール類から成る群から選択されるポリマーアルコール類から成る群から選択される固定化剤を用いて固定化される請求項１記載の生物学的インジケーター、または請求項３記載のテストパック、また請求項４に記載の微生物または酵素の熱安定性改良方法、または請求項５記載の滅菌サイクルの効力を決定する方法。
- 微生物または酵素を、テストパック材料または装置外で、121℃常圧の蒸気滅菌サイクルに少なくとも５分間暴露後も、検出可能な量の該固定化微生物または酵素が生存しまたは活性な状態であり得、かつ、テストパック材料または装置外で、該蒸気滅菌サイクルに15分間以上暴露後、該固定化微生物または酵素が生存しないかまたは活性な状態となり得ない程度に固定化した請求項１または２記載の生物学的インジケーター、または請求項３記載のテストパック、または請求項４に記載の微生物または酵素の熱安定性改良方法、または請求項５記載の滅菌サイクルの効力を決定する方法。
- 微生物または酵素を、テストパック材料または装置外で、132℃予備減圧の蒸気滅菌サイクルに少なくとも20秒間暴露後も、検出可能な量の該固定化微生物または酵素が生存しまたは活性な状態であり得、かつテストパック材料または装置外で、該蒸気滅菌サイクルに６分間以上暴露後では、該固定化微生物または酵素が生存しないかまたは活性な状態となり得ない程度に固定化する請求項１または２記載の生物学的インジケーター、または請求項３記載のテストパック、または請求項４に記載の微生物または酵素の熱安定性改良方法、または請求項５記載の滅菌サイクルの効力を決定する方法。
- 微生物または酵素を、テストパック材料または装置外で、121℃または134℃予備減圧の蒸気滅菌サイクルに少なくとも５秒間暴露後も、検出可能な量の該固定化微生物または酵素が生存しまたは活性な状態であり得、かつテストパック材料または装置外で、該蒸気滅菌サイクルに２分間以上暴露後では、該固定化微生物または酵素が生存しないかまたは活性な状態となり得ない程度に固定化した請求項１または２記載の生物学的インジケーター、または請求項３記載のテストパック、または請求項４に記載の微生物または酵素の熱安定性改良方法、または請求項５記載の滅菌サイクルの効力を決定する方法。
- 微生物または酵素を、テストパック材料または装置外で、酸化エチレン滅菌サイクルに少なくとも15分間暴露後も、検出可能な量の該固定化微生物または酵素が生存しまたは活性な状態であり得、かつテストパック材料または装置外で、該酸化エチレン滅菌サイクルに90分間以上暴露後では、該固定化微生物または酵素が生存しないかまたは活性な状態となり得ない程度に固定化した請求項１または２記載の生物学的インジケーター、または請求項３記載のテストパック、または請求項４に記載の微生物または酵素の熱安定性改良方法、または請求項５記載の滅菌サイクルの効力を決定する方法。
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