JPH0984597A - ホルムアルデヒドガス滅菌用生物学的インディケーター及び滅菌確認方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ホルムアルデヒドガス滅菌状況を正確に確認
し得る生物学的インディケーター、および従来の生物学
的インディケーターを用いても、ホルムアルデヒドガス
滅菌状況を正確に確認し得る滅菌確認方法の提供。 【解決手段】 支持体に胞子を担持したホルムアルデヒ
ドガス滅菌用の生物学的インディケーターであって、前
記支持体が実質的にホルムアルデヒドに対する吸着性を
有さない材質から成ることを特徴とする生物学的インデ
ィケーター。ホルムアルデヒドガス滅菌に供した後の生
物学的インディケーターと培地とを接触させ、培地中の
ホルムアルデヒド濃度が５０ｐｐｍ以下となる条件下で
前記培地を培養し、ついでこの培地の物性を測定するこ
とを特徴とする滅菌確認方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ホルムアルデヒド
ガス滅菌用の生物学的インディケーター及び滅菌確認方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来ホルムアルデヒドガス滅菌方法とし
ては、安全キャビネット内でパラホルムアルデヒドを加
熱昇華してホルムアルデヒドガスを発生させる方法（空
気清浄，Ｖｏｌ３０，Ｎｏ３（１９９２）、先行技術
１）、ホルマリンを加熱してホルムアルデヒドガスを発
生させ、発生させたガスを滅菌する部屋に送風し循環さ
せる方法（特開平４−１６１１６０号、先行技術２）等
が知られている。

【０００３】これらの方法においては、滅菌対象の室中
にホルムアルデヒドガスを供給し、所定時間保持するこ
とにより滅菌操作を行っていた。この操作を行うことに
より滅菌対象の室内は、滅菌されたものと想定し、滅菌
の程度を直接には検査しないこともあった。または滅菌
室内に置かれたホルムアルデヒドと反応して発色する化
学的インディケーターを用い間接的に滅菌の確認を行っ
ていた。

【０００４】しかし、このような確認方法では、滅菌室
内中のホルムアルデヒドガスが届きにくい部分の滅菌が
十分であるか否かの確認をすることは完全にはできなか
った。このため、滅菌室内のいかなる部分においても、
滅菌状態を直接的に確認できる手段の提供が望まれてい
た。

【０００５】ところで、滅菌確認の手段として、支持体
に胞子を担持した生物学的インディケーターが知られて
いる。例えば、メンブランフィルター等の表面に微生物
の胞子を付着させたインディケーター（特公５７−４１
９２０号、先行技術３）が知られている。更に、指標菌
の芽胞を吸着させた濾紙片を培養液とともに透明容器に
充填したインディケーター（特開平１−１０７７６５
号、先行技術４）も知られている。

【０００６】更に、市販の滅菌用インディケーターとし
て、例えば、アテスト（スリーエムヘルスケア株式会社
製）、アムスコ プルーフ・プラス（日本アムスコ株式
会社製）、滅菌テスパー（栄研器材株式会社製）、Ｓｐ
ｏｒｄｅｘ（ＡＭＳＣＯＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）、
ＳＰＯＲＴＲＯＬ（株式会社センコム製）等が知られて
いる。

【０００７】しかるに、本発明者らが知る限り、市販さ
れている生物学的インディケーターにホルムアルデヒド
ガス滅菌用のものはなく、また報告もない。即ち、先行
技術３には、対象となる滅菌として、高圧蒸気滅菌、加
熱滅菌、酸化エチレンガス滅菌及びγ−線照射滅菌が開
示されているのみである。さらに、先行技術４に開示さ
れたインディケーターの用途は、蒸気滅菌および酸化エ
チレンガス滅菌である。

【０００８】このような状況下、本発明者らは、ホルム
アルデヒドガス滅菌用の生物学的インディケーターの開
発を試みた。まず初めに、市販のインディケーター（ホ
ルムアルデヒドガス滅菌用ではない）をホルムアルデヒ
ドガス滅菌の確認に試用してみた。その結果、滅菌に常
用されているよりも低いホルムアルデヒドガス濃度にお
いても、担持された胞子が死滅してしまった。

【０００９】そこで、担持された胞子のホルムアルデヒ
ドに対する耐性の強弱を検討する目的で、支持体に担持
されていない胞子を上記と同じ条件で滅菌試験した。そ
の結果、支持体に担持されていない胞子は常用されてい
るより低いホルムアルデヒドガス濃度で死滅することは
なかった。但し、常用されているホルムアルデヒドガス
濃度においては胞子は、当然ではあるが死滅した。

【００１０】これらの実験の結果は、担持された胞子自
体は、ホルムアルデヒドガス滅菌の確認のために適した
ものであるにもかかわらず、インディケーターのいずれ
かの部分に適切な滅菌確認を妨げる要因があることを示
唆するものであった。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明の目的
は、ホルムアルデヒドガス滅菌状況を正確に確認し得る
生物学的インディケーターを提供することにある。

【００１２】更に本発明の目的は、従来の生物学的イン
ディケーターを用いても、ホルムアルデヒドガス滅菌状
況を正確に確認し得る滅菌確認方法を提供することにあ
る。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、種々の生
物学的インディケーターをホルムアルデヒドガス滅菌に
用いた場合についてさらに検討した。その結果、ホルム
アルデヒドガスはフィルター、濾紙等の支持体に吸着し
易いため、支持体に吸着したホルムアルデヒドにより胞
子の殺菌が助長されることを見いだした。

【００１４】更に、滅菌後の培養時に、支持体に吸着し
たホルムアルデヒドが培地に混入し、培養の段階で胞子
が死滅することを見いだした。そして、支持体として実
質的にホルムアルデヒドに対する吸着性を有さない材質
を用いること、あるいは培地中のホルムアルデヒド濃度
を一定以下に抑えることにより上記の課題を解決できる
ことを見いだし、本発明を完成するに至った。

【００１５】即ち、本発明は、支持体に胞子を担持した
ホルムアルデヒドガス滅菌用の生物学的インディケータ
ーであって、前記支持体が実質的にホルムアルデヒドに
対する吸着性を有さない材質から成ることを特徴とする
生物学的インディケーターに関する。

【００１６】更に、本発明は、ホルムアルデヒドガス滅
菌に供した後の生物学的インディケーターと培地とを接
触させ、培地中のホルムアルデヒド濃度が５０ｐｐｍ以
下となる条件下で前記培地を培養し、ついでこの培地の
物性を測定することを特徴とする滅菌確認方法に関す
る。以下、本発明を更に詳細に説明する。

【００１７】生物学的インディケーター 本発明のインディケーターに使用する支持体は、実質的
にホルムアルデヒドに対する吸着性を有さない材質から
成る。ここで「実質的にホルムアルデヒドに対する吸着
性を有さない」とは、滅菌に常用される濃度のホルムア
ルデヒドガスに平衡状態になるまで暴露したと同程度の
濃度のホルムアルデヒドを吸着した場合でも、支持体に
吸着しているホルムアルデヒドにより支持体上の胞子が
死滅しないことを意味する。

【００１８】具体的には、例えば、９４０ｐｐｍのホル
ムアルデヒドガスに５時間暴露されたときのホルムアル
デヒドガス吸着量が０．４ｇ／ｍ² 以下であれば、その
上に担持した胞子は死滅しない。好ましくは、上記ホル
ムアルデヒドガス吸着量が０．２ｇ／ｍ² 以下である。
尚、ホルムアルデヒドガス吸着量の測定は、実施例に述
べる方法により行うことができる。

【００１９】本発明のインディケーターに使用できる、
実質的にホルムアルデヒドに対する吸着性を有さない材
質からなる支持体としては、例えば、ガラス繊維濾紙、
シリカ繊維濾紙、テフロン繊維濾紙、クロマト用濾紙、
薬包紙、アルミホイル又はポリエチレンフィルム等が挙
げられる。

【００２０】本発明のインディケーターにおいて支持体
に担持される微生物の胞子は、ホルムアルデヒドガス滅
菌操作によって滅菌し得るものであれば良い。微生物の
種類等には特に限定はない。具体的には、バチルス・サ
ブチリス(Bacillus subtilis) ＡＴＣＣ ９３７２、バ
チルス・サブチリス(Bacillus subtilis) ＡＴＣＣ６６
３３、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus) ＡＴＣ
Ｃ ２７１４２、バチルス・ステアロサーモフィラス
（Bacillus stearothermophilus)ＡＴＣＣ ７９５３、
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearot
hermophilus)ＮＣＩＢ ８９１９、バチルス・ステアロ
サーモフィラス（Bacillus stearothermophilus)ＡＴＣ
Ｃ １２９８０等のバチルス・サブチリス(Bacillus su
btilis)、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus) 、
バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearot
hermophilus)に属するバクテリア類またはネロスボラ
属、ピソマイセス属、ドルディニア属等の真菌類が挙げ
られる。但し、ホルムアルデヒドガスに対して耐性が高
く、病原性が低く、取扱いの安全性が高いという観点か
ら、好ましくはバチルス・サブチリス(Bacillus subtil
is) である。

【００２１】これらの微生物の胞子は、公知の方法によ
り支持体に担持させることができる。まず、微生物をそ
れ自体既知の培地で培養する。培地は固体培地でも液体
培地でもよい。培養条件は、前記微生物の生育し得る雰
囲気、温度、時間、ｐＨであれば特に制限はない。培養
により得られる胞子は、培地からかき取り生理食塩水中
に分散させ、胞子懸濁液を調製する。または、培養液を
そのまま用いるか、培養液から遠心分離等により集めた
胞子を生理食塩水または蒸留水中に分散させ、胞子懸濁
液を調製する。次に、前記支持体を用いて調製した胞子
懸濁液を濾過するか、支持体に胞子懸濁液を塗布するこ
とにより支持体に胞子を担持させる。

【００２２】支持体表面上に担持される胞子は、通常知
られている固定剤を用いて固定してもよい。固定剤とし
ては、例えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアル
コール、カルボキシメチルセルロースまたはメチルセル
ロース等の水性高分子物質が挙げられる。胞子の固定化
はこれらの固定剤の約０．０００１〜２０重量％、好ま
しくは０．１〜１．０％の水溶液で胞子を洗浄、噴霧す
ることにより行うことができる。また、胞子懸濁液中に
前記濃度で固定剤を混入することによっても、胞子を固
定化することができる。

【００２３】胞子を担持した支持体は、必要であれば室
温で風乾又は３０〜４０℃に加熱して乾燥させることも
できる。この前処理により得られた、一定のホルムアル
デヒドガス耐性を有す胞子を用いることで、インディケ
ーターの信頼性を高めることができる。

【００２４】滅菌確認方法 本発明の滅菌確認方法を以下に説明する。ホルムアルデ
ヒドガス滅菌に供した後の生物学的インディケーターと
培地とを接触させ、前記培地を培養する。この際、イン
ディケーターには、支持体の種類に応じてホルムアルデ
ヒドが吸着しており、支持体中のホルムアルデヒドが培
地に移行する。培地に移行するホルムアルデヒド量が多
くなると、培養中に胞子が死滅してしまう。そこで本発
明者らは、培養中の胞子が死滅しないホルムアルデヒド
濃度について検討した。その結果、培地中のホルムアル
デヒド濃度が５０ｐｐｍ以下であれば、培養中の胞子が
死滅しないことを見いだした。さらに、信頼性を高める
という観点からは、上記濃度は２０ｐｐｍ以下であるこ
とが好ましい。

【００２５】インディケーターと接触させた後の培地中
のホルムアルデヒド濃度は、インディケーターを構成す
る支持体に吸着しているホルムアルデヒド量を考慮して
培地の容量を設定することで、上記条件を満足させるこ
とができる。従って、ホルムアルデヒド吸着性の高い支
持体の場合、培地の容量を増すことで、培地中のホルム
アルデヒド濃度を５０ｐｐｍ以下とすることができる。

【００２６】インディケーターに使用する支持体の種類
と寸法、さらには滅菌の際のホルムアルデヒドガス濃度
及び暴露時間に応じて、上記条件を満たす培地の容量を
予め求めておくことができる。例えば、滅菌により吸着
するホルムアルデヒド量が０．４ｇ／ｍ² である支持体
１０ｍｍ×１０ｍｍを用いる場合、０．８ｍｌ以上の培
地を用いることにより、培地中のホルムアルデヒド濃度
を５０ｐｐｍ以下とすることができる。

【００２７】本発明の滅菌確認方法は、前記本発明のイ
ンディケーターを用いた滅菌確認に用いることができる
ばかりでなく、従来の生物学的インディケーターを用い
た滅菌確認にも利用することができる。即ち、ホルムア
ルデヒド吸着量が０．４ｇ／ｍ² を超える支持体を用い
ても、培地の容量を増して、培地中のホルムアルデヒド
濃度を５０ｐｐｍ以下とすることで、培養中に胞子が死
滅することなく培養することができる。

【００２８】上記培養において、培地中のホルムアルデ
ヒド濃度を５０ｐｐｍ以下とすること以外には特に制限
はない。例えば、培地の組成には特に制限はない。但
し、後述する滅菌確認のために測定される物性の種類に
より組成は適宜設定できる。培地としては、ペプトン、
グルコース、ｐＨ指示薬を含有する栄養培地を用いるこ
とができる。

【００２９】培養条件は胞子が生育し得る雰囲気、温
度、時間、ｐＨであれば特に制限はない。例えば、バチ
ルス・サブチリス（Bacillus subtilis)では３５±２
℃、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus ste
arothermophilus)では５５±２℃、ｐＨは何れも中性で
好気条件が好ましい。ついでこの培地の物性を測定する
ことにより滅菌の確認を行う。滅菌確認のために測定さ
れる物性は公知のものでよく、、例えば、培地の濁度や
ｐＨ等を挙げることができる。

【００３０】

【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明する。実施例１ （１）生物学的インディケーターの製造 バチルス・サブチリス（Baccilus subtilis)ＡＴＣＣ
６６３３を、培地Ａ〔組成；肉エキス５ｇ／ｌ、ペプト
ン１０ｇ／ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、寒天１５ｇ／
ｌ〕に植菌し、３５℃で２週間培養した。得られた培養
液を無菌の生理食塩水で希釈し、胞子数が１０⁸ 個／ｍ
ｌとなるように懸濁させた。この懸濁液１０μｌを支持
体である１０ｍｍ×１０ｍｍのポリフロン繊維製濾紙
（商品名：ＰＦ０５０、アドバンテク社製）にクリーン
ベンチ内で塗布し、室温で風乾させ、生物学的インディ
ケーターを調製した。なお、濾紙は予めオートクレーブ
にて加熱滅菌し、乾燥させたものを用いた。

【００３１】（２）インディケーターの試験 （１）で製造した生物学的インディケーターを小室内に
入れ、パラホルムアルデヒドを加熱昇華することにより
ホルムアルデヒドガスを発生させた。滅菌が十分である
２０℃、５ｈｒ、相対湿度７０％、ホルムアルデヒドガ
ス濃度８００ｐｐｍの条件（条件１）および滅菌が不十
分である２０℃、５ｈｒ、相対湿度４０％、ホルムアル
デヒドガス濃度８００ｐｐｍの条件（条件２）で滅菌を
行った。滅菌後の支持体をそれぞれ培地Ａ５ｍｌに入れ
て十分攪拌した。３５℃で１８ｈｒ培養した後、培地の
濁度（６００ｎｍ）を測定した結果を表１に示す。

【００３２】

【表１】

【００３３】表１の結果より、滅菌が十分である条件１
では菌の生育が認められず、滅菌が不十分である条件２
では菌の生育が認められた。このことより本発明のイン
ディケーターがホルムアルデヒド用のインディケーター
として信頼性が高いことが分かる。

【００３４】（３）支持体へのホルムアルデヒドガス吸
着量の測定 １ｍ³ ガスボックス内にホルムアルデヒドガス発生器、
循環ファン及びホルムアルデヒドガス濃度計（商品名：
ＮＡＢＡ、株式会社メルシャンクリンテック製）を設置
し、パラホルムアルデヒドを昇華させ、ホルムアルデヒ
ドガス雰囲気にした。ホルムアルデヒドガス濃度が９４
０ｐｐｍになったら、大きさが１０ｍｍ×１０ｍｍの表
２に記載の支持体をそれぞれ蓋を取り除いて開放系にし
たエッペンドルフチューブに入れ、これをガスボックス
内に入れ、５時間、暴露させた。５時間の間ホルムアル
デヒドガス濃度を一定に保つため、ホルムアルデヒドガ
ス発生器の電源のＯＮ／ＯＦＦによりパラホルムアルデ
ヒドの昇華を繰り返した。支持体を暴露後、支持体をガ
スボックスから取り出した。取り出した支持体をピンセ
ットで５．０ｍｌの蒸留水を入れたガラスチューブに入
れ、１分間激しく振とうした。

【００３５】振とうにより、支持体に吸着したホルムア
ルデヒドを抽出し、水中のホルムアルデヒド濃度を化学
定量分析器〔テストワコー（和光純薬）〕により定量し
た。支持体に吸着したホルムアルデヒド量を求めて単位
面積当たりの吸着量を求めた結果を表１に示す。

【００３６】

【表２】 ＊アドバンテック社製

【００３７】尚、ホルムアルデヒドガス発生器によるガ
スボックス内の濃度調整は、設定濃度±５０ｐｐｍ内
（ＮＡＢＡ表示値）になるように調整した。また、ＮＡ
ＢＡはあらかじめキャリブレーションを行ったものを使
用した。表２の結果より、市販の生物学的インディケー
ターに用いられている支持体はいずれもホルムアルデヒ
ドを吸着しやすいことが分かった。

【００３８】実施例２ 細菌のホルムアルデヒドに対する感受性試験 ホルムアルデヒド（和光純薬社製）を表３の濃度で含む
ミューラーヒントン培地〔組成；肉浸出液乾燥末２ｇ／
ｌ、カゼイン水解物１７．５ｇ／ｌ、澱粉１．５ｇ／
ｌ〕を調製した。バチルス・サブチリス(Bacillus subt
ilis) ＡＴＣＣ ６６３３及びスタフィロコッカス・ア
ウレウス（Stoaphylococcus aureus) 209pをそれぞれ上
記の培地３ｍｌに約１０⁶ ＣＦＵ／ｍｌとなるように植
菌した。３５℃にて５日目まで静置培養し、濁度により
生育の有無を判定した。その結果を表３に示した。

【００３９】

【表３】 ＋は菌の生育ありを示し、−は菌の育成なしを示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 支持体に胞子を担持したホルムアルデヒ
   ドガス滅菌用の生物学的インディケーターであって、前
   記支持体が実質的にホルムアルデヒドに対する吸着性を
   有さない材質から成ることを特徴とする生物学的インデ
   ィケーター。
2. 【請求項２】 ホルムアルデヒドガス滅菌に供した後の
   生物学的インディケーターと培地とを接触させ、培地中
   のホルムアルデヒド濃度が５０ｐｐｍ以下となる条件下
   で前記培地を培養し、ついでこの培地の物性を測定する
   ことを特徴とする滅菌確認方法。
3. 【請求項３】 培地中のホルムアルデヒド濃度が２０ｐ
   ｐｍ以下となる条件下で培養を行う請求項２に記載の滅
   菌確認方法。