JP6259052B2 - 生物活性の検出方法 - Google Patents

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Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１０年１１月１日出願の、米国特許仮出願第６１／４０８，９６６号及び同第６１／４０８，９７７号の利益を主張する。
サンプル内の細胞（例えば、病原性微生物又は癌細胞）の検出に関する方法は、多くの場合、その特定の細胞と関連していることが既知である生物活性（例えば、酵素活性又は生化学的経路）の検出を伴う。多くの場合、生物活性は、その生物活性を介して生物学的誘導体に変化する、指示薬システムを使用して検出される。
一部の方法は、特定のタイプの細胞を検出するために、２つの指示薬システムを採用する。例えば、大腸菌を検出するための方法は、ｐＨ指示薬と組み合わせたラクトースを含む、第１の指示薬システムを含み得る。ラクトースの、有機酸への発酵が、大腸菌群（大腸菌及び他の腸内微生物を含む）の１種の存在を示す。それらの方法はまた、殆どの大腸菌内に見出される酵素である、β−グルクロニダーゼ酵素を検出するために使用される、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロン酸などの、第２の指示薬システムも含む。それゆえ、双方の指示薬システムを採用する方法では、ラクトースからの酸性最終生成物の蓄積は、蛍光化合物（４−メチルウンベリフェロン）の蓄積と共に、サンプル中の大腸菌の存在を示し得る。
サンプル中の特定の生物活性の検出は、そのサンプル中の生存細胞を示し得る。細菌の芽胞は、例えば、サンプル中の生存芽胞の存在を検出する方法（例えば、迅速法を含む）で使用することができる、生物活性（例えば、α−グルコピラノシダーゼ又はβ−グルコピラノシダーゼなどの酵素活性）を含む。これらの生物活性又は他の生物活性のうちの１つの破壊を使用して、滅菌プロセスの有効性を検証及び／又は立証することができる。
本開示は、全般的には、サンプル中の生物活性を検出するための方法に関する。本発明の方法は、少なくとも２種の（例えば、「第１」及び「第２」の）指示試薬で生物活性を検出するための手段を提供する。本方法は、反応混合物中の、第２の指示試薬の生物学的誘導体の、迅速で敏感な検出を提供し、この反応混合物には、初期には、その生物学的誘導体の検出を妨害するために十分高い濃度の、第１の指示試薬が含まれる。
一態様では、本開示は、生物活性の検出方法を提供する。本方法は、１つ以上の既定の生物活性の発生源を含み得るサンプルと、第１の吸光度スペクトルを有する第１の指示試薬を含む、第１の指示薬システムと、第２の既定の生物活性によって、第２の発光スペクトルを有する第２の生物学的誘導体に変換される第２の指示試薬を含む、第２の指示薬システムと、水性混合物から第１の指示試薬を受容及び濃縮する基材とを、提供する工程を含み得る。第１の指示試薬は、第１の既定の生物活性によって、第１の生物学的誘導体に変換させることができる。第１の吸光度スペクトルは、第２の発光スペクトル内に存在する波長の少なくとも一部分内に、検出可能な吸光度を含み得る。本方法は、このサンプル、第１の指示試薬、及び第２の指示試薬を含む、第１の水性混合物を形成する工程を更に含み得る。本方法は、第１の水性混合物を基材と流体連通させて、第１の指示試薬の濃度が、その第１の水性混合物中の第１の指示試薬の濃度よりも低い、第２の水性混合物を形成する工程を更に含み得る。本方法は、第２の生物学的誘導体からの蛍光の有無を検出する工程を更に含み得る。
一部の実施形態では、第２の生物学的誘導体からの蛍光の有無を検出する工程は、第２の水性混合物中の蛍光の有無を検出することを含み得る。一部の実施形態では、本方法は、基材を観察して、第１の指示試薬又は第１の生物学的誘導体を検出する工程を更に含み得る。上記のいずれかの実施形態において、第１の水性混合物中の第１の指示試薬の濃度は、通常であれば検出可能な量の第２の生物学的誘導体の検出を、阻止するために十分なものとすることができる。上記のいずれかの実施形態において、本方法は、生体細胞の増殖を促進するための栄養素を提供する工程を更に含み得、第１の水性混合物を形成する工程は、その栄養素を含む混合物を形成することを含む。上記のいずれかの実施形態において、本方法は、滅菌剤に生物活性を晒す工程を更に含み得る。滅菌剤は、蒸気、エチレンオキシド、過酸化水素、ホルムアルデヒド、及びオゾンからなる群から選択することができる。
上記のいずれかの実施形態において、第１の指示試薬は、発色団を含み得、第１の試薬の生物学的誘導体を検出する工程は、色を検出することを含む。上記のいずれかの実施形態において、第１の指示試薬は、発色性指示薬を含み得る。上記のいずれかの実施形態において、第１の指示試薬は、ｐＨ指示薬又は酵素基質を含み得る。一部の実施形態では、第１の指示試薬は、ブロモクレゾールパープルを含み得る。
上記のいずれかの実施形態において、第２の指示試薬は、蛍光発生化合物を含み得る。蛍光発生化合物は、蛍光発生酵素基質を含み得る。
上記のいずれかの実施形態において、第２の生物学的誘導体の有無を検出する工程は、第２の生物学的誘導体の量を測定することを更に含み得る。上記のいずれかの実施形態において、第１の生物学的誘導体の有無を検出する工程は、第１の生物学的誘導体の量を測定することを更に含み得る。
上記のいずれかの実施形態において、本方法は、第１の指示試薬、又は第２の指示試薬の生物学的誘導体を検出する、計器を提供する工程と、その計器を使用して、第１の指示試薬、又は第２の指示試薬の生物学的誘導体を検出する工程とを、更に含み得る。
一部の実施形態では、本方法は、第１の指示試薬又は第２の生物学的誘導体を検出する、計器を提供する工程と、その計器を使用して、第１の指示試薬又は第２の生物学的誘導体を検出する工程とを、更に含み得る。一部の実施形態では、本方法は、第１の指示試薬及び第２の生物学的誘導体を検出する、計器を提供する工程と、その計器を使用して、第１の指示試薬及び第２の生物学的誘導体を検出する工程とを、更に含み得る。
別の態様では、本開示は、生物活性の検出方法を提供する。本方法は、ハウジング、容器、第２の既定の生物活性の発生源、及び基材を提供する工程を含み得る。ハウジングは、第１チャンバ及び第２チャンバを含み得る。容器は、第１の水性液体を収容することができる。容器は、第１チャンバ内に配置することができる。容器の少なくとも一部分は、壊れやすくすることができる。第１の水性液体は、第１の吸光度スペクトルを有する第１の指示試薬を含む、第１の指示薬システムと、既定の生物活性によって、第２の発光スペクトルを有する第２の生物学的誘導体に変換される第２の指示試薬を含む、第２の指示薬システムとを含み得、第１の吸光度スペクトルは、第２の発光スペクトル内に存在する波長の少なくとも一部分内に、検出可能な吸光度を含む。第１の指示試薬は、第１の既定の生物活性によって、第１の生物学的誘導体に変換させることができる。既定の生物活性の発生源は、第２チャンバ内に配置することができる。基材は、ハウジング内に配置することができ、第１の水性液体から第１の指示試薬を受容及び濃縮することができる。本方法は、第１の水性混合物を基材と流体連通させて、第１の指示試薬の濃度が、その第１の水性混合物中の第１の指示試薬の濃度よりも低い、第２の水性混合物を形成する工程を更に含み得る。本方法は、第２の生物学的誘導体からの蛍光の有無を検出する工程を更に含み得る。一部の実施形態では、第２の生物学的誘導体からの蛍光の有無を検出する工程は、第２の水性混合物中の蛍光の有無を検出することを含み得る。一部の実施形態では、第１の水性混合物を基材と流体連通させて、第２の水性液体を形成する工程は、壊れやすい容器の少なくとも一部分を断裂させることを含み得る。一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーターは、ハウジング内に配置される破砕装置を更に含み得、壊れやすい容器を断裂させることは、容器及び破砕装置を互いに対して押し付けることを含む。一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーターのハウジングは、第１部分及び第２部分を含み得る。第２部分は、第１部分に結合するように適合させることができ、この第２部分は、第１部分に結合される場合、第１部分に対して、第１の位置と第２の位置との間で移動可能である。本方法は、ハウジングの第２部分を、第１の位置から第２の位置に移動させる工程を更に含み得る。
別の態様では、本開示は、既定の生物活性を検出するためのシステムを提供する。本システムは、第１の吸光度スペクトルを有する第１の指示試薬を含む、第１の指示薬システムと、既定の生物活性によって、第２の発光スペクトルを有する第２の生物学的誘導体に変換される第２の指示試薬を含む、第２の指示薬システムと、液体媒質を保持するように構成される槽と、水性混合物から第１の指示試薬を受容及び濃縮する基材と、槽を受容して、第１の指示試薬、又は第２の指示試薬の生物学的誘導体を検出するように構成される計器とを含み得る。第１の指示試薬は、第１の既定の生物活性によって、第１の生物学的誘導体に変換させることができる。第１の吸光度スペクトルは、第２の発光スペクトル内に存在する波長の少なくとも一部分内に、検出可能な吸光度を含む。一部の実施形態では、計器は、第１の生物学的誘導体を検出するように構成することができる。一部の実施形態では、本システムは、プロセッサを更に含み得る。本システムの上記のいずれかの実施形態において、計器は、液体媒質の温度を調節するように、更に構成することができる。本システムの上記のいずれかの実施形態において、計器は、第１の指示試薬及び第２の生物学的誘導体の双方を検出するように構成することができる。
用語「好ましい」及び「好ましくは」とは、特定の状況下で、特定の利益をもたらすことができる、本発明の実施形態を指す。しかしながら、他の実施形態もまた、同じ状況又は他の状況下で、好ましい場合がある。更には、１つ以上の好ましい実施形態の詳細説明は、他の実施形態が有用ではないことを意味するものではなく、本発明の範囲から他の実施形態を排除することを意図するものではない。
用語「含む」及びその変化形は、これらの用語が、本説明及び特許請求の範囲に現れる場合、限定する意味を有するものではない。
本明細書で使用するとき、「１つの」、「その」、「少なくとも１つの」、及び「１つ以上の」は、互換的に使用される。それゆえ、例えば、（１つの）基材とは、「１つ以上の」基材を意味するように、解釈することができる。
用語「及び／又は」とは、列記される要素のうちの１つ若しくは全て、又は列記される要素のうちの任意の２つ以上の組み合わせを意味する。
「生物活性」とは、本明細書で使用するとき、生体細胞に関連する、いずれかの特定の触媒プロセス、又はプロセス群を指す。生物活性の非限定的な例としては、分解酵素活性（例えば、炭水化物発酵経路）、同化酵素活性（例えば、核酸、アミノ酸、又はタンパク質に関する合成経路）、共役反応（例えば、代謝経路）、生体分子媒介レドックス反応（例えば、電子伝達系）、及び生物発光反応が挙げられる。「既定の」生物活性とは、本方法が、特定の生物学的プロセス（例えば、酵素反応）、又は生物学的プロセス群（例えば、生化学的経路）の検出に向けて進められることを意味する。特定の既定の生物活性を、特定のタイプの細胞（例えば、癌細胞又は微生物）、又は病理学的プロセスに関連付けることができる点が、当業者には理解されるであろう。
「生物学的誘導体」とは、本明細書で使用するとき、生物活性の生成物を指す。この生成物としては、例えば、酵素反応の生成物、及び生物学的電子伝達系の生成物が挙げられる。
「生体分子」とは、本明細書で使用するとき、生存生物内で天然に存在する、いずれかの化学化合物、並びにそのような天然に存在する化合物の、誘導体又は断片とすることができる。生体分子は、窒素、酸素、リン、及びイオウと共に、主として炭素及び水素からなる。他の元素が組み込まれる場合もあるが、極めて稀である。生体分子としては、タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、多糖類、脂質、脂肪酸、ステロイド、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、ビタミン、補助因子、サイトカイン、及び核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオシド、ヌクレオチド、プリン、及びピリミジンが挙げられる）、例えば抗生物質及び毒素を含めた、生存生物によって作り出される代謝産物が挙げられるが、これらに限定されない。生体分子としてはまた、化学物質で修飾（例えば、過ヨウ素酸ナトリウムで酸化）されているタンパク質又は抗体などの、天然に存在する化合物の誘導体を挙げることもできる。生体分子としてはまた、架橋された天然に存在する生体分子、すなわち天然に存在する生体分子の、化学物質で架橋された生成物を挙げることもできる。それゆえ、「生体分子」としては、非修飾分子及び修飾分子（例えば、グリコシル化されたタンパク質、酸化された抗体）の双方、並びにそれらの断片（例えば、タンパク質断片）が挙げられるが、これらに限定されない。生体分子の断片としては、例えば、化学処理、酵素処理、又は照射処理による、加水分解から生じるものを挙げることができる。
また本明細書では、終端点による数値範囲の詳細説明は、その範囲内に含まれる全ての数を包含する（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを包含する）。
上記の本発明の課題を解決するための手段は、開示される実施形態のそれぞれ、又は本発明のあらゆる実装を説明することを意図するものではない。以下の説明により、例示的実施形態を、より具体的に例示する。本出願の全体にわたる幾つかの箇所で、実施例のリストを通じて指針が提供され、それらの実施例は、様々な組み合わせで使用することができる。いずれの場合でも、記載されるリストは、代表的な群としての役割のみを果たすものであり、排他的なリストとして解釈するべきではない。
基材、及び指示試薬を含む液体媒質を保持する槽の上面斜視図。 液体媒質中に図１Ａの基材を液浸させた直後の、図１Ａの槽の上面斜視図。 一定の期間の後の、図２Ａの槽の上面斜視図。 ブロモクレゾールパープルの水溶液の、紫外可視吸光度スペクトル及び４−メチルウンベリフェロンの溶液の蛍光発光スペクトルの図面。 本開示による、生物活性の検出方法の一実施形態のブロック図。 生物学的滅菌インジケーターが、第１部分及び第２部分を含むハウジングを含む、本開示の一実施形態による、生物学的滅菌インジケーターの正面斜視図。 図４の生物学的滅菌インジケーターの背面斜視図。 図４及び図５の生物学的滅菌インジケーターの正面分解図。 生物学的滅菌インジケーターが、第１の状態で示され、生物学的滅菌インジケーターのハウジングの第２部分が、第１の位置で示される、図４の線４−４に沿った、図４〜６の生物学的滅菌インジケーターの側面断面図。 図６の線５−５に沿った、図４〜６の生物学的滅菌インジケーターの上面断面図。 生物学的滅菌インジケーターが、第２の状態で示され、生物学的滅菌インジケーターのハウジングの第２部分が、第２の位置で示される、図４〜８の生物学的滅菌インジケーターの側面断面図。 明瞭性のために諸部分が取り除かれた、図４〜９の生物学的滅菌インジケーターの上面断面図。
本開示は、生物活性を検出するための迅速法に関する。本方法は、２種以上の指示試薬の使用を含む。本方法は、第１の指示試薬及び第２の指示試薬を含む、液体混合物を提供する工程を含み、第１の指示試薬は、通常であれば検出可能な量の、第２の指示試薬の生物学的誘導体の検出（例えば、光学検出）を、妨害するために十分な濃度で、混合物中に存在する。本発明の方法は、第２の指示試薬の生物学的誘導体の検出を促進するために、液体混合物のバルクから、妨害量の第１の指示試薬の少なくとも一部分を隔離することによって、生物活性の迅速で敏感な検出を提供する。本方法は、第１の指示試薬又はその生物学的誘導体を、より容易に観察するための手段を更に提供する。本発明の方法は、生物活性の自動検出に関するシステム内で、使用することができる。
本発明のシステム及び／又は本開示の方法を使用して、生物活性（例えば、酵素、細胞、又は微生物に関連する活性）を検出することができる。一部の実施形態では、本発明のシステム及び／又は方法を使用して、例えば、プロセス（例えば、消毒プロセス、食品又は飲料の調製プロセス、滅菌プロセス）への曝露を生き残った、特定のタイプの微生物（例えば、栄養細胞又は芽胞）に関連する、生物活性を検出することができる。
本発明の方法は、サンプル中の生物活性の検出に関する。このサンプルは、本明細書で定義されるような生物活性を含む、いずれかのサンプルとすることができる。好適なサンプルの非限定的な例としては、細胞（例えば、哺乳類細胞、昆虫細胞、酵母細胞、糸状菌、細菌細胞）の懸濁液若しくは培養液、環境サンプル（例えば、表面のスワブ）、食品（例えば、原材料、プロセス中のサンプル、及び最終製品サンプル）、飲料、臨床サンプル（例えば、血液、尿、痰、組織、粘膜、糞便、創傷滲出液、膿）、及び水（例えば、地表水、飲料水、プロセス水）が挙げられる。
微生物（例えば、細菌、真菌、ウイルス）は、生物活性の発生源であり、生理液、例えば、血液、唾液、眼球レンズ液、滑液、脳脊髄液、膿、汗、滲出液、尿、粘液、分泌乳などのような、いずれかの発生源に由来し得る、試験サンプル中で分析することができる。更には、試験サンプルは、身体部位、例えば、創傷、皮膚、鼻孔、頭皮、爪などに由来し得る。
具体的な対象のサンプルとしては、鼻サンプル（例えば、前鼻孔、鼻咽頭腔、鼻腔、前部鼻前庭などからの）、並びに外耳、中耳、口腔、直腸、膣、又は他の同様の組織からのサンプルなどの、粘液含有サンプルが挙げられる。特定の粘膜組織の例としては、頬粘膜、歯肉粘膜、鼻粘膜、眼粘膜、気管粘膜、気管支粘膜、胃腸粘膜、直腸粘膜、尿道粘膜、尿管粘膜、膣粘膜、子宮頸部粘膜、及び子宮粘膜が挙げられる。
生理液以外に、他の試験サンプルとしては、液体媒質中に溶解される固体、並びに他の液体を挙げることができる。対象のサンプルとしては、プロセス流、水、土壌、草木又は他の植物、空気、表面（例えば、汚染表面）などを挙げることができる。サンプルとしてはまた、培養細胞を挙げることもできる。サンプルとしてはまた、細胞、芽胞、又は酵素を含むデバイス（例えば、生物学的インジケーターデバイス）上、若しくはデバイス内のサンプルを挙げることもできる。
固体サンプルは、崩壊させることができ（例えば、混合、音波破砕、均質化によって）、液体（例えば、水、緩衝剤、ブロス）中に懸濁させることができる。一部の実施形態では、サンプル材料を含むサンプル採取デバイス（例えば、スワブ、スポンジ）を、本方法で使用することができる。あるいは、サンプル材料を本方法で使用する前に、サンプル採取デバイスから、そのサンプル材料を溶離させる（例えば、すすぐ、擦り落とす、搾り出す）ことができる。一部の実施形態では、液体サンプル又は固体サンプルは、液体（例えば、水、緩衝剤、ブロス）中に希釈することができる。
好適なサンプルはまた、滅菌剤に晒された、液体サンプル及び／又は固体サンプルである。これらのサンプルの非限定的な例としては、芽胞懸濁液、芽胞ストリップ、及び芽胞若しくは栄養型微生物細胞の懸濁液が塗布された様々な材料の試験片が挙げられる。
好適なサンプルとしてはまた、細胞を含むか、又は従前に細胞を含んでいた、細胞懸濁培地（例えば、培養ブロス、半固体細胞培養培地、及び組織培養培地、濾液）も挙げられる。好適なサンプルとしてはまた、細胞溶解物も挙げられる。細胞溶解物は、化学的手段（例えば、洗浄剤、酵素）、機械的手段（音波振盪、均質化、フレンチプレス）によって、又は当該技術分野において既知の他の細胞溶解手段によって、作り出すことができる。
図１Ａ〜１Ｃは、本開示による、液体媒質から、基材上、又は基材内に、指示試薬（又はその生物学的誘導体）を受容及び濃縮するプロセスを示す。図１Ａは、基材３０、及び有色指示試薬を含む液体混合物２０を収容する槽１０の上面斜視図を示す。図１Ｂは、液体混合物２０中に、基材３０を液浸させた直後の、図１Ａの槽１０の上面斜視図を示す。図１Ｃは、基材３０が液体混合物２０から有色指示試薬を受容及び濃縮することを可能にするために十分な期間の後の、図１Ｂの槽１０の上面斜視図を示す。図１Ｃでは、液体混合物の色は、より強度が軽減されている一方で、基材３０は、有色指示試薬を受容及び保持していることにより、その初期の無色状態から、有色状態に変化している点を認めることができる。
一部の実施形態では、基材は、指示試薬又はその生物学的誘導体を、受動的に受容及び濃縮することができる（例えば、試薬又は誘導体の、液体媒質を通じた単純な拡散によって）。あるいは、又は更には（図示せず）、基材は、指示試薬及び／又は生物学的誘導体を能動的に受容及び濃縮することができる（例えば、混合若しくは混転を介して、液体に対して基材を移動させることができ、かつ／又は、基材の主表面に対する、概して横方向、接線方向、若しくは垂直方向の流体の流れを介して、基材に対して液体媒質を移動させることができる）。
指示試薬
先行技術は、既定の生物活性を検出するための方法で使用されている、既知の、市販の、多様な起源の色覚性及び蛍光発生酵素基質を数多く含み、それらの酵素基質は、本開示による第１の指示試薬又は第２の指示試薬としての使用に関して好適である。これらの中には、様々な蛍光発生４−メチルウンベリフェリル誘導体（４−メチルウンベリフェロンに加水分解性）；例えば、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、英国特許第１，５４７，７４７号、及び欧州特許第０，０００，０６３号で開示されるような、７−アミド−４−メチル−クマリンの誘導体；ジアセチルフルオレセイン誘導体；及びフルオレスカミンがある。
本開示による第１の指示試薬は、第１の吸収スペクトルを有する試薬を含み、それゆえ、その指示試薬は、電磁スペクトルの、紫外線波長及び／又は可視波長での光を吸収する。
一部の実施形態では、第１の指示試薬は、指示薬染料（例えば、ｐＨ指示薬染料、レドックス染料）とすることができる。いずれかの所定の生物活性を検出するために使用される、特定の指示薬染料は、例えば、検出される生物活性との適合性（例えば、好ましくは非阻害性）、溶解度、検出システム（例えば、視覚的及び／又は自動的）を含めた、当該技術分野において既知の評価基準に従って選択される。
本方法のいずれかの実施形態において、指示薬染料は、生物活性を検出するために好適な、ｐＨ指示薬とすることができる。指示薬染料は、例えば、ｐＨの範囲、生物活性との適合性、及び溶解度などの、当該技術分野において既知の評価基準に従って選択することができる。一部の実施形態では、塩形態のｐＨ指示薬を使用して、例えば、水性混合物中での、そのｐＨ指示薬の溶解度を増大させることができる。好適なｐＨ指示薬染料の非限定的な例としては、例えば、チモールブルー、トロペオリンＯＯ、メチルイエロー、メチルオレンジ、ブロモフェノールブルー、ブロモクレゾールグリーン、メチルレッド、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッド、フェノールフタレイン、チモールフタレイン、アリザリンイエロー、トロペオリンＯ、ニトラミン、トリニトロ安息香酸、チモールブルー、ブロモフェノールブルー、テトラブロモフェノールブルー、ブロモクレゾールグリーン、ブロモクレゾールパープル、メチルレッド、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、コンゴレッド、及びクレゾールレッドが挙げられる。
本方法のいずれかの実施形態において、指示薬染料は、生物活性を検出するために好適な、酸化還元指示薬（レドックス指示薬とも呼ばれる）とすることができる。酸化還元指示薬染料は、ｐＨ依存性、又はｐＨ非依存性とすることができる。酸化還元指示薬染料の非限定的な例としては、２，２’−ビピリジン（Ｒｕ錯体）、ニトロフェナントロリン（Ｆｅ錯体）、Ｎ−フェニルアントラニル酸、１，１０−フェナントロリン（Ｆｅ錯体）、Ｎ−エトキシクリソイジン、２，２’−ビピリジン（Ｆｅ錯体）、５，６−ジメチルフェナントロリン（Ｆｅ錯体）、ｏ−ジアニシジン、ジフェニルアミンスルホン酸ナトリウム、ジフェニルベンジジン、ジフェニルアミン、ビオロゲン、２，６−ジブロモフェノールインドフェノールナトリウム、２，６−ジクロロフェノールインドフェノールナトリウム、ｏ−クレゾールインドフェノールナトリウム、チオニン（ラウスバイオレットの異名）、メチレンブルー、インジゴテトラスルホン酸、インジゴトリスルホン酸、インジゴジスルホン酸、インジゴモノスルホン酸、フェノサフラニン、サフラニンＴ、及びニュートラルレッドが挙げられる。
一部の実施形態では、第１の指示試薬は、実施例４に示すように、スルホンフタレインｐＨ指示薬（例えば、ブロモクレゾールパープル）とすることができる。スルホンフタレインｐＨ指示薬（例えば、ブロモクレゾールパープル）は、水性混合物中に、１リットル当り約０．０３ｇの濃度で存在し得る。スルホンフタレインｐＨ指示薬は、基材（例えば、荷電ナイロン基材、例えば、ＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ Ｌａｂｓｔｏｒｅ（Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ，ＭＮ）より入手可能な、ＭＡＧＮＡＰＲＯＢＥ、０．４５マイクロメートル荷電ナイロン膜、品番ＮＰ０ＨＹ０００１０など）によって、受容及び濃縮することができる。この基材は、概して平面的なストリップ（例えば、約３ｍｍ×約１０ｍｍであるストリップ）として構成することができる。
本開示による第２の指示試薬は、第２の生物学的誘導体に変換させることができる。第２の生物学的誘導体は、第２の吸収スペクトルを有する試薬を含む。更には、第２の生物学的誘導体は、特徴的な第２の発光スペクトル（例えば、蛍光発光スペクトル）を有する。一部の実施形態では、第２の生物学的誘導体は、電磁エネルギースペクトルの紫外部での波長を含む、特徴的な第２の吸収スペクトルを有する。第２の生物学的誘導体の第２の発光スペクトルは、電磁エネルギースペクトルの可視部での波長を含み得る。
第２の指示試薬としての使用に関して好適な化合物は、蛍光発生化合物（例えば、蛍光発生酵素基質）を含む。蛍光発生酵素基質としては、４−メチルウンベリフェリル誘導体、７−アミド−４−メチルクマリン誘導体、及びジアセチルフルオレセイン誘導体が挙げられる。
好適な４−メチルウンベリフェリル誘導体としては、例えば、４−メチルウンベリフェリル−２−アセタミド−４，６−Ｏ−ベンジリデン−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノシド；４−メチルウンベリフェリルアセテート；４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニド；４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニド；４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド；２’−（４−メチルウンベリフェリル）−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸；４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−アラビノフラノシド；４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−アラビノシド；４−メチルウンベリフェリルブチラート；４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−セロビオシド；メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−Ｎ，Ｎ’ジアセチルキトビオシド；４−メチルウンベリフェリルエライジンサン塩；４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−フコシド；４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−フコシド；４−メチルウンベリフェリルβ−Ｌ−フコシド；４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−ガラクトシド；４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−ガラクトシド；４−メチルウンベリフェリルａ−Ｄ−グルコシド；４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルコシド；４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルクロニド；４−メチルウンベリフェリルｐ−グアニジノ安息香酸塩；４−メチルウンベリフェリルヘプタノエート；４−メチルウンベリフェリルα−Ｄ−マンノピラノシド；４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−マンノピラノシド；４−メチルウンベリフェリルオレエート；４−メチルウンベリフェリルパルミテート；４−メチルウンベリフェリルホスフェート；４−メチルウンベリフェリルプロピオネート；４−メチルウンベリフェリルステアレート；４−メチルウンベリフェリルサルフェート；４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−トリアセチルキトトリオース；４−メチルウンベリフェリル２，３，５−トリ−ｏ−ベンゾイル−α−Ｌ−アラビノフラノシド；４−メチルウンベリフェリル−ｐ−トリメチルアンモニウムシンナメートクロリド；及び４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−キシロシドが挙げられる。
好適な７−アミド−４−メチルクマリン誘導体としては、例えば、Ｌ−アラニン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−プロリン７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−チロシン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−ロイシン−７−アミド−４−メチルクマリン；Ｌ−フェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリン；及び７−グルタミルフェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリンが挙げられる。
好適な７−アミド−４−メチルクマリンのペプチド誘導体としては、例えば、Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｎ−ＣＢＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ ７−アミド−４−メチルクマリン；Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ ７−アミド−４−メチルクマリン；及びＮ−グルタリル−Ｇｌｙ−Ａｒｇ ７−アミド−４−メチルクマリンが挙げられる。
好適なジアセチルフルオレセイン誘導体としては、例えば、フルオレセインジアセテート、フルオレセインジ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、及びフルオレセインジラウレートが挙げられる。
検出される生物活性が、例えばゲオバチルス・ステアロサーモフィルスからの、α−Ｄ−グルコシダーゼ、キモトリプシン、又は脂肪酸エステラーゼである場合には、好ましい蛍光発生酵素基質は、それぞれ、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコシド、７−グルタミルフェニルアラニン−７−アミド４メチルクマリン、又は４−メチルウンベリフェリルヘプタノエートである。検出される生物活性が、例えばバチルス・サブティリス由来の、α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼである場合には、好ましい蛍光発生酵素基質は、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｌ−アラビノフラノシドである。検出される生物活性が、例えばバチルス・サブティリス由来の、β−Ｄ−グルコシダーゼである場合には、好ましい蛍光発生酵素基質は、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコシドである。
酵素を含む生物活性を検出する際に、本発明の方法を実施するためには、オペレーターは、検出される酵素活性と、酵素と反応することにより、蛍光、色などのいずれかによって検出することができる生成物を作り出す、酵素基質とに関して、知識豊富であるべきである（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍ．Ｒｏｔｈの、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ」（Ｖｏｌ．７，Ｄ．Ｇｌｏｃｋ編，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９６９を参照）。利用される適切な酵素基質は、検出される生物活性に応じて決定される。
本開示の方法は、第１の吸収スペクトルを有する第１の指示試薬と、生物活性によって、第２の発光スペクトルを有する第２の生物学的誘導体に変換される、第２の指示試薬とを含み、第１の吸収スペクトルは、第２の発光スペクトルと、少なくとも部分的に重なり合う。それゆえ、第１の指示試薬及び第２の生物学的誘導体の双方が、液体混合物中に存在する場合、第１の指示試薬は、第２の指示試薬によって放出される光の少なくとも一部分を吸収することにより、第２の生物学的誘導体を検出する能力を減少させる可能性がある。
本開示による、第１の指示試薬と第２の生物学的誘導体との関係性を、図面によって示すことができる。図２は、例示的な第１の指示試薬である、ブロモクレゾールパープル（以降では、「ＢＣＰ」と呼ばれる）の吸光度スペクトルと、例示的な第２の指示試薬である、４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルコシドの可能な生物学的誘導体、４−メチルウンベリフェロン（以降では、「４ＭＵ」と呼ばれる）の蛍光発光スペクトルとを示す。これらのスペクトルは、実施例１及び実施例２で説明されるように取得された。
ＢＣＰの吸光度スペクトルを示す線「Ａ」は、約６００ｎｍの可視範囲での吸光度極大を示し、４２５〜５５０ｎｍの波長での、ＢＣＰによる比較的小さい吸光度を有する。このデータは、約６００ｎｍの可視波長での吸光度ピーク、及び＜３３０ｎｍの紫外線波長での吸光度ピークを示す。４ＭＵの蛍光発光スペクトルを示す線「Ｂ」は、約４５０ｎｍで、発光極大を示し、３７５〜４２５ｎｍ及び４７５〜５２５ｎｍの範囲で、比較的小さい発光を有する。図２では、ＢＣＰの吸光度スペクトルが、４ＭＵの蛍光発光ピークの全体（４５０ｎｍを中心とする）と実質的に重なり合うことを認めることができる。
第１の指示試薬を含有する溶液による、いずれの特定波長の光の吸光量も、その溶液中の第１の指示試薬の濃度と、選択される波長での、その指示試薬のモル吸光係数とによって影響を受けることが、関連分野の当業者には理解されるであろう。第２の指示試薬の生物学的誘導体を含有する溶液による、いずれの特定波長の光の放出量も、その溶液中の第２の生物学的誘導体の濃度と、その生物学的誘導体の蛍光量子収率とによって影響を受けることもまた、当業者には理解されるであろう。それゆえ、液体混合物中の第１の指示試薬の濃度を、適切な基材と併せて選択して、ｉ）その基材が、液体混合物から、第１の指示薬基質を十分に除去することにより、第２の生物学的誘導体の、より敏感な検出を可能にし、ｉｉ）第１の指示試薬（又は、その生物学的誘導体）が、その基材材料上で、より容易に検出されることを可能にすることができる。
ブロモクレゾールパープルと４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコシドとの組み合わせは、それぞれ、本開示による、好適な第１の指示試薬及び第２の指示試薬の一実施例を表す。この組み合わせを使用して、例えば、炭水化物の酸最終生成物への発酵などの、第１の生物活性、及び−α−Ｄ−グルコシダーゼ酵素活性などの、第２の生物活性を検出することができる。これらの活性は、例えば、滅菌プロセスに生物学的滅菌インジケーターを晒した後の、生存芽胞の有無を示し得る。ブロモクレゾールパープルは、例えば、水性混合物中、約０．０３ｇ／Ｌの濃度で使用することができる。４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコシドは、例えば、水性混合物中、約０．０５〜約０．５ｇ／Ｌ（例えば、約０．０５ｇ／Ｌ、約０．０６ｇ／Ｌ、約０．０７ｇ／Ｌ、約０．０８ｇ／Ｌ、約０．０９ｇ／Ｌ、約０．１ｇ／Ｌ、約０．１５ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ、約０．２５ｇ／Ｌ、約０．３ｇ／Ｌ、約０．３５ｇ／Ｌ、約０．４ｇ／Ｌ、約０．４５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ）の濃度で使用することができる。
それゆえ、本開示によれば、第１の指示試薬は、通常であれば検出可能な量の、第２の指示試薬の生物学的誘導体の検出を、妨害する恐れがある。いずれの提案される第１の指示試薬と第２の指示試薬との間のスペクトル干渉も、当業者が、以下の簡単な実験を行なうことによって、実証することができる。
最初に、オペレーターは、提案される第２の指示試薬の、予期される生物学的誘導体の、比較的低濃度ではあるが、蛍光検出可能な水溶液を作製する。例えば、第２の指示試薬が、４−メチルウンベリフェリル化合物である場合には、予期される生物学的誘導体は４ＭＵである。この溶液は、例えば、１ミリリットル当り、約０．０５〜０．２マイクログラムの４ＭＵを含有し得る。次に、オペレーターは、有効量の、提案される第１の指示試薬を添加する。例えば、ＢＣＰが、提案される第１の指示試薬である場合には、ＢＣＰは、発酵性微生物の検出のための、微生物学的増殖培地中で使用される濃度（例えば、１ミリリットル当り０．０４ミリグラム）で、添加することができる。ＢＣＰを有する４ＭＵ溶液の蛍光と、ＢＣＰを有さない４ＭＵ溶液の蛍光とを比較することによって、第１の指示試薬（この実施例では、ＢＣＰ）が、第２の指示試薬の生物学的誘導体（この場合は４ＭＵ）の検出を妨害し得るか否かを判定することができる。次いで、オペレーターは、低減された量のＢＣＰを４ＭＵ溶液に添加することによって、比較的低い濃度の４ＭＵの検出が改善されるか否かを試験することができる。このタイプの実験は、第１の指示試薬と第２の指示試薬との任意の組み合わせを使用して、容易に行なうことができる。この手順の一実施例が、実施例３に示される。
基材
本開示による好適な基材は、指示試薬を受容及び濃縮するように構成される。指示試薬又はその生物学的誘導体を濃縮する、基材の能力は、当該技術分野において既知であり、かつ本明細書で論じられる、様々な力のうちの１つ以上によって、影響を受ける場合がある。それゆえ、当業者は、例えば、プラスに荷電することが既知である基材を選択して、マイナスに荷電することが既知である指示試薬（又はその生物学的誘導体）を濃縮することができる。反対に、当業者は、マイナスに荷電することが既知である基材を選択して、プラスに荷電することが既知である指示試薬（又はその生物学的誘導体）を濃縮することができる。当業者は、疎水性の特性を有することが既知である基材を選択して、疎水性基材によって保持される疎水性部分を含むことが既知である指示試薬（又はその生物学的誘導体）を濃縮することができる。更には、当業者は、候補の基材材料を、一定の期間、指示試薬又はその生物学的誘導体を含む液体と接触させ、その基材を分析して、検出可能量の指示試薬又はその誘導体が、基材上、又は基材内に蓄積するか否かを判定することによって、好適な基材材料を容易に選択することができる。
基材材料は、指示試薬又はその生物学的誘導体の、既知の特性に従って選択することができる点が、当業者には明らかであろう。例えば、プラスに荷電する基材は、指示試薬の生物学的誘導体がマイナスに荷電する分子である場合の方法で使用するために、選択することができる。更には、マイナスに荷電する基材は、指示試薬の生物学的誘導体がプラスに荷電する分子である場合の方法で使用するために、選択することができる。
あるいは、本発明の方法での、所定の第１の指示試薬と共に使用するための、いずれかの所定の基材材料の適合性は、以下の実験手法を使用して容易に判定することができる。好適な槽（例えば、試験管）内で、既定の生物活性の発生源（例えば、炭水化物を酸性最終生成物に発酵させることが可能な微生物細胞）を、第１の指示試薬（例えば、ｐＨ指示薬）と共に、生物活性を促進するように選択される液体媒質（例えば、発酵性炭水化物を含むブロス培地）に添加することができる。既定の生物活性を促進する条件下で、この液体媒質を、候補の基材材料と接触させることができ、媒質から基材を取り出して、過剰な液体を、任意選択的に、すすぎ及び／又は吸い取ることにより除去し、その基材材料が、液体媒質との接触の間に、第１の指示試薬及び／又はその生物学的誘導体を濃縮したか否かを判定するために、目視観察又は計器観察する（例えば、分光反射率計又は蛍光計で）ことができる。図示の実施形態では、好適な基材／指示薬の組み合わせは、第１の指示試薬又はその生物学的誘導体のいずれかが、接触期間の間に、その基材材料上、若しくは基材材料中に（液体媒質から）濃縮された証拠を示す。基材材料を有さない対照反応を実施して、混合物中の生物活性の存在を確認することができる。
基材は、概して平面的なシート形状（例えば、図１Ａに示すような、膜のストリップ）に製作することができる。基材のサイズ及び／又は有効表面積もまた、指示試薬（又はその生物学的誘導体）を濃縮する、基材の能力に影響を及ぼし得る。基材に関する好ましい材料としては、多孔質材料（例えば、織布材料、不織布材料、多孔性膜、微多孔性膜、濾紙）が挙げられる。一部の実施形態では、特に好ましい基材材料としては、例えば、荷電ナイロン膜（例えば、ＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ Ｌａｂｓｔｏｒｅ（Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ，ＭＮ）より入手可能な、ＭＡＧＮＡＰＲＯＢＥ、０．４５マイクロメートル荷電ナイロン膜、品番ＮＰ０ＨＹ０００１０）などの、荷電膜が挙げられる。本開示で使用される基材は、様々な材料から製作することができる。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５６２，２９７号は、ｐＨ指示薬の固定化のための膜を説明している。好適な基材材料の非限定的な例としては、例えば、天然材料（例えば、セルロース）、合成材料（例えば、ナイロン）、並びにそれらの組み合わせ及び／又は誘導体が挙げられる。
生物活性の検出方法：
図３は、本開示による、複数個の生物活性のうちの１つを検出するための方法の、一実施形態のブロック図を示す。
本方法は、複数個の既定の生物活性のうちの１つを含み得るサンプルと、第１の指示試薬及び第２の指示試薬と、水性媒質から、第１の指示試薬、及び任意選択的にその生物学的誘導体を、受容並びに濃縮する基材とを提供する工程４０を含む。
一部の実施形態では、本方法は、消毒剤、抗生物質、又は滅菌剤に、生物活性を晒す、任意選択工程４５を含み得る。この任意選択工程は、滅菌プロセスの有効性を判定するために、又は選択的集積培養プロセスの後の、既定の生物活性（又は微生物）を検出するために、含めることができる。滅菌剤に生物活性を晒す工程は、滅菌プロセスに生物活性を晒すことを含み得る。滅菌プロセスは、サンプルを、例えば、蒸気、乾性温熱、エチレンオキシド、ホルムアルデヒド、過酸化物、過酸化水素、過酢酸、オゾン、又はこれらの混合物（例えば、オゾンと過酸化水素との混合物）などの、滅菌剤に晒すことを含む。
本方法は、サンプルと第１の指示試薬及び第２の指示試薬とを含む、第１の水性混合物を形成する工程５０を含む。この第１の水性混合物は、水性媒質中で形成される。本方法での生物活性の発生源は、本明細書で説明されるような、１つ以上の生物活性を含むか、又は含む可能性がある、いずれかのサンプルとすることができる。「水性媒質」とは、本明細書で使用するとき、第１の指示試薬及び第２の指示試薬が、その中に溶解若しくは懸濁しているか、又は溶解若しくは懸濁することができる、水性液体を指す。好ましくは、この媒質は、検出される既定の生物活性の検出を、実質的に妨害しない。一部の実施形態では、水性媒質は、その媒質のｐＨを調整するための構成成分（例えば、緩衝剤）を含み得る。水性媒質は、１つ以上の生物活性の検出を促進するための、当該技術分野において既知の試薬（例えば、洗浄剤、補助因子、細胞溶解剤）を更に含み得る。
一部の実施形態では、サンプルは水を含み、それゆえ、そのサンプル自体を、水性媒質と見なすことができる。いずれかの実施形態において、サンプルは、そのサンプルを第１の指示試薬及び第２の指示試薬と混合する前に、任意選択的に第２の液体（例えば、水性媒質、希釈剤、緩衝剤、消毒剤を中和する溶液）と混合することができる。
一部の実施形態では、水性媒質は、その媒質をサンプルと混合する前に、第１の指示試薬及び／又は第２の指示試薬と組み合わせることができる。一部の実施形態では、第１の指示試薬及び第２の指示試薬、並びにサンプルを、水性媒質に連続的に添加して、第１の水性混合物を形成することができる。一部の実施形態では、第１の指示試薬及び第２の指示試薬を、水性媒質及びサンプルと、同時に組み合わせて、第１の水性混合物を形成することができる。いずれかの実施形態において、第１の指示試薬及び第２の指示試薬のいずれか若しくは双方は、その試薬が水性媒質及び／又はサンプルと組み合わされて、第１の水性混合物を形成する前に、最初は、乾燥試薬、液体、ゲル、又はフィルムの形態とすることができる。
第１の指示試薬は、本明細書で説明される、いずれかの好適な試薬とすることができる。第１の指示試薬は、既定の生物活性を検出するように選択されるため、第１の指示試薬及びその生物学的誘導体の化学的性質は既知であり、それゆえ、好適な基材材料を、本明細書で説明されるように特定することができる。第２の指示試薬は、本明細書で説明される、いずれかの好適な試薬とすることができる。
本方法のいずれかの実施形態において、第１の水性混合物を形成する工程は、栄養素を含む第１の水性混合物を形成することを含み得る。この栄養素は、標的の細胞又は微生物の増殖を促進するために提供することができ、例えば、栄養素の混合物として提供することができる。微生物の増殖を促進するための栄養素及び栄養培地は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）による出版の、Ｒｏｎａｌｄ Ａｔｌａｓによる「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ」に見出すことができる。Ｍａｔｎｅｒら（米国特許第５，０７３，４８８号）は、生物学的滅菌インジケーター内の細菌の芽胞の増殖及び検出のための、栄養培地を説明している。真核細胞（例えば、哺乳類細胞、昆虫細胞）の増殖を促進するための栄養素及び栄養培地もまた、当該技術分野において既知であり、それらの栄養素及び栄養培地としては、例えば、糖（例えば、グルコース）、アミノ酸、ビタミン（例えば、チアミン、ナイアシン）、コリン、イノシトール、血清、及びこれらの混合物が挙げられる。
本開示の方法は、第１の水性混合物を基材と流体連通させて、第２の水性混合物を形成する工程６０を更に含む。典型的には、第１の水性混合物を基材と流体連通させるプロセスは、槽（例えば、管、ボトル、フラスコ、マイクロウェル）内で実施される。いずれかの実施形態において、この槽を封止して、例えば、蒸発を最小限に抑え、かつ／又は、外因性の生物活性による汚染を防止することができる。いずれかの実施形態において、第１の水性混合物を基材と流体連通させる工程は、既定の生物活性を促進する条件下で、液体混合物と基材とを接触させることを含み得る。当業者には、既定の生物活性を促進する条件が理解されるであろう。この条件としては、例えば、混合物のｐＨ、イオン強度、又は緩衝能；第１の指示試薬及び／又は第２の指示試薬の濃度；混合物又は槽内の補助因子の存在；及び／又は混合物の温度を挙げることができる。
本方法のいずれかの実施形態において、第１の水性混合物を基材と流体連通させる工程は、その混合物の温度を制御することを含み得る。一部の実施形態では、温度は、加熱ブロック、インキュベーター、又は当該技術分野において既知の、何らかの他の好適な加熱手段を使用して、周囲温度よりも高い温度（例えば、生物活性を伴う、触媒反応又は結合反応などの反応を促進する温度）に制御することができる。一部の実施形態では、混合物の温度は、周囲温度よりも低い温度に制御することができる。一部の実施形態では、混合物を一過性の温度シフト（例えば、熱ショック又は低温ショック）に晒すことにより、既定の生物活性の検出を促進することができる。
本開示による、第１の水性混合物を基材と流体連通させる工程は、第１の指示試薬、並びに任意選択的にその生物学的誘導体を、基材上、及び／又は基材内に濃縮することを含む。この結果として、第２の水性混合物中の第１の指示試薬の濃度は、第１の水性混合物中の第１の指示試薬の濃度よりも低いものとなる。上述のように、基材は、第１の指示試薬を受容及び濃縮するように選択される。基材は、水性媒質との接触を介して、第１の指示試薬を受容する。基材は、様々な手段を介して、第１の指示試薬又はその生物学的誘導体を保持する。理論に束縛されるものではないが、基材材料上、及び／又は基材材料内への、第１の指示試薬若しくはその生物学的誘導体の蓄積は、様々な化学的引力のうちの１つ以上を通じて生じ得るものであり、それらの化学的引力としては、例えば、イオン性相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス力、及び水素結合が挙げられるが、これらに限定されない。
基材による、第１の指示試薬若しくはその生物学的誘導体の受容及び濃縮のプロセスは、水性媒質と基材との流体連通の期間中に発生する。この流体連通の期間中に、第１の指示試薬又はその生物学的誘導体は、多数の要因に応じて決定され得る速度で、基材上に蓄積し、それらの要因としては、例えば、第１の指示試薬（又はその生物学的誘導体）の濃度、液体媒質に接触する基材材料の表面積、基材の多孔度、基材材料に関連する電荷密度、並びに／あるいは、基材による、第１の指示試薬若しくはその生物学的誘導体の受容又は濃縮を、妨害する方法で、基材及び／又は第１の指示試薬（又はその生物学的誘導体）と相互作用する恐れがある、液体媒質中の他の物質が挙げられる。基材上への、第１の指示試薬若しくはその生物学的誘導体の少なくとも一部分の受容及び濃縮は、比較的短い接触期間内（例えば、数分以内）に生じ得るものであり、より長い接触期間（例えば、最大１時間、最大２時間、最大４時間、最大１８時間、最大２４時間、最大７日間、最大２週間）にわたって継続し得る。一部の実施形態では、第１の指示試薬は、比較的短い期間内（例えば、数分、数時間）で、基材上、又は基材内に濃縮し得るが、第１の生物学的誘導体は、存在する場合には、比較的長い期間（例えば、数時間、数日）にわたって、基材上、又は基材内に、検出可能に濃縮し得ない。
上述の、水性混合物と基材との流体連通のいずれかの期間中に、基材は、第１の指示試薬（又はその生物学的誘導体）の全て若しくは一部分を、受容及び濃縮することができる。一部の実施形態では、基材は、第１の指示試薬（又はその生物学的誘導体）の少なくとも５パーセントを、受容及び濃縮する。一部の実施形態では、基材は、第１の指示試薬（又はその生物学的誘導体）の少なくとも１０パーセントを、受容及び濃縮する。一部の実施形態では、基材は、第１の指示試薬（又はその生物学的誘導体）の少なくとも２０パーセントを、受容及び濃縮する。一部の実施形態では、基材は、第１の指示試薬（又はその生物学的誘導体）の少なくとも３０パーセントを、受容及び濃縮する。一部の実施形態では、基材は、第１の指示試薬（又はその生物学的誘導体）の少なくとも４０パーセントを、受容及び濃縮する。一部の実施形態では、基材は、第１の指示試薬（又はその生物学的誘導体）の少なくとも５０パーセントを、受容及び濃縮する。一部の実施形態では、基材は、第１の指示試薬（又はその生物学的誘導体）の少なくとも７５パーセントを、受容及び濃縮する。一部の実施形態では、基材は、第１の指示試薬（又はその生物学的誘導体）の少なくとも８０パーセントを、受容及び濃縮する。一部の実施形態では、基材は、第１の指示試薬（又はその生物学的誘導体）の少なくとも９０パーセントを、受容及び濃縮する。一部の実施形態では、基材は、第１の指示試薬（又はその生物学的誘導体）の９０パーセント超を、受容及び濃縮する。一部の実施形態では、基材は、第１の指示試薬（又はその生物学的誘導体）の９５パーセント超を、受容及び濃縮する。
基材が第１の指示試薬（又はその生物学的誘導体）を受容及び濃縮することについての判定は、実施例１に示すように、第１の指示試薬（又はその生物学的誘導体）を含む液体媒質を、一定の期間、基材と流体連通させて、その試薬（又はその生物学的誘導体）の存在に関して基材を分析することによって、容易に達成することができる。好ましくは、基材に関連する、試薬又は生物学的誘導体の量が、その基材によって保持される量を示すように、いずれの過剰な液体媒質も、その基材を分析する前に、基材から除去される（例えば、吸い取り又は遠心分離によって）。好適な分析方法は、当業者には明らかであろう。例えば、有色の第１の指示試薬（例えば、ｐＨ指示薬）を受容及び濃縮する基材は、例えば、Ｘ−Ｒｉｔｅモデル５３０Ｐ携帯用分光濃度計を使用して、反射分光方によって分析することができる。
それゆえ、サンプル及び第１の指示試薬（又はその生物学的誘導体）を含む液体媒質を、好適な基材と流体連通させると、バルク液体媒質中の第１の指示試薬（又はその生物学的誘導体）の濃度は、第１の指示試薬（又はその生物学的誘導体）が基材によって受容及び濃縮されるため、減少する。本発明のこの特徴は、比較的低濃度の、第２の指示試薬の生物学的誘導体の検出を促進するが、これは、第１の指示試薬が、水性混合物から基材上に濃縮されるため、第１の指示試薬による干渉（すなわち蛍光の吸収）の少なくとも一部分が取り除かれるためである。一部の実施形態では、第１の指示試薬及び／又はその生物学的誘導体は、自由拡散形態である場合（すなわちバルク液体媒質中で）、生物活性を阻害する恐れがある。これらの実施形態では、本発明の更なる有利点は、基材が、第１の指示試薬の少なくとも一部分を効果的に隔離することにより、第１の指示試薬による生物活性の阻害を低減することができる点である。
再び図３を参照すると、本方法は、細胞の増殖を促進する、任意選択工程６５を更に含み得る。細胞の増殖を促進する工程は、例えば、芽胞の発芽、エネルギー代謝、生合成、及び／又は細胞分裂を促進する条件（例えば、栄養素、発芽剤、緩衝剤、酸化還元電位、気体）を提供することを含むように、広範に使用される。細胞の増殖を促進する工程は、元のサンプルからの、１つ以上の既定の生物活性の増幅をもたらし得ることにより、その既定の生物活性の検出感度を改善することができる。
本開示の方法は、第２の指示試薬の生物学的誘導体（本明細書では、「第２の生物学的誘導体」と呼ばれる）を検出する工程７０を更に含む。一部の実施形態では、第２の生物学的誘導体は、水性媒質中で検出することができる。第２の生物学的誘導体の有無を検出する工程により、それぞれ、サンプル中の対応する既定の生物活性の有無が示される。
第２の生物学的誘導体は、幾つかの手段によって検出することができる。一部の実施形態では、第２の生物学的誘導体は、光学的に検出することができる。一部の実施形態では、第２の生物学的誘導体を検出する工程は、その生物学的誘導体を視覚的に検出することを含み得る。一部の実施形態では、第２の生物学的誘導体を検出する工程は、その生物学的誘導体を、計器を使用して検出することを含み得る。例えば、第２の生物学的誘導体が、蛍光計などの光学計器を使用して検出することができる場合である。
いずれかの実施形態において、その第２の生物学的誘導体の有無を検出する工程は、第２の生物学的誘導体の量を測定することを更に含み得る。この量の測定は、当該技術分野において既知の任意の手段、例えば、計器（例えば、蛍光計）を使用してその量を測定することによって、実施することができる。一部の実施形態では、第２の生物学的誘導体の量を測定する工程は、水性混合物中の蛍光を、蛍光標準と比較することを含み得る。
いずれかの実施形態において、本開示の方法は、第１の指示試薬又はその第１の生物学的誘導体を検出する工程７５を、任意選択的に含む。第１の指示試薬又は第１の生物学的誘導体を検出するための手段は、当業者には理解されるように、その第１の指示試薬又は第１の生物学的誘導体の性質に応じて決定される。例えば、第１の指示試薬が色覚性（有色）であり、かつ／又は第１の生物学的誘導体が色覚性化合物である場合には、その第１の指示試薬及び／又は第１の生物学的誘導体は、光学的に（視覚的に、又は計器（例えば、分光光度計）によって）検出することができる。一部の実施形態では、第１の指示試薬又は第１の生物学的誘導体を検出する工程は、基材と関連しない水性混合物の部分内で（例えば、バルク液体中で）、第１の指示試薬又は第１の生物学的誘導体を検出することを更に含み得る。例えば、第１の指示試薬又は第１の生物学的誘導体が、分光光度計などの光学計器を使用して検出される場合、その光路は、基材のいずれの部分とも交差しない。
いずれかの実施形態において、第１の指示試薬又は第１の生物学的誘導体の有無を検出する工程は、第１の指示試薬又は第１の生物学的誘導体の量を測定することを更に含み得る。この量の測定は、例えば、計器（例えば、分光光度計、分光濃度計）を使用してその量を測定することを含めた、当該技術分野において既知の任意の手段によって、実施することができる。
それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，２５２，４８４号及び同第５，４１８，１６７号では、迅速な読み出しの生物学的インジケーターの一実施形態が説明され、この生物学的インジケーターは、酵素キャリア（芽胞ストリップ）と、４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコシド（蛍光発生酵素基質である、「ＭＵＧ」）及びブロモクレゾールパープル（ｐＨ指示薬である「、ＢＣＰ」）を有する溶液を収容する、アンプルとを含む。ＭＵＧは、酵素活性によって、ＭＵＧの蛍光誘導体である、４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）に加水分解されることが既知である。米国特許第５，２５２，４８４号の実施例１及び実施例２に示すように、ＭＵＧの酵素加水分解によって作り出される４ＭＵは、酵素キャリアを、ＭＵＧ及びＢＣＰを含む溶液と流体連通させた後、数分以内に、蛍光によって視覚的に検出することができる。
本研究者らは、米国特許第５，２５２，４８４号の実施例１で説明されるものと同様の、溶液中で使用されるＢＣＰの濃度が、水溶液中の低濃度の４ＭＵの検出を妨害するために十分であることを見出した。本開示による、溶液からの、ＢＣＰの少なくとも一部分の除去は、生物学的インジケーター内の、より少量の４ＭＵの検出を可能にすることにより、滅菌プロセスに晒されていたことによって不活化及び／又は死滅しなかった生物活性（例えば、芽胞、酵素）の、より早期の検出が可能になる。
生物活性を検出するためのシステム
本開示は、サンプル中の既定の生物活性を検出するためのシステムを含む。本システムを、本発明の方法に従って使用することにより、サンプル中の１つ以上の既定の生物活性を検出することができる。本システムは、第１の既定の生物活性によって、第１の生物学的誘導体に変換させることができる、第１の指示試薬を含む、第１の指示薬システムを含む。この第１の指示試薬は、第１の吸収スペクトル、及び任意選択的に第１の発光スペクトルを有する。本システムは、第２の既定の生物活性によって、第２の生物学的誘導体に変換せることができる、第２の指示試薬を含む、第２の指示薬システムを更に含む。この第２の生物学的誘導体は、第１の吸収スペクトル、及び第２の発光スペクトルを有する。
本システムは、液体サンプルを受容するように構成される計器を更に含み、この液体サンプルは、第１の指示試薬、第２の指示試薬、第１の生物学的誘導体、第２の生物学的誘導体、又は上記のうちの２つ以上の任意の組み合わせを含み得る。この計器は、分析機器の分野において既知のような「シッパー」手段を介して、外部容器から液体サンプルを引き込むように構成することができる。あるいは、この計器は、液体サンプルを収容する槽（例えば、管、マイクロウェルプレートなど）を受容するように構成することができる。
この計器は、第２の生物学的誘導体を検出するように構成される。任意選択的に、この計器は、第１の指示試薬、第２の指示試薬、第１の生物学的誘導体、又は上記のうちの２つ以上の任意の組み合わせを検出するように、更に構成することができる。
本システムの指示試薬は、特定の既定の生物活性を検出するための、本明細書で説明されるような、いずれかの好適な指示試薬とすることができる。第１の指示試薬及び第２の指示試薬は、キットの形で提供することができ、例えば、このキットは、指示試薬及びサンプルが中に混合される、水性媒質（例えば、緩衝剤、懸濁媒質、希釈剤）を、任意選択的に含み得る。本明細書で論じられるように、サンプルは、水を含み得ることにより、その水性媒質を構成することができる。任意選択的に、このキットは、サンプルと第１の指示試薬及び第２の指示試薬とを含む水性混合物が中に形成される、槽（例えば、管、キュベットなど）を更に含み得る。一部の実施形態では、本システムは、例えば、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１０年１１月１日出願の米国特許出願第６１／４０８，９７７号及び同第６１／４０８，９８８号の生物学的インジケーター、並びに米国特許第５，２５２，４８４号で説明される生物学的インジケーターなどの、生物学的滅菌インジケーターと共に使用することができる。
色覚性化合物の吸収スペクトルを検出するための計器は、当該技術分野において既知であり、例えば、それらの計器としては、様々な市販の分光光度計及び分光濃度計が挙げられる。蛍光化合物の発光スペクトルを検出するための計器もまた、当該技術分野において既知であり、例えば、それらの計器としては、様々な市販の蛍光計が挙げられる。そのような計器は、液体サンプル及び／又は既定の場所に配置される基材に関連する、指示試薬（又はその生物学的誘導体）を検出するように、容易に適合させることができる。
一部の実施形態では、基材は、水性混合物から取り出して、計器によって指示試薬（又はその生物学的誘導体）を検出することができるように配置する（例えば、表面上、又はキュベット内に）ことができる。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０２５，１８９号は、内蔵型の生物学的インジケーター内の既定の場所で、生物活性に関連する蛍光シグナルを検出するように構成される、計器を説明している。そのような計器を、色覚性シグナルを検出するように改変することは、当該技術分野における通常の技術の範囲内である。
一部の実施形態では、本システムは、プロセッサを更に含み得る。一部の実施形態では、この計器は、計器を制御して、指示試薬若しくはその生物学的誘導体に関連するデータを、収集及び／又は伝送することが可能な、マイクロプロセッサを含み得る。本システムの一部の実施形態では、プロセッサは、外部プロセッサを含み得る。この外部コンピュータは、パーソナルコンピュータ（ＰＣ）、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、ハンドヘルドコンピュータ、ワークステーションなどを含み得る。例えば、ソフトウェアを外部コンピュータにロードして、計器を制御し、かつ／あるいは、計器からのデータの収集、転送、及び／又は分析を促進することができる。
一部の実施形態では、本システムは、液体の温度を調節するための手段を更に含み得る。温度制御のための手段としては、例えば、熱電対及び熱交換器などの、当該技術分野において既知のいずれかの手段を挙げることができる。有利には、これらの実施形態は、温度を制御することによって生物活性を促進することができ、かつ生物活性の生成物を検出することができる、システムを提供する。
生物学的滅菌インジケーター：
図４〜１０は、本開示の一実施形態による、生物学的滅菌インジケーター１００を示す。生物学的滅菌インジケーターの他の好適な実施形態は、同時係属のＰＣＴ国際公開第２０１１／０１１１８９号、表題「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｕｓｉｎｇ Ｓａｍｅ」；米国特許出願第６１／４０９，０４２号、表題「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ」；同第６１／４０８，９９７号、表題「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ」；及び同第６１／４０８，９７７号、表題「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｕｓｉｎｇ Ｓａｍｅ」で説明され、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
生物学的滅菌インジケーター１００は、ハウジング１０２を含み得、このハウジング１０２は、一体に結合されて、内蔵型の生物学的滅菌インジケーターを提供するように適合される、第１部分１０４及び第２部分１０６（例えば、キャップ）を含み得る。一部の実施形態では、第１部分１０４及び第２部分１０６は、同じ材料で形成することができ、一部の実施形態では、第１部分１０４及び第２部分１０６は、異なる材料で形成することができる。ハウジング１０２は、生物学的滅菌インジケーター１００のリザーバ１０３を画定することができ、このリザーバ１０３内に、他の構成要素を配置することができ、滅菌プロセスの間、滅菌剤を注ぎ込むことができる。
ハウジング１０２は、第１部分１０４の壁部１０８、及び／又は第２部分１０６の壁部１１０などの、少なくとも１つの液体不透過性の壁部によって、画定することができる。一部品の一体型ハウジング１０２もまた採用することができ、又は第１部分１０４及び第２部分１０６は、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、他の形状、寸法、若しくは相対的構造を取ることができる点を理解するべきである。ハウジング１０２（例えば、壁部１０８及び壁部１１０）に関して好適な材料としては、ガラス、金属（例えば、箔）、ポリマー（例えば、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリフェニレン（ＰＰＥ）、ポリエチレン、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ））、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ又はアクリル樹脂）、アクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ））、セラミック、磁器、又はこれらの組み合わせを挙げることができるが、それらに限定されない。
一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００は、液体１２２を収容し、かつ生物学的滅菌インジケーター１００の内部、例えば、ハウジング１０２の少なくとも一部分の内部（例えば、少なくとも、ハウジング１０２の第１部分１０４の内部）に受容されるように寸法決めされる、壊れやすい容器１２０を更に含み得る。壊れやすい容器１２０は、様々な材料で形成することができ、それらの材料としては、金属（例えば箔）、ポリマー（例えば、ハウジング１０２に関して上記に列挙されるポリマーのうちのいずれか）、ガラス（例えば、ガラスアンプル）、及びこれらの組み合わせのうちの１つ以上が挙げられるが、それらに限定されない。一部の実施形態では、容器１２０の一部分のみが壊れやすく、例えば、容器１２０は、壊れやすい部分又はカバー（例えば、壊れやすい障壁、フィルム、膜など）を含み得る。壊れやすい容器１２０は、容器１２０が無損傷であり、かつ液体１２２が中に収容される第１の状態、及び容器１２０の少なくとも一部分が断裂する第２の状態を有し得る容器１２０の第２の状態では、液体１２２は、例えば容器１２０が生物学的滅菌インジケーター１００内に配置される場合、生物学的滅菌インジケーター１００のリザーバ１０３と流体連通することができる。
例示の実施形態に示すように、容器１２０は、以下でより詳細に説明される、挿入部材１３０によって、生物学的滅菌インジケーター１００内部で定位置に保持し、かつ／又は断裂させることができる。容器１２０は、例えば、挿入部材１３０（例えば、破砕装置として機能する挿入部材）に対して容器１２０を押し付けることによって、又は容器１２０に対して挿入部材１３０を押し付けることによって、断裂させることができる。
ハウジング１０２の第１部分１０４は、生物学的滅菌インジケーター１００の構成要素の大半を収容するように適合させることができ、「管」、「管状本体」、「基部」などと称することができる。ハウジング１０２は、ハウジング１０２の第１部分１０４及び第２部分１０６の一方若しくは双方によって画定することができる、リザーバ１０３を含み得る。生物学的滅菌インジケーター１００は、リザーバ１０３と流体連通して配置される、芽胞又は別の生物活性の発生源１１５（又は芽胞の所在部位）を更に含み得る。図４〜６に示すように、ハウジング１０２の第２部分１０６は、１つ以上の開口１０７を含み、ハウジング１０２の内部（例えば、リザーバ１０３）と環境との間の流体連通を提供することができる。例えば、１つ以上の開口１０７は、滅菌プロセスの間、芽胞１１５と環境との間の流体連通を提供することができ、生物学的滅菌インジケーター１００内への入口としての、かつ滅菌剤通路１６４（以下でより詳細に説明する）の入口としての役割を果たすことができる。一部の実施形態では、ハウジング１０２の第２部分１０６を、ハウジング１０２の第１部分１０４の第１（例えば、開放）末端部１０１に結合することができ、芽胞１１５を、ハウジング１０２の第１部分１０４の、第１末端部１０１とは反対側の第２（例えば、閉鎖）末端部１０５に配置することができる。
一部の実施形態では、障壁又はフィルター（例えば、無菌障壁、図示せず）を、滅菌剤通路１６４内に（例えば、開口１０７によって形成される入口に）配置して、汚染性若しくは異質の生物、物体、又は材料が、生物学的滅菌インジケーター１００に入り込むことを阻止することができる。そのような障壁は、気体透過性、微生物不透過性の材料を含み得、様々な結合手段によって、ハウジング１０２に結合することができ、それらの手段としては、接着剤、熱融着、超音波溶接などが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、この障壁は、ハウジング１０２の第１部分１０４に結合される（例えば、スナップ嵌め係合、ねじ込み係合、圧入係合、又はこれらの組み合わせで）支持構造（第２部分１０６など）を介して、滅菌剤通路１６４に結合することができる。滅菌剤への曝露の間、滅菌剤は、この障壁を通過して、滅菌剤通路１６４に入り、芽胞１１５と接触することができる。
一部の実施形態では、例示の実施形態に示すように、ハウジング１０２は、内側壁部（又は部分的壁部）１１８、棚部、隔壁、フランジなどによって少なくとも部分的に隔離することができる下方部分１１４及び上方部分１１６を含み得、この内側壁部１１８内には、下方部分１１４と上方部分１１６との間の流体連通を提供する、開口部１１７を形成することができる。一部の実施形態では、ハウジング１０２の第１部分１０４の下方部分１１４（単純に「下方部分１１４」又は「ハウジング１０２の下方部分１１４」と称される場合もある）は、芽胞１１５又は芽胞の所在部位を収容するように適合させることができる。一部の実施形態では、下方部分１１４は、ハウジング１０２の「検出部分」又は「検出領域」と称することができるが、これは、下方部分１１４の少なくとも一部分を、芽胞の増殖の標示に関して検査することができるためである。更には、一部の実施形態では、ハウジング１０２の第１部分１０４の上方部分１１６（簡略性のために、「上方部分１１６」又は「ハウジング１０２の上方部分１１６」と称される場合もある）は、特に作動の前に、壊れやすい容器１２０の少なくとも一部分を収容するように適合させることができる。
一部の実施形態では、ハウジング１０２の上方部分１１６によって少なくとも部分的に画定される、リザーバ１０３の部分は、第１チャンバ（又はリザーバ、区画、領域、又は容積）１０９と称することができ、ハウジング１０２の下方部分１１４によって少なくとも部分的に画定される、リザーバ１０３の部分は、第２チャンバ（又はリザーバ、区画、領域、又は容積）１１１と称することができる。一部の実施形態では、第２チャンバ１１１は、「芽胞増殖チャンバ」又は「検出チャンバ」と称することができ、滅菌プロセスの有効性を判定するために、芽胞の生存度に関して検査される容積を含み得る。
第１チャンバ１０９及び第２チャンバ１１１は、滅菌剤及び液体１２２が、第１チャンバ１０９から（すなわち第１チャンバ１０９を通過して）第２チャンバ１１１に移動することを可能にするように、互いに流体連通して配置することができる。一部の実施形態では、第１チャンバ１０９と第２チャンバ１１１との間の流体接続の程度（例えば、第１チャンバ１０９と第２チャンバ１１１とを接続する、開口部１１７などの、開口部のサイズ）は、作動工程（すなわち液体１２２が容器１２０から解放されること）の後に、作動工程と同時に、及び／又は作動工程に応答して、増大させることができる。一部の実施形態では、第１チャンバ１０９（例えば、上方部分１１６内の）と第２チャンバ１１１（例えば、下方部分１１４内の）との間の流体連通（又は流体接続の度合）の制御は、挿入部材１３０の少なくとも一部分によって提供することができる。
容器１２０は、滅菌の間、及び容器１２０が第１の断裂していない状態にあるとき、第１チャンバ１０９内に配置して、保持することができる。芽胞１１５は、容器１２０が第１の状態にあるとき、第２チャンバ１１１内に環境と流体連通して収容することができる。第１チャンバ１０９及び第２チャンバ１１１は、容器１２０が、第２チャンバ１１１内に存在しないように、具体的には、容器１２０が、第１の断裂していない状態にあるときに、第２チャンバ１１１内に存在しないように構成することができる。滅菌剤は、滅菌の間に、第２チャンバ１１１内に移動することができ（例えば、第１チャンバ１０９を介して）、液体１２２は、作動の間に、容器１２０が断裂して、液体１２２がハウジング１０２の内部へと解放されると、第２チャンバ１１１内に移動することができる（例えば、第１チャンバ１０９から）。
結果として、容器１２０が第１の状態にあるとき、第１チャンバ１０９及び第２チャンバ１１１は、互いに、また環境と（例えば、滅菌の間）、流体連通することができる。例えば、第１チャンバ１０９及び第２チャンバ１１１は、１つ以上の開口１０７を介して、環境と流体連通することができる。一部の実施形態では、第１チャンバ１０９及び第２チャンバ１１１は、滅菌剤が生物学的滅菌インジケーター１００に入る際に、第１チャンバ１０９が、第２チャンバ１１１の上流に配置されるような方式で、環境と流体連通することができる。すなわち第１チャンバ１０９は、滅菌剤の入口（例えば、１つ以上の開口１０７）と第２チャンバ１１１との間に配置することができ、滅菌剤の入口は、第１チャンバ１０９の、第２チャンバ１１１とは反対の側に、配置することができる。
図７及び図９に示すように、一部の実施形態では、第１チャンバ１０９は、特に容器１２０が第１の状態にある場合、第１部分１０４及び第２部分１０６の一方若しくは双方によって画定することができる。更には、一部の実施形態では、第１チャンバ１０９は、ハウジング１０２の第１部分１０４の開放末端部１０１に隣接し、ハウジング１０２の第２部分１０６に隣接して配置され、かつ／又は第２部分１０６によって少なくとも部分的に画定される、第１末端部１１２を含み得る。第１チャンバ１０９は、第２チャンバ１１１に隣接し、かつ第２チャンバ１１１と流体連通して配置され、ハウジング１０２の閉鎖末端部１０５に向けて配置される、第２末端部１３を更に含み得る。第１チャンバ１０９の第１末端部１１２は、ハウジング１０２の第１部分１０４及び／又は第２部分１０６によって、画定することができる。
図７及び図９に更に示すように、一部の実施形態では、第２チャンバ１１１は、第１チャンバ１０９に隣接し、かつ第１チャンバ１０９と流体連通して配置され、ハウジング１０２の開放末端部１０１に向けて配置される、第１末端部１２４と、ハウジング１０２の閉鎖末端部１０５によって少なくとも部分的に画定されるか、閉鎖末端部１０５を含むか、又は閉鎖末端部１０５に隣接して配置される、第２末端部１２５とを含み得る。
換言すれば、図７及び図９に示すように、生物学的滅菌インジケーター１００は、長手方向ＤＬを含み得、一部の実施形態では、第１チャンバ１０９は、第２チャンバ１１１の長手方向上方に、配置することができる。
一部の実施形態では、第２チャンバ１１１は、生物学的滅菌インジケーター１００の閉鎖末端部１０５によって、少なくとも部分的に画定することができるか、閉鎖末端部１０５を含み得るか、又は閉鎖末端部１０５に隣接して配置することができる。更には、一部の実施形態では、第２チャンバ１１１は、第１チャンバ１０９、及び生物学的滅菌インジケーター１００が作動される際に解放される、容器１２０内の液体１２２の容積のうちの少なくとも一方よりも小さく（例えば、容積及び／又は断面積で）することができる。結果として、そのような実施形態では、第２チャンバ１１１は、第２チャンバ１１１内に存在する気体（例えば、空気）が、第２チャンバ１１１内への流体の移動を阻止する恐れがある、空気閉塞効果を呈し得る。一部の実施形態では、以下でより詳細に説明するように、第２チャンバ１１１が、生物学的滅菌インジケーター１００の別の部分に通気することを可能にする、流体通路により、第２チャンバ１１１内への流体の移動を促進することができる。
一部の実施形態では、壁部１１８（「分割壁」と称される場合もある）は、角度を付けるか、又は傾斜させて、例えば、ハウジング１０２の長手方向ＤＬに対して、非ゼロの角度かつ非直角の方向に（例えば、長手方向ＤＬが、ハウジング１０２の長さに沿って延びる場合）配置することができる。壁部１１８の、そのような角度付け又は傾斜により、滅菌の後に、容器１２０が破砕されて、液体１２２を解放した後の、上方部分１１６から下方部分１１４への、液体１２２の移動を促進することができる。
図４〜６に示すように、一部の実施形態では、壁部１１８は、ハウジング１０２の内法寸法の変化によって、少なくとも部分的に形成することができる。例えば、図示のように、壁部１１８は、第１チャンバ１０９内の第１の長手方向位置から、第２チャンバ１１１内の第２の長手方向位置への、断面積の減少によって形成することができる。更には、単なる例として、ハウジング１０２の内部断面形状を、第１チャンバ１０９から第２チャンバ１１１への移行部で、第１チャンバ１０９内の実質的に丸い形（例えば、周長の５０％未満を構成する、１つの平坦面を有する）から、第２チャンバ１１１内の実質的な平行六面体（例えば、実質的な正方形）へと、変化させることができる。
更には、一部の実施形態では、壁部１１８はまた、ハウジング１０２の外法寸法の変化によって、少なくとも部分的に形成することもできる。図４〜６に示すように、一部の実施形態では、ハウジング１０２は、壁部１１８と一致して角度付けされ（壁部１１８が角度付けされる場合には）、かつハウジング１０２の外側形状及び外法寸法の変化を含む、段差部（又は、棚部、張り出し部、移行部など）１２３を含む。しかしながら、一部の実施形態では、ハウジング１０２の内法寸法が変化して、第１チャンバ１０９とは異なる断面形状又は寸法を有する、第２チャンバ１１１を作り出す場合であっても、ハウジング１０２の外側形状及び外法寸法を変化させる必要はないこと、又は内側形状及び／又は内法寸法の変化と一致して変化させる必要はないことを理解するべきである。例えば、一部の実施形態では、段差部１２３は、長手方向ＤＬに対して、実質的に垂直に配向することができる。
一部の実施形態では、リザーバ１０３は、少なくとも約０．５ミリリットル（ｍＬ）の容積を有し、一部の実施形態では、少なくとも約１ｍＬ、一部の実施形態では、少なくとも約１．５ｍＬの容積を有する。一部の実施形態では、リザーバ１０３は、約５ｍＬ以下の容積を有し、一部の実施形態では、約３ｍＬ以下、一部の実施形態では、約２ｍＬ以下の容積を有する。
一部の実施形態では、壊れやすい容器１２０は、少なくとも約０．２５ｍＬの容積を有し、一部の実施形態では、少なくとも約０．５ｍＬ、一部の実施形態では、少なくとも約１ｍＬの容積を有する。一部の実施形態では、壊れやすい容器１２０は、約５ｍＬ以下の容積を有し、一部の実施形態では、約３ｍＬ以下、一部の実施形態では、約２ｍＬ以下の容積を有する。
一部の実施形態では、壊れやすい容器１２０内に収容される液体１２２の容積は、少なくとも約５０マイクロリットル、一部の実施形態では、少なくとも約７５マイクロリットル、一部の実施形態では、少なくとも約１００マイクロリットルである。一部の実施形態では、壊れやすい容器１２０内に収容される液体１２２の容積は、約５ｍＬ以下、一部の実施形態では、約３ｍＬ以下、一部の実施形態では、約２ｍＬ以下である。
一部の実施形態では、第１チャンバ１０９（すなわちハウジング１０２の第１部分１０４の上方部分１１６によって形成される）は、少なくとも約５００マイクロリットル（又は立方ミリメートル）の容積を有し、一部の実施形態では、少なくとも約１０００マイクロリットル、一部の実施形態では、少なくとも約２０００マイクロリットル、一部の実施形態では、少なくとも約２５００マイクロリットルの容積を有する。一部の実施形態では、第１チャンバ１０９は、約５０００マイクロリットル以下の容積を有し、一部の実施形態では、約４０００マイクロリットル以下、一部の実施形態では、約３０００マイクロリットル以下の容積を有する。一部の実施形態では、第１チャンバ１０９は、約２７９０マイクロリットル、又は２８００マイクロリットルの容積を有する。
一部の実施形態では、第２チャンバ１１１（すなわちハウジング１０２の第１部分１０４の下方部分１１４によって形成される）は、少なくとも約５マイクロリットルの容積を有し、一部の実施形態では、少なくとも約２０マイクロリットル、一部の実施形態では、少なくとも約３５マイクロリットルの容積を有する。一部の実施形態では、第２チャンバ１１１は、約２５０マイクロリットル以下の容積を有し、一部の実施形態では、約２００マイクロリットル以下、一部の実施形態では、約１７５マイクロリットル以下、一部の実施形態では、約１００マイクロリットル以下の容積を有する。一部の実施形態では、第２チャンバ１１１は、約２０８マイクロリットル、又は２１０マイクロリットルの容積を有する。
一部の実施形態では、第２チャンバ１１１の容積は、第１チャンバ１０９の容積の少なくとも約５％であり、一部の実施形態では、少なくとも約７％である。一部の実施形態では、第２チャンバ１１１の容積は、第１チャンバ１０９の容積の約２０％以下であり、一部の実施形態では、約１５％以下、一部の実施形態では、約１２％以下、一部の実施形態では、約１０％以下である。一部の実施形態では、第２チャンバ１１１の容積は、第１チャンバ１０９の容積の約７．５％である。
一部の実施形態では、第２チャンバ１１１の容積は、容器１２０内に収容される液体１２２の容積の約６０％以下であり、一部の実施形態では、約５０％以下、一部の実施形態では、約２５％以下である。一部の実施形態では、容器１２０内に収容される液体１２２の容積よりも実質的に少ない容積を有するように、第２チャンバ１１１を設計することにより、その追加的な液体容積が、意図せざる蒸発を補償し得ることを確実にすることができる。
一部の実施形態では、第１チャンバ１０９（すなわちハウジング１０２の第１部分１０４の上方部分１１６によって形成される）は、第１チャンバ１０９と第２チャンバ１１１との間の移行部で、又は第２チャンバ１１１に隣接する位置で、少なくとも約２５ｍｍ２の断面積（又は、平均断面積）を有し、一部の実施形態では、少なくとも約３０ｍｍ２、一部の実施形態では、少なくとも約４０ｍｍ２の断面積を有する。一部の実施形態では、第１チャンバ１０９は、第１チャンバ１０９と第２チャンバ１１１との間の移行部で、又は第２チャンバ１１１に隣接する位置で、約１００ｍｍ２以下の断面積を有し、一部の実施形態では、約７５ｍｍ２以下、一部の実施形態では、約５０ｍｍ２以下の断面積を有する。
一部の実施形態では、第２チャンバ１１１（すなわちハウジング１０２の第１部分１０４の下方部分１１４によって形成される）は、第１チャンバ１０９と第２チャンバ１１１との間の移行部で、又は第１チャンバ１０９に隣接する位置で、少なくとも約５ｍｍ２の断面積を有し、一部の実施形態では、少なくとも約１０ｍｍ２、一部の実施形態では、少なくとも約１５ｍｍ２の断面積を有する。一部の実施形態では、第２チャンバ１１１は、約３０ｍｍ２以下の断面積（又は、平均断面積）を有し、一部の実施形態では、約２５ｍｍ２以下、一部の実施形態では、約ｍｍ２以下の断面積を有する。
一部の実施形態では、第１チャンバ１０９と第２チャンバ１１１との間の移行部での、第２チャンバ１１１の断面積は、その移行部での第１チャンバ１０９の断面積の、約６０％以下、一部の実施形態では、約５０％以下、一部の実施形態では、約４０％以下、一部の実施形態では、約３０％以下とすることができる。
一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００は、基材１１９を更に含み得る。一部の実施形態では、図４〜７、及び図９に示すように、基材１１９は、壁部１１８に隣接して、具体的には、壁部１１８の上に安置されるように、配置することができる。基材１１９は、生物学的滅菌インジケーター１００の上方部分１１６（すなわち第１チャンバ１０９）と下方部分１１４（すなわち第２チャンバ１１１）との間に配置することができ、一部の実施形態では、第１チャンバ１０９及び第２チャンバ１１１を、少なくとも部分的に画定することができる。それゆえ、一部の実施形態では、基材１１９は、容器１２０と芽胞１１５との間に配置することができる。一部の実施形態では、基材１１９は、基材１１９が第２チャンバ１１１内に配置されないように、第１チャンバ１０９内に、すなわち壁部１１８の第１チャンバ側上に配置することができる。
更には、基材１１９は、第２チャンバ１１１から外への、検定シグナル（例えば、蛍光）の拡散を、最小限に抑えるように配置することができる。一部の実施形態では、基材１１９の材料構成に応じて、基材１１９はまた、生物学的滅菌インジケーター１００からのシグナルの正確な読み取りを阻害する恐れのある、染料、指示試薬、又は溶液からの他の材料（すなわち「阻害物質」）を吸収することもできる。一部の実施形態では、図４〜７、９、及び図１０に示すように、基材１１９は、１つ以上の開口１２１を含み得、この開口１２１は、生物学的滅菌インジケーター１００の第１チャンバ１０９と第２チャンバ１１１との間の、流体の移動を制御する（すなわち数、サイズ、形状、及び／又は場所に応じて、促進並びに／あるいは制限する）ように構成することができ、具体的には、容器１２０が断裂される際、芽胞１１５への液体１２２の移動を促進することができる。単なる例として、図示のように、開口１２１を、基材１１９の中心の前方（又は「の前部」）に配置した場合、具体的な利益又は有利点が認められた。図４〜１０に示す実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００又は内部構成要素の「前方」とは、全般的には、平坦面１２６に向かうものとして説明することができる。全般的には、生物学的滅菌インジケーター１００の「前方」は、読み取り装置によって検査される、生物学的滅菌インジケーター１００の部分を指すことができる。
更には、単なる例として、開口１２１は、円形又は丸い形であるとして示されるが、しかしながら、他の断面開口形状も可能であり、本開示の範囲内にある。更には、単なる例として、また図６に示すように、基材１１９は、第１チャンバ１０９と第２チャンバ１１１との間の移行部で、第１チャンバの断面積を実質的に充填するように成形される。しかしながら、基材１１９の他の形状も可能であり、生物学的滅菌インジケーター１００の、ハウジング１０２、第１チャンバ１０９、第２チャンバ１１１、壁部１１８、又は別の部分に対応するように適合させることができる。
上述のように、第２チャンバ１１１は、検査される容積を含み得る。そのような容積を、芽胞の生存度に関して検定し、滅菌手順の致死性又は有効性を判定することができる。一部の実施形態では、この検査される容積は、第２チャンバ１１１の全て、又は一部分とすることができる。一部の実施形態では、基材１１９は、検査される容積の外側に配置することができ、このことにより、その容積内の、検定プロセスを妨害する恐れがある構造の数を、最小限に抑えることができる。例えば、一部の実施形態では、基材１１９が、芽胞１１５、芽胞キャリア１３５、及び芽胞リザーバ１３６のうちの少なくとも１つと直接接触しないように、基材１１９を配置することができる。一部の実施形態では、基材１１９が、検出システム（例えば、蛍光励起源及び発光検出器などの、光学検出システム）と、芽胞１１５、芽胞キャリア１３５、及び芽胞リザーバ１３６のうちの少なくとも１つとの間に位置しないように、基材１１９を配置することができる。基材１１９は、容器１２０が第１の状態及び／又は第２の状態にあるとき、特に、容器１２０が第２の状態にあるとき、上記の位置を有し得る。
一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００内での基材の位置は、芽胞の生存度に関する迅速な検出システム（例えば、蛍光検出）と、より緩徐な（例えば、一晩又は２４時間の）検出システム（例えば、芽胞の増殖に反応して色変化を呈し得る（例えば、２４時間で）ｐＨ指示薬）との相関関係に影響を及ぼし得る。例えば、一部の実施形態では、基材１１９は、様々な時点での蛍光の読み取り値と、２４時間後の増殖の結果との相関関係を、改善することができる。具体的には、基材１１９が、本明細書で説明され、かつ図１、２、及び図４〜７に示すような、「第１」の位置にある場合、蛍光は、増殖との正確な相関関係を示し得る。そのような相関関係は、他の基材の位置、及び基材を有さない生物学的滅菌インジケーターに勝る、改善とすることができる。
更には、基材１１９は、容器１２０が第１の状態にあるとき、基材１１９が容器１２０と直接接触しないように、生物学的滅菌インジケーター１００内に配置することができる。例えば、一部の実施形態では、基材１１９は、第１チャンバ１０９内に（例えば、第１チャンバ１０９の底部末端部（例えば、第２末端部１１３）に隣接して）配置することができるが、そのような実施形態であっても、基材１１９が容器１２０に接触しないように、基材１１９を配置することができる。例えば、図４、５、及び図７〜９に示すように、一部の実施形態では、容器１２０が第１の状態にあるとき、挿入部材１３０を、容器１２０と基材１１９との間に配置することができ、それにより、挿入部材１３０が、容器１２０を第１の状態に保持する。挿入部材１３０、又はその一部分は、基材１１９に隣接して配置することができる。例えば、例示の実施形態に示すように、基材１１９は、挿入部材１３０と壁部１１８との間に（例えば、間に挟み込んで）配置することができる。それゆえ、一部の実施形態では、基材１１９は、挿入部材１３０と第２チャンバ１１１との間に配置することができる。
上述のように、一部の実施形態では、基材１１９は、生物学的滅菌インジケーター１００内の、流体の流れを制御するか、若しくは流体の流れに影響を及ぼすように、具体的には、第１チャンバ１０９と第２チャンバ１１１との間の流体の流れを制御するように、配置及び構成することができる。例えば、一部の実施形態では、基材１１９は、滅菌剤が第２チャンバ１１１に（及び芽胞１１５に）送達される速度を制御するように構成する（例えば、サイズ決定する、成形する、配向する、かつ／又は特定の材料で構築する）ことができる。例えば、滅菌剤の送達速度は、基材１１９が、第１チャンバ１０９と第２チャンバ１１１との間に存在しない場合には、そうではない場合よりも小さくなる可能性がある。
更には、一部の実施形態では、基材１１９は、検査される容積から外へと検出可能生成物が拡散する速度を制御するように構成する（例えば、サイズ決定する、成形する、配置する、配向する、かつ／又は特定の材料で構築する）ことができる。一部の実施形態では、検出可能生成物は、芽胞の生存度を示すシグナル（例えば、蛍光シグナル）を含み得、一部の実施形態では、検出可能生成物は、芽胞１１５自体とすることができる。検査される容積から外への、検出可能生成物の拡散を制御することは、液体１２２の容積が、第２チャンバ１１１の（又は検査される容積の）容積よりも大きい実施形態で、特に有用とすることができるが、これは容器１２０が、その第２の断裂した状態にあるとき、そのような実施形態での液体１２２が、生物学的滅菌インジケーター１００内で、第２チャンバ１１１（又は検査される容積）よりも高いレベルまで、延在し得るためである。そのような実施形態では、検出可能生成物は、液体１２２の容積の全体にわたって（すなわち検査される容積の、外側の容積にまで）、自由に移動することができるが、ただし、基材１１９などの、そのような拡散を制御するための何らかの障壁又は手段が存在する場合は、その限りではない。例えば、一部の実施形態では、基材１１９を、検査される容積の直上の（すなわち液体１２２のレベルよりも低い）レベルに配置して、基材１１９の上方に位置する液体１２２の部分への、検出可能生成物の移動を阻止することができる。
一部の実施形態では、基材１１９は、滅菌剤及び／又は検出可能生成物に対する、物理的障壁若しくは遮断物を提供することによって、滅菌剤の送達速度（例えば、第２チャンバ１１１内への）及び／又は検出可能生成物の拡散速度（例えば、第２チャンバ１１１から外への）を制御することができる。そのような物理的障壁はまた、容器１２０が、第２の断裂した状態にあるとき、容器１２０の破砕部分を回収する機能も果たし、その破砕部分が、検出プロセス（例えば、光学検出プロセス）を遮断、屈折、反射、又は他の方法で妨害する恐れがある、検査される容積内への破砕部分の移動を阻止することができる。
更には、一部の実施形態では、液体１２２は、芽胞１１５と接触する前、又は接触した後に、正確な検定若しくは検出プロセスを妨害する恐れがある、１種以上の阻害物質又は他の構成成分を含み得る。一部の実施形態では、阻害物質の例としては、染料、指示試薬、芽胞の生存度の検出のために不可欠な反応（例えば、酵素反応）を阻害する恐れがある他の材料若しくは物質（例えば、塩類など）、検出プロセスを妨害する恐れがある他の材料若しくは物質のうちの少なくとも１つ、又はこれらの組み合わせを挙げることができる。そのような実施形態では、基材１１９は、液体１２２からの、又は少なくとも、検査される液体１２２の容積からの１種以上の阻害物質を、吸収及び／又は選択的に濃縮するように構成することができる。
例えば、一部の実施形態では、芽胞１１５と接触する前に、又は芽胞１１５との接触の結果として、２種以上の指示試薬が液体１２２中に存在し得る。そのような実施形態では、第１の指示試薬（例えば、蛍光検出に関して使用される）は、芽胞の生存度の検出のために不可欠とすることができるが、その一方で、第２の指示試薬（例えば、ｐＨ指示薬）が、実際に、第１の指示試薬の検出に干渉する場合がある。単なる例として、第２の指示試薬がｐＨ指示薬（例えば、ブロモクレゾールパープル、メチルレッド、又はこれらの組み合わせのうちの１つ以上）である実施形態では、ｐＨ指示薬は、例えばそのｐＨ指示薬が、第１の指示試薬の蛍光のスペクトルバンドと類似する波長で、電磁放射線を放出する（例えば、ｐＨ指示薬が色の推移を呈する際に）実施形態では、第１の指示試薬の蛍光読み取りに抵触又は干渉する場合がある。そのような実施形態では、基材１１９は、液体１２２と接触して配置される際に、第２の指示試薬を吸収及び／又は選択的に濃縮して、液体１２２中の、又は少なくとも検査される液体１２２の容積中の、第２の指示試薬の濃度を低減するように構成する（例えば、適切な材料で形成する）ことができる。
更には、一部の実施形態では（例えば、壁部１１８が傾斜しており、基材１１９が、壁部１１８に隣接して配置される実施形態では）、基材１１９は、角度を付けるか、又は傾斜させて、例えば、ハウジング１０２の長手方向ＤＬに対して、非ゼロの角度かつ非直角の方向に配置することができる。基材１１９の、そのような角度付け又は傾斜により、滅菌の後に、容器１２０が破砕されて、液体１２２を解放した後の、第１チャンバ１０９から第２チャンバ１１１への、液体１２２の移動を促進することができる。
一部の実施形態では、基材１１９は、上記の機能のうちの１つ以上を達成するために、様々な材料で形成することができる。基材材料の例としては、綿、グラスウール、布、不織ポリプロピレン、不織レーヨン、不織ポリプロピレン／レーヨン配合物、不織ナイロン、不織ガラス繊維若しくは他の不織繊維、濾紙、微多孔性の疎水性及び親水性フィルム、ガラス繊維、連続気泡ポリマーフォーム、及び半透過性プラスチックフィルム（例えば、粒子充填フィルム、熱誘起相分離（ＴＩＰＳ）膜など）、並びにこれらの組み合わせを挙げることができるが、それらに限定されない。例えば、基材１１９を使用して、１種以上の指示試薬（例えば、ブロモクレゾールパープル（ＢＣＰ））を選択的に濃縮することができる実施形態では、基材１１９は、荷電ナイロン（ＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓより入手可能な（商品名「ＭＡＧＮＡＰＲＯＢＥ」（例えば、０．４５マイクロメートル、カタログ番号ＮＰ０ＨＹ０００１０、材料番号１２２６５６６）で）、リプローブ可能な荷電転写膜など）で形成することができる。
基材１１９を採用することができる方法及びシステムの実施例はまた、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１０年１１月１日出願の、同時係属の米国特許出願第６１／４０８，８８７号、表題「Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」でも説明される。
一部の実施形態では、挿入部材１３０、壁部１１８、及び／又は基材１１９若しくはその中の開口部のうちの１つ以上の、少なくとも一部分は、第１チャンバ１０９（例えば、上方部分１１６内の）と第２チャンバ１１１（例えば、下方部分１１４内の）との間の流体連通を提供することができ、かつ／あるいは、第１チャンバ１０９と第２チャンバ１１１との間の流体連通を制御することができる（例えば、第１チャンバ１０９と第２チャンバ１１１との間の流体接続の度合を制御することによって）。
生物学的滅菌インジケーター１００は、第１チャンバ１０９と第２チャンバ１１１とを流体結合するように配置することができる、第１流体通路１６０を含み得、この第１流体通路１６０は、滅菌剤（例えば、滅菌の間の、容器１２０が、第１の断裂していない状態にあるとき）及び／又は液体１２２（例えば、滅菌の後の作動の間に、容器１２０が、第２の断裂した状態にあるとき）が、芽胞１１５に到達することを可能にすることができる。図示の実施形態では、第１流体通路１６０は、全般的には、以下のうちの１つ以上によって、画定することができる：（１）挿入部材１３０、例えば、以下で説明する開口１７７、挿入部材１３０内に形成される開口部、及び／又は挿入部材１３０（例えば、その前方部分）とハウジング１０２との間などの、挿入部材１３０の周囲のいずれかの開放空間を介して；（２）壁部１１８、例えば、壁部１１８によって画定される開口１１７；（３）基材１１９、例えば、その中に形成される開口１２１、又は基材１１９（例えば、その前方部分）とハウジング１０２との間などの、基材１１９の周囲のいずれかの開放空間；（４）ハウジング１０２、例えば、その中に形成される、いずれかの開口部又は空間；及びこれらの組み合わせ。結果として、第１流体通路１６０は、全般的には、図示の実施形態では、図７及び図１０の矢印によって表される。
生物学的滅菌インジケーター１００は、第２チャンバ１１１を、第１チャンバ１０９などの、生物学的滅菌インジケーター１００の別のチャンバ若しくは別の部分と流体結合するように配置される、第２流体通路１６２を更に含み得る。第２流体通路１６２は、例えば、滅菌剤及び／又は液体１２２が、第２チャンバ１１１内に移動される際、第２チャンバ１１１内に従前に存在していた気体が排出されて、第２チャンバ１１１から抜け出ることを可能にするように、更に配置することができる。それゆえ、以下でより詳細に説明される、第２流体通路１６２は、生物学的滅菌インジケーター１００内の内部通気口としての役割を果たし得る。
一部の実施形態では、基材１１９は、以下のうちの少なくとも１つを可能にし得る、第１チャンバ１０９と第２チャンバ１１１との間の物理的障壁又は遮断物を提供することができる：滅菌剤が第２チャンバ１１１内に送達される際の、滅菌剤の送達速度／殺傷率の制御；第２チャンバ１１１から外への、芽胞１１５及び／又は検出可能生成物の拡散の制御；容器１２０が第２の断裂した状態にあるときの、第２チャンバ１１１への（及び芽胞１１５への）液体１２２の送達速度の制御；又はこれらの組み合わせ。
一部の実施形態では、基材１１９は、作動の間（すなわち容器１２０が第２の状態にあるとき）、第２チャンバ１１１への液体１２２の送達に対する物理的障壁を提供することができるため、基材１１９内の開口１２１、及び／又は基材１１９の角度を制御することにより、所望の液体送達速度を生じさせることができる。更には、又は代替的には、第２流体通路１６２は、第２チャンバ１１１内に閉じ込められた、あらゆる気体又は空気に関する通気口を提供して、所望されるときの、基材１１９を通過するか又は基材１１９を越えて第２チャンバ１１１内へ入る、液体１２２の移動を促進することができる。
更には、又は代替的には、ハウジング１０２を、所望されるときの、第２チャンバ１１１への液体１２２の移動を促進するように構成する（例えば、適切な材料で形成し、かつ／又は微細構造の溝、若しくは他の物理的な表面改変で構成する）ことができる。
一部の実施形態では、液体１２２は、生き残った芽胞の発芽を助長する発芽培地などの、芽胞のための栄養培地を含み得る。一部の実施形態では、液体１２２は、栄養素と組み合わせて栄養培地を形成することができる、水（又は、別の溶媒）を含み得る。好適な栄養素は、生き残った芽胞の発芽及び／又は増殖を助長するために必要な栄養素を含み得、リザーバ１０３内に、例えば、生物学的滅菌インジケーター１００の、芽胞１１５の近傍の領域内に、乾燥形態（例えば、ビーズ又は他のキャリア内に封入される、粉末形態、錠剤形態、カプレット形態、カプセル形態、フィルム若しくはコーティング、別の好適な形状又は構成、あるいはこれらの組み合わせ）で、提供することができる。
栄養培地は、全般的には、芽胞が生存可能である場合には、芽胞の発芽及び初期増殖を誘導するように選択することができる。栄養培地は、１種以上の糖を含み得、それらの糖としては、グルコース、フルクトース、セロビオースなど、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。栄養培地はまた、塩も含み得、それらの塩としては、塩化カリウム、塩化カルシウムなど、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。一部の実施形態では、栄養素は、少なくとも１種のアミノ酸を更に含み得、それらのアミノ酸としては、メチオニン、フェニルアラニン、及びトリプトファンのうちの、少なくとも１つが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、栄養培地は、指示薬分子、例えば、芽胞の発芽又は増殖に応答して変化する光学特性を有する、指示薬分子を含み得る。好適な指示薬分子としては、ｐＨ指示薬分子、酵素基質、ＤＮＡ結合色素、ＲＮＡ結合色素、他の好適な指示薬分子、又はこれらの組み合わせを挙げることができるが、それらに限定されない。
図４〜１０に示すように、生物学的滅菌インジケーター１００は、挿入部材１３０を更に含み得る。一部の実施形態では、挿入部材１３０は、容器１２０が、滅菌の間に、芽胞１１５から隔離された場所内に無損傷で保持されるように、容器１２０を保持又は支持するように適合させることができる。すなわち一部の実施形態では、挿入部材１３０は、特に、容器１２０が、作動工程（すなわち滅菌プロセスの後に実施することができる、液体１２２を、容器１２０から解放して、芽胞１１５に導入する工程）の間に破砕される前の、容器１２０のためのキャリア１３２（図４を参照）を含み得る（又はキャリア１３２として機能することができる）。一部の実施形態では、挿入部材１３０は、容器１２０が、ハウジング１０２内で、例えばハウジング１０２に対して長手方向に、少なくとも多少は移動することを可能にするように、更に適合させることができる。図示の実施形態の挿入部材１３０は、以下でより詳細に説明される。他の好適な挿入部材及びキャリアの実施例は、同時係属のＰＣＴ国際公開第２０１１／０１１１８９号で説明されている。
一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００は、図４〜７、及び図９に示すように、芽胞キャリア１３５を更に含み得る。しかしながら、一部の実施形態では、芽胞１１５を収容するように適合された部分を含むように、挿入部材１３０を改変することができる。例えば、一部の実施形態では、挿入部材１３０及び芽胞キャリア１３５は、容器１２０を保持し、かつ最終的には、所望されるときに断裂させるように適合される、第１部分と、滅菌の間（すなわち断裂の前に）、芽胞１１５を、生物学的滅菌インジケーター１００の、容器１２０から隔離された領域内に収容するように適合される、第２部分とを含む、１つの挿入部材として、一体的に形成することができる。
図４〜７、及び図９に示すように、芽胞キャリア１３５は、芽胞１１５を、直接的に又は基材上に配置することができる、芽胞リザーバ１３６（凹部、ディボット、ウェル、陥凹などと称することもできる）を含み得る。液体１２２が容器１２０から解放される際に、液体１２２と混合されるように配置される、栄養培地を採用する実施形態では、その栄養培地は、芽胞リザーバ１３６の近傍、又は芽胞リザーバ１３６内に配置することができ、栄養培地は、容器１２０から水が解放される際に、その水と混合する（例えば、その水中に溶解する）ことができる。単なる例として、栄養培地が、乾燥形態で提供される実施形態では、この乾燥形態は、リザーバ１０３の内部に、芽胞リザーバ１３６の内部に、芽胞用の基材上に、又はこれらの組み合わせで存在することができる。一部の実施形態では、液体と乾燥栄養培地との組み合わせを、採用することができる。
一部の実施形態では、芽胞リザーバ１３６は、少なくとも約１マイクロリットルの容積を有し、一部の実施形態では、少なくとも約５マイクロリットル、一部の実施形態では、少なくとも約１０マイクロリットルの容積を有する。一部の実施形態では、芽胞リザーバ１３６は、約２５０マイクロリットル以下の容積を有し、一部の実施形態では、約１７５マイクロリットル以下、一部の実施形態では、約１００マイクロリットル以下の容積を有する。
図７及び図９に示すように、一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００は、ハウジング１０２の壁部１０８に結合させるか、若しくは一体的に形成することができる、リブ又は突出部１６５を更に含み得、このリブ又は突出部１６５は、芽胞キャリア１３５を、ハウジング１０２内の所望の場所内に、かつ／又は読み取り装置１２の検出システム（例えば、光学検出システム）に対して所望の角度若しくは配向で維持するように、配置することができる。
図４〜７、及び図９に示すように、ハウジング１０２の第２部分１０６は、第１部分１０４に結合するように適合させることができる。例えば、図示のように、第２部分１０６は、ハウジング１０２の第１部分１０４の上方部分１１６（例えば、第１末端部１０１）に結合するように適合させることができる。一部の実施形態では、図４〜７に示すように、第２部分１０６は、ハウジング１０２の第１部分１０４の少なくとも一部分を受容するように寸法決めすることができる、キャップの形態とすることができる。
図４、５、及び図７、８に示すように、滅菌の間、及び作動の前には、第２部分１０６は、第１部分１０４に対して、第１の「非作動」位置１４８にあることが可能であり、容器１２０は、第１の無損傷状態にあることが可能である。図９に示すように、ハウジング１０２の第２部分１０６は、第１部分１０４に対して、第２の「作動」位置１５０（例えば、第２部分１０６が、完全に押し下げられる場所）へと移動させることができ、容器１２０は、第２の断裂した状態にあることが可能である。例えば、滅菌の後に、第２部分１０６を、第１の位置１４８から第２の位置１５０へと（すなわち十分な量）移動させて、容器１２０の断裂を引き起こし、容器１２０から液体１２２を解放して、液体１２２が、芽胞１１５と流体連通することを可能にすることによって、生物学的滅菌インジケーター１００を作動させることができる。生物学的滅菌インジケーター１００は、読み取り装置のウェル内に、生物学的滅菌インジケーター１００を配置する前に、ウェル内に生物学的滅菌インジケーター１００を配置した後に、又はウェル内に生物学的滅菌インジケーター１００を配置すると同時に、作動させることができる（すなわち生物学的滅菌インジケーター１００を、読み取り装置内の定位置へと滑り込ませることができ、第２部分１０６を、その第２の位置１５０に至るまで、例えば、ウェルの底部が、第２部分１０６を、その第２の位置１５０へと移動させるために十分な抵抗力を提供するまで、押し付け続けることができる）。第２の位置１５０は、第１の位置１４８よりも、生物学的滅菌インジケーター１００の第１部分１０４の閉鎖末端部１０５に近接させて位置決めすることができる。
例示の実施形態に示すように、一部の実施形態では、ハウジング１０２の第１部分１０４は、段差部、張り出し部、又は平坦から丸い形への移行部１５２を含み得る。段差部１５２は、第２部分１０６が、その第１の位置１４８にあるとき、露出しているように示され、第２部分１０６が、その第２の位置１５０にあるとき、隠されているか、又は覆われているように示される。それゆえ、段差部１５２を探知することにより、第２部分１０６が、第１の位置１４８にある（すなわち生物学的滅菌インジケーター１００が非作動である）か、又は第２の位置１５０にあるか（すなわち生物学的滅菌インジケーター１００が作動している）を判定することができる。生物学的滅菌インジケーター１００のそのような機構を使用して、生物学的滅菌インジケーター１００の状態を判定し、例えば、生物学的滅菌インジケーター１００が作動しているか否かを確認することは、同時係属の米国特許出願第６１／４０９，０４２号で、より詳細に説明されている。段差部１５２の長手方向位置は、単なる例として示されるが、しかしながら、段差部１５２は、その代わりに、異なる長手方向位置に（例えば、生物学的滅菌インジケーター１００の閉鎖末端部１０５に、より近接させて）配置することができ、又は一部の実施形態では、丸い形の部分から平坦面への移行部は、段階的、テーパー形状、又は傾斜状とすることができる点を理解するべきである。
ハウジング１０２の第１部分１０４と第２部分１０６との間に、様々な結合手段を採用することにより、第１部分１０４及び第２部分１０６が、互いに取り外し可能に結合されることを可能にすることができ、それらの結合手段としては、重力（例えば、１つの構成要素を、別の構成要素の上に、又はその接合部分に設置することができる）、ねじ山、圧入係合（「摩擦嵌め係合」又は「締まり嵌め係合」と称される場合もある）、スナップ嵌め係合、磁石、接着剤、熱封止、他の好適な取り外し可能結合手段、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００は、再び開放する必要はなく、第１部分１０４及び第２部分１０６を、互いに取り外し可能に結合させる必要はないが、むしろ、互いに恒久的に、又は半恒久的に結合させることができる。そのような恒久的又は半恒久的結合手段としては、接着剤、縫合、ステープル、ネジ、クギ、リベット、無頭釘、クリンプ、溶接（例えば、音波（例えば、超音波）溶接）、任意の熱接着技術（例えば、結合させる構成要素の一方若しくは双方に適用される、熱及び／又は圧力）、スナップ嵌め係合、圧入係合、熱封止、他の好適な恒久的若しくは半恒久的結合手段、及びこれらの組み合わせを挙げることができるが、それらに限定されない。恒久的又は半恒久的結合手段の一部はまた、取り外し可能であるように適合させることも、またその逆も可能であり、単なる例として、この方式で分類されることが、当業者には理解されるであろう。
図７及び図９に示すように、第２部分１０６は、第１部分１０４に対する第１の長手方向位置１４８と、第１部分１０４に対する第２の長手方向位置１５０との間で、移動可能とすることができるが、しかしながら、生物学的滅菌インジケーター１００は、その代わりに、第１の位置１４８及び第２の位置１５０が、必ずしも、ハウジング１０２の第１部分１０４及び第２部分１０６の一方若しくは双方に対する、長手方向位置であるとは限らないような、異なる構成とすることが可能である点を理解するべきである。
第２部分１０６は、第２部分１０６が第２の位置１５０へと移動され、液体１２２が容器１２０から開放された後（すなわち容器１２０が、第２の断裂した状態にあるとき）に、第１部分１０４の第１末端部１０１、具体的には、第１部分１０４の開放上方末端部１５７に接触して、生物学的滅菌インジケーター１００を閉鎖又は封止する（例えば、気密封止する）ように配置することができる、封止部１５６（例えば、突起部、突出部、フラップ、フランジ、ｏリングなど、又はこれらの組み合わせ）を更に含み得る。すなわち芽胞１１５は、容器１２０が第２の状態にあるとき、環境から封止することができる。封止部１５６は、様々な形態を取ることができ、図７及び図９では、例として、第２部分１０６の壁部１１０と共に、ハウジング１０２の第１部分１０４の上方末端部１５７を受容して、生物学的滅菌インジケーター１００を封止するように寸法決めされる、内側リング又は空洞部を形成するものとして示される。
一部の実施形態では、封止部１５６及び上方末端部１５７の一方若しくは双方は、ハウジング１０２の第２部分１０６を、ハウジング１０２の第１部分１０４に結合するために、それぞれ、封止部１５６及び上方末端部１５７の他方に係合するように構成される構造（例えば、突出部）を更に含み得る。
更には、一部の実施形態では、ハウジング１０２の第２部分１０６を、ハウジング１０２の第１部分１０４に結合して、作動の後に、生物学的滅菌インジケーター１００を環境から封止することができる。そのような封止は、液体１２２が容器１２０から解放された後の、液体１２２の汚染、蒸発、若しくは溢流を阻止することができ、かつ／又は生物学的滅菌インジケーター１００の内部の汚染を阻止することができる。
ここで、挿入部材１３０を、より詳細に説明する。
図４、５、及び図７に示すように、滅菌の間、及び作動の前には、第２部分１０６は、第１部分１０４に対して、第１の位置１４８にあることが可能である。第１の位置１４８では、容器１２０は、下方部分１１４、第２チャンバ１１１、又は芽胞１１５から隔離された場所内に、無損傷で保持することができ、液体１２２を、容器１２０内部に収容することができる。
図９に示すように、滅菌の後に、生物学的滅菌インジケーター１００を作動させて、容器１２０から液体１２２を解放し、第２チャンバ１１１へと、液体１２２を移動させることができる。すなわちハウジング１０２の第２部分１０６を、第１部分１０４に対して、第２の位置１５０に移動させることができる。第２部分１０６が、第１の位置１４８から第２の位置１５０に移動されると、ハウジング１０２の第２部分１０６の封止部１５６が、第１部分１０４の上方末端部１５７に係合して、生物学的滅菌インジケーター１００のリザーバ１０３を、環境から封止することができる。そのような実施形態では、第２部分１０６は、第２の位置１５０で、第１部分１０４に可逆的に係合することができ、一部の実施形態では、第２部分１０６は、第１部分１０４に不可逆的に係合することができる。しかしながら、第１部分１０４及び第２部分１０６に関する構造並びに結合手段は、図示の実施形態では、単なる例として示されるものであり、上述の結合手段のいずれもが、その代わりに、ハウジング１０２の第１部分１０４と第２部分１０６との間で採用することができる点を理解するべきである。
挿入部材１３０は、容器１２０が、滅菌の間に、芽胞１１５から隔離された場所内に無損傷で保持されるように、容器１２０を保持又は支持するように適合させることができる。すなわち上述のように、一部の実施形態では、挿入部材１３０は、特に、容器１２０が、作動工程（すなわち典型的には滅菌プロセスの後に実施される、液体１２２を、容器１２０から解放して、芽胞１１５に導入する工程）の間に破砕される前の、容器１２０のためのキャリア１３２を含み得る（又はキャリア１３２として機能することができる）。
更には、挿入部材１３０は、容器１２０とハウジング１０２との間、及び／又は容器１２０とハウジング１０２内の他のあらゆる構成要素若しくは構造（例えば、キャリア１３２などの、挿入部材１３０の少なくとも一部分など）との間に、少なくとも最小限の空隙部（例えば、最小限の断面積の空間）を維持する、ハウジング１０２内の位置に、容器１２０を保持して、例えば、生物学的滅菌インジケーター１００内に、実質的に一定の滅菌剤通路１６４を維持するように適合させることができる。一部の実施形態では、挿入部材１３０は、ハウジング１０２内の実質的に一定の場所内に、容器１２０を保持するように適合させることができる。
一部の実施形態では、図６に示すように、ハウジング１０２の少なくとも一部分は、ハウジング１０２（例えば、壁部１０８及び／又はその内側表面）が、ハウジング１０２の長手方向ＤＬで概して先細になる、テーパー形状部分１４６を含み得る。結果として、ハウジング１０２内の断面積は、長手方向ＤＬに沿って、概して減少し得る。
一部の場合には、容器１２０の周囲（例えば、容器１２０と周囲を取り囲む構造との間）に少なくとも最小限の空隙部を維持するための手段が提供されない場合、容器１２０が、滅菌剤通路１６４を閉塞又は遮断する方式で、ハウジング１０２内に（例えば、テーパー形状部分１４６内に）配置され得る可能性が、存在し得る。しかしながら、本開示の生物学的滅菌インジケーター１００は、このことが発生することを阻止するように設計される。例えば、図示の実施形態では、挿入部材１３０（具体的には、キャリア１３２）は、ハウジング１０２のテーパー形状部分１４６の外に、容器１２０を保持するように構成することができるため、作動の前の生物学的滅菌インジケーター１００がいずれの配向にあっても、少なくとも最小限の断面積が、容器１２０の周囲に維持される。例えば、図４〜８に示す実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００が、上下を逆転される場合であっても、容器１２０は、挿入部材１３０との接触から脱落する可能性はあるが、いずれの配向であっても、容器１２０は、生物学的滅菌インジケーター１００の作動まで、テーパー形状部分１４６又は芽胞１１５に、より近接して移動されることはない。更には、作動までは、容器１２０とハウジング１０２及び／又は挿入部材１３０との間の、少なくとも最小限の空隙部（具体的には、その空隙部の断面積）を維持して、例えば、実質的に一定の滅菌剤通路１６４を、容器１２０の周囲から、第１流体通路１６０を通じて、第２チャンバ１１１内へと提供することができる。
一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００の構成要素の、相対的なサイズ設定及び配置は、作動の前に、容器１２０が、生物学的滅菌インジケーター１００内の実質的に一定の場所内に、無損傷で保持されるように構成することができる。そのような構成により、実質的に一定の滅菌剤通路１６４を提供することができ、作動の前に、生物学的滅菌インジケーター１００内で、容器１２０が移動することが、仮にあるとしても、実質的に不可能であるような位置に、容器１２０を維持することができる。
一部の実施形態では、挿入部材１３０の少なくとも一部分は、容器１２０が、ハウジング１０２内で、例えば、容器１２０が無損傷である第１の（長手方向）位置と、容器１２０の少なくとも一部分が断裂される第２の（長手方向）位置との間で、ハウジング１０２に対して長手方向で移動することを可能にするように適合させることができる。単なる例として、挿入部材１３０は、作動の前に、容器１２０を保持及び支持するように適合され、かつ作動の間に、例えば、第２部分１０６が、ハウジング１０２の第１部分１０４に対して移動されるときに、容器１２０がハウジング１０２内で移動することを可能にするように適合される、１つ以上の突起部又はアーム１５８（容器１２０の周りで離間する２つの突起部１５８を、単なる例として示す）を含み得る。突起部１５８はまた、生物学的滅菌インジケーターが作動されるときに、容器１２０を所望の方式で断裂させるように適合させる（例えば、成形及び／又は配置する）こともできる。結果として、挿入部材１３０は、場合によって、作動の前に、容器１２０を保持するよう機能することができ、作動の間に、容器１２０を破砕するように機能することができる。結果として、挿入部材１３０、又はその一部分は、場合によって、「キャリア」（例えば、キャリア１３２）及び／又は「破砕装置」と称することができる。
単なる例として、突起部１５８は、図４、及び図６〜１０では、分割壁１１８に当接するように適合された基部又は支持部１２７に、結合されるものとして示される。例えば、基部１２７は、リザーバ１０３内に受容されるように寸法決めすることができ、かつ分割壁１１８の上に設置されるか、分割壁１１８に当接するか、又は他の方法で分割壁１１８と協働若しくは結合するように、寸法決めすることができる。生物学的滅菌インジケーター１００の内部構造との、そのような結合により、所望されるときに容器１２０を破砕するために必要な、抵抗及び力を提供することができる。しかしながら、一部の実施形態では、挿入部材１３０は基部１２７を含まず、突起部１５８は、ハウジング１０２の一部分に結合されるか、又はハウジング１０２の一部分を形成することができる。一部の実施形態では、挿入部材１３０は、ハウジング１０２と一体的に形成されるか、又はハウジング１０２によって提供される。
図示のように、挿入部材１３０は、突起部１５８を連結し、かつハウジング１０２の内側表面及び／又は容器１２０の外側表面に対応するように成形される、側壁部１３１を更に含み得る。そのような側壁部１３１は、突起部１５８に支持及び剛性を提供して、容器１２０を、一貫した方式で確実に破砕することを援助することができる。側壁部１３１はまた、作動の間に、容器１２０がハウジング１０２内を移動する際、容器１２０を所望の方式で誘導して、例えば、突起部１５８に所望の方式で接触させ、容器１２０を確実に断裂させるように、成形及び寸法決めすることもできる。側壁部１３１、及び／又はハウジング１０２の壁部１０８（又はその内側表面）はまた、例えば、挿入部材１３０の外側表面と、ハウジング１０２の内側表面との間に、生物学的滅菌インジケーター１００の第２流体通路１６２の少なくとも一部分を画定するように、成形することもできる。例えば、一部の実施形態では、図４、５、８、及び図９に示すように、挿入部材１３０の側壁部１３１は、第２流体通路１６２の少なくとも一部分を形成するように構成される、チャネル（又は溝、陥凹など）１６９を含み得る。
第２流体通路１６２は、生物学的滅菌インジケーター１００内部の「内部通気口」又は「通気チャネル」として機能することにより、気体（例えば、第２チャンバ１１１内に（例えば、生物学的滅菌インジケーター１００の閉鎖末端部１０５付近に）閉じ込められていた空気などの、排出される気体）が、生物学的滅菌インジケーター１００の第２チャンバ１１１から抜け出ることを可能にすることができる。一部の実施形態では、第２流体通路１６２は、作動の間に、第２チャンバ１１１内に存在する気体のための逃げ道、すなわち内部通気口を提供することにより、液体１２２が容器１２０から解放される際に、第１チャンバ１０９から第２チャンバ１１１内への液体１２２の移動を促進することができる。更には、又は代替として、一部の実施形態では、第２流体通路１６２は、滅菌の間に、第２チャンバ１１１内に存在する気体のための逃げ道、すなわち内部通気口を提供することにより、生物学的滅菌インジケーター１００の第２チャンバ１１１内への、及び芽胞１１５への、滅菌剤の移動を促進して、第２チャンバ１１１内への、より効率的な滅菌剤の浸入を可能にする。
単なる例として、図５及び図１０に示すように、第２流体通路１６２は、挿入部材１３０の一部分（例えば、チャネル１６９）、及びハウジング１０２の壁部１０８内（例えば、壁部１０８の内側表面内）に形成されるチャネル（又は溝、陥凹など）１６３の双方によって、少なくとも部分的に画定することができる。しかしながら、一部の実施形態では、第２流体通路１６２が、第２チャンバ１１１と、生物学的滅菌インジケーター１００の別の内部部分若しくは領域との間に、流体連通を提供するように、第２流体通路１６２を、完全にハウジング１０２で形成することができ、又は、生物学的滅菌インジケーター１００の他の構成要素の、様々な組み合わせで形成することができる点を理解するべきである。例えば、第２流体通路１６２は、ハウジング１０２及び挿入部材１３０の双方によって形成する必要はなく、これらの構成要素の一方、又は他の構成要素によって、形成することができる。更には、図５及び図１０に示すように、第２流体通路１６２の少なくとも一部分を画定する、チャネル１６３は、チャネル１６３が、ハウジング１０２の内側及び外側上で可視であるように、ハウジング１０２の外側表面及び内側表面内に成形される。しかしながら、ハウジング１０２の外側表面は、そのような形状を含む必要はなく、むしろ、一部の実施形態では、ハウジング１０２の外側表面は、実質的に均一又は無変化のまま維持することができ、ハウジング１０２（例えば、ハウジング１０２の壁部１０８）の内側表面が、チャネル１６３を含み得る。
更には、一部の実施形態では、挿入部材１３０又はハウジング１０２のいずれもが、それぞれ、チャネル１６９又はチャネル１６３を含むのではなく、むしろ、挿入部材１３０とハウジング１０２との間に、第２チャンバ１１１と流体連通する空間又は間隙が提供されるように、挿入部材１３０並びにハウジング１０２が成形及び寸法決めされ、そのような空間又は間隙が、第２流体通路１６２として機能する。
図７及び図９に更に示すように、一部の実施形態では、第１流体通路１６０及び／又は第２流体通路１６２は、壁部１１８、基材１１９、挿入部材１３０、及びハウジング１０２のうちの１つ以上によって、少なくとも部分的に画定することができる。更には、第１流体通路１６０及び第２流体通路１６２の少なくとも一方は、芽胞キャリア１３５、又はその一部分によって、少なくとも部分的に画定することができる。
一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００は、容器１２０が、第１の断裂していない状態にあるとき、以下の順序で配置構成される、以下の構成要素を含み得る：生物学的滅菌インジケーター１００のハウジング１０２の閉鎖末端部１０５、第２チャンバ１１１、基材１１９、挿入部材１３０、第１チャンバ１０９、容器１２０、ハウジング１０２（又はハウジング１０２の第２部分１０６）の開放末端部１０１。
例示の実施形態に示すように、第２流体通路１６２は、第２チャンバ１１１が、第１チャンバ１０９などの、生物学的滅菌インジケーター１００の別の部分に通気することを可能にし得る。一部の実施形態では、特に、第２流体通路１６２が、第２チャンバ１１１を、第１チャンバ１０９へ戻して通気する実施形態では、第２流体通路１６２は、第１流体通路１６０が第２チャンバ１１１に入る位置よりも上方（例えば、垂直上方）に配置される位置で、第２チャンバ１１１から出ることができる。換言すれば、一部の実施形態では、第２流体通路１６２は、第２チャンバ１１１から、第１流体通路１６０が第２チャンバ１１１に入る位置（例えば、以下で説明する、第１のレベルＬ１又は第２のレベルＬ２）よりも上方にある、生物学的滅菌インジケーター１００内の位置（例えば、以下で説明する、第４のレベルＬ４）まで、延在することができる。更には、一部の実施形態では、第２流体通路１６２が第１チャンバ１０９に入る位置は、第１流体通路１６０が第２チャンバ１１１に入る位置よりも上方（例えば、垂直上方）に配置することができる。
一部の実施形態では、第１流体通路１６０は、第２チャンバ１１１を、生物学的滅菌インジケーター１００の近位部分（例えば、第２チャンバ１１１に近接又は隣接して、例えば、第１のレベルＬ１及び／又は第２のレベルＬ２に配置される、第１チャンバ１０９の一部分）と流体結合するように配置することができ、第２流体通路１６２は、第２チャンバ１１１を、生物学的滅菌インジケーター１００の遠位部分（すなわち第２チャンバ１１１からより遠くに、例えば、以下で説明する第３のレベルＬ３、及び／又は第４のレベルＬ４に配置される、第１チャンバ１０９の一部分）と流体結合するように配置することができる。結果として、第２流体通路１６２が第１チャンバ１０９に入る位置は、第１流体通路１６０が第２チャンバ１１１に入る位置よりも、第２チャンバ１１１から遠くに配置することができる。
より具体的には、また単なる例として、図７及び図９を参照すると、一部の実施形態では、流体は、挿入部材１３０、基材１１９、ハウジング１０２、及び／又は第２チャンバ１１１の前方に概して配置される、第１のレベル、高さ、若しくは位置（例えば、長手方向位置）Ｌ１、並びに基材１１９内の開口１２１のレベルに概ね配置される、第２のレベル、高さ、又は位置（例えば、長手方向位置）Ｌ２などの、様々な場所で、第２チャンバ１１１に入ることができる。上述のように、流体が第２チャンバ１１１内に移動することを可能にする、第１チャンバ１０９と第２チャンバ１１１との間の様々な開口部及び空間を、第１流体通路１６０と総称することができる点を理解するべきである。図７に更に示すように、一部の実施形態では、気体（例えば、排出される気体）は、第２流体通路１６２を介して（すなわち流体が、第１流体通路１６０を介して第２チャンバ１１１内に移動する際に）、挿入部材１３０、基材１１９、ハウジング１０２、及び／又は第２チャンバ１１１の後方に概して配置される、第３のレベル、高さ、若しくは位置（例えば、長手方向位置）Ｌ３で、第２チャンバ１１１から抜け出ることができる。
図７及び図９に示す、生物学的滅菌インジケーター１００の垂直的な直立配向では、第３のレベルＬ３は、第１のレベルＬ１及び第２のレベルＬ２の双方以上に位置する。更には、一部の実施形態では、第３のレベルＬ３は、生物学的滅菌インジケーター１００の動作中（例えば、読み取り装置のウェル内に設置されるとき、滅菌の間、及び／又は作動の間）、依然として、第１のレベルＬ１及び第２のレベルＬ２の双方以上に位置することができる。すなわち一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００は、動作中に傾斜させることができる（例えば、図７若しくは図９の左手側に向けて、図４若しくは図６の右手側に向けて、図４若しくは図６の奥へ、及び／又は図７若しくは図９の手前に）。
第１のレベルＬ１、第２のレベルＬ２、及び第３のレベルＬ３は、単なる例として示されるが、しかしながら、第１流体通路１６０が第２チャンバ１１１に入る正確な場所、及び／又は第２流体通路１６２が第２チャンバ１１１から出る正確な場所は、図７及び図９に示すものとは異なるものにすることができる点を理解するべきである。
図７及び図９に示すように、第２流体通路１６２は、挿入部材１３０のチャネル１６９及び／又はハウジング１０２のチャネル１６３によって、少なくとも部分的に画定され、これらは、全般的に、以下の論考では単純に「チャネル」と称され、図示の実施形態のチャネル１６９及び／又はチャネル１６３の、少なくとも一部分を指すように、解釈することができる図示の実施形態では、チャネルは、第２チャンバ１１１内の任意の地点、又は第３のレベルＬ３に位置しているとして説明することができる、入口と、第４のレベル、高さ、又は位置（例えば、長手方向位置）Ｌ４に概して配置される、出口とを有する。図７及び図９に示すように、例えば、生物学的滅菌インジケーター１００の動作中には、チャネルの出口位置（すなわち第４のレベルＬ４）は、第１流体通路１６０が第２チャンバ１１１と接続する位置（すなわち第１のレベルＬ１及び／又は第２のレベルＬ２）よりも上方に、概して配置される。
換言すれば、第１流体通路１６０は、第１チャンバ１０９の第２（下方）末端部１１３を、第２チャンバ１１１の第１（上方）末端部１２４に、流体結合するように配置することができる。その一方で、第２流体通路１６２は、第２チャンバ１１１（例えば、第２チャンバ１１１の第１（上方）末端部１２４）を、第１チャンバ１０９の上方部分（例えば、第１（上方）末端部１１２）に、流体結合するように配置することができる。
更には、一部の実施形態では、第２流体通路１６２（又はチャネル）が第２チャンバ１１１と接続する位置又はレベルは、容器１２０が、その第２の断裂した状態にあるときに、液体１２２で最後に充填される、第２チャンバ１１１の部分に位置しているとして、説明することができる。
一部の実施形態では、容器１２０が、第２の断裂した状態にあり、第２チャンバ１１１が、液体１２２で少なくとも部分的に充填される場合、液体１２２は、あるレベル、高さ、又は位置（例えば、長手方向位置）Ｌを有し得、第２流体通路１６２は、そのレベルＬよりも下方の位置と、レベルＬよりも上方の位置との間に延在し得る。結果として、容器が第２の状態にあるとき、第２チャンバ１１１が、液体１２２で充填される際、第２チャンバ１１１は、第２流体通路１６２によって、継続的に通気することができる。
一部の実施形態では、第１流体通路１６０は、第１チャンバ１０９と第２チャンバ１１１との間の、主要又は一次的な流体連通路として機能することができ、第２流体通路１６２は、第２チャンバ１１１と第１チャンバ１０９との間の、補助的又は二次的な流体連通路としての役割を果たすことができる（例えば、第２流体通路１６２が、第１チャンバ１０９内に抜け出るものであって、生物学的滅菌インジケーター１００の別の部分に抜け出るものではない場合）。そのような実施形態では、第２流体通路１６２の総合的な空間、容積、及び／又は面積は、第１流体通路１６０のものよりも実質的に小さいものとすることができる。一部の実施形態では、第１流体通路１６０及び第２流体通路１６２の少なくとも一部分は、実質的に互いに離隔しているものとして、又は実質的に平行で交差しないものとして、説明することができる。一部の実施形態では、第１流体通路１６０及び第２流体通路１６２は、それぞれ、第１チャンバ１０９と第２チャンバ１１１との間で、実質的に長手方向に（例えば、長手方向ＤＬに実質的に平行に）延在することができる。
すなわち全般的には、（１）第１チャンバ１０９から第２チャンバ１１１への流体の移動の、少なくとも大半に対応するように構成される、第１流体通路１６０などの第１流体通路と、（２）第２チャンバ１１１からの気体を通気するように構成される、第２流体通路１６２などの第２流体通路とを含む、生物学的滅菌インジケーター１００は、１つのみの内部チャンバを含んでいたか、あるいは流体が第２チャンバ１１１に入る通路と同じ流体通路を介して、気体が第２チャンバ１１１から抜け出なければならないような、第１チャンバ１０９及び第２チャンバ１１１を接続する、１つのみの流体通路を含んでいた、生物学的滅菌インジケーター１００に勝る有利点を有する。
例示の実施形態に示すように、第１流体通路１６０及び第２流体通路１６２を構成することによって、一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００は、第２チャンバ１１１内に、滅菌剤及び／又は液体１２２を移動させる試みの結果として生じる恐れがある、あらゆる空気閉塞効果を、少なくとも部分的に排除することができる。更には、一部の実施形態では、第２流体通路１６２は、生物学的滅菌インジケーター１００が作動して、液体１２２が、重力により第２チャンバ１１１内に移動することを可能にする一方で、生物学的滅菌インジケーター１００は、液体１２２を第２チャンバ１１１内に移動させるために、生物学的滅菌インジケーター１００の上下を逆転させるか、又は他の方法で再配向することを必要とせずに、同じ配向（例えば、図４、５、７、及び図９に示すような、実質的に垂直的な直立配向）で維持される。
挿入部材１３０を引き続き参照すると、挿入部材１３０の突起部１５８は、比較的、剛性であり、固定されているものとして示される。すなわち一部の実施形態では、突起部１５８は、容器１２０がハウジング１０２内で移動する際に、容器１２０に対して、実質的に屈曲、歪曲、変形、又は他の方法で対処するように適合させることができない。むしろ、一部の実施形態では、図４〜７、及び図９に示すように、突起部１５８は、作動の前に、容器１２０を上に配置して無損傷で保持することができる、上方末端部１５９を有するように、それぞれ構成することができる。図４、５、及び図７に示すように、一部の実施形態では、突起部１５８は、例えば、楕円形又はカプセル形状の容器１２０が採用される場合、容器１２０を、その半曲末端部で断裂させるように配置することができる。
突起部１５８に、キャリア１３２の少なくとも一部分を形成させることの潜在的な１つの有利点は、容器１２０が断裂する際に、容器１２０の底部を非拘束的にすることができるため、比較的容易かつ確実に、液体１２２を、容器１２０から解放して、芽胞１１５に向けて移動させることができる点である。
そのような実施形態では、例えば、楕円形又はカプセル形状の容器１２０が採用される場合、挿入部材１３０を使用して、容器１２０の平坦面に実質的に垂直の方向で、容器１２０を断裂させることができる。そのような実施形態では、容器１２０を、その側面に沿って断裂させることは、容器１２０の下方末端部の周囲に、幾分の開放空間を維持することと共に達成されるため、容器１２０が断裂する際の、容器１２０から芽胞１１５の近位への液体１２２の移動を促進することができる。
上述のように、突起部１５８は、例えばハウジング１０２の第２部分１０６が、ハウジング１０２の第１部分１０４に対して移動する（例えば、第１の位置１４８から第２の位置１５０へと）ことに応答して、容器１２０がハウジング１０２に対して移動する（例えば、長手方向ＤＬに沿って）際に、容器１２０を断裂させるように適合させることができる。
一部の実施形態では、突起部１５８は、１つ以上の縁端部（例えば、テーパー形状の縁端部）若しくは尖端部を含むか、又は他の方法で、粉砕力を集中させるように構成して、突起部１５８に隣接する領域内での、容器１２０に対する圧力を増大させ、容器１２０を、より容易に、かつ１つ以上の所望の領域内で断裂させることを促進することができる。一部の実施形態では、そのような力の集中により、第２部分１０６を第１部分１０４に対して移動させて、容器１２０（又は、その一部分）を断裂させるために必要とされる、全体的な労力又は力を低減することができる。
図４〜７、及び図９に示すように、突起部１５８は、挿入部材１３０の基部１２７と一体的に形成されるが、しかしながら、突起部１５８は、その代わりに、ハウジング１０２の壁部１０８と一体的に形成することができる点を理解するべきである。更には、一部の実施形態では、突起部１５８は、ハウジング１０２に結合することができ、あるいは突起部１５８及び基部１２７は、別個の挿入部材によって提供することができる。そのような実施形態では、突起部１５８は、それぞれ、別個の挿入部材とすることができ、又は複数の突起部１５８を、１つ以上の挿入部材によって提供することができる。更には、挿入部材１３０は、壁部１１８に当接して、芽胞１１５の近位（例えば、ハウジング１０２の下方部分１１４）内への、第１部分の挿入部材１３０の移動を阻止するように構成することができる。
更には、一部の実施形態では、図４〜７、及び図９に示すように、突起部１５８は、長手方向ＤＬに沿って延在することができ、突起部１５８の長さ及び／又は厚さ（例えば、厚さは、長さに沿って変化し得る）を調整して、ハウジング１０２内の所望の位置、及び所望の方式での、容器１２０の断裂を制御することができる。突起部１５８の構成を、単なる例として、図４〜１０に示す。
全般的には、突起部１５８のそれぞれは、単なる例として、芽胞１１５に向けて、長手方向ＤＬに沿って厚さが増大する（例えば、容器１２０、又はハウジング１０２の中心に向けて、内側方向に）ものとして示される。そのような構成により、例えば、第２部分１０６が、第２の位置１５０に移動することに応答して、容器１２０が、芽胞１１５に向けて移動するにつれて、容器１２０に利用可能な断面積を減少させることができる。
更には、生物学的滅菌インジケーター１００は、単なる例として、２つの突起部１５８、及び側壁部１３１を含むものとして図３〜１０に示されるが、１つの突起部１５８、若しくは構造的に可能な限り多くの突起部１５８、及び他の構成を採用することができる点を理解するべきである。更には、突起部１５８は、ハウジング１０２の形状及び寸法、容器１２０の形状及び寸法、挿入部材１３０の形状及び寸法、並びに／あるいは容器１２０を断裂させるために所望される方式及び位置に応じて、所望されるように成形及び寸法決めすることができる。
上述のように、一部の実施形態では、ハウジング１０２の少なくとも一部分は、テーパー形状とすることができる（例えば、図６のテーパー形状部分１４６を参照）。結果として、ハウジング１０２内の断面積は、長手方向ＤＬに沿って、概して減少し得る。しかしながら、ハウジング１０２の内法寸法は、ハウジング１０２の外法寸法を変化させることなく、テーパー形状部分で、長手方向Ｄ１に沿って概して減少し得ることを理解するべきである。一部の実施形態では、ハウジング１０２の内側部分が、その長さに沿って先細となる場合であっても、ハウジング１０２の外法寸法は、その長さに沿って均一とすることができる。一部の実施形態では、１つ以上の突起部１５８のみが、長手方向ＤＬに沿って、厚さが変化し得る（すなわち容器１２０に向けて、例えば、半径方向で）ことにより、ハウジング１０２の寸法が変化しない場合であっても（例えば、ハウジング１０２が、内部又は外部のいずれにも、いずれのテーパー形状部分１４６を含まない場合であっても）、容器１２０が、作動の間にハウジング１０２内で移動するにつれて、容器１２０に利用可能な断面積は概して減少する。
図４〜１０に示すように、突起部１５８のそれぞれの、上方末端部１５９は、丸形、湾曲、又は弓状の表面を含み、この表面により、突起部１５８の上方末端部１５９の上方に、容器１２０が少なくとも部分的に設置される、第１の位置１４８から、突起部１５８の間（又はハウジング１０２の壁部１０８と１つ以上の突起部１５８との間）の、より小さい断面積の領域内に、容器１２０が少なくとも部分的に押し込められる位置への、容器１２０の移動を促進することができる。更には、丸形の上方末端部１５９は、容器１２０の時期尚早の破砕を阻止することができ、このことにより、生物学的滅菌インジケーター１００の時期尚早の作動（すなわち液体１２２の時期尚早の解放）を阻止することができる。
一部の実施形態では、図６に示すように、挿入部材１３０は、容器１２０を、突起部１５８の上方に、かつ１つ以上の突起部１５８の、内側方向を向く表面の、いずれかの部分に隣接する領域から離れて保持することにより、生物学的滅菌インジケーター１００の偶発的又は時期尚早の作動を阻止することが可能になるように、サイズ決定及び成形することができる。そのような構成はまた、衝撃又は材料の膨張（例えば、滅菌プロセスの間の熱曝露による）による、不用意な破砕も阻止することができる。
突起部１５８の上方末端部１５９によって、少なくとも部分的に形成することができる、キャリア１３２は、容器１２０の底部部分を保持するように構成することができ、突起部１５８は、容器１２０がハウジング１０２内に配置される際、容器１２０の底部付近の場所で、容器１２０を断裂させるように、配置することができる。そのような構成により、容器１２０が、その底部付近で破砕されることを可能にすることができ、容器１２０からの液体１２２の除去を促進することができ、このことにより、芽胞１１５への液体１２２の利用可能性を増進することができ、液体１２２を、芽胞１１５と（例えば、芽胞リザーバ１３６と）流体連通するように解放することの確実性を増進することができる。そのような構成は、単なる例として示されるが、しかしながら、突起部１５８は、任意の所望の方式で容器１２０を断裂させるように構成及び配置することができる点を理解するべきである。
本開示の一部の実施形態は、比較的小さい力を使用する、壊れやすい容器１２０の最適かつ安全な破砕を提供する一方で、生物学的滅菌インジケーター１００の芽胞領域（例えば、ハウジング１０２の第２チャンバ１１１）への液体１２２の移動を増進し、かつ／又は生物学的滅菌インジケーター１００の芽胞領域内での、液体１２２の封じ込めを増進する。更には、本開示の一部の実施形態は、生物学的滅菌インジケーター１００の検出チャンバ（例えば、第２チャンバ１１１）などの、生物学的滅菌インジケーター１００の特定領域に、液体を推進するように動作する。
図４〜１０に示す実施形態では、挿入部材１３０は、容器１２０の周りで、かつ／又は側壁部１３１の周りで、ほぼ等しく離間する、２つの突起部１５８を含むものとして示される。しかしながら、一部の実施形態では、側壁部１３１は、側壁部１３１から半径方向内側に延在する、１つの中実の（例えば、実質的に環状、又は半環状の）突起部１５８を含み得る。更には、一部の実施形態では、側壁部１３１は、ハウジング１０２の内側表面の周囲で、図示されるものよりも更に延在し得る。しかしながら、図４〜１０に示すもののような、より狭い（例えば、角度寸法で）１つ以上の突起部１５８を採用することにより、実質的に一定又は実質的に非閉塞の滅菌剤通路１６４を、容器１２０の周囲に提供することができる。
挿入部材１３０が、１つ以上の突起部１５８を含む場合であれ、又は側壁部１３１を含む場合であれ、挿入部材１３０は、ハウジング１０２内の一定の場所内に、容器１２０を保持して、滅菌の間、実質的に一定の滅菌剤通路１６４を提供するように構成することができる。例えば、容器１２０が、作動の前に（例えば、滅菌の間に）、ハウジング１０２内で、移動又は回転する（例えば、半径方向及び／又は長手方向に）ことを可能にするのではなく、挿入部材１３０は、実質的に一定の位置に、容器１２０を保持することができ、このことにより、不用意な遮断の機会が殆ど又は全く伴わない、容器１２０の外側表面とハウジング１０２の内側表面との間の、滅菌剤の実質的に一定かつ比較的非閉塞の通路を可能にすることができる。
例示の実施形態に示すように、挿入部材１３０は、実質的に水平に、又は生物学的滅菌インジケーターの長手方向ＤＬに対して垂直に配置される（例えば、挿入部材１３０が、生物学的滅菌インジケーター内に配置される場合）、１つ以上の突起部１６１を更に含み得る。突起部１６１は、「第２突起部」又は「水平突起部」と称することができ、その一方で、容器１２０を保持及び／又は破砕するために使用される突起部１５８は、「第１突起部」又は「垂直突起部」と称することができる。第２突起部１６１は、基部１２７のように下向きに角度付けされない。結果として、第２突起部１６１は、様々な目的に関して使用することができる。例えば、第２突起部１６１は、容器１２０を断裂させる力の下で、挿入部材１３０を安定させる（例えば、生物学的滅菌インジケーター１００のハウジング１０２内の所望の位置に、挿入部材１３０を保持することを援助する）ことができる。更には、第２突起部１６１は、容器１２０が断裂した後に、容器１２０の断裂部分を保持及び／又は回収することにより、芽胞の増殖、及び／又は芽胞の増殖の検出に悪影響を及ぼす恐れがある、生物学的滅菌インジケーター内の芽胞の近位への、そのような部分の移動を阻止するように、機能することができる。芽胞１１５に至る固体の移動を阻止しつつ、芽胞１１５に至る流体の移動を依然として可能にする、第２突起部１６１の他の形状及び構成を採用することができる。
一部の実施形態では、挿入部材１３０（例えば、基部１２７）は、ハウジング１０２の第２チャンバ１１１（すなわち下方部分１１４）内への流体の移動（例えば、液体１２２の移動）を促進又は可能にすること；ハウジング１０２の第２チャンバ１１１内への、断裂した容器１２０の断片又は諸部分（例えば、固体）の移動を最小限に抑えること、すなわち断裂した容器１２０の諸部分を回収及び／又は保持すること；並びに／あるいは、ハウジング１０２の第２チャンバ１１１から外への、芽胞１１５及び／又はシグナルの拡散を最小限に抑えることのうちの、１つ以上に関して適合させることができる。例えば、一部の実施形態では、基部１２７は、格子又はフィルターとして機能するように構成することができる。一部の実施形態では、芽胞の増殖は、蛍光指示薬／分子（例えば、蛍光色素分子）又は他のマーカーによって判定される。一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００内での、作動の後の液体のレベルが、芽胞１１５の場所よりも上方である場合には、そのような分子若しくはマーカー、又は芽胞１１５自体が、芽胞リザーバ１３６から離れる方向に、若しくは芽胞リザーバ１３６から外へ、かつ潜在的には、ハウジング１０２の第２チャンバ１１１から外へ、移動又は拡散する恐れがある。結果として、生物学的滅菌インジケーター１００の諸部分（例えば、挿入部材１３０）は、生物学的滅菌インジケーター１００の第２チャンバ１１１から外への、様々な指示薬、分子、及び／又はマーカーの望ましくない拡散を阻止するように構成することができる。一部の実施形態では、上述のように、基材１１９もまた、そのような望ましくない拡散を阻止することができる。
図４〜７に示す実施形態では、挿入部材１３０の基部１２７は、概してＵ字形又は馬蹄形であり、滅菌の間の芽胞１１５に向けた滅菌剤の移動、及び作動の間の芽胞１１５に向けた液体１２２の移動を促進する、中心開口１７７（図５を参照）を含む。基部１２７の馬蹄形は、ハウジング１０２の上方部分１１６（すなわち第１チャンバ１０９）と下方部分１１４（すなわち第２チャンバ１１１）との間の開口部を増大させることができるが、しかしながら、この形状は、単なる例として示すものであり、他の形状を採用することもできる。
一部の実施形態では、挿入部材１３０は、下向きに延出する１つ以上の突起部１２７を含むものとして説明することができ、この突起部１２７は、壁部１１８、又は生物学的滅菌インジケーター１００の別の内部構造に当接するか、若しくは他の方法で結合して、挿入部材１３０のための基部若しくは支持部を提供し、作動の前のハウジング１０２に対する挿入部材１３０及び容器１２０の移動を阻止し、かつ／又は作動の間の容器１２０の破砕を援助するように適合される。結果として、一部の実施形態では、基部１２７は、その代わりに、「第３突起部」１２７と称することができる。
例示の実施形態に示すように、一部の実施形態では、挿入部材１３０は、生物学的滅菌インジケーター１００の第１チャンバ１０９内に、完全に存在するように構成することができるため、挿入部材１３０が、検査又は検出プロセスを潜在的に妨害する可能性がある、第２チャンバ１１１内へと、延在することがない。更には、挿入部材１３０は、第２チャンバ１１１内への、生物学的滅菌インジケーター１００の他の部分（例えば、断裂した容器１２０）の移動を阻止するように構成することができる。
図示の実施形態の挿入部材１３０は、中心の長手方向対称軸に関して、概して対称であることにより、２つの同一の第１突起部１５８、２つの同一の第２突起部１６１、及び２つの同一の第３突起部１２７が存在する。しかしながら、挿入部材１３０は、いずれの対称軸も含む必要はなく、第１突起部１５８は、互いに同じである必要はなく、第２突起部１６１は、互いに同じである必要はなく、第３突起部１２７は、互いに同じである必要はない。挿入部材１３０、並びに様々な突起部１５８、１６１、及び突起部１２７は、滅菌剤通路１６４を制御して、例えば、生物学的滅菌インジケーター１００の殺傷／生存率を調整し、容器１２０の不用意な断裂を阻止し、ハウジング１０２内での容器１２０の移動を促進し、ハウジング１０２と接合若しくは係合し、かつ／又は容器１２０の破砕を制御するように、サイズ決定及び配置することができる。
単なる例として、図示の挿入部材１３０は、少なくとも以下を含む一体型デバイスであるとして示される：作動の前に容器１２０を保持するための手段、作動の間に容器１２０を断裂させるための手段；ハウジング１０２内での容器１２０の移動を可能にするための手段；実質的に均一な滅菌剤通路１６４を提供するための手段、作動の後の断裂した容器１２０の諸部分を回収及び／又は保持する（又はハウジング１０２の第２チャンバ１１１内への、断裂した容器１２０の諸部分の移動を、少なくとも部分的に阻止する）ための手段；並びに／あるいは作動後の、ハウジング１０２の第２チャンバ１１１から第１チャンバ１０９への、芽胞１１５及び／又はシグナルの拡散を最小限に抑えるための手段。しかしながら、一部の実施形態では、挿入部材１３０は、単一の一体型デバイスの一部とすることができない、複数の部分を含み得、それらの部分のそれぞれを、上記の機能のうちの１つ以上を行なうように適合させることができる点を理解するべきである。
挿入部材１３０が「挿入部材」と称される理由は、図示の実施形態では、上記の機能を実行するデバイスが、ハウジング１０２のリザーバ１０３（具体的には、第１チャンバ１０９）内に挿入することができるデバイスであるためである。しかしながら、挿入部材１３０は、その代わりに、ハウジング１０２自体、又は生物学的滅菌インジケーター１００の別の構成要素によって提供することができ、必ずしもハウジング１０２内に挿入される必要がないことを理解するべきである。用語「挿入部材」が、簡略性のために、本開示の全体を通して説明されるが、そのような用語は限定することを意図するものではないことを理解するべきであり、上記の機能のうちの１つ以上を実行する他の等価の構造を、挿入可能な挿入部材１３０の変わりに、又は挿入可能な挿入部材１３０と組み合わせて使用することができる点を理解するべきである。更には、図示の実施形態では、挿入部材１３０は、ハウジング１０２内に、具体的にはハウジング１０２の第１部分１０４（及び第１チャンバ１０９）内に挿入可能であり、かつ、そこから取り外し可能である。しかしながら、挿入部材１３０がハウジング１０２内に挿入可能な場合であっても、挿入部材１３０は、ハウジング１０２から取り外し可能である必要はなく、むしろ、挿入部材１３０を所望の場所内に配置した後は、ハウジング１０２からの挿入部材１３０の取り外しを阻止する方式で、ハウジング１０２に固定結合させることができる点を理解するべきである。
一部の実施形態では、ハウジング１０２の少なくとも一部分、例えば、ハウジング１０２の下方部分１１４は、電磁放射線の波長、又は様々な波長に対して透過的（例えば、可視光線光学検出方法が採用される場合、可視光線に対して透過的）とすることができ、このことにより、芽胞の増殖の検出を促進することができる。すなわち一部の実施形態では、図６、７及び図９に示すように、ハウジング１０２の少なくとも一部分は、検出窓１６７を含むか、又は検出窓１６７を形成することができる。
更には、一部の実施形態では、図６に示すように、ハウジング１０２の少なくとも一部分、例えば、下方部分１１４は、１つ以上の平面壁部１６８を含み得る。そのような平面壁部１６８により、芽胞の増殖の検出（例えば、光学検出）を促進することができる。更には、上記で示し、かつ説明されるように、ハウジング１０２の第１部分１０４の壁部１０８は、段差部１５２、段差部１２３、及びテーパー形状壁部、すなわち段差部１７０などの、１つ以上の段差状若しくはテーパー形状領域を含み得る。テーパー形状壁部１７０は、ハウジング１０２の下方部分、すなわち検出部分１１４の、全体的な厚さ及びサイズを低減するように機能し得ることにより、ハウジング１０２の外法寸法が、内法寸法に加えて低減される。生物学的滅菌インジケーター１００の下方部分１１４の、そのようなサイズ及び／又は厚さの低減により、検出を促進することができる。更には、段差部及び／又はテーパー形状壁部１２３、１５２、１７０などの、１つ以上の機構を有することは、生物学的滅菌インジケーター１００が、読み取り又は検出デバイスに、１つの配向のみで結合されることを可能にし得るため、生物学的滅菌インジケーター１００が、読み取り装置に対して「キー止め」され、このことにより、ユーザーのエラーを最小限に抑え、検出プロセスの確実性を増進することができる。一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００の１つ以上の部分を、読み取り装置に対してキー止めすることができる。
本開示の生物学的滅菌インジケーターは、全般的には、滅菌の間、液体１２２及び芽胞１１５を、隔離させながらも比較的接近させて維持する（例えば、内蔵型の生物学的滅菌インジケーター１００の内部で）ことにより、滅菌プロセスに晒した後に、液体１２２と芽胞１１５とを容易に組み合わせることができる。液体１２２及び芽胞１１５は、検出プロセスの間、インキュベートすることができ（例えば、読み取り装置１２は、生物学的滅菌インジケーター１００をインキュベートすることができる）、又は生物学的滅菌インジケーター１００は、検出プロセスの前にインキュベートすることができる。一部の実施形態では、液体１２２を使用して芽胞をインキュベートする場合、室温よりも高いインキュベーション温度を使用することができる。例えば、一部の実施形態では、インキュベーション温度は、少なくとも約３７℃であり、一部の実施形態では、インキュベーション温度は、少なくとも約５０℃（例えば、５６℃）であり、一部の実施形態では、少なくとも約６０℃である。一部の実施形態では、インキュベーション温度は、約６０℃以下であり、一部の実施形態では、約５０℃以下、一部の実施形態では、約４０℃以下である。
検出プロセスは、芽胞１１５からの（例えば、芽胞リザーバ１３６内部からの）、又は芽胞１１５の周囲を取り囲む液体１２２からの、検出可能な変化を検出するように適合させることができる。すなわち検出プロセスは、様々な特性を検出するように適合させることができ、それらの特性としては、電磁放射線（例えば、紫外バンド、可視バンド、及び／又は赤外バンドでの）、蛍光、発光、光散乱、電子的特性（例えば、コンダクタンス、インピーダンスなど、又はこれらの組み合わせ）、濁度、吸収度、ラマン分光光度、偏光度など、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。そのような特性の検出は、蛍光計、分光光度計、比色計などのうちの１つ以上、又はこれらの組み合わせによって実施することができる。蛍光、可視光線などを測定する実施形態などの、一部の実施形態では、検出可能な変化は、特定波長で検出することによって測定される。
芽胞及び／又は液体１２２は、芽胞の生存度の標示である生化学反応の結果として、上記の特性のうちの１つ以上を生じさせるように適合させる（例えば標識する）ことができる。結果として、検出可能な変化が存在しない（例えば、ベースライン又はバックグラウンドの読み取り値と比較して）ことは、有効な滅菌プロセスを意味し得るが、その一方で、検出可能な変化は、無効な滅菌プロセスを意味し得る。一部の実施形態では、検出可能な変化は、上記の特性のうちの１つ以上が変化する（例えば、蛍光の増大、濁度の減少など）際の速度を含み得る。
一部の実施形態では、芽胞の生存度は、酵素活性を利用することによって、判定することができる。参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｔｎｅｒらの米国特許第５，０７３，４８８号、表題「Ｒａｐｉｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａ Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｃｙｃｌｅ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ Ｒｅａｄ−ｏｕｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ」で説明されるように、特定のタイプの芽胞に関して、滅菌プロセスの有効性を判定するために利用することができる特に有用な特性を有する酵素を、特定することができる。そのような特性としては、（１）酵素が、１×１０６個の試験微生物の集団を、約６の対数で減少させる（すなわち試験微生物の増殖の欠如によって測定される、約０個の集団まで）ために十分な滅菌条件に供される場合に、その酵素に関する基質系との反応によって測定されるような、「バックグラウンド」と等しい残留活性を有すること、及び（２）酵素が、１×１０６個の試験微生物の集団を、少なくとも１の対数で、ただし６の対数未満で減少させるためにのみ十分な滅菌条件に供される場合に、その酵素基質系との反応によって測定されるような、「バックグラウンド」よりも高い酵素活性を有することを、挙げることができる。酵素基質系は、酵素によって反応が引き起こされ、検出可能な変化によって明白であるような、検出可能な酵素修飾生成物を生じさせる物質、あるいは物質の混合物を含み得る。
一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００は、生物学的滅菌インジケーター１００が、例えば芽胞１１５付近に配置される１つのみの検出窓（例えば、図６の検出窓１６７）を含む、片面モードで検定することができる。しかしながら、一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００は、２つ以上の検出窓（例えば、ハウジング１０２の下方部分１１４の、双方の平行壁部１６８の、全て又は一部分によって形成される窓）を含み得ることにより、生物学的滅菌インジケーター１００は、２つ以上の検出窓を介して検定することができる。複数の検出窓を採用する実施形態では、検出窓を、左右に並べて（片面モードと同様に）配置することができ、又は検出窓を、互いに対して一定の角度（例えば、９０度、１８０度など）で配向することができる。
全般的には、芽胞１１５は、リザーバ１０３と流体連通する、芽胞リザーバ１３６の内部に配置される。一部の実施形態では、芽胞リザーバ１３６は、リザーバ１０３の一部分（例えば、第２チャンバ１１１の一部分）を形成する。図７に示すように、リザーバ１０３は、滅菌の間、環境と流体連通して（例えば、開口１０７を介して）、滅菌プロセスの間、滅菌剤がリザーバ１０３に入り、芽胞１１５を滅菌することを可能にする。容器１２０は、滅菌の間、液体１２２を収容して、液体１２２が、滅菌の間に、芽胞１１５、リザーバ１０３、及び滅菌剤と流体連通することを阻止するように構成することができる。
ここで、芽胞１１５及び／又は芽胞リザーバ１３６の様々な詳細をより詳細に説明する。
一部の実施形態では、芽胞１１５は、ハウジング１０２の下方部分１１４内に直接配置することができ、又は芽胞１１５は、芽胞リザーバ１３６（例えば、芽胞キャリア１３５によって提供される）などの、芽胞リザーバ内に配置することもできる。芽胞１１５が、ハウジング１０２の下方部分１１４内に直接配置される場合であれ、又は芽胞リザーバ内に配置される場合であれ、芽胞１１５は、様々な方式で提供することができる。一部の実施形態では、芽胞１１５は、生物学的滅菌インジケーター１００内の所望の場所内に配置して、乾燥させることができる、芽胞懸濁液中に存在し得る。一部の実施形態では、芽胞１１５は、生物学的滅菌インジケーター１００内の所望の場所内に配置及び／又は固定することができる、基材（図示せず）上に提供することができる。一部の実施形態は、乾燥形態で提供される芽胞１１５と基材上に提供される芽胞１１５との組み合わせを含み得る。
一部の実施形態では、この基材は、芽胞１１５を支持し、かつ／又は、芽胞１１５を所望の所在部位内に維持することに役立つように、配置することができる。そのような基材としては、様々な材料を挙げることができ、それらの材料としては、紙、ポリマー（例えば、ハウジング１０２に関して上記に列挙されるポリマーのうちのいずれか）、接着剤（例えば、アクリレート、天然若しくは合成ゴム、シリコーン、シリコーンポリ尿素、イソシアネート、エポキシ、又はこれらの組み合わせ）、織布、不織布、微多孔性材料（例えば、微多孔性ポリマー材料）、反射性材料（例えば、金属箔）、ガラス、磁器、セラミック、ゲル形成材料（例えば、グアーガム）、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。更には、又は代替的には、そのような基材は、親水性コーティングを含むか、又は親水性コーティングに結合させて、液体１２２を芽胞１１５と緊密に接触させることを、促進することができる（例えば、採用される液体１２２が、水性である場合）。更には、又は代替的には、そのような親水性コーティングは、液体１２２と芽胞１１５とを流体結合するように配置される、いずれの流体通路にも適用することができる。一部の実施形態では、親水性コーティングに加えて、又は親水性コーティングの代わりに、液体１２２が、優先的に移動して芽胞１１５と接触するように、ハウジング１０２の他の部分（例えば、ハウジング１０２の下方部分１１４）及び／又は芽胞リザーバ１３６の他の部分に、疎水性コーティングを適用することができる。
生物学的滅菌インジケーター１００の一部の実施形態は、芽胞キャリア１３５を含まない。むしろ、芽胞リザーバ１３６が、ハウジング１０２の下方部分１１４自体によって提供され、芽胞１１５は、下方部分１１４内に配置することができ、下方部分１１４の内側表面若しくは壁部に吸着させることができ、又はこれらの組み合わせとすることができる。一部の実施形態では、芽胞１１５は、ハウジング１０２の下方部分１１４内に配置される、基材上に提供することができる。
一部の実施形態では、芽胞１１５は、１つの芽胞の所在部位内に、又は複数個の芽胞の所在部位内に配置することができ、それらの所在部位の全ては、リザーバ１０３内、ハウジング１０２の下方部分１１４内、及び／又は芽胞リザーバ１３６内のいずれかに配置することができる。一部の実施形態では、複数の芽胞の所在部位を有することにより、滅菌剤及び液体１２２に対する芽胞の曝露を最大化することができ、製造性を改善することができ（例えば、生物学的滅菌インジケーター１００内部の凹部内に、芽胞の所在部位のそれぞれを定置することによって、芽胞の定置を促進することができる）、検出特性を改善することができる（例えば、１つの大きい芽胞の所在部位の中央の芽胞は、それほど容易に検出することができないため）。複数個の芽胞の所在部位を採用する実施形態では、芽胞の各所在部位は、異なる既知数の芽胞を含み得、かつ／又は芽胞の各所在部位は、複数個の芽胞のタイプを試験することができるように、異なる芽胞を含み得る。複数のタイプの芽胞を採用することによって、生物学的滅菌インジケーター１００を、様々な滅菌プロセスに関して使用することができ、芽胞の特定の所在部位を、特定の滅菌プロセスに関して分析することができ、又は複数のタイプの芽胞を使用して、滅菌プロセスの有効性若しくは信頼性を、更に試験することができる。
更には、一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００は、複数個の芽胞リザーバ１３６を含み得、各芽胞リザーバ１３６が、１つ以上の芽胞１１５の所在部位を含み得る。複数個の芽胞リザーバ１３６を採用する、一部の実施形態では、複数個の芽胞リザーバ１３６を、リザーバ１０３と流体連通して配置することができる。
一部の実施形態では、芽胞１１５は、芽胞１１５及び／又は芽胞リザーバ１３６に密着するか、若しくは上から装着されるように適合される、カバー（図示せず）で覆うことができる。そのようなカバーは、製造、滅菌、及び／又は使用の間、生物学的滅菌インジケーター１００の所望の領域の範囲内に、芽胞を維持することに役立ち得る。このカバーは、採用される場合には、実質的に検出プロセスを妨げることがなく、かつ／又は対象の電磁放射線波長に対して少なくとも部分的に透過性である材料で、形成することができる。更には、カバーの材料構成に応じて、一部の実施形態では、このカバーにより、芽胞１１５に沿った液体１２２（例えば、栄養培地）のウィッキングを促進することができる。一部の実施形態では、このカバーはまた、毛管チャネル、親水性の微多孔性線維若しくは膜など、又はこれらの組み合わせなどの、芽胞リザーバ１３６内への（又は芽胞１１５への）流体の流れを促進するための機構も含み得る。更には、一部の実施形態では、このカバーは、シグナルを分離するか、又はシグナルを増強することができ、このことにより検出を促進することができる。そのようなカバーは、芽胞１１５が、芽胞リザーバ１３６内部に配置される場合であれ、又はハウジング１０２の下方部分１１４内に直接配置される場合であれ、採用することができる。更には、そのようなカバーは、複数個の芽胞の所在部位を採用する実施形態で、採用することができる。このカバーとしては、様々な材料を挙げることができ、それらの材料としては、紙、ポリマー（例えば、ハウジング１０２に関して上記に列挙されるポリマーのうちのいずれか）、接着剤（例えば、アクリレート、天然若しくは合成ゴム、シリコーン、シリコーンポリ尿素、イソシアネート、エポキシ、又はこれらの組み合わせ）、織布、不織布、微多孔性材料（例えば、微多孔性ポリマー材料）、ガラス、磁器、セラミック、ゲル形成材料（例えば、グアーガム）、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００は、反射性表面、白色表面、黒色表面、又は表面の光学特性を最適化するために好適な別の表面改変などの、改変された内側表面を更に含み得る。反射性表面（例えば、金属箔によって提供される）を配置することにより、検定又は検出デバイスから芽胞リザーバ１３６内へ送られるシグナルを反射し、かつ／あるいは芽胞リザーバ１３６内部で生成されるあらゆるシグナルを、検定デバイスに向けて反射して戻すことができる。結果として、この反射性表面は、生物学的滅菌インジケーター１００からのシグナルを改善する（例えば、その強度を改善する）ように機能することができる。そのような反射性表面は、ハウジング１０２の内側表面、ハウジング１０２の内側表面に結合される材料、芽胞リザーバ１３６の内側表面、芽胞リザーバ１３６の内側表面に結合される材料などによって提供することができ、又は反射性表面は、芽胞基材の一部分を形成するか、若しくは芽胞基材に結合することができ、あるいはこれらの組み合わせとすることができる。
同様に、一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００は、検定デバイスから芽胞リザーバ１３６内へ送られる特定のシグナルを増大及び／又は減少させ、かつ／あるいは芽胞リザーバ１３６内部で生成される特定のシグナルを増大及び／又は減少させるように配置される、白色表面及び／又は黒色表面を更に含み得る。単なる例として、白色表面を使用して、シグナルを増強することができ、黒色表面を使用して、シグナル（例えば、ノイズ）を低減することができる。
一部の実施形態では、芽胞１１５は、所望の表面上での芽胞１１５の固定化を助長するために、機能化表面上に配置することができる。例えば、そのような機能化表面は、ハウジング１０２の内側表面、芽胞リザーバ１３６の内側表面によって提供することができ、芽胞基材の一部分を形成するか、若しくは芽胞基材に結合することなどが可能であり、又はこれらの組み合わせとすることができる。
一部の実施形態では、芽胞１１５は、微細構造表面又は微細複製表面（例えば、それらの全てが参照により本明細書に組み込まれる、ＨａｌｖｅｒｓｏｎらのＰＣＴ国際公開第２００７／０７０３１０号、Ｈａｎｓｃｈｅｎらの米国特許出願公開第２００３／０２３５６７７号、及びＧｒａｈａｍらのＰＣＴ国際公開第２００４／０００５６９号で開示されるもののような、微細構造表面など）上に配置される（例えば、コーティング又は別の適用方法によって適用される）。例えば、そのような微細構造表面は、ハウジング１０２の内側表面によって提供することができ、芽胞リザーバ１３６の内側表面によって提供することができ、芽胞基材の一部分を形成するか、若しくは芽胞基材に結合することなどが可能であり、又はこれらの組み合わせとすることができる。
一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００は、液体１２２が容器１２０から解放される際に、芽胞１１５及び液体１２２と組み合わされるように配置される、ゲル形成材料を更に含み得る。例えば、このゲル形成材料は、芽胞１１５の近傍に（例えば、芽胞リザーバ１３６内に）、ハウジング１０２の下方部分１１４内に、配置することができ、芽胞基材の一部分を形成するか、若しくは芽胞基材に結合することなどが可能であり、又はこれらの組み合わせとすることができる。そのようなゲル形成材料は、液体１２２が芽胞と接触する際に、芽胞及び栄養素を含む、ゲル（例えば、ヒドロゲル）若しくはマトリクスを形成することができる。ゲル形成材料（例えば、グアーガム）は、水和するとゲルを形成する能力を有し、シグナル（例えば、蛍光）の局在化を援助することができ、芽胞１１５を定位置に固定することができ、芽胞１１５及び／又は芽胞リザーバ１３６からの信号の拡散を、最小限に抑えることを助けることができ、かつ／あるいは検出を増進することができるため、特に有用とすることができる。
一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００は、吸収材料又はウィッキング材料を更に含み得る。例えば、ウィッキング材料は、芽胞１１５の近傍に（例えば、芽胞リザーバ１３６内に）配置することができ、芽胞基材の少なくとも一部分を形成するか、若しくは芽胞基材に結合することなどが可能であり、又はこれらの組み合わせとすることができる。そのようなウィッキング材料としては、液体１２２を芽胞と緊密に接触させることを促進することができる、多孔質のウィッキングパッド、浸漬パッドなど、又はこれらの組み合わせを挙げることができる。
一部の実施形態では、壊れやすい容器１２０は、壊れやすい容器１２０の、所望の方式での断裂を促進するように構成することができる。例えば、一部の実施形態では、壊れやすい容器１２０の下方部分は、その下方部分が、壊れやすい容器１２０の別の部分よりも優先的に断裂するように、より薄く、かつ／又はより低い強度の材料で形成することができる。更には、一部の実施形態では、壊れやすい容器１２０は、壊れやすい容器１２０の、所望の方式での断裂を促進するように配置される、様々な機構を含み得、それらの機構としては、薄く、かつ／若しくは低い強度の区域、切り込み線、ミシン目など、又はこれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。
壊れやすい容器１２０は、液体１２２が壊れやすい容器１２０の内部に収容される、第１の閉鎖状態と、壊れやすい容器１２０が断裂して、液体１２２がリザーバ１０３及び／又は芽胞リザーバ１３６内に解放され、芽胞１１５と流体連通する、第２の開放状態とを有し得る。
一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００は、手動で作動させることができる（例えば、第２部分１０６を、第２の位置１５０に移動させることができる）。一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００は、読み取り装置によって作動させることができる（例えば、生物学的滅菌インジケーター１００が、読み取り装置内に配置される際に）。一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００は、そのような読み取り装置とは無関係のデバイス（例えば、作動デバイス）を使用して、例えば、生物学的滅菌インジケーター１００を読み取り装置のウェル内に配置する前に、そのデバイス内に生物学的滅菌インジケーター１００を配置することによって作動させることができる。一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００は、読み取りデバイス、読み取りデバイスとは無関係のデバイス、及び手動による作動のうちの、２つ以上の組み合わせによって作動させることができる。
生物学的滅菌インジケーター１００、及び読み取り装置などの別のデバイスの、一方若しくは双方は、壊れやすい容器１２０の時期尚早又は偶発的な断裂を阻止するように、更に構成することができる。例えば、一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００、作動デバイス、又は読み取り装置は、ハウジング１０２の第２部分１０６が第２の位置１５０へと移動することを、所望されるまで阻止するように配置される、ロック又はロッキング機構を含み得る。そのような実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００は、そのロックが移動するか、取り外されるか、又はロック解除されるまで、作動させることができない。更には、又は代替的には、一部の実施形態では、生物学的滅菌インジケーター１００、作動デバイス、及び／又は読み取り装置は、ハウジング１０２の第２部分１０６が、作動の後に、第２の位置１５０から第１の位置１４８へと移動して戻ることを阻止するように配置される、ロック又はロッキング機構を含み得る。
一部の実施形態では、例示の実施形態に示すように、ハウジングの少なくとも一部分を、平坦にすることができ（例えば、平行壁部１６８）、芽胞リザーバ１３６に対して実質的に平面的とすることができ、また平行壁部１６８の一方若しくは双方、又はその一部分（例えば、検出窓１６７）は、その壁部１６８（又は検出窓１６７）の少なくとも１つの寸法が、芽胞リザーバ１３６及び／又は芽胞１１５の所在部位の、少なくとも１つの寸法に実質的に一致するように、サイズ決定することができる。換言すれば、壁部１６８又はその一部分（例えば、検出窓１６７）は、芽胞リザーバ１３６及び／又は芽胞１１５の所在部位の断面積と、実質的に同じサイズである断面積を含み得る。壁部１６８／検出窓１６７と、芽胞リザーバ１３６及び／又は芽胞１１５の所在部位との、そのようなサイズの一致により、検出又は検定プロセスの間に検出されるシグナルを最大化することができる。あるいは、又は更には、壁部１６８又は検出窓１６７は、リザーバ１０３と一致するようにサイズ決定することができる（例えば、少なくとも１つの寸法又は断面積を、一致するようにサイズ決定することができる）。検出区画間のそのようなサイズの一致により、芽胞の検定及び検出を改善することができる。
図４〜１０に示す生物学的滅菌インジケーター１００は、少なくとも、芽胞１１５が配置される生物学的滅菌インジケーター１００の部分が、比較的薄い（すなわち「ｚ方向寸法」が最小化される）ことにより、芽胞から壁部１６８（又は検出窓１６７）までの光路長が最小化され、かつ／又は液体１２２（又は栄養培地）中の妨害物質のいずれの影響も最小限に抑えられる。
使用時には、生物学的滅菌インジケーター１００は、滅菌プロセス用の滅菌バッチと共に、定置することができる。滅菌の間、滅菌剤は、リザーバ１０３（すなわち第１チャンバ１０９及び第２チャンバ１１１）、芽胞リザーバ１３６、及び芽胞１１５と、主に滅菌剤通路１６４を介して流体連通することにより、滅菌剤は、芽胞に到達して、滅菌済みの芽胞を作り出すことができる。上述のように、第１流体通路１６０と第２流体通路１６２との協働により、第２チャンバ１１１内への、具体的には生物学的滅菌インジケーター１００の閉鎖末端部１０５内への、滅菌剤の移動を促進することができる。更には、滅菌の間、壊れやすい容器１２０は閉鎖状態にあり、少なくとも部分的に、挿入部材１３０のキャリア１３２によって、無損傷で保持される。壊れやすい容器１２０が、閉鎖状態にあるとき、液体１２２は、滅菌剤から防護され、リザーバ１０３（具体的には、ハウジング１０２の下方部分１１４によって少なくとも部分的に形成される、第２チャンバ１１１）、芽胞リザーバ１３６、芽胞１１５、又は滅菌剤通路１３６とは流体連通しない。
滅菌は、容器１２０が第１の状態にあるとき、第１流体通路１６０を介して、第１チャンバ１０９から第２チャンバ１１１へ滅菌剤を移動させることと、第１チャンバ１０９から第２チャンバ１１１への滅菌剤の移動に応答して、又は滅菌剤の移動を促進するために、第２流体通路１６２を介して、第２チャンバ１１１から外へ排出気体（例えば、閉じ込められた空気）を移動させることとを更に含み得る。
滅菌に続いて、生物学的滅菌インジケーター１００を使用して、その滅菌プロセスの有効性を判定することができる。ハウジング１０２の第２部分１０６は、従前に第１の位置１４８にロックされている場合には、ロック解除して、第１の位置１４８（図６を参照）から第２の位置１５０（図７を参照）に移動させることにより、生物学的滅菌インジケーター１００の作動を引き起こすことができる。第２部分１０６のそのような移動により、壊れやすい容器１２０を、ハウジング１０２内で、例えば、長手方向ＤＬに沿って、突起部１５８の上方末端部１５９の上方の位置から、突起部１５８の内側の内部の位置まで移動させることができ、このことにより、壊れやすい容器１２０を断裂させることができる。壊れやすい容器１２０を断裂させることにより、壊れやすい容器１２０を、その閉鎖状態から、その開放状態へと変化させ、液体１２２を、リザーバ１０３内に解放して、芽胞リザーバ１３６及び芽胞１１５と流体連通させることができる。液体１２２は、芽胞のための栄養培地（例えば、発芽培地）を含み得るか、又は液体１２２は、乾燥形態（例えば、粉末又は錠剤の形態）の栄養培地に接触して、栄養培地を形成することができるため、滅菌済みの芽胞及び栄養培地を含む、混合物が形成される。次いで、この混合物を、検出若しくは検定プロセスの前に、又はそのプロセスの間、インキュベートすることができ、生物学的滅菌インジケーター１００を、芽胞の増殖の標示に関して検査することができる。
作動は、容器１２０が第２の状態にあるとき、第１流体通路１６０を介して、第１チャンバ１０９から第２チャンバ１１１へ液体１２２を移動させることと、第１流体通路１６０を介した、第１チャンバ１０９から第２チャンバ１１１への液体１２２の移動に応答して、又は液体１２２の移動を促進するために、第２流体通路１６２を介して、第２チャンバ１１１から外へ排出気体（例えば、閉じ込められた空気）を移動させることとを更に含み得る。
芽胞１１５の検出可能な変化を検出するために、液体１２２と芽胞１１５とが組み合わされた直後に、生物学的滅菌インジケーター１００を検定して、ベースラインの読み取り値を獲得することができる。その後は、このベースラインの読み取り値からの、あらゆる検出可能な変化を、検出することができる。生物学的滅菌インジケーター１００は、継続的若しくは断続的に、監視及び測定することができる。一部の実施形態では、インキュベーション工程の一部分又は全体は、検出可能な変化を測定する前に実施することができる。一部の実施形態では、インキュベーションは、ある１つの温度で（例えば、３７℃で、５０〜６０℃で、など）実施することができ、検出可能な変化の測定は、異なる温度で（例えば、室温で、２５℃、又は３７℃で）実施することができる。
生物学的滅菌インジケーター１００の読み出し時間（すなわち滅菌プロセスの有効性を判定するための時間）は、一部の実施形態では、８時間未満とすることができ、一部の実施形態では、１時間未満、一部の実施形態では、３０分未満、一部の実施形態では、１５分未満、一部の実施形態では、５分未満、一部の実施形態では、１分未満とすることができる。
実施形態
実施形態１は、生物活性の検出方法であって、
１つ以上の既定の生物活性の発生源を含み得るサンプルと、
第１の吸光度スペクトルを有する第１の指示試薬を含む、第１の指示薬システムであって、第１の既定の生物活性によって、この第１の指示試薬を、第１の生物学的誘導体に変換させることができる、第１の指示薬システムと、
既定の生物活性によって、第２の発光スペクトルを有する第２の生物学的誘導体に変換される第２の指示試薬を含む、第２の指示薬システムと、
水性混合物から第１の指示試薬を受容及び濃縮する基材とを、提供する工程と、
サンプル、第１の指示試薬、及び第２の指示試薬を含む、第１の水性混合物を形成する工程と、
第１の水性混合物を基材と流体連通させて、第１の指示試薬の濃度が、その第１の水性混合物中の第１の指示試薬の濃度よりも低い、第２の水性混合物を形成する工程と、
第２の生物学的誘導体からの蛍光の有無を検出する工程とを含み、
第１の吸光度スペクトルが、第２の発光スペクトル内に存在する波長の少なくとも一部分内に、検出可能な吸光度を含む、生物活性の検出方法である。
実施形態２は、第２の生物学的誘導体からの蛍光の有無を検出する工程が、第２の水性混合物中の蛍光の有無を検出することを含む、実施形態１の方法である。
実施形態３は、基材を観察して、第１の指示試薬又は第１の生物学的誘導体を検出する工程を更に含む、実施形態１又は実施形態２の方法である。
実施形態４は、第１の水性混合物中の第１の指示試薬の濃度が、通常であれば検出可能な量の第２の生物学的誘導体の検出を、阻止するために十分なものである、前述の実施形態のいずれか１つの方法である。
実施形態５は、生体細胞の増殖を促進するための栄養素を提供する工程を更に含み、第１の水性混合物を形成する工程が、その栄養素を含む混合物を形成することを含む、前述の実施形態のいずれか１つの方法である。
実施形態６は、滅菌剤に生物活性を晒す工程を更に含む、前述の実施形態のいずれか１つの方法である。
実施形態７は、滅菌剤が、蒸気、エチレンオキシド、過酸化水素、ホルムアルデヒド、及びオゾンからなる群から選択される、実施形態６の方法である。
実施形態８は、一定の期間、生物活性を温度シフトに晒す工程を更に含む、前述の実施形態のいずれか１つの方法である。
実施形態９は、第１の指示試薬が、発色団を含み、第１の生物学的誘導体を検出する工程が、色を検出することを含む、前述の実施形態のいずれか１つの方法である。
実施形態１０は、第１の指示試薬が、発色性指示薬を含む、実施形態９の方法である。
実施形態１１は、第１の指示試薬が、ｐＨ指示薬又は酵素基質を含む、実施形態９又は実施形態１０の方法である。
実施形態１２は、第１の指示試薬が、ブロモクレゾールパープル、ブロモクレゾールグリーン、コンゴレッド、及びメチルオレンジからなる群から選択される、実施形態１１の方法である。
実施形態１３は、第２の指示試薬が、蛍光発生化合物を含む、前述の実施形態のいずれか１つの方法である。
実施形態１４は、蛍光発生化合物が、蛍光発生酵素基質を含む、実施形態１３の方法である。
実施形態１５は、第２の生物学的誘導体の有無を検出する工程が、第２の生物学的誘導体の量を測定することを更に含む、前述の実施形態のいずれか１つの方法である。
実施形態１６は、第１の生物学的誘導体の有無を検出する工程が、第１の生物学的誘導体の量を測定することを更に含む、前述の実施形態のいずれか１つの方法である。
実施形態１７は、第１の生物学的誘導体の量を測定することが、第２の水性混合物の、基材に関連しない部分内で測定される色の量を、色標準と比較することを含む、実施形態１６の方法である。
実施形態１８は、
第１の指示試薬又は第２の生物学的誘導体を検出する、計器を提供する工程と、
その計器を使用して、第１の指示試薬又は第２の生物学的誘導体を検出する工程とを、更に含む、前述の実施形態のいずれか１つの方法である。
実施形態１９は、
第１の指示試薬及び第２の生物学的誘導体を検出する、計器を提供する工程と、
その計器を使用して、第１の指示試薬及び第２の生物学的誘導体を検出する工程とを、更に含む、前述の実施形態のいずれか１つの方法である。
実施形態２０は、生物活性の検出方法であって、
第１チャンバ及び第２チャンバを含む、ハウジングと、
第１の水性液体を収容する容器であって、この容器は、第１チャンバ内に配置され、容器の少なくとも一部分が壊れやすく、この液体が、第１の吸光度スペクトルを有する第１の指示試薬を含む、第１の指示薬システムと、第２の既定の生物活性によって、第２の発光スペクトルを有する第２の生物学的誘導体に変換される第２の指示試薬を含む、第２の指示薬システムとを含み、第１の既定の生物活性によって、第１の指示試薬を、第１の生物学的誘導体に変換させることができ、第１の吸光度スペクトルが、第２の発光スペクトルの波長の少なくとも一部分内に、検出可能な吸光度を含む、容器と、
第２チャンバ内に配置される、第２の既定の生物活性の発生源と、
第１の水性液体から第１の指示試薬を受容及び濃縮する基材であって、ハウジング内に配置される基材とを含む、生物学的滅菌インジケーターを提供する工程と、
第１の水性液体を基材と流体連通させて、第１の指示試薬の濃度が、その第１の水性液体中の第１の指示試薬の濃度よりも低い、第２の水性液体を形成する工程と、
第２の水性混合物中の第２の生物学的誘導体からの蛍光の有無を検出する工程とを含む、生物活性の検出方法である。
実施形態２１は、第１の水性液体を基材と流体連通させる工程が、壊れやすい容器の少なくとも一部分を、断裂させることを含む、実施形態２０の方法である。
実施形態２２は、生物学的滅菌インジケーターが、ハウジング内に配置される破砕装置を更に含み、壊れやすい容器を断裂させることが、容器及び破砕装置を互いに対して押し付けることを含む、実施形態２１の方法である。
実施形態２３は、生物学的滅菌インジケーターのハウジングが、
第１部分と、
第１部分に結合するように適合される、第２部分とを含み、この第２部分が、第１部分に結合される場合、第１部分に対して、第１の位置と第２の位置との間で移動可能であり、
ハウジングの第２部分を、第１の位置から第２の位置に移動させる工程を更に含む、実施形態２０又は実施形態２１の方法である。
実施形態２４は、ハウジングが長手方向を含み、ハウジングの第２部分を移動させる工程が、ハウジングの第２部分を長手方向で移動させることを含む、実施形態２３の方法である。
実施形態２５は、ハウジングの第２部分を、第１の位置から第２の位置に移動させる工程に応答して、ハウジング内で容器を移動させることを更に含む、実施形態２３の方法である。
実施形態２６は、ハウジング内で容器を移動させることにより、容器を断裂させる、実施形態２５の方法である。
実施形態２７は、
第１の吸光度スペクトルを有する第１の指示試薬を含む、第１の指示薬システムであって、第１の既定の生物活性によって、この第１の指示試薬を、第１の生物学的誘導体に変換させることができる、第１の指示薬システムと、
既定の生物活性によって、第２の発光スペクトルを有する第２の生物学的誘導体に変換される第２の指示試薬を含む、第２の指示薬システムと、
液体媒質を保持するように構成される槽と、
水性混合物から第１の指示試薬を受容及び濃縮する基材と、
槽を受容して、第１の指示試薬又は第２の生物学的誘導体を検出するように構成される計器とを含み、
第１の吸光度スペクトルが、第２の発光スペクトル内に存在する波長の少なくとも一部分内に、検出可能な吸光度を含む、既定の生物活性を検出するためのシステムである。
実施形態２８は、プロセッサを更に含む、実施形態２７のシステムである。
実施形態２９は、計器が、液体媒質の温度を調節するように更に構成される、実施形態２７又は実施形態２８のシステムである。
実施形態３０は、計器が、第１の指示試薬及び第２の生物学的誘導体の双方を検出するように構成される、実施形態２７〜２９のいずれか１つのシステムである。
本発明を、以下の実施例によって例示する。具体的な実施例、材料、量、及び手順は、本明細書に記載される本発明の範囲及び趣旨に従って、広範に解釈されるものとして理解されたい。
参考実施例１−ブロモクレゾ−ルパープル（ＢＣＰ）の吸光度スペクトル。
この参考実施例は、ブロモクレゾ−ルパープルの吸光度スペクトルを示す。
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より得たブロモクレゾ−ルパープル（カタログ番号Ｂ−５８８０）を、ｐＨ ７．３のリン酸緩衝生理食塩水中に、０．００４の濃度で溶解させた。この溶液を、石英キュベット内に定置し、ＴＥＣＡＮ ＩＮＦＩＮＩＴＥ Ｍ２００ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ ＵＳ（Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ））に提供される、１ｃｍキュベットアダプターを使用して、紫外可視吸光度スペクトルを走査した。この走査パラメーターを、表１に提示する。
結果を、図２に示されるグラフで示す。吸光度のピークは、約３００ｎｍ、約３８０ｎｍ、及び約６００ｎｍの波長で認めることができる。
Figure 0006259052
参考実施例２：７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン（４−メチルウンベリフェロン）の発光スペクトル。
この参考実施例は、４−メチルウンベリフェロンの発光スペクトルを示す。
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より得た、４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）、カタログ番号ｍ１３８１を、ｐＨ ７．３のリン酸緩衝生理食塩水中に、０．００４ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた。この溶液を、石英キュベット内に定置し、ＴＥＣＡＮ ＩＮＦＩＮＩＴＥ Ｍ２００ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒに提供される、１ｃｍキュベットアダプターを使用して、発光スペクトルを記録した。この走査パラメーターを、表２に提示する。
結果を、図２に示されるグラフで示す。発光のピークは、約４５０ｎｍの波長で認めることができる。
Figure 0006259052
参考実施例３−４ＭＵの検出に対するＢＣＰの影響
この参考実施例は、同じ溶液中に２種の化合物が存在する場合の、４ＭＵの蛍光の検出に対するＢＣＰの影響を示す。
実施例２で説明されるように調製した、４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）の原液を、リン酸緩衝生理食塩水中に、表３に示す濃度まで、段階希釈した。ブロモクレゾ−ルパープル（ＢＣＰ）の原液を、実施例１で説明されるように、リン酸緩衝生理食塩水中に調製した。このブロモクレゾ−ルパープル（０．０３ｍｇ／ｍＬの最終濃度）を、表３に示す、４ＭＵのそれぞれの溶液と混合した。それぞれの溶液の各３部のアリコート（１００マイクロリットル／ウェル）を、９６ウェルプレート内に装填し、ＴＥＣＡＮ ＩＮＦＩＮＩＴＥ Ｍ２００ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを使用して、各ウェル内での蛍光を測定した。励起波長は３５０ｎｍとし、検出は４２０ｎｍとした。相対蛍光単位（ＲＦＵ）として列挙される結果を、表３に示す。このデータは、試験された４ＭＵのあらゆる濃度で、溶液中のブロモクレゾ−ルパープルの存在が、測定可能な蛍光の減少をもたらしたことを示す。
Figure 0006259052
この結果は、３部の複製の平均である。全ての値は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）で報告される。
参考実施例４．−液体培地からのＢＣＰの吸着
この参考実施例は、増殖培地から基材材料上への、ＢＣＰの吸着を示す。
水１リットル当り、１７ｇの細菌用ペプトン、０．１７ｇのＬ−アラニン、及び０．０３ｇのブロモクレゾ−ルパープルｐＨ指示薬染料からなる、芽胞増殖培地溶液を調製した。この栄養培地溶液のｐＨを、０．１Ｎの水酸化ナトリウムで、７．６に調節した。
６０個のホウケイ酸ガラス管（１２ｍＬ、ＶＷＲ、カタログ＃５３２８３−８０２）のそれぞれに、１．０ｍＬの調製済み増殖培地を添加して、ライナーなしキャップクロージャー（ＶＷＲ、カタログ＃ ６６０１０−６８０）で蓋をした。
２つの異なる基材材料を評価した：ＧＥ荷電ナイロン（ＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ Ｌａｂｓｔｏｒｅ（Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ，ＭＮ）より入手可能な、ＭＡＧＮＡＰＲＯＢＥ、０．４５マイクロメートル荷電ナイロン膜、品番ＮＰ０ＨＹ０００１０）、及び紙（Ｗｈａｔｍａｎ Ｉｎｃ．ＵＳＡ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）より入手可能な、Ｗｈａｔｍａｎグレード１Ｃｈｒセルロースクロマトグラフィー用ペーパー）。
２つの基材材料のそれぞれの、２０個のストリップを、４ｍｍ×１０ｍｍのサイズに切り出した。全てのストリップを、Ｐｒｏｐｐｅｒ ＣＨＥＸ−ＡＬＬ ＩＩ Ｉｎｓｔａｎｔ Ｓｅａｌｉｎｇ Ｐｏｕｃｈ（Ｐｒｏｐｐｅｒ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｉｎｃ．（Ｌｏｎｇ Ｉｓｌａｎｄ Ｃｉｔｙ，ＮＹ））内に定置して、ＡＭＳＣＯ滅菌器（Ｓｔｅｒｉｓ（Ｍｅｎｔｏｒ，ＯＨ））内で、１２１℃の蒸気液体サイクルで、３０分間、それらを滅菌することによって、予備滅菌した。
これらの滅菌済みの基材ストリップを、パウチから無菌状態で取り出して、ガラス管に移動させ、２０個の管のそれぞれにつき５つのナイロン基材のストリップ、及び異なる２０個の管のそれぞれにつき５つの紙基材のストリップとした。
Ｇ．ステアロサーモフィルスの芽胞（ＡＴＣＣ ７９５３）を収容する、分解した、蒸気滅菌器用１２９２ ＡＴＴＥＳＴ Ｒａｐｉｄ Ｒｅａｄｏｕｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ（３Ｍ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ））から、芽胞ストリップを取得した。この芽胞ストリップを、それぞれ約６．４ｍｍ×６．４ｍｍの、４等分に切り出し、表４に従って、また以下で更に説明するように、ガラス管に添加した。１２９２ ＡＴＴＥＳＴの芽胞ストリップの１片（６．４ｍｍ×６．４ｍｍ）を、それぞれが５片のナイロン基材及び増殖培地を収容する、１０個のガラス管のそれぞれに添加した。芽胞ストリップの１片を、各管が５片のワットマン紙及び増殖培地を収容する、１０個のガラス管のそれぞれに添加した。芽胞ストリップの１片を、各管が増殖培地のみを収容し、基材を収容しない、１０個のガラス管のそれぞれに添加した。残りの３０個の管である、５片のナイロン基材を収容する１０個の管、５片の紙基材を収容する１０個の管、及び基材を収容しない１０個の管には、芽胞ストリップ片を添加しなかった。
Figure 0006259052
上記のサンプルのそれぞれのうちの、２つの管を、１分の時点で、以下の観察及び分析に関して選択した。管の中にある間のナイロン又は紙の基材材料の色と、周囲を取り囲む液体増殖培地の色とを、基材が培地よりも暗いか又は明るいかに関して比較した。増殖培地を収容するガラス管から取り出したときの、基材材料の色を、観察及び記録した。
Ｘ−Ｒｉｔｅ ５３０Ｐ濃度計（Ｘ−Ｒｉｔｅ（Ｇｒａｎｄ Ｒａｐｉｄｓ ＭＩ））を使用して、濃度測定読み取り値を取得する前に、ナイロン基材及び紙基材のストリップを管から取り出して、ＫＩＭＷＩＰＥ（Ｋｉｍｂｅｒｌｙ−Ｃｌａｒｋ）上に定置した。Ｘ−Ｒｉｔｅ ５３０Ｐ濃度計に対する光学濃度設定は、Ｖフィルターの結果を提供する「色」に設定した。基材のΔＥの結果に関して、選択されたＰａｎｔｏｎｅ ２６６５Ｕ及びＰａｎｔｏｎｅ １０２Ｕと「比較」するように、Ｘ−Ｒｉｔｅ濃度計を設定した。ＣＩＥ７６色差式を使用して、各ＰａｎｔｏｎｅでのΔＥを計算した。ΔＥの値は、Ｌ＊Ａ＊Ｂ色空間内での、測定された点から基準値のＰａｎｔｏｎｅの色までの距離である。より低いΔＥは、測定された色が、より基準値に近いことを示す。約２．５のΔＥの値は、人間の眼が色を識別するための、ほぼ最小の閾値である。使用する２つの基準値は、Ｐａｎｔｏｎｅ ２６６５Ｕ（薄い紫色）、及びＰａｎｔｏｎｅ １０２Ｕ（明るい黄色）とした。これらの２つの値は、「色相環」上で正反対に位置するものではないため、２６６５ＵでのΔＥの増大が、必ずしも１０２ＵでのΔＥの正確な減少を意味するものではないことに留意されたい。換言すれば、２６６５ＵでのΔＥは、何物かが、より「紫色」になったか否かを示すのみであり、何物かが、より「黄色」になったか否かを示すものではない。
各管内の培地の色もまた、観察及び記録した（表５）。３重に、各管から２００μＬの量の培地を取り出して、９６ウェルプレート（透明な底部を有する、黒色の組織培養処理９６ウェルプレート、ＣＯＳＴＡＲ ＣＬＳ−３６０３−４８ＥＡ）内に定置し、Ｇｅｎ ５ソフトウェアでＳＹＮＥＲＧＹ ４分光光度計を使用して、５９０ｎｍ及び４３０ｎｍでの光学濃度を測定した。ＯＤ測定値は、モノクロメーター（ＢｉｏＴｅｋ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ））を使用して取得した。
残りの管を、５６℃でインキュベートした。３０分、１時間、４時間、及び２４時間のインキュベーションの、それぞれの時間で、各サンプルのうちの２つの管をインキュベーターから取り出して、目視観察し、かつ上述のように計器測定した。
Figure 0006259052
全てのバイアル瓶内の培地は、４時間の読み取り後までは、紫色に維持された。芽胞を有さないサンプルは、２４時間後も紫色に維持された。芽胞を有する全てのサンプルは、ＢＣＰ ｐＨ指示薬染料によって示される、培地のｐＨの減少をもたらす細胞の増殖により、２４時間までには、視覚的に黄色に変化した。
それぞれの時間間隔で、培地から基材を取り出す前に、基材の色を、培地の色と比較した（表６を参照）。２つの色の間に何らかの差異が存在した場合には、その差異を記録した。基材としてナイロン基材を使用した、全ての場合で、基材は、周囲の培地よりも暗い色合いを呈した。基材として紙を使用した、全ての場合で、基材は、周囲の培地よりも明るい色合いを呈した。これらの結果は、指示試薬を受容及び濃縮する点で、ナイロン基材が、紙基材よりも優れていることを示す。
Figure 0006259052
殆どの場合、「暗い」とは、基材が培地よりも視覚的に暗い紫色であることを意味したが、２４時間の、芽胞を有するナイロンは、例外として、より暗い黄色であった。殆どの場合、「明るい」とは、基材が培地よりも視覚的に明るい紫色であることを意味したが、２４時間の、芽胞を有する紙は、例外として、より明るい黄色であった。
芽胞を有するサンプルに関しては、２４時間での、５９０ｎｍでのＯＤ測定値は、黄色の強度の差異を示すものではない。それゆえ、２４時間での、４３０ｎｍで取得されたＯＤ値のみを評価した。
Figure 0006259052
紙基材の存在下での、芽胞を有する培地サンプル、及び芽胞を有し、基材を有さない培地サンプル（対照）の、２４時間の４３０ｎｍでの読み取り値は、双方とも、表７に示すように、それぞれ、０．８２７及び０．８３５の、同様のＯＤの値を有する。しかしながら、ナイロンの存在下での、芽胞を有する培地サンプルは、対照又は紙基材を有するサンプルよりも０．５ ＯＤ単位小さい、わずか０．２７１のＯＤを有するものであった。このことは、ナイロンの存在下での培地の黄色の強度が、指示試薬を受容及び濃縮するナイロン基材により、低減されたことを示す。
Figure 0006259052
全ての値は、ｎ＝６（３つの読み取り値×２つの管）を表す。
＊ｎ＝５の読み取り値：管１に関する３つの読み取り値、及び管２に関する２つの読み取り値。
＊＊＊ サンプルの色が黄色であることにより、５９０ｎｍでのＯＤは、培地の色を正確に測定するものではない。
１分での、基材を有さない対照（芽胞あり及び芽胞なし）の吸光度を、培地に関する初期ベースラインＯＤ測定値と見なした。表８は、１分の時点でさえ、ナイロンの存在下での、芽胞を有するサンプル培地の、５９０ｎｍでのＯＤ（１．１２４）が、芽胞を有する、紙の存在下でのサンプル培地のＯＤ（１．４０４）、又は芽胞を有する対照（１．４０２）よりも低いものであったことを示す。この差異は、培地の紫色の強度が、ＢＣＰ指示試薬を急速に受容及び濃縮するナイロン基材により、既に低減されたことを示す。２４時間での、ナイロンの存在下での、芽胞を有さないサンプル培地の、５９０ｎｍでのＯＤは、紙の存在下での培地のＯＤ（１．７０８）、又は芽胞を有さない対照サンプルのＯＤ、１．８１２よりも遙かに低い、１．１２２であった。
Figure 0006259052
Figure 0006259052
＊＊＊ ２４時間での、芽胞を有する基材サンプルの色は、黄色であり、Ｖフィルターは、基材の色を正確に測定するものではない。
Figure 0006259052
＊＊＊ ２４時間での、芽胞を有する基材サンプルの色は、黄色であり、Ｖフィルターは、基材の色を正確に測定するものではない。
Figure 0006259052
上記の表は、様々な長さの時間にわたって、培地（芽胞あり及び芽胞なし）に晒した後の、基材の濃度測定読み取り値を示す。各基材に関する、時間０の読み取り値は、基材サンプルを培地中に定置する前の、初期濃度測定読み取り値である。紫色である基材を評価する場合、Ｖフィルター及びΔＥ（Ｐａｎｔｏｎｅ ２６６５Ｕ）が、最大の対比を示すものであった。ナイロン基材に関する、Ｖフィルターでの平均濃度測定読み取り値は、表１０に示すように、実験全体を通して上昇し、高いまま維持された（唯一の例外は、「芽胞あり」のサンプルに関して、基材が２４時間の時点で黄色であったときである）。対照的に、紙基材に関する濃度測定読み取り値は、それらの時点の全体にわたって、ほぼ一定のまま維持された。同様に、表１１に示す、ナイロン基材のΔＥ（Ｐａｎｔｏｎｅ ２６６５Ｕ）の値は、実験全体を通して、概して減少した（唯一の例外は、「芽胞あり」のサンプルに関して、基材が２４時間の時点で黄色であったときである）。このことは、ナイロン基材が、ＢＣＰ指示試薬を受容及び濃縮していることを示すものであった。一方で、対照的に、紙基材に関するΔＥ（Ｐａｎｔｏｎｅ ２６６５Ｕ）の値は、ほぼ一定のまま維持された。
表１２は、２４時間の時点で、ナイロン基材に関するΔＥ（Ｐａｎｔｏｎｅ １０２Ｕ）の値が、紙基材に関するＥ（Ｐａｎｔｏｎｅ １０２Ｕ）の値よりも大幅に低いものであったことを示し、ナイロン基材が、紙基材よりもｐａｎｔｏｎｅ １０２Ｕの色に近いもの（より明るい黄色）であったことを示す。
参考実施例５ ２回の２４時間のインキュベーション後の、液体培地からの、ナイロン基材のＢＣＰの吸着
この参考実施例は、液体増殖培地からナイロン基材上への、ＢＣＰの吸着を示す。
実施例４で使用したものと同じ培地及び構成要素を、実施例５で使用した。４つのガラス管のそれぞれに、１．０ｍＬの調製済み増殖培地を添加した。１２９２ ＡＴＴＥＳＴの芽胞ストリップの１片を、約６．４ｍｍ×６．４ｍｍに切り出して、各ガラス管に添加した。これらの管を、インキュベーター内に、５６℃で２４時間定置して、Ｇ．ステアロサーモフィルス細胞の増殖を助長させた。２４時間のインキュベーションの後、ナイロン基材の５つ（５）のストリップ（それぞれ４ｍｍ×１０ｍｍに切り出す）を、２つ（２）の管に添加した。これらの管を、インキュベーター内に、５６℃で更に２４時間定置した。管に対する２回目の２４時間のインキュベーション期間の後（ナイロン基材の添加の２４時間後）、以下の分析を実行した。ナイロン基材片を管から取り出し、ＫＩＭＷＩＰＥ上に定置して、基材ストリップの濃度測定読み取り値を取得した。各管から、２００μＬの３つのアリコートを採取し、９６ウェルプレート内に定置した。それらの培地の、４３０ｎｍでの光学濃度を測定した。
Figure 0006259052
ｎ＝１２（４つの管のそれぞれからの、３つの読み取り値）
ｎ＝３（１つの対照の管からの１つの読み取り値）
表１３は、ナイロン基材を管に添加した２４時間後の培地の、基材を添加しなかった対照と比較した、４３０ｎｍでのＯＤの減少を示す。２つのサンプルの間のＯＤ測定値の差異は、サンプル培地中に存在する黄色の量の差異を示す。このことは、ナイロンの存在下での、培地の黄色の強度が、指示試薬を受容及び濃縮するナイロン基材により、低減されたことを示す。
Figure 0006259052
ｎ＝１０（５つのナイロン基材のストリップ×２つの管）
表１４は、既に２４時間インキュベートされていた、芽胞を有する培地の管に、添加された２４時間後の、ナイロン基材のΔＥ（１０２Ｕ）の値を示す。この値を、培地中に定置しなかったナイロン基材と比較した。２つのサンプルの間のΔＥ測定値の差異は、芽胞を有する（黄色の）培地に晒された基材の色が、培地に晒されなかった基材よりもｐａｎｔｏｎｅ １０２Ｕ（明るい黄色）に近いことを示す。
参考実施例６−様々な基材による、液体培地からのＢＣＰの吸着
この参考実施例は、様々な基材材料上への、液体増殖培地からのＢＣＰの吸着を示す。
水１リットル当り、１７グラムの細菌用ペプトンＣ、０．１７グラムのＬ−アラニン、及び０．０３グラムのブロモクレゾ−ルパープル（ＢＣＰ）ｐＨ指示薬染料からなる、芽胞増殖培地溶液を調製した。この栄養培地溶液のｐＨを、０．１Ｎの水酸化ナトリウムで、７．６に調節した。
ホウケイ酸ガラス管（１２ｍＬ、ＶＷＲ、カタログ＃５３２８３−８０２）のそれぞれに、１．０ｍＬの調製済み増殖培地を添加して、ライナーなしキャップクロージャー（ＶＷＲ、カタログ＃ ６６０１０−６８０）で蓋をした。
４つの異なる基材材料を評価した：（１）ＧＥ荷電ナイロン（ＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ Ｌａｂｓｔｏｒｅ（Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ，ＭＮ）より入手可能な、ＭＡＧＮＡＰＲＯＢＥ、０．４５マイクロメートル荷電ナイロン膜、品番ＮＰ０ＨＹ０００１０）；（２）第４級アミン基でプラスに荷電した、ＢＩＯ−ＲＡＤ高強度ナイロン膜（ＢＩＯ−ＲＡＤ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）より入手可能な、ＺＥＴＡ−ＰＲＯＢＥ ＧＴ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、カタログ＃１６２−０１９６）；（３）０．２μＭのニトロセルロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）より入手可能、カタログ＃ ＬＣ−２０００）、及び（４）０．２μＭの二フッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）より入手可能、カタログ＃ ＬＣ−２００２）。基材材料のそれぞれの、幾つかのストリップを、各ガラス管に関する１つ（１）のストリップにとって十分な、４ｍｍ×１０ｍｍのサイズに切り出した。
全てのストリップを、Ｐｒｏｐｐｅｒ ＣＨＥＸ−ＡＬＬ ＩＩ Ｉｎｓｔａｎｔ Ｓｅａｌｉｎｇ Ｐｏｕｃｈ（Ｐｒｏｐｐｅｒ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｉｎｃ．（Ｌｏｎｇ Ｉｓｌａｎｄ Ｃｉｔｙ，ＮＹ））内に定置して、ＡＭＳＣＯ滅菌器（Ｓｔｅｒｉｓ（Ｍｅｎｔｏｒ，ＯＨ））内で、蒸気液体サイクル（１２１℃での）で３０分間、それらを滅菌することによって、予備滅菌した。次いで、それらのストリップを、各管に無菌状態で移動させた。各基材の２つの管を、基材を収容しない２つの対照の管と共に評価した。
以下の観察及び分析を、０時間、３０分、１時間、４時間、及び２４時間の時点で実行した：（１）各管内の基材材料の色を、同じ管の周囲の培地の色と比較した。（暗いか、又は明るいか）、（２）基材材料を管から取り出し、ＫＩＭＷＩＰＥ上に定置して吸い取り乾燥させ、次いで上述のように、Ｖフィルターで濃度測定読み取り値を取得し、（３）各管から２００μＬの培地を取り出して、９６ウェルプレート（透明な底部を有する、黒色の組織培養処理９６ウェルプレート、ＣＯＳＴＡＲ ＣＬＳ−３６０３−４８ＥＡ）内へと、３重に移動させ、Ｇｅｎ ５ソフトウェアでＳＹＮＥＲＧＹ ４分光光度計を使用して、５９０ｎｍでの培地の光学濃度を測定した。ＯＤ測定値は、モノクロメーター（ＢｉｏＴｅｋ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ））を使用して取得した。
残りの管を、５６℃でインキュベートした。３０分、１時間、４時間、及び２４時間のインキュベーションの、それぞれの時間で、各サンプルのうちの２つの管を、インキュベーターから取り出して、目視観察し、かつ上述のように計器測定した。
Figure 0006259052
暗い＝基材が、培地よりも視覚的に暗い紫色であった
明るい＝基材が、培地よりも視覚的に明るい紫色であった
それぞれの読み取りで、基材を培地から取り出す前に、培地の色を、基材の色と視覚的に比較した。基材の色と培地の色との差異を観察して、表１５内に報告した。培地との接触の３０分後に、ナイロン基材材料は、双方とも培地よりも視覚的に暗いものとなり、実験全体を通して、より暗いまま維持された。
Figure 0006259052
表１６は、様々な長さの時間にわたって培地に晒された後の、基材材料の濃度測定読み取り値を示す。各基材に関する、時間０の読み取り値は、培地中に定置されている基材の、３０秒以内の初期濃度測定読み取り値である。全ての場合で、ナイロン基材の濃度測定は、３０分以内で上昇し、実験全体を通して高いまま維持された。
Figure 0006259052
表１７は、各基材材料を収容する管から、指定の時間で取り出された培地の、平均光学濃度読み取り値を示す。各時点で、いずれのナイロン基材の存在下にあった培地に関するＯＤも、ニトロセルロース又はＰＶＤＦのいずれかを含む培地に関するＯＤ読み取り値よりも、低いものであったことに注目するべきである。更には、ニトロセルロース又はＰＶＤＦは、ＯＤ読み取り値の変化を殆ど示すことなく、対照のＯＤの値に極めて類似している。
参考実施例７−液体培地からのメチルレッド（ＭＲ）の基材吸着
この参考実施例は、様々な基材材料上への、液体増殖培地からのＢＣＰの吸着を示す。
水１リットル当り、１７グラムの細菌用ペプトン、０．１７グラムのＬ−アラニン、及び０．０３グラムのメチルレッドｐＨ指示薬染料からなる、芽胞増殖培地溶液を調製した。この栄養培地溶液のｐＨを、０．１Ｎの塩酸で、４．２に調節した。
ホウケイ酸ガラス管（１２ｍＬ、ＶＷＲ、カタログ＃５３２８３−８０２）のそれぞれに、１．０ｍＬの調製済み増殖培地を添加して、ライナーなしキャップクロージャー（ＶＷＲ、カタログ＃ ６６０１０−６８０）で蓋をした。
２つの異なる基材材料を評価した：ＧＥ荷電ナイロン（ＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ Ｌａｂｓｔｏｒｅ（Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ，ＭＮ）より入手可能な、ＭＡＧＮＡＰＲＯＢＥ、０．４５マイクロメートル荷電ナイロン膜、品番ＮＰ０ＨＹ０００１０）；第４級アミン基でプラスに荷電した、ＢＩＯ−ＲＡＤ高強度ナイロン膜（ＢＩＯ−ＲＡＤ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）より入手可能な、Ｚｅｔａ−Ｐｒｏｂｅ ＧＴ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、カタログ＃１６２−０１９６）。基材材料のそれぞれの、幾つかのストリップを、各ガラス管に関する１つ（１）のストリップにとって十分な、４ｍｍ×１０ｍｍのサイズに切り出した。
全てのストリップを、Ｐｒｏｐｐｅｒ ＣＨＥＸ−ＡＬＬ ＩＩ Ｉｎｓｔａｎｔ Ｓｅａｌｉｎｇ Ｐｏｕｃｈ（Ｐｒｏｐｐｅｒ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｉｎｃ．（Ｌｏｎｇ Ｉｓｌａｎｄ Ｃｉｔｙ，ＮＹ））内に定置して、ＡＭＳＣＯ滅菌器（Ｓｔｅｒｉｓ（Ｍｅｎｔｏｒ，ＯＨ））内で、蒸気液体サイクル（１２１℃での）で３０分間、それらを滅菌することによって、予備滅菌した。次いで、それらのストリップを、各管に無菌状態で移動させた。
以下の観察及び分析を、各基材の２つの管に関して、０時間、３０分、１時間、４時間、及び２４時間の時点で実行した：（１）基材材料を管から取り出し、ＫＩＭＷＩＰＥ上に定置して吸い取り乾燥させ、次いで上記で実行したように、Ｖフィルターで濃度測定読み取り値を取得し、（２）各管内の基材材料の色を、同じ管の周囲の培地の色と比較した。（暗いか、又は明るいか）。
残りの管を、５６℃でインキュベートした。３０分、１時間、４時間、及び２４時間のインキュベーションの、それぞれの時間で、各サンプルのうちの２つの管を、インキュベーターから取り出して、目視観察し、かつ上述のように計器測定した。
Figure 0006259052
上記の表は、様々な長さの時間にわたって、培地に晒した後の、基材の濃度測定読み取り値を示す。各基材に関する、時間０の読み取り値は、培地中に定置されている基材の、３０秒以内の初期濃度測定読み取り値である。全ての場合で、ナイロン基材の濃度測定は、３０分以内で上昇し、実験全体を通して高いまま維持された。
Figure 0006259052
暗い＝基材が、培地よりも視覚的に暗いものであった
明るい＝基材が、培地よりも視覚的に明るいものであった
それぞれの読み取りで、基材材料を培地から取り出す前に、培地の色を、基材の色と比較した（表１９を参照）。基材の色と培地の色との差異を、観察及び報告した。培地との接触の３０分後に、ナイロン基材材料は、双方とも培地よりも視覚的に暗いものとなり、実験全体を通して、より暗いまま維持された。
参考実施例８ ＢＣＰ及びメチルレッドでのアクリジンオレンジ（ＡＯ）検出の阻害
この参考実施例は、ｐＨ指示薬の一方（すなわちＢＣＰ又はＭＲ）が、アクリジンオレンジを有する溶液中に存在する場合の、アクリジンオレンジの蛍光の検出に対する、ＢＣＰ及びメチルレッドの影響を示す。
１７グラムの細菌用ペプトン、０．１７グラムのＬ−アラニンからなる、芽胞増殖培地溶液を調製した。２００μＬの容積の、この増殖培地を、２つ（２）の９６ウェルプレート内の各ウェルに添加した。
４．８ｇ／Ｌから開始して０．７５ｇ／Ｌまで希釈される、ｐＨ指示薬溶液の希釈系列を、メチルレッド（ＭＲ）及びブロモクレゾ−ルパープル（ＢＣＰ）の双方に関して作製した。１：５０から開始して１：８００まで希釈される、アクリジンオレンジの希釈系列を作製した。
プレート＃１では、２０μＬの適切な希釈のＢＣＰを、プレートの各横列に添加し、２０μＬの適切な希釈のアクリジンオレンジ（ＡＯ）を、プレート＃１の各縦列に添加した。プレート＃２では、２０μＬの適切な希釈のメチルレッドを、プレートの各横列に添加し、２０μＬの適切な希釈のアクリジンオレンジ（ＡＯ）を、プレート＃２の各縦列に添加した。プレート＃１及びプレート＃２の設定に関しては、表２０を参照されたい。
Figure 0006259052
プレート＃１及びプレート＃２を、ＳＹＮＥＲＧＹ ４分光光度計内に定置して、吸光度の読み取り値を、５９０ｎｍで取得した。更には、４３５ｎｍ／５３０ｎｍでの蛍光励起／発光の読み取り値もまた、収集した（表２１Ａ、２１Ｂを参照）。
Figure 0006259052
＊＊ 計器の検出閾値を上回るシグナル
Figure 0006259052
＊＊ 計器の検出閾値を上回るシグナル
全てのアクリジンオレンジの濃度に関して、溶液中のブロモクレゾ−ルパープルの量が減少するにつれて、アクリジンオレンジによって生成されるシグナルが増大した。換言すれば、ＢＣＰの存在は、アクリジンオレンジのシグナルを覆い隠すものであった。例えば、０．３ｇ／Ｌの初期ＢＣＰ濃度を有する横列に関しては、０のＢＣＰを有する横列と比較して、約２７〜３６％のアクリジンオレンジの蛍光シグナルが失われる。
Figure 0006259052
＊＊ 計器の検出閾値を上回るシグナル
Figure 0006259052
＊＊ 計器の検出閾値を上回るシグナル
ＢＣＰと同様に、メチルレッドもまた、アクリジンオレンジの蛍光シグナルを覆い隠すものであった。メチルレッドの濃度が高いほど、検出されるアクリジンオレンジの蛍光シグナルは低下する。例えば、０．３ｇ／Ｌの初期メチルレッド濃度を有する横列に関しては、メチルレッドを有さない横列と比較して、約３〜２７％のアクリジンオレンジの蛍光シグナルが失われる（表２２Ａ、２２Ｂを参照）。
実施例１〜３：生物活性の検出
３Ｍ ＡＴＴＥＳＴ １２９１ Ｒａｐｉｄ Ｒｅａｄｏｕｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒを、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）より得る。荷電ナイロン膜（ＭＡＧＮＡＰＲＯＢＥ、０．４５マイクロメートル荷電ナイロン膜、品番ＮＰ０ＨＹ０００１０）を、ＧＥ Ｏｓｍｏｎｉｃｓ Ｌａｂｓｔｏｒｅ（Ｍｉｎｎｅｔｏｎｋａ，ＭＮ）より得る。
生物学的インジケーターのキャップを取り外し、この生物学的インジケーター管を反転させることによって、ガラスアンプルを取り出す。このアンプルは、後の使用のために確保する。ナイロン膜を、小さいストリップ（０．５ｃｍ×２ｃｍ）に切り出す。生物学的インジケーター管の底部の壁部に隣接させて、ストリップを定置し（縦方向に）、各管内にガラスアンプルを再び定置する。各管上に、再び慎重にキャップを取り付ける。
この改変された生物学的インジケーターを、様々な長さの時間にわたって、蒸気への曝露に晒す（表２３に示す）。この蒸気曝露は、Ｈ＆Ｗ Ｓｔｅａｍ Ｒｅｓｉｓｔｏｍｅｔｅｒ（Ｈ＆Ｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＬＬＣ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）より入手可能）内の、２７０°Ｆ／１３２℃のＧｒａｖｉｔｙ Ｓｔｅａｍで遂行される。蒸気への曝露に続いて、生物学的インジケーターを放冷し、製造元の使用説明書に従って、生物学的インジケーター内でアンプルを粉砕する。
アンプルを、インキュベーター内に５６℃で定置して、定期的に（例えば、１５分後、３０分後、４５分後、６０分後、９０分後、１２０分後、３時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１２時間後、１８時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、及び／又は７２時間後に）取り出して、液体媒質の色、ナイロン膜の色、及び液体媒質の蛍光を観察する。蛍光は、手持ち式の紫外光源で管を照射することによって、視覚的に検出することができ、あるいは、好適な蛍光計内に管（又は管からの液体）を定置して、蛍光を測定することができる。
蒸気曝露に殆ど晒されないか、又は全く晒されない（例えば、０〜１分の蒸気曝露）生物学的インジケーターは、ブロス中、及びナイロン膜上で、ｐＨ指示薬（ブロモクレゾ−ルパープル）の、紫色から黄色への転換を示す。これらの生物学的インジケーターはまた、蛍光発生酵素基質の、蛍光最終生成物（４−メチルウンベリフェロン）への実質的な転換も示す。
致死的な蒸気曝露に晒される（例えば、≧１５分）生物学的インジケーターは、ナイロン膜上でのブロモクレゾ−ルパープルの蓄積を示すが、その指示薬の、紫色から黄色への実質的な転換は示さない。これらの生物学的インジケーターは、蛍光発生酵素基質の、蛍光最終生成物への実質的な転換を示さない。
Figure 0006259052
準備実施例１−生物学的滅菌インジケーター（ＢＩ）の準備
本開示を例示するために、上記の説明に従って、かつ図４〜７に示すように、幾つかの生物学的滅菌インジケーター（ＢＩ）を準備した。実施例で使用されるＢＩの具体的な詳細を、以下に記載する。
図４〜７に示すように、生物学的滅菌インジケーター１００は、ハウジング１０２を含み、このハウジング１０２は、一体に結合されて、内蔵型の生物学的滅菌インジケーターを提供する、第１部分１０４（例えば、中空管）及び第２部分１０６（例えば、キャップ）を含むものとした。このキャップは、長さ約２１ｍｍ×直径約１４ｍｍの全体寸法を有する、成形ポリプロピレンとした。第１部分１０４（中空管）は、長さ約５２ｍｍ及び頂部の直径約１２ｍｍの全体寸法を有し、図４〜６に示す形状を有する、成形ポリプロピレンとした。第１部分１０４（例えば、中空管）の全容積は、約３ｍＬとした。
図４〜６に示すように、ハウジング１０２の第２部分（キャップ）１０６は、ハウジング１０２の内部（例えば、リザーバ１０３）と環境との間の流体連通を提供する、６つの開口又は開口部１０７を含むものとした。障壁としての役割を果たす濾紙材料（図４〜６には示さず）を、滅菌剤通路内に、開口１０７の上から配置し、片面感圧接着性紙ラベルで、定位置に保持した。この濾紙材料は、現在入手可能な、蒸気滅菌器用の３Ｍ ＡＴＴＥＳＴ １２９１ Ｒａｐｉｄ Ｒｅａｄｏｕｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮの、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙより入手可能）のキャップ内に存在するものと、同じ材料とした。
生物学的滅菌インジケーター１００は、液体増殖培地１２２を収容する、壊れやすい容器１２０を更に含むものとした。壊れやすい容器１２０は、ホウケイ酸ガラスで作製され、芽胞の増殖培地を収容するものとした。この培地は、ｐＨ指示薬ブロモクレゾールパープル、及び蛍光酵素基質４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−グルコシドを含有する、修正されたトリプティックソイブロス（ＴＳＢ）からなるものとした。このアンプルは、長さ約４０ｍｍ×直径約４ｍｍであり、約５００μＬの培地液を保持するものとした。液体増殖培地１２２は、Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮの、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙより、蒸気滅菌器用の３Ｍ ＡＴＴＥＳＴ １２９１ Ｒａｐｉｄ Ｒｅａｄｏｕｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒとして現在入手可能な製品内で使用されるものと、同じ培地とした。
図４〜７に示すように、挿入部材１３０によって、液体培地容器１２０を、生物学的滅菌インジケーター１００内部で定位置に保持した。挿入部材（破砕装置とも呼ばれる）１３０は、容器１２０を定位置に保持することと、液体培地容器１２０を破砕するために第２部分１０６が押し下げられる、ＢＩの作動工程の間に実施される、容器１２０の制御された破砕を促進するように機能することとの双方に役立つものとした。挿入部材１３０は、長さ約２２ｍｍ×幅約９ｍｍの寸法を有する、成形ポリカーボネート構造とした。
第２部分１０６は、作動の後に、第１部分１０４の第１末端部１０１と、第１部分１０４の開放上方末端部１５７で接触して、生物学的滅菌インジケーター１００を閉鎖又は封止する（例えば、気密封止する）ように配置される、封止突起部１５６を有するものとした。
生物学的滅菌インジケーター１００は、第１部分１０４と流体連通して配置される、Ｇ．ステアロサーモフィルスの芽胞（ＡＴＣＣ ７９５３）１１５を更に含むものとした。芽胞１１５は、ポリプロピレンの芽胞キャリア１３５（９ｍｍ×４ｍｍ）の、芽胞リザーバ１３６内に付着させた。芽胞１１５は、ポリプロピレンの表面上に直接付着させ、芽胞リザーバ１３６は、約１５μＬの容積を有するものとした。
ハウジング１０２は、内側部分的壁部若しくは棚部１１８によって部分的に隔離される、下方部分１１４（第１チャンバ１０９を少なくとも部分的に画定する）及び上方部分１１６（第２チャンバ１１１を少なくとも部分的に画定する）を含むものとし、この内側壁部又は棚部１１８内には、第１チャンバ１０９と第２チャンバ１１１との間の流体連通を提供する、開口部１１７を形成した。第２チャンバ１１１は、芽胞１１５を収容するように適合させた。第１チャンバ１０９は、特に作動の前に、壊れやすい容器１２０を収容するように適合させた。壁部１１８は、図４〜７に示すように、ハウジング１０２の長手方向に対して、非ゼロの角度かつ非直角に、角度付けされるか、又は傾斜するものとした。
「芽胞増殖チャンバ」又は「検出チャンバ」と称することもできる第２チャンバ１１１は、滅菌プロセスの有効性を判定するために、芽胞の生存度に関して検査される容積を含むものとした。
液体培地容器１２０は、滅菌の間、及び容器１２０が断裂していないとき、第１チャンバ１０９内に配置して、保持した。芽胞１１５は、滅菌の間、第２チャンバ１１１内に、環境と流体連通させて収容した。滅菌の間に、第２チャンバ１１１内に、滅菌剤が移動した（例えば、第１チャンバ１０９を介して）。その後、液体培地１２２が、作動の間、容器１２０が断裂して、液体１２２がハウジング１０２の内部へと解放されると、第２チャンバ１１１内に移動した（例えば、第１チャンバ１０９から）。
第１チャンバ１０９は、約２８００マイクロリットルの容積（全ての内部構成要素が存在しない状態で）を有するものとした。壁部１１８の直上の、第１チャンバ１０９の断面積は、約５０ｍｍ２とした。第２チャンバ１１１は、約２１０マイクロリットルの容積を有するものとした。壁部１１８の直下の、第２チャンバ１１１の断面積は、約２０ｍｍ２とした。
生物学的滅菌インジケーター１００は、基材１１９を更に含むものとした。基材１１９は、サイズを約９ｍｍ×約８ｍｍとして、壁部１１８の上に安置されるように寸法決めした。基材１１９は、生物学的滅菌インジケーター１００の第１チャンバ１０９と第２チャンバ１１１との間に配置した。基材１１９は、貫通して形成される、直径約３．２ｍｍ（０．１２５インチ）の開口１２１を含み、この穴は、基材のほぼ中心に置かれるものとした。基材１１９は、挿入部材１３０と壁部１１８との間に配置した（例えば、間に挟み込んで）。基材１１９は、荷電ナイロンで形成し、具体的には、ＧＥ Ｗａｔｅｒ ＆ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｔｒｅｖｏｓｅ，ＰＡ）より、商品名「ＭＡＧＮＡＰＲＯＢＥ」（０．４５マイクロメートルの孔径、３０ｃｍ×３ｍのロール、カタログ番号ＮＰ０ＨＹ０００１０、材料番号１２２６５６６）で入手可能な、リプローブ可能な荷電転写膜とした。
生物学的滅菌インジケーター１００は、第２チャンバ１１１を第１チャンバ１０９と流体結合するように配置される、図７に示すような通気機構１６２を有するものとした。また、図７に示すように、生物学的滅菌インジケーター１００は、ハウジング１０２の壁部１０８と一体的に形成される、リブ又は突出部１６５を有し、このリブ又は突出部１６５は、芽胞キャリア１３５を、ハウジング１０２内の所望の場所内に維持するように、配置されるものとした。
ハウジング１０２は、ハウジング１０２内の断面積が、長手方向ＤＬに沿って、概して減少するように、先細のものとした（例えば、図６のテーパー形状部分１４６を参照）。
実施例１−蛍光の読み取り値と２４時間後の増殖との相関関係
図４〜７に示し、かつ準備実施例１で上述した設計の、生物学的インジケーター（ＢＩ）を、〜１×１０７ＣＦＵのＧ．ステアロサーモフィルスＡＴＣＣ ７９５３芽胞嚢を使用して構築した。一部のＢＩ（結果は、表２６及び表２７に示され、以下で論じられる）は、基材材料を使用することなく作製した。液体増殖培地１２２は、Ｓｔ．Ｐａｕｌの３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙより入手可能な、蒸気滅菌器用の３Ｍ ＡＴＴＥＳＴ １２９２ Ｒａｐｉｄ Ｒｅａｄｏｕｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ内で使用されるものと同じものとした。次いで、各ＢＩを、Ｈ＆Ｗ Ｓｔｅａｍ Ｒｅｓｉｓｔｏｍｅｔｅｒ（Ｈ＆Ｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＬＬＣ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）より入手可能）内の、２７０°Ｆ／１３２℃のＧｒａｖｉｔｙ Ｓｔｅａｍで、１分、１分４５秒、２分、２分１５秒、２分３０秒、及び３分の、様々な長さの蒸気滅菌サイクルで処理した。滅菌に続いて、ＢＩを放冷して、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙより入手可能な２９０ ＡＵＴＯＲＥＡＤＥＲ読み取り装置と類似の、３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）より入手可能な４９０ ＡＵＴＯＲＥＡＤＥＲ読み取り装置内で作動させた；４９０ ＡＵＴＯＲＥＡＤＥＲの具体的な機構は、同時係属の米国特許出願第６１／４０９０４２号（代理人整理番号６６１７５ＵＳ００２）及び同第６１／４０８９９７号（代理人整理番号６６１７６ＵＳ００２）で説明される。３６５／４６０ｎｍの励起／発光での、蛍光の読み取り値を、１分毎に６０分間取得した。蛍光が検出された場合には、「あり」として報告し、蛍光が検出されない場合には、「ＮＦ」（すなわち蛍光なし）として報告した。また、読み取り装置内での２４時間のインキュベーションの後に、ＢＩを取り出して、紫色から黄色への培地中の（ｐＨ指示薬の）色変化に基づいて、増殖に関して評価した。色変化が観察された場合には、「あり」として報告し、色変化が観察されない場合には、「なし」として報告した。
以下の表２４及び表２５に示す結果は、全ての長さの滅菌サイクルに晒された全てのＢＩに関して、基材が第１の場所内に配置される場合の、蛍光の結果と２４時間の増殖の確認結果との間の良好な相関関係を示す。
以下の表２６及び表２７に示す結果は、基材が存在しなかった場合のＢＩに関して、特に２分１５秒、２分３０秒、及び３分のサイクル時間で、矛盾する結果が観察されたことを示す。
Figure 0006259052
Figure 0006259052
Figure 0006259052
Figure 0006259052
本発明の広範囲で記載される数値範囲及びパラメーターは、近似値であるが、具体的な実施例に記載される数値は、可能な限り正確に報告する。しかしながら、全ての数値は、それらの対応する試験測定値に見出される標準偏差から必然的に生じる一定の範囲を、本質的に含む。
全ての見出しは、読者の利便性のためであり、指定のない限り、その見出しに続く本文の意味を限定するために使用するべきではない。
本明細書で引用される、全ての特許、特許出願、刊行物の完全な開示内容、並びに核酸及びタンパク質のデータベースエントリーは、個別に組み込まれる場合のように、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の範囲及び趣旨から逸脱することなく、本発明の様々な修正及び変更が、当業者には明らかとなり、また、本明細書に記載される例示的実施形態に、本発明が不当に限定されるものではないことを理解するべきである。

Claims (1)

  1. 滅菌プロセスの有効性の検出方法であって、
    第１チャンバ及び第２チャンバを含む、ハウジングと、
    第１の水性液体を収容する容器であって、前記容器は、前記第１チャンバ内に配置され、前記容器の少なくとも一部分が壊れやすく、前記液体が、吸光度スペクトルを有するｐＨ指示薬を含む、第１の指示薬システムと、蛍光発光スペクトルを有する第２の生物学的誘導体に変換される蛍光発生酵素基質を含む、第２の指示薬システムとを含み、前記吸光度スペクトルが、前記蛍光発光スペクトルの波長の少なくとも一部分内に、検出可能な吸光度を含む、容器と、
    前記第２チャンバ内に配置される芽胞であって、ｐＨ指示薬を第１の生物学的誘導体に変換することができる第１の酵素活性と、蛍光発生酵素基質を第２の生物学的誘導体に変換することができる第２の酵素活性を有し、前記第１及び第２酵素活性は滅菌剤により不活性にされる芽胞と、
    前記第１の水性液体から前記ｐＨ指示薬を受容及び濃縮する荷電されたナイロン基材であって、前記ハウジング内に配置される、荷電されたナイロン基材と、を含む、生物学的滅菌インジケーターを提供する工程と、
    前記第２の生物学的誘導体を検出する、光路を含む計器、を提供する工程と、
    前記第１の水性液体を前記基材と接触させて、前記ｐＨ指示薬の濃度が、前記第１の水性液体中の前記ｐＨ指示薬の濃度よりも低い、第２の水性液体を形成する工程と、
    前記計器を使用して前記第２の生物学的誘導体からの蛍光の有無を検出し、第２の生物学的誘導体を検出する工程と、を含み、ここで前記光路は前記基材のいずれの部分とも交差しない、滅菌プロセスの有効性の検出方法。
JP2016229668A 2010-11-01 2016-11-28 生物活性の検出方法 Active JP6259052B2 (ja)

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