CN107505311A

CN107505311A - 快速确定灭菌效果的方法和生物指示剂

Info

Publication number: CN107505311A
Application number: CN201710874182.9A
Authority: CN
Inventors: 羌维兵; 童明庆; 张怡
Original assignee: Xintrum Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Xintrum Pharmaceuticals Ltd
Priority date: 2017-09-25
Filing date: 2017-09-25
Publication date: 2017-12-22
Also published as: WO2019056927A1

Abstract

本发明涉及一种快速确定灭菌效果的方法和生物指示剂。所述方法是直接检测灭菌处理后芽孢的ATP，通过生物发光法检测芽孢的ATP，几分钟就可以确定灭菌效果。本方法直接检测来自于存活芽孢的ATP，相较于检测杀死的芽孢的相关参数的间接方法具有更高的准确性。所述生物指示剂是基于该方法的，含有芽孢和芽孢ATP检测试剂，可以约5分钟就提供灭菌过程的评价结果。

Description

快速确定灭菌效果的方法和生物指示剂

技术领域：

本发明涉及一种快速确定灭菌效果的方法。本发明还涉及一种快速确定灭菌效果的生物指示剂。

背景技术：

本领域众所周知，微生物芽孢(endospores，亦或芽胞)与绝大多数其他类型的微生物相比，更难灭活。测定经灭菌处理后的芽孢的存活情况，是确定灭菌是否彻底最有力的证据。

生物指示剂已被广泛用于测试和(或)确定灭菌方法的有效性。典型地，将含有微生物芽孢的生物指示剂暴露于某种选定的灭菌剂或灭菌方法，然后将暴露处理过的芽孢置于能够维持芽孢发芽和微生物生长的培养环境中，从而确定暴露处理过的芽孢的存活率。

目前市售的生物指示剂主要可以分为常规生物指示剂和快速生物指示剂。常规生物指示剂是依据芽孢恢复生长时，新陈代谢产生酸性代谢产物引起培养基pH变化，通过添加pH指示剂如溴甲酚紫，根据其颜色变化来判读结果，微生物培养时间为24-48h。常规生物指示剂结果可靠，但耗时过久，无法实现快速判读，无法满足医院迫切需要知道灭菌结果的需求，在临床应用中有极大的限制。快速生物指示剂主要依据芽孢恢复生长时产生的α-葡萄糖苷酶，水解底物产生荧光物质，通过检测荧光强度的变化判读灭菌结果。α-葡萄糖苷酶是芽孢恢复生长所必须的水解酶，存在于芽孢外壁和繁殖体细胞中，通过对酶水解底物产生的荧光物质进行检测可在1-3h内读取结果，缩短读取到灭菌失败结果的时间。但该方法是间接检测酶的存在与否来判读结果，可能存在酶对灭菌因子的耐受程度与芽孢不一致的情况，致使检测结果失真。

对快速检测的需求催生了一些不需要经过培养能够在更短时间内指示灭菌有效性的方法。例如，Feltner等人(US7183048)公开了通过测量在灭菌处理期间所释放的吡啶二羧酸(DPA)的量来快速确定灭菌处理效果的方法。作为生物指示剂的微生物芽孢包含大约10-15％重量的DPA。DPA通常以吡啶二羧酸钙的形式存在于芽孢的外壁中，当芽孢失活时，DPA从芽孢释放出来。通过在大约545nm波长的光谱分析或借助于导数紫外线光谱分析可以测定出包含芽孢的溶液中DPA的浓度。根据检测的DPA的浓度确定灭菌过程中杀死的芽孢数量，进而评估灭菌效果。该方法无需对芽孢进行培养，灭菌完成后很快就能够得到灭菌过程的评价结果。宋等人(CN101095961)公开了通过测量与灭菌处理期间杀死的芽孢释放出的无机物浓度相关的参数来确定灭菌处理效果的方法。活体芽孢存在大量的无机物，如钙、锰、镁、钾和钠等，灭菌处理杀死的芽孢释放出这些无机物，无机物的释放改变溶液的导电率等相关性质。通过测量水溶液的导电率就可以获知杀死的芽孢的量，确定芽孢的存活率。该方法可以在非常短的时间内给出灭菌处理过程的评价结果，甚至是一分钟。上述的两种方法都可以不经过培养，直接在非常短的时间内对灭菌效果进行评价。但由于其测量的参数都是与被杀灭的芽孢相关的，属于间接检测，并不是对于存活芽孢的直接检测，该策略易导致检测结果失真。

因此，需要有一种能够在非常短的时间内检测活体芽孢是否存在，从而准确评价灭菌效果的方法和生物指示剂。

发明内容：

本发明的目的是提供一种快速准确确定灭菌效果的方法，特别是直接检测灭菌处理后芽孢存活情况的方法，解决现有技术存在的评估耗时较长或准确度不高的问题。同时基于该方法提供一种快速准确确定灭菌效果的生物指示剂。

本发明提供了一种快速确定灭菌效果的方法，检测灭菌处理后的生物指示剂中存活的芽孢，方法是检测所述芽孢的ATP，从而确定灭菌后存活的芽孢的量来评价灭菌效果。

所述检测ATP，可以通过高效液相色谱、免疫分析或生物发光法等手段实现。优选的检测方法是通过生物发光法检测芽孢ATP。所述生物发光方法是使用发光检测仪器测定生物发光值，是目前检测ATP的最灵敏的方法，可以实现对单个细胞内ATP的检测。

一种优选的快速确定灭菌效果的方法，其操作步骤是：通过生物发光方法直接检测灭菌处理后芽孢的发光值，根据发光值确定芽孢的存活情况，并进一步评价灭菌效果。

本发明还提供了一种快速确定灭菌效果的生物指示剂，该生物指示剂包含有芽孢和芽孢ATP检测试剂。

所述芽孢是活体芽孢，种类不限，根据实际应用的需要而定。因为芽孢的种类因灭菌因子而异，不同灭菌方式灭菌效果评估使用的芽孢的种类也不同。

使用的芽孢可参照国标GB18281-2015《医疗保健产品灭菌生物指示剂》进行选择。例如，应用于环氧乙烷灭菌的芽孢可以是萎缩芽孢杆菌ATCC 9372、NCTC 10073、NCIMB8058、DSM 2277、NRRL B-4418或CIP 77.18的芽孢；

应用于湿热灭菌的芽孢可以是嗜热脂肪地芽孢杆菌ATCC 7953(NCTC 10007、DSM22和CIP 52.81)或ATCC 12980(同NRRL B-4419)的芽孢；

应用于干热灭菌的芽孢可以是萎缩芽孢杆菌CIP 77.18、NCIMB 8058、DSM 675、NRRL B-4418和ATCC 9372或者枯草芽孢杆菌DSM 13019的芽孢；

应用于低温蒸汽甲醛灭菌的可以是嗜热脂肪地芽孢杆菌NCIB 8224、DSM 6790、ATCC 10149或ATCC 12980的芽孢。

此外还可以提供其它类型的芽孢适用于其它灭菌因子灭菌，如过氧化氢、二氧化氯或辐射等。芽孢的存在形式可以是芽孢的悬液，或者是芽孢存在于滤纸、不锈钢、玻璃、塑料或陶瓷等载体之上。

每份生物指示剂的芽孢含量不小于1.0×10⁵。

所述芽孢ATP检测试剂是用生物发光法检测芽孢ATP的试剂，是含有芽孢ATP释放剂和生物发光物质的检测试剂，可以一步实现芽孢的裂解和ATP的释放与检测。

优选的芽孢ATP检测试剂含有芽孢ATP释放剂、缓冲液、萤光素酶、D-萤光素和稳定剂等。

其中，所述芽孢ATP释放剂优选为表面活性剂，选自十六烷基三甲基溴化铵、苯扎氯铵、氯己定和曲拉通中的一种或多种。

例如，芽孢ATP检测试剂由下列成分组成：醋酸氯己定(0.15％-1.20％)、曲拉通X-100(1.5％-2.5％)、萤光素酶(0.02％-0.05％)和D-萤光素(0.1％-0.2％)的水溶液。所述百分比是质量比。

本发明的一个实例中所用的芽孢ATP检测试剂组成为：N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(150-250mM)、十六烷基三甲基溴化铵(0.06％-0.10％)、醋酸氯己定(0.15％-1.2％)、曲拉通(1.5％-2.5％)、氯化镁(0.3％-0.5％)、乙二胺四乙酸(0.7％-1.0％)、氟化钠(0.05％-0.1％)、焦磷酸钠(0.01％-0.02％)、萤光素酶(0.02％-0.05％)、D-萤光素(0.1％-0.2％)和水。

所述生物指示剂的应用，具体操作方法是：将所述芽孢进行灭菌处理，灭菌完成后，将所述芽孢ATP检测试剂施于灭菌处理过的芽孢中，然后使用生物发光检测仪器检测芽孢的发光值；根据发光值确定灭菌是否完全。

实施例中，本发明提供了用于多种不同灭菌方式的新型生物指示剂，包括湿热灭菌用生物指示剂、环氧乙烷灭菌用生物指示剂、干热灭菌用生物指示剂和低温蒸汽甲醛灭菌用生物指示剂。

本发明与现有技术相比的优点是：

1、更快速评估出灭菌效果

约5分钟就可以报告结果，远快于市售的快速生物指示剂所需的1-3小时

2、更高的准确度

直接检测来自于存活芽孢的ATP，相较于检测杀死的芽孢的相关参数的间接方法具有更高的准确性和可信度。

附图说明：

图1是不同量芽孢检测的ATP发光，横纵坐标轴均为对数刻度；

横坐标轴为芽孢数，纵座标轴为S：N(信噪比)，S：N＝(信号平均值-背景平均值)/背景的标准偏差。

具体实施方式:

实施例1 制备细菌芽孢悬液

芽孢悬液的制备参照《消毒技术规范(2002年版)》中的细菌芽孢悬液的制备方法。(1)取冻干菌种管，在无菌操作下打开，加适量营养肉汤培养基。取含营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18-24h。用接种环取第1代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37℃培养18-24h。挑取上述第2代培养物中典型菌落，接种于营养肉汤培养基，于37℃培养18-24h，即为第3代培养物。(2)吸取第3代-5代的18-24h营养肉汤培养物，接种于罗氏瓶中营养琼脂培养基表面，将罗氏瓶置于37℃温箱内，培养5-7d。(3)用接种环取菌样少许涂于玻片上，固定后以改良芽孢染色法染色，并在显微镜(油镜)下进行镜检。当芽孢形成率达95％以上时，即可进行以下处理。否则，应继续放置一定时间，直至达到上述芽孢形成率后再进行以下处理。(4)罗氏瓶培养物，加无菌蒸馏水于每一罗氏瓶中，以L棒轻轻推刮下菌苔。将洗下的菌悬液集中于一含玻璃珠的无菌三角烧瓶中，振摇5min，打碎菌块，使成均匀的芽孢悬液。(5)用无菌纱布过滤芽孢悬液，清除其中的琼脂凝块。(6)将过滤后的芽孢悬液，置无菌离心管内，以3000r/min速度离心30min。弃上清液，加蒸馏水使芽孢重新悬浮。再离心和重新悬浮清洗，先后共3遍。(7)将洗净的芽孢悬浮于三角烧瓶内蒸馏水中，并加入适量小玻璃珠。将芽孢液放于80℃水浴中10min，以杀灭残余的细菌繁殖体。待冷至室温后，保存于4℃冰箱中备用。有效使用期为半年。在制备芽孢时，萎缩芽孢杆菌的培养温度为37℃，而嗜热脂肪地芽孢杆菌的培养温度为58℃；且嗜热脂肪地芽孢杆菌的芽孢于80℃水浴中处理的时间延长为30min。

实施例2 配制芽孢ATP检测试剂

按照以下步骤配制芽孢ATP检测试剂：

(1)使用新鲜制备的高纯水配制100mL 150-250mM的N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)溶液；加入0.15-1.20g醋酸氯己定，1.5-2.5mL曲拉通X-100(Triton X-100)，0.3-0.5g六水合氯化镁，0.7-1.0g二水合乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)；使用1M的氢氧化钠调节溶液pH为7.5后，使用0.22μm的滤膜过滤除菌；加入20-50mg萤光素酶(Sigma)和100-200mg D-萤光素(Sigma)，溶解，-20℃保存。

或(2)使用新鲜制备的高纯水配制100mL 150-250mM的N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)溶液；加入0.06-0.10g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，0.15-1.20g醋酸氯己定，1.5-2.5mL曲拉通X-100(Triton X-100)，0.3-0.5g六水合氯化镁，0.7-1.0g二水合乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)，0.05-0.10g氟化钠和0.01-0.02g焦磷酸钠溶解；使用1M的氢氧化钠调节溶液pH为7.5后，使用0.22μm的滤膜过滤除菌；加入20-50mg萤光素酶(Sigma)和100-200mg D-萤光素(Sigma)，溶解，-20℃保存。

又或(3)使用新鲜制备的高纯水配制100mL 200mM的N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)溶液；加入0.08g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，0.16g醋酸氯己定，1mL曲拉通X-100(Triton X-100)，0.4g六水合氯化镁，0.86g二水合乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)，0.08g氟化钠和0.01g焦磷酸钠溶解；使用1M的氢氧化钠调节溶液pH为7.5后，使用0.22μm的滤膜过滤除菌；加入35.8mg萤光素酶(Sigma)和168mg D-萤光素(Sigma)，溶解，-20℃保存。

实施例3 芽孢ATP检测试剂检测芽孢

取实施例1中制备的嗜热脂肪地芽孢杆菌(ATCC 7953)的芽孢，使用无菌水稀释成不同的浓度，在96孔板中加入不同浓度的芽孢悬液，使每孔中芽孢分别为0、1、10、100、1000、10 000、100 000和1 000 000个，而后加入实施例2中的芽孢ATP检测试剂，使用多功能读板仪(PerkinElmer)检测发光值。图1所示是不同量的芽孢的ATP发光，发光的S：N(信噪比)与芽孢量呈正相关性，芽孢越多，S：N(信噪比)越大。当芽孢量为1时，S：N(信噪比)依然大于10，表明本发明的芽孢ATP检测试剂检测芽孢具有超高的灵敏度。

实施例4 湿热灭菌用生物指示剂

湿热灭菌用生物指示剂包含有实施例1中的嗜热脂肪地芽孢杆菌(ATCC 7953)的芽孢悬液和实施例2中的芽孢ATP检测试剂。该芽孢悬液为无菌水悬液，每份生物指示剂的芽孢含量是1.0×10⁶。芽孢悬液经过湿热灭菌后，将芽孢ATP检测试剂加入到芽孢悬液中，再使用发光检测仪器检测发光值。如果检测到的发光值低于设定阈值，则芽孢被完全杀灭，表明灭菌完全；而如果检测到高于设定阈值，则芽孢未被完全杀灭，表明灭菌不完全。阈值根据背景值进行设定。

将一批本发明的生物指示剂的芽孢分别放置于下排气式灭菌器(上海申安)中的5个不同位置，每个位置两份芽孢，121℃下灭菌不同的时间。灭菌完成后，每个位置的两份芽孢，一份加入芽孢ATP检测试剂，使用多功能读板仪(PerkinElmer)检测发光值，其结果如表1所示。另一份则加入溴甲酚紫蛋白胨培养液(青岛海博)，在58℃下进行培养，24h后观察结果，该培养方法是标准方法，其利用pH指示剂的颜色进行判断，培养液紫色表示没有活芽孢，培养液黄色则有活芽孢，其结果如表2所示。根据表1中的背景值，设定阈值为283(背景平均值+背景标准偏差*10)。当灭菌时间分别为0、5、10和15分钟时，检测的发光值是高于阈值的，则判断芽孢未被完全杀灭，灭菌不完全；对应的培养结果表明存在活芽孢，灭菌不完全，两者结果一致。当灭菌时间分别为20、25和30分钟时，检测的发光值低于阈值，则判断芽孢被完全杀灭，灭菌完全，而培养的结果同样表明灭菌完全。使用本发明的生物指示剂进行评估的结果与常规的培养方法是一致的，具有良好的准确性。而本发明的生物指示剂用时只需要约5分钟，远快于常规培养方法的24小时。该结果表明本发明的湿热灭菌用生物指示剂可以更快速地对灭菌效果进行准确评价。

表1检测的芽孢的发光值(RLU)

表2芽孢培养结果

注：表中“有”表示有活芽孢；“无”表示无活芽孢。

实施例5 环氧乙烷灭菌用生物指示剂

环氧乙烷灭菌用生物指示剂包含有实施例1中的萎缩芽孢杆菌(ATCC 9372)的芽孢悬液和实施例2中的芽孢ATP检测试剂。该芽孢悬液为无菌水悬液，每份生物指示剂的芽孢含量是1.0×10⁶。芽孢悬液经过环氧乙烷灭菌后，将芽孢ATP检测试剂加入到芽孢悬液中，再使用发光检测仪器检测发光值。如果检测到的发光值低于设定阈值，则芽孢被完全杀灭，表明灭菌完全；而如果检测到高于设定阈值，则芽孢未被完全杀灭，表明灭菌不完全。阈值根据背景值进行设定。

实施例6 干热灭菌用生物指示剂

干热灭菌用生物指示剂包含有实施例1中的萎缩芽孢杆菌(ATCC 9372)的芽孢悬液和实施例2中的芽孢ATP检测试剂。该芽孢悬液为无菌水悬液，每份生物指示剂的芽孢含量是1.0×10⁶。芽孢悬液经过干热灭菌后，将芽孢ATP检测试剂加入到芽孢悬液中，再使用发光检测仪器检测发光值。如果检测到的发光值低于设定阈值，则芽孢被完全杀灭，表明灭菌完全；而如果检测到高于设定阈值，则芽孢未被完全杀灭，表明灭菌不完全。阈值根据背景值进行设定。

实施例7 低温蒸汽甲醛灭菌用生物指示剂

低温蒸汽甲醛灭菌用生物指示剂包含有实施例1中的嗜热脂肪地芽孢杆菌(ATCC12980)的芽孢悬液和实施例2中的芽孢ATP检测试剂。该芽孢悬液为无菌水悬液，每份生物指示剂的芽孢含量是1.0×10⁶。芽孢悬液经过低温蒸汽甲醛灭菌后，将芽孢ATP检测试剂加入到芽孢悬液中，再使用发光检测仪器检测发光值。如果检测到的发光值低于设定阈值，则芽孢被完全杀灭，表明灭菌完全；而如果检测到高于设定阈值，则芽孢未被完全杀灭，表明灭菌不完全。阈值根据背景值进行设定。

Claims

1.一种快速确定灭菌效果的方法，其特征是通过检测芽孢ATP确定灭菌处理后存活芽孢的量。

2.权利要求1所述的方法，是通过生物发光法检测芽孢ATP。

3.权利要求2所述的方法，其特征是：直接检测灭菌处理后芽孢的发光值，根据发光值确定芽孢的存活情况评价灭菌的效果。

4.一种快速确定灭菌效果的生物指示剂，由芽孢和芽孢ATP检测试剂组成，所述芽孢是活体芽孢。

5.权利要求4所述的生物指示剂，所述芽孢选自如下：

应用于环氧乙烷灭菌的芽孢：萎缩芽孢杆菌ATCC 9372、NCTC 10073、NCIMB 8058、DSM2277、NRRL B-4418或CIP 77.18的芽孢；

应用于湿热灭菌的芽孢：嗜热脂肪地芽孢杆菌ATCC 7953(NCTC 10007、DSM 22和CIP52.81)或ATCC 12980(同NRRL B-4419)的芽孢；

应用于干热灭菌的芽孢：萎缩芽孢杆菌CIP 77.18、NCIMB 8058、DSM 675、NRRL B-4418和ATCC 9372或者枯草芽孢杆菌DSM 13019的芽孢；

应用于低温蒸汽甲醛灭菌的芽孢：嗜热脂肪地芽孢杆菌NCIB 8224、DSM 6790、ATCC10149或ATCC 12980的芽孢。

6.权利要求4所述的生物指示剂，所述芽孢ATP检测试剂含有芽孢ATP释放剂和生物发光物质。

7.权利要求6所述的生物指示剂，所述芽孢ATP释放剂为表面活性剂；所述生物发光物质包括萤光素酶和D-萤光素。

8.权利要求4所述的生物指示剂，所述芽孢ATP检测试剂按照以下A或B或C任一配制：

A使用新鲜制备的高纯水配制100mL 150-250mM的N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)溶液；加入0.15-1.20g醋酸氯己定，1.5-2.5mL曲拉通X-100(Triton X-100)，0.3-0.5g六水合氯化镁，0.7-1.0g二水合乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)；使用1M的氢氧化钠调节溶液pH为7.5后，使用0.22μm的滤膜过滤除菌；加入20-50mg萤光素酶(Sigma)和100-200mgD-萤光素(Sigma)，溶解，-20℃保存；

B使用新鲜制备的高纯水配制100mL 150-250mM的N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)溶液；加入0.06-0.10g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，0.15-1.20g醋酸氯己定，1.5-2.5mL曲拉通X-100(Triton X-100)，0.3-0.5g六水合氯化镁，0.7-1.0g二水合乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)，0.05-0.10g氟化钠和0.01-0.02g焦磷酸钠溶解；使用1M的氢氧化钠调节溶液pH为7.5后，使用0.22μm的滤膜过滤除菌；加入20-50mg萤光素酶(Sigma)和100-200mg D-萤光素(Sigma)，溶解，-20℃保存；

C使用新鲜制备的高纯水配制100mL 200mM的N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)溶液；加入0.08g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，0.16g醋酸氯己定，1mL曲拉通X-100(TritonX-100)，0.4g六水合氯化镁，0.86g二水合乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)，0.08g氟化钠和0.01g焦磷酸钠溶解；使用1M的氢氧化钠调节溶液pH为7.5后，使用0.22μm的滤膜过滤除菌；加入35.8mg萤光素酶(Sigma)和168mg D-萤光素(Sigma)，溶解，-20℃保存。

9.权利要求4所述的生物指示剂，芽孢的含量大于等于1.0×10⁵。

10.权利要求4～9中任一所述生物指示剂的应用，是检测灭菌效果；

其操作步骤是：将所述芽孢先进行灭菌处理，然后将所述芽孢ATP检测试剂施于灭菌处理过的芽孢中，再使用发光检测仪器检测所述芽孢的发光值；根据发光值确定灭菌是否完全。