CN114981399A - 带有盐化合物的整装配套式生物指示器 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及整装配套式生物指示器，其中单种类型的指示器能够用于各种灭菌条件，包括用蒸汽、过氧化氢和/或环氧乙烷来灭菌。在一些实施方案中，单种类型的生物指示器能够用于具有变化的温度和灭菌循环的不同蒸汽灭菌条件。
Description
本公开涉及整装配套式生物指示器，其可在各种灭菌条件下使用，包括用蒸汽、环氧乙烷和/或其他灭菌剂进行灭菌，包括特别是过氧化氢蒸气。在一些实施方案中，单种类型的生物指示器能够用于具有变化的温度和灭菌循环的不同蒸汽灭菌条件。
背景技术
设备、器械和其他装置的灭菌在医疗保健行业中是至关重要的。例如，医院和其他医疗机构经常对在治疗患者中使用的医疗器械和设备进行灭菌。用于对此类设备进行灭菌的灭菌循环的特定类型可基于待灭菌的特定设备或装置以及基于执行灭菌循环的实体的特定偏好而变化。然而，所有此类灭菌循环或过程通常被设计为杀灭可能原本会污染待灭菌的设备或装置的活生物体。
各种灭菌方法使用不同的循环或技术来灭菌。例如，灭菌可包括向待灭菌的设备或装置施用蒸汽、干热、化学物质(例如，环氧乙烷)、气相过氧化氢(VPHP)或辐射。当待灭菌的设备在高温下是耐热的时，蒸汽灭菌通常是有效的，因为这些物品接触温度大致在121℃-135℃范围内的蒸汽。接触蒸汽的时间段取决于灭菌温度。例如，设备或器械可以在不同的温度和时间标准下接触蒸汽灭菌过程，例如在132℃下约三分钟或在121℃下至多30分钟或更长时间。基于气相过氧化氢(VPHP)的灭菌模式包括通常被称为气化过氧化氢(VHP)灭菌的那些，以及包括过氧化氢等离子体的模式，并且通常被称为过氧化氢气体等离子体(HPGP)灭菌。
其他类型的灭菌涉及使装置或器械接触化学剂。用于低温灭菌的常用化学灭菌剂是环氧乙烷气体。通常，对于环氧乙烷灭菌而言，待灭菌的装置接触环氧乙烷气体的时间段范围为处于55℃一小时到处于38℃大约四小时。干热灭菌通常涉及使待灭菌的装置接触大约180℃或更高的范围内的温度至少两小时。在许多医学应用中，灭菌循环的功效至关重要。
生物指示器通常用于评价和验证各种环境中的灭菌过程的有效性。一般来讲，使嗜热生物体的活的但相对较高耐受性的孢子连同待灭菌的任何装置或器械一起经受灭菌条件。一般来讲，与将因自然污染而存在的大多数其他生物体相比，测试微生物更耐受灭菌循环。申请人已使用能够产生酶的微生物的孢子，该酶催化非荧光底物反应为荧光产物，能够检测该荧光产物以指示存活孢子的存在。
通常，在完成灭菌循环之后，将孢子在营养培养基中温育以确定测试生物体的任一种在该灭菌工序之后是否存活。在常规生物指示器中，对于pH颜色变化指示剂而言，可检测数量的生物体的生长可能需要24小时或更长的时间。
然后检查生物指示器以确定是否已发生此类生长。申请人使用快速读出技术，该技术基于因在孢子萌发和向外生长期间释放酶而在生长培养基中的温育期间出现荧光响应。当培养基与活孢子接触时，孢子相关酶与培养基中所含的荧光底物相互作用。酶和底物相互作用引起底物裂解而产生荧光检测的化合物。因荧光产物引起的与其他参数关联的荧光强度的分析用于确定灭菌过程是否成功。
一般来讲，生物指示器专为具体循环而设计并且申请人明白没有生物指示器可在所有常用市售灭菌循环下使用。本公开涉及可用于商业蒸汽灭菌循环中的一者或多者的生物指示器。
发明内容
在一个方面，本公开提供了整装配套式生物指示器。整装配套式生物指示器可用于确定给定灭菌循环的功效以及对包括那些生物指示器的物品的功效。在其他实施方案中，相同生物指示器能够确定大多数或所有蒸汽灭菌循环的功效。在一些实施方案中，生物指示器可在小于60分钟内确定灭菌循环的功效。
在一个方面，本公开提供了整装配套式生物指示器。整装配套式生物指示器可包括壳体。壳体可含有多个测试微生物(该多个测试微生物包含和/或能够产生能催化酶底物的裂解的酶)、营养组合物、酶底物、含有液体组合物的容器、和有效量的盐化合物。营养组合物促进测试微生物的萌发和/或生长。容器适于允许液体组合物与测试微生物之间的选择性流体连通。当溶解于液体组合物中时，有效量的盐化合物以在液体组合物中至少0.5mM且至多50mM的盐化合物的浓度存在；前提条件是当浓度等于10mM时，盐化合物不是磷酸钾。通过酶使酶底物裂解产生能够荧光检测的化合物。
在任何实施方案中，盐化合物可以是选自以下的任何离子的盐：乙酸盐；硼酸盐；柠檬酸盐；碳酸盐；碳酸氢盐；磷酸盐；磷酸氢盐；磷酸二氢盐；氯化物；硫酸盐；N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐；N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸；3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸；N-环己基-2-氨基乙磺酸盐；咪唑
盐；2-(N-吗啉基)乙磺酸盐；3-(N-吗啉基)丙磺酸；三(羟甲基)甲基甘氨酸，2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇；以及前述盐中的任何两种或更多种的组合。在以上实施方案中的任一个中，酶可以选自：α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、脂肪酶、酯酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、蛋白酶、氨肽酶、胰凝乳蛋白酶、β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖醛酸酶、β-葡糖醛酸酶、磷酸水解酶、钙蛋白酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、α-L-岩藻糖苷酶、亮氨酸氨肽酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、半胱氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、β-木糖苷酶、葡聚糖酶、纤维二糖糖苷酶、纤维素酶、α-阿拉伯糖苷酶、聚糖酶、硫酸酯酶、丁酯酶、糖苷酶、阿拉伯糖苷酶以及上述酶中的任何两种或更多种的组合。在以上实施方案中的任一个中，酶底物包括4-甲基伞形酮的衍生物或7-氨基-4-甲基香豆素的衍生物。在以上实施方案中的任一个中，酶包括α-D-葡糖苷酶，其中所述酶底物包括4-甲基伞形酮基-α-D-吡喃葡萄糖苷。
在另一个方面，本公开提供了试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒可包括整装配套式生物指示器的任何上述实施方案。在某些可供选择的实施方案中，试剂盒可包括壳体、多个测试微生物(该多个测试微生物包含和/或能够产生能催化酶底物的裂解的酶)、营养组合物、酶底物、含有液体组合物的容器、和有效量的盐化合物。营养组合物促进测试微生物的萌发和/或生长。酶底物包含能够荧光检测的组分。当溶解于液体组合物中时，有效量的盐化合物产生在液体组合物中至少0.5mM且至多50mM的盐化合物的浓度；前提条件是当浓度等于10mM时，盐化合物不是磷酸钾。在以上试剂盒实施方案中的任一个中，可将营养组合物、酶底物、液体组合物、盐化合物和多个测试微生物中的一个或多个设置在壳体中。在以上试剂盒实施方案中的任一个中，可将液体组合物设置在易碎容器中。
在又一个方面，本公开提供了用于确定灭菌过程的功效的系统。该系统可包括整装配套式生物指示器的任何上述实施方案和自动读取器。自动读取器可被构造为接收生物指示器的至少一部分，将第一波长的电磁辐射引导到壳体中的液体组合物中，并且检测或测量由荧光产物发射的第二波长的电磁辐射的量。在该系统的以上实施方案中的任一个中，整装配套式生物指示器适于用于确定选自以下的任何蒸汽灭菌过程的功效：121℃重力过程、121℃预真空过程、121℃SFPP过程、132℃重力过程、132℃预真空过程、132℃SFPP过程、134℃预真空过程、134℃SFPP过程、135℃重力过程、135℃预真空过程和135℃SFPP过程。SFPP意指蒸汽喷冲压力脉冲，并且预真空意指预抽真空或真空辅助，两者均被认为是与重力相反的动态空气去除的方面，其为无源空气去除过程。
在又一个方面，本公开提供了用于确定灭菌过程的功效的方法。该方法可包括使设置在壳体中的多个测试微生物接触灭菌过程，其中多个测试微生物包含和/或能够产生能与酶底物反应以生成荧光产物的酶。该方法还可包括在使测试微生物接触灭菌过程之后，使多个测试微生物与液体组合物接触。使多个测试微生物与液体组合物接触包括将测试微生物放置成与荧光酶底物发生液体接触。在使测试微生物与液体组合物接触之后，多个测试微生物和液体组合物的所得混合物包含营养组合物、酶底物和盐化合物；其中盐化合物以在液体组合物中至少0.5mM且至多50mM的盐化合物的浓度存在于混合物中；前提条件是当浓度等于10mM时，盐化合物不是磷酸钾。营养组合物促进测试微生物的萌发和/或生长。该方法还可包括将混合物温育一段时间并检测混合物中的荧光产物，其中检测到至少阈值量的荧光产物指示灭菌过程缺乏功效。
在该方法的任何上述实施方案中，将混合物温育一定时间段包括在指定温度下温育混合物。在该方法的任何上述实施方案中，该时间段是指定时间段，其中指定时间段小于或等于180分钟，其中在指定时间段之后检测到小于阈值量的荧光产物指示灭菌过程的功效。在该方法的任何上述实施方案中，检测荧光产物可包括定量由荧光产物发射的荧光。
除非另外指明，否则本文所使用的所有科学和技术术语具有在本领域中普遍使用的含义。本文给出的定义旨在有利于理解本申请中频繁使用的某些术语，并无意排除那些术语在本公开上下文中的合理解释。
除非另外指明，否则说明书和权利要求书中所使用的所有表达特征尺寸、量和物理特性的说明书和权利要求书中的数值在所有情况下均应理解成由术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则在上述说明书和所附权利要求书中列出的数值参数均为近似值，这些近似值可根据本领域的技术人员利用本文所公开的教导内容来寻求获得的期望特性而变化。最低程度上说，并且在不试图将等同原则的应用限制到权利要求书的范围内的前提下，至少应当根据所报告的有效位数并通过应用惯常的四舍五入法来解释每个数值参数。虽然在本发明的广泛范围内所示的数值范围和参数为近似值，但在具体实施例中所示的数值是尽可能准确地报告的。然而，任何数值都固有地包含一定的误差，这些误差必定是由在它们相应的试验测量中存在的标准偏差引起。
通过端点表述的数值范围包括该范围内所包括的全部数字(例如，1至5的范围包括例如1、1.5、2、2.75、3、3.80、4和5)和该范围内的任何范围。
除非内容另外明确指明，否则如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”涵盖具有多个指代物的实施方案。除非内容另外明确指明，否则如本说明书和所附权利要求书中使用的，术语“或”一般以其包括“和/或”的意义采用。
词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况或其它情况下，其它实施方案也可以是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其它实施方案是不可用的，且并非旨在将其它实施方案排除在本发明范围之外。
如本文所用，对于具有n个元素的给定集合S而言，术语“幂集”是指S的幂集和所有可能子集的数学定义，不包括空集但包括S自身，具有每一种组合的1至n个元素，并且被表示为P(S)。申请人注意到，幂集的数学定义包括空集(没有元素的集合)。然而，申请人在此采用的定义排除了空集并且包括具有至少一个元素的所有子集，包括n个元素的全集(S)。一般来讲，幂集包括具有“i”个元素的所有子集，其中i＝1至n-1，以及具有所有n个元素(n)的子集。例如，具有元素a、b和c(n＝3)的子集S的幂集包括以下7个子集：具有一个元素的所有可能子集：{(a),(b),(c)}；具有两个元素的任何可能组合的所有可能子集：{(a,b),(a,c),(b,c)}，以及具有所有3个元素的子集：(a,b,c)。
术语“易碎容器”是指可作用于其上例如通过使之破裂、使之穿孔、使之破碎、对其进行切割等来释放其内容物的任何容器。
术语“过程挑战装置”(缩写为“PCD”)是指这样的容器，其可包括内部的生物指示器并且包含阻碍灭菌剂到达其内容物(例如，生物指示器)的附加屏障，相比之下，如果物品不在PCD内部，灭菌剂将需要沿该路径行进而到达PCD内部的物品(例如，生物指示器)。PCD也称为“测试包”并且这两个术语在本公开中可互换使用。PCD被设计为模拟用于待灭菌的器械或其他物品的灭菌条件并且通常包括对灭菌过程的所定义的挑战。在其最简单的实施方案中，PCD是密封的容器，其具有入口(例如，孔或穿孔)以便灭菌剂能够到达容器的内部。
术语“能够荧光检测的化合物”是指易通过荧光来检测的化合物，即使该化合物可能并不总是发荧光并且仅在受到适当波长的能量激发时才发荧光。可用于本专利申请的能够荧光检测的化合物的示例包括底物与裂解酶的酶促反应的产物，其中底物使用用于检测酶促反应产物的激发波长是不可荧光检测的。可在溶液中或在底物上进行荧光检测。这种化合物的示例是4-甲基伞形酮(4-MU)，其是通过α-D-葡糖苷酶这种酶对4-甲基伞形酮基-α-D-吡喃葡萄糖苷进行酶解所得的产物。
如通过对上下文中出现的“相邻”的理解，术语“相邻”是指彼此靠近的两个元件(诸如例如，两个层)的相对位置，并且可需要或未必需要彼此接触或者可以具有分开两个元件的一个或多个层。
术语“紧邻”是指两个元件(诸如例如，两个层)彼此紧接和彼此接触的相对位置并且不具有分开两个元件的中间层。然而，术语“紧邻”涵盖以下情况：其中一个或两个元件(例如，层)已用底漆处理，或其表面已通过诸如蚀刻、压花等，或通过可改善粘附性的表面处理诸如电晕或等离子体处理等改性以影响其特性。
以上发明内容仅仅旨在提供本公开的主题的粗略概述，并不旨在描述本发明的每个公开实施方案或每种实施方式。以下描述更具体地举例说明了例示性实施方案。在本申请全文中的若干地方，通过示例的列表来提供指导，这些示例可以以各种组合方式使用。在每种情况下，所引用的列表都只用作代表性的组，并且不应被理解为排他性列表。
附图说明
图1表示本公开的示例性生物指示器的示意图。
图2表示本公开的示例性生物指示器的展开图。
具体实施方式
本公开提供了一种整装配套式生物指示器(SCBI)。SCBI可用于评估灭菌过程的功效。SCBI包含多个测试微生物(该多个测试微生物包含和/或能够产生能催化酶底物的裂解的酶)、营养组合物、酶底物、含有液体组合物的容器、和有效量的盐化合物。营养组合物促进测试微生物的萌发和/或生长。容器适于允许液体组合物与测试微生物之间的选择性流体连通。当溶解于液体组合物中时，有效量的盐化合物以在液体组合物中至少0.5mM且至多50mM的盐化合物的浓度存在；前提条件是当浓度等于10mM时，盐化合物不是磷酸钾。通过酶使酶底物裂解产生能够荧光检测的化合物。
现在已知的是，添加有效量的盐化合物可改善催化酶底物以产生能够荧光检测的化合物的酶的检测(例如，通过增加酶的活性和/或通过使荧光信号稳定和/或通过改善在生物指示器接触灭菌过程后检测酶活性和检测测试微生物生长的相关性)。
整装配套式生物指示器
现在转到图1和图2，示例性生物指示器100可包括壳体102，该壳体可包括第一部分104和第二部分106(例如盖件)，该第一部分和第二部分适于联接在一起以提供整装配套式生物指示器。在一些实施方案中，第一部分104和第二部分106可由相同的材料形成，并且在一些实施方案中，第一部分104和第二部分106可由不同的材料形成。壳体102可限定生物指示器100的贮存室103，在其中可定位其他部件并且在灭菌过程期间可导入灭菌剂。
壳体102可由至少一个不透液体的壁限定，诸如第一部分104的壁108和/或第二部分106的壁110。应理解，在不背离本发明的实质和范围的前提下，也可采用一件式一体壳体102，或者第一部分104和第二部分106可具有他形状、维度或相对结构。壳体102(如壁108和110)的合适材料可包括但不限于玻璃、金属(如箔)、聚合物(如聚碳酸酯(PC)、聚丙烯(PP)、聚亚苯基(PPE)、聚乙烯、聚苯乙烯(PS)、聚酯(如聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET))、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA或丙烯酸类树脂)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、环状烯烃聚合物(COP)、环状烯烃共聚物(COC)、聚砜(PSU)、聚醚砜(PES)、聚醚酰亚胺(PEI)、聚对苯二甲酸丁二酯(PBT)、陶瓷、瓷器或者它们的组合。
在一些实施方案中，生物指示器100还可包括易碎容器120，该易碎容器包含液体(例如，液体组合物)122并且其尺寸被设计成可被接收于生物指示器100内，例如在壳体102的至少一部分内(例如，至少在壳体102的第一部分104内)。易碎容器120可由多种材料形成，包括但不限于金属(如箔)、聚合物(如以上针对壳体102所列举的聚合物的任何一种)、玻璃(如玻璃安瓿)中的一种或多种以及它们的组合。在一些实施方案中，容器120的仅一部分是易碎的，例如，容器120可包括易碎部分或覆盖件(如易碎屏障、膜、隔膜等)。易碎容器120可具有第一状态，其中易碎容器是完整的并且液体122容纳在其中，以及具有第二状态，其中容器120的至少一部分是破碎的。在容器120的第二状态中，例如当容器120定位在生物指示器100中时，液体122可与生物指示器100的贮存室103流体连通。
如图1和图2中的图示实施方案所示，可以将容器120保持在生物指示器100内的合适位置和/或用嵌件130使其破碎。
壳体102的第一部分104可适于容纳生物指示器100的大部分部件，并且可称为“主体”或“管”、“管状体”、“基座”等。壳体102可包括贮存室103，其可由壳体102的第一部分104和第二部分106中的一者或两者限定。生物指示器100还可包括测试微生物115诸如孢子，例如(或测试微生物的座位)定位成与贮存室103流体连通。如图1至图2所示，壳体102的第二部分106可包括一个或多个孔口107，以提供壳体102的内部(如贮存室103)与周围环境之间的流体连通。例如，该一个或多个孔口107可在灭菌过程期间提供测试微生物115与周围环境之间的流体连通，并且可充当进入生物指示器100的入口和充当灭菌剂路径164的入口(下文有更详细的描述)。在一些实施方案中，壳体102的第二部分106可联接到壳体102的第一部分104的第一(例如开口)端101，并且测试微生物115可定位在壳体102的第一部分104中与第一端101相对的第二(例如封闭)端105处。
在一些实施方案中，屏障或过滤器(例如无菌屏障；未示出)可定位在灭菌剂路径164中(例如在孔口107所形成的入口处)以防止污染性的或外来的生物体、物体或材料进入生物指示器100。这种屏障可包括能透过气体但不能透过微生物的材料，且可通过多种联接方式联接到壳体102，所述联接方式包括但不限于粘合剂、热密封、超声焊接等。另选地，屏障可通过联接到壳体102的第一部分104的支撑结构(诸如第二部分106)来联接到灭菌剂路径164(例如以按扣配合式接合、螺旋配合式接合、压力配合式接合或者它们的组合的方式联接)。在接触灭菌剂的过程中，灭菌剂可穿过屏障进入灭菌剂路径164并与测试微生物115接触。
在一些实施方案中，如图示实施方案中所示，壳体102可包括可至少部分地被内壁(或部分壁)118、突架(ledge)、隔离件(partition)、凸缘等分开的下部114和上部116，在其中可形成开口117，开口117提供下部114和上部116之间的流体连通。在一些实施方案中，壳体102的第一部分104的下部114(有时仅称为“下部114”或“壳体102的下部114”)可适于容纳测试微生物115或测试微生物座位。在一些实施方案中，下部114可称为壳体102的“检测部分”或“检测区域”，因为可检查下部114的至少一部分确认测试微生物生长的迹象。另外，在一些实施方案中，壳体102的第一部分104的上部116(为简单起见，有时称为“上部116”或“壳体102的上部116”)可适于容纳易碎容器120的至少一部分，特别是在激活前。
在一些实施方案中，贮存室103的至少部分地被壳体102的上部116限定的部分可以称为第一室(或贮存室、区、区域或空间)109，贮存室103的至少部分地被壳体102的下部114限定的部分可以称为第二室(或贮存室、区、区域或空间)111。在一些实施方案中，第二室111可以称为“测试微生物生长室”或“检测室”，并可以包括要检查测试微生物活力以确定灭菌过程功效的空间。
第一室109和第二室111可被定位成彼此流体连通，以使得灭菌剂和液体122能够从(即通过)第一室109移动到第二室111。在一些实施方案中，第一室109与第二室111之间的流体连接程度(例如，连接第一室109和第二室111的开口(诸如开口117)的尺寸)可在激活步骤(即液体122从容器120释放出来)之后增加、与激活步骤同时增加和/或响应于激活步骤而增加。在一些实施方案中，对第一室109(例如，上部116中)与第二室111(例如，下部114中)之间的流体连通(或流体连接的程度)的控制可由嵌件130的至少一部分提供。
在灭菌期间和容器120处于未破碎的第一状态时，容器120可被定位和保持在第一室109中。当容器120处于第一状态时，测试微生物115可被容纳在第二室111中并与周围环境流体连通。第一室109和第二室111可被构造为使得容器120不存在于第二室111中，并且具体地讲，当容器120处于其未破碎的第一状态时，容器120不存在于第二室111中。当容器120破碎并且液体122被释放到壳体102的内部时，灭菌剂可以在灭菌期间(如，经由第一室109)移入第二室111，并且液体122可以在激活期间(如，从第一室109)移入第二室111。
因此，当容器120处于第一状态时，第一室109和第二室111可彼此流体连通并且与周围环境流体连通(例如，在灭菌期间)。例如，第一室109和第二室111可通过一个或多个孔口107与周围环境流体连通。在一些实施方案中，第一室109和第二室111可以一定方式与周围环境流体连通，使得在灭菌剂进入生物指示器100时第一室109位于第二室111的上游。即，第一室109可定位在灭菌剂入口(例如，一个或多个孔口107)与第二室111之间，并且灭菌剂入口可定位在第一室109的相对侧，而不是第二室111的相对侧。
系统
在另一个方面，本公开提供了可用于确定灭菌过程的功效的系统。该系统包括根据本发明的整装配套式生物指示器的任何实施方案和自动读取器。自动读取器被构造为i)接收生物指示器的至少一部分，ii)将第一波长的电磁辐射引导到壳体中的液体组合物中，并且iii)检测或测量由荧光产物发射的第二波长的电磁辐射的量。因此，本领域普通技术人员应当认识到，自动读取器尤其包括尺寸被设计成接收生物指示器的位点(例如，室)、紫外电磁辐射源、用于检测和测量从生物指示器发射的荧光的光检测器、用于控制自动读取器的部件的至少一个微处理器。任选地，自动读取器还包括具有用于识别展现出荧光的生物指示器的算法的软件或固件，该荧光指示在接触灭菌过程之后测试微生物完全失活或测试微生物的至少一部分存活。
在该系统的任何实施方案中，如本文所公开的整装配套式生物指示器适于用于确定选自以下的任何蒸汽灭菌过程的功效：121℃重力过程、121℃预真空过程、121℃SFPP过程、132℃重力过程、132℃预真空过程、132℃SFPP过程、134℃预真空过程、134℃SFPP过程、135℃重力过程、135℃预真空过程和135℃SFPP过程。
壳体
一般来讲，壳体是指定位有生物指示器的其他部件的容器，通常是外容器，其具有不能透过灭菌剂的壁。壳体可位于过程挑战装置内或可为过程挑战装置本身。在一些实施方案中，壳体可具有可用于产生平坦或大致平面的生物指示器的尺寸。本公开涵盖任何形状和尺寸的壳体。
壳体包含使得灭菌剂能够流动到壳体内部的至少一个开口(灭菌剂路径)。在一些实施方案中，壳体可包括具有开口的主体和关闭该开口的盖件。在一些实施方案中，盖件可能能够完全密封壳体并且消除壳体内部与周围环境之间的任何流体连通(例如，关闭灭菌剂路径)。一般来讲，盖件具有打开位置，在该打开位置中，容器的盖件与主体之间存在开口(例如，间隙)，从而使得液体或气体(例如，灭菌剂)能够流入和流出壳体的内部。盖件还具有关闭位置，在该关闭位置中，开口被密封并且穿过该间隙的任何流体流均被消除。在其他实施方案中，盖件可包括通气口，即使存在盖件并且盖件处于关闭位置，这些通气口也使得灭菌剂能够传递到壳体的内部并且形成附加灭菌剂路径。然而，在其他优选的实施方案中，当盖件包括通气口时，将盖件置于关闭位置会同时关闭：(a)容器的盖件与主体之间的间隙以及(b)盖件上存在的通气口，从而基本上关闭灭菌剂路径。
在其他实施方案中，盖件可缺少通气口，并且当盖件处于打开位置时，唯一的灭菌剂路径可穿过壳体的盖件与主体之间的空间(或穿过另一个开口或通气口(如果主体上存在的话))。在一些实施方案中，如果通气口存在于壳体上，则它们位于盖件上。在除壳体的盖件与主体之间的开口之外不存在其他开口的实施方案中，则将盖件置于关闭位置会完全封住壳体的内部，从而阻止壳体的内部与周围环境之间的流体连通。在那些实施方案中，当盖件处于关闭位置时，可密封灭菌剂路径。
测试微生物
本公开的制品包括测试微生物。在某些实施方案中，测试微生物可为多个测试微生物。在某些实施方案中，测试微生物可为多个孢子。用于整装配套式生物指示器的合适测试微生物是本领域中众所周知的。测试微生物包含和/或能够产生能催化酶底物的裂解的酶，该酶可以用于检测接触灭菌过程后存活的测试微生物。
包含可用于本发明实践的酶的优选微生物是处于孢子或营养体状态的细菌或真菌。尤其优选的测试微生物无限制地包括芽孢杆菌属(Bacillus)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、脉孢菌属(Neurospora)以及假丝酵母(Candida)属微生物。
本发明的方法可包括将灭菌循环完成之后保持活性的微生物中的任何一种与水性营养培养基一起温育的步骤。添加此步骤以通过常规技术来确认灭菌条件是否已足以杀灭指示器中的全部微生物，由此指示出灭菌条件是否已足以对灭菌器中的所有物品灭菌。如果以常规方式使用微生物的生长来确认快速酶测试的结果，则该微生物应为常规用于监测灭菌条件的微生物。这些常规使用的微生物对所采用的灭菌工序的耐性通常比在天然污染物中遇到的大多数有机体高数倍。细菌孢子被公认为是具有最高耐性的微生物生命形式。它是在用于确定设备、化学品和工艺的灭菌功效的所有测试中所选择的生命形态。源自芽孢杆菌属和梭状芽孢杆菌属的孢子最常用于监测采用饱和蒸汽、干热、γ射线照射以及环氧乙烷的灭菌工序。
一般来讲，选择尤其耐受给定灭菌过程的测试微生物用于生物指示器。在某些实施方案中，本公开的生物指示器包括已知种类的微生物的活培养物，通常为微生物孢子的形式。至少部分地使用孢子(例如，细菌孢子)而不是微生物的营养体型，因为已知营养体微生物相对容易地被灭菌过程杀灭。另外，孢子还具有良好的存储特性并且能够多年保持其休眠状态。因此，标准化孢子菌株的种菌的灭菌提供在灭菌室中所有微生物已经发生失活的更高可信度。
仅作为示例，本公开将生物指示器中使用的微生物描述为“孢子”；然而应当理解，生物指示器的特定实施方案中使用的微生物的类型(例如，孢子)是针对能耐受所设想的特定灭菌过程来选择的(比通常存在于待灭菌的物品上的微生物的耐受性更大以使得测试微生物的失活指示灭菌成功)。因此，本公开的使用不同灭菌剂的不同实施方案可使用不同的微生物，这取决于特定实施方案有意采用的灭菌过程。
一般来讲，在特定系统中使用的孢子根据手头的灭菌过程进行选择。例如，对于蒸汽灭菌过程而言，可使用嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)。又如，针对环氧乙烷灭菌处理，可使用萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)(以前称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))。在一些实施方案中，孢子可包括但不限于如下诸项中的至少一者：嗜热脂肪地芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、产孢梭菌(Clostridium sporogenes)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)或它们的组合物。
酶和酶底物
测试微生物要么包含能够催化酶底物裂解而产生能够荧光检测的化合物的酶，要么能够产生这种酶，或两者兼有。可用于本公开的生物指示器的酶包括胞外酶和胞内酶，这些酶的活性与通常用于监测灭菌功效的微生物(“测试”微生物或“测试孢子”)中的至少一种的活力关联。在该上下文中，“关联”意指超过背景的酶活性可用于预测测试微生物的生长。酶应为这样的酶，其在对测试微生物亚致死的灭菌循环之后在二十四小时内以及在优选实施方案中在八小时或更短时间内保持足够的活性以与酶的底物反应，而在对测试微生物致死的灭菌循环之后被灭活或活性明显降低。
在测试微生物已经接触灭菌过程之后，对酶活性的检测提供比传统的基于生长的检测方法更快速地对存活测试微生物的检测。
合适的酶的示例包括α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、脂肪酶、酯酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、蛋白酶、氨肽酶、胰凝乳蛋白酶、β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖醛酸酶、β-葡糖醛酸酶、磷酸水解酶、纤溶酶、凝血酶、胰蛋白酶、钙蛋白酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、α-L-岩藻糖苷酶、亮氨酸氨肽酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷、半胱氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、β-木糖苷酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、葡聚糖酶、纤维二糖苷、纤维素酶、α-阿拉伯糖苷酶、聚糖酶、硫酸酯酶、丁酯酶、糖苷酶、阿拉伯糖苷以及上述酶中的任何两种或更多种的组合。在本公开的制品、试剂盒、系统和方法的某些实施方案中，其中使用的生物活性源包括任何上述合适的酶的分离形式或以其他方式纯化的形式。
在本申请的上下文中，酶底物包括在酶对其起作用时会将其转化为酶修饰产物的一种物质或物质混合物。尽管优选的底物产生能够荧光检测的化合物，但是在其他实施方案中，酶促作用的产物可为发光或有色的材料。然而，在其他实施方案中，酶底物可由某化合物组成，该化合物在与酶反应时将产生产物，该产物将与附加化合物或组合物反应而产生发光、发荧光或有色的材料。优选地，如果底物要在灭菌期间包括在指示器装置中，则底物不应在灭菌或温育期间自发地分解或转化为可检测产物。例如，在用于监测蒸汽和干热灭菌的装置中，底物必须在约20℃与180℃之间的温度下稳定。还优选地，在酶底物要与常规生长培养基包括在一起的情况下，酶底物必须在生长培养基中稳定，例如不会在生长培养基中自发荧光。
一般来讲，有两种基本类型的酶底物可用于本公开的生物指示器。第一类型的底物可为荧光的(或显色的)，并且可以以诸如AB的化学式给出。当通过酶对其起作用时，AB分解成产物A和B。B例如可为发荧光的或有色的。这种类型的荧光底物的具体示例是4-甲基伞形酮的衍生物。这种类型的其他荧光底物包括7-酰氨基-4-甲基香豆素(7-AMC)、吲哚和荧光素的衍生物。该类型的显色底物的示例是5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐。在存在磷酸酶的情况下，底物将分解成靛蓝和磷酸盐。该类型的其他显色底物包括下列5-溴-4-氯-3-吲哚基、硝基酚和酚酞的衍生物。
第二类型的底物可以以例如化学式CD给出，该CD将由特异性的酶转化成C和D。然而，在这种情况下，C和D都不会发荧光或为有色的，但C或D中的任一者能够进一步与化合物Z反应而产生发荧光或有色的化合物，从而指示酶活性。该类型的具体荧光示例是氨基酸赖氨酸。在存在赖氨酸脱羧酶的情况下，赖氨酸失去CO2分子。于是赖氨酸的剩余部分称为尸胺，它是强碱性的。可掺入诸如4-甲基伞形酮的碱性指示剂，并且该碱性指示剂将在存在强碱的情况下发荧光。该类型的显色底物将为2-萘基磷酸酯。磷酸酶与该底物反应而产生β-萘酚。释放的β-萘酚与包含l-重氮-4-苯甲酰氨基-2,5-二乙氧基苯(可以以“固蓝BB盐”从西格玛化工公司(Sigma Chemical)商购获得)的显色试剂反应而产生紫罗兰色。
如上所述，优选的酶底物在一些实施方案中是荧光底物，其在本文中被定义为能够经酶修饰(例如，通过水解或其他酶促作用)而给出衍生物荧光团的化合物，该衍生物荧光团具有明显改变的或增强的荧光。
本领域普通技术人员应当理解，合适的荧光化合物本身是非荧光或变荧光(meta-fluorescent)的(即，以与对应酶修饰产物明显不同(例如，在颜色或强度上)的方式发荧光)。就此而言，按照荧光技术用户已知的方式使用适当的激发波长和检测波长将通过酶修饰所形成的荧光信号与可存在的任何其他荧光分开。
合适的酶底物的非限制性示例可包括例如香豆素的衍生物(包括7-羟基香豆素(也称为伞形酮或7-羟基-2H-苯并吡喃-2-酮)衍生物)和4-甲基伞形酮(7-羟基-4-甲基香豆素)衍生物，包括例如：4-甲基伞形酮基α-D-吡喃葡萄糖苷、4-甲基伞形酮基α-D-半乳吡喃糖苷、庚酸4-甲基伞形酮酯、棕榈酸-4-甲基伞形酮酯、油酸-4-甲基伞形酮酯、乙酸-4-甲基伞形酮酯、壬酸-4-甲基伞形酮酯、辛酸-4-甲基伞形酮酯、丁酸-4-甲基伞形酮酯、4-甲基伞形酮基-β-D-纤维二糖苷、乙酸4-甲基伞形酮基酯、磷酸4-甲基伞形酮基酯、硫酸4-甲基伞形酮基酯、肉桂酸-4-甲基伞形酮基-β-三甲基氯化铵、4-甲基伞形酮基-β-D-N,N',N"-三乙酰基壳三糖、4-甲基伞形酮基-β-D-木糖苷、4-甲基伞形酮基-N-乙酰基-1-β-D-氨基葡糖苷、4-甲基伞形酮基-N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷、丙酸4-甲基伞形酮基酯、硬脂酸4-甲基伞形酮基酯、4-甲基伞形酮基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷、4-甲基伞形酮基-α-L-阿拉伯糖苷；4-甲基伞形酮基-β-D-N,N'-二乙酰基壳二糖苷、反油酸4-甲基伞形酮基酯、4-甲基伞形酮基-α-D-吡喃甘露糖苷、4-甲基伞形酮基-β-D-吡喃甘露糖苷、4-甲基伞形酮基-β-D-岩藻糖苷、4-甲基伞形酮酰-α-L-岩藻糖苷、4-甲基伞形酮酰-β-L-岩藻糖苷、4-甲基伞形酮酰-α-D-半乳糖苷、4-甲基伞形酮酰-β-D-半乳糖苷、4-三氟甲基伞形酮酰β-D-半乳糖苷、4-甲基伞形酮基-α-D-葡糖苷、4-甲基伞形酮基-β-D-葡糖苷、4-甲基伞形酮基-7,6-磺基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡糖苷、4-甲基伞形酮基-β-D-葡糖苷酸、6,8-二氟-4-甲基伞形酮基-β-D-葡糖苷酸、6,8-二氟-4-甲基伞形酮基-β-D-半乳糖苷、磷酸6,8-二氟-4-甲基伞形酮基酯、6,8-二氟-4-甲基伞形酮基-β-D-木二糖苷酸。第二底物也可以是7-酰氨基-4-甲基香豆素的衍生物，包括：Ala-Ala-Phe-7-酰氨基-4-甲基香豆素、Boc-Gln-Ala-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素盐酸盐、Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素、Boc-Val-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素盐酸盐、D-Ala-Leu-Lys-7-酰氨基-4-甲基香豆素、L-丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素三氟乙酸盐、L-甲硫氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素三氟乙酸盐、L-酪氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素、Lys-Ala-7-酰氨基-4-甲基香豆素二盐酸盐、N-对甲苯磺酰基-Gly-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素盐酸盐、N-琥珀酰-Ala-Ala-Phe-7-酰氨基-4-甲基香豆素、N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-7-酰氨基-4-甲基香豆素、N-琥珀酰-Ala-Phe-Lys-7-酰氨基-4-甲基香豆素乙酸盐、N-琥珀酰-Leu-Leu-Val-Tyr-7-酰氨基-4-甲基香豆素、D-Val-Leu-Lys-7-酰氨基-4-甲基香豆素、Fmoc-L-谷氨酸1-(7-酰氨基-4-甲基香豆素)、Gly-Pro-7-酰氨基-4-甲基香豆素氢溴酸盐、L-亮氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素盐酸盐、L-脯氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素氢溴酸盐；其它7-羟基香豆素衍生物包括3-氰基-7-羟基香豆素(3-氰基伞形酮)和7-羟基香豆素-3-羧酸酯例如7-羟基香豆素-3-羧酸乙酯、7-羟基香豆素-3-羧酸甲酯、3-氰基-4-甲基伞形酮和3-(4-咪唑基)伞形酮；荧光素衍生物，包括：2',7'-双-(2-羧乙基)-5-(和-6-)羧基荧光素、2',7'-双-(2-羧丙基)-5-(和-6-)-羧基荧光素、5-(和6)-羧基萘荧光素、石荧光素、2',7'-二氯荧光素二乙酸酯、5(6)-羧基荧光素、5(6)-羧基荧光素二乙酸酯、5-(溴甲基)荧光素、5-(碘乙酰氨基)荧光素、5-([4,6-二氯三嗪-2-基]氨基)荧光素盐酸盐、6-羧基荧光素、伊红Y、二乙酸荧光素5-马来酰亚胺、荧光素-O'-乙酸、O'-(羧甲基)荧光素酰胺、蒽荧光素、玫瑰醇(rhodols)、卤代荧光素；罗丹明的衍生物，包括：四甲基罗丹明、羧基四甲基罗丹明、羧基-X-罗丹明、磺酰罗丹明101和罗丹明B；氟代葡糖胺衍生物；苯并蒽染料的衍生物，包括：半萘荧光酮、羧基半萘荧光酮、半萘荧光素、半萘并罗丹氟(seminaphthorhodafluors)；花菁的衍生物，包括磺化五甲川菁和庚甲川菁(septamethine cyanine)。
在一些实施方案中，要检测其活性的酶可选自α-D-葡糖苷酶、胰凝乳蛋白酶或脂肪酸酯酶。就嗜热脂肪芽孢杆菌而言，荧光酶底物优选地为4-甲基伞形酮基-α-D-葡糖苷、7-戊二酰苯丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素或庚酸4-甲基伞形酮酯。如果要检测其活性的酶为α-L-阿拉伯呋喃糖酶(例如衍生自萎缩芽孢杆菌)，则优选的荧光酶底物为4-甲基伞形酮基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷。在优选的实施方案中，4-甲基伞形酮基α-D-吡喃葡萄糖苷为用于产生代谢活性的酶底物，并且酶为葡糖苷酶，诸如β-D-葡糖苷酶。
盐化合物
本公开的整装配套式生物指示器包含设置在壳体中的有效量盐化合物。合适的盐化合物可包括选自以下的任何离子的盐：乙酸盐；硼酸盐；柠檬酸盐；碳酸盐；碳酸氢盐；磷酸盐；磷酸氢盐；磷酸二氢盐；氯化物；硫酸盐；N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐；N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸；3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸；N-环己基-2-氨基乙磺酸盐；咪唑
盐；2-(N-吗啉基)乙磺酸盐；3-(N-吗啉基)丙磺酸；三(羟甲基)甲基甘氨酸，2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇；以及前述盐中的任何两种或更多种的组合。
盐化合物包括基本上不会抑制所得混合物中的孢子和/或测试微生物的生长、萌发或检测的一种或多种化合物。另选地或除此之外，盐化合物包括基本上不会抑制所得混合物中的可检测酶活性的检测的一种或多种盐化合物。
盐化合物可设置在壳体中的液体组合物中。另选地或除此之外，盐化合物可以与测试微生物在壳体中混合并且任选地干燥。在一些实施方案中，盐化合物可包含缓冲剂。在一些实施方案中，盐化合物可设置在液体组合物中。在一些实施方案中，盐化合物可与液体组合物分开地设置在壳体中。在一些实施方案中，盐化合物可设置成以干燥形式与测试微生物分开或与测试微生物混合。在一些实施方案中，盐化合物可设置在液体组合物中并且可与液体组合物分开地设置在壳体中。
盐化合物的有效量由盐化合物当与整装配套式生物指示器的液体组合物混合时的最终浓度确定。下文公开了液体组合物中的盐化合物的合适浓度。
液体组合物
液体组合物位于易碎容器中并且包含一种或多种上述酶底物。在某些实施方案中，酶底物是4-甲基伞形酮基-α-D-葡糖苷(MUG)。在一些实施方案中，液体组合物还可包含用于测试微生物(例如孢子)的营养物质，诸如使得任何活的存活孢子能够萌发和/或生长的萌发营养物质。在一些优选的实施方案中，液体组合物的溶剂是水。营养物质的组合形成营养培养基并且与酶底物和其他非营养组分(诸如pH指示剂)一起形成液体组合物。
最初可将合适的营养物质以干燥形式(例如，粉末形式、片剂形式、囊片形式、胶囊形式、膜或包衣、截留在小珠或其他载体中、另一种合适的形状或构型、或它们的组合)提供，然后与合适的溶剂组合而提供液体组合物，随后将液体组合物放置在易碎容器中。
液体培养基中的营养物质可包括一种或多种糖，包括但不限于葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖等或它们的组合物。另选地，营养物质可包括复合培养基，诸如蛋白胨、胰蛋白胨、植物蛋白胨、酵母提取物、大豆酪蛋白消化物、其他提取物、水解产物等或它们的组合物。在其他实施方案中，液体组合物中的营养物质表示一种或多种复合培养基组分和其他具体营养物质的组合。营养培养基还可以包含本公开的盐化合物。在一些实施方案中，营养物质还可包括至少一种氨基酸，包括但不限于甲硫氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸和色氨酸中的至少一者。
作为整装配套式生物指示器的一部分，任选地包含营养物质、酶底物和/或其他组分的液体组合物通常存在于整个灭菌工序中但保持分开并且不会被易碎容器中的测试微生物接触，直至需要为止。在完成灭菌过程并且使用生物指示器来确定灭菌的功效之后，将液体组合物放置成与测试微生物接触，从而产生混合物。在本公开中，将放置液体组合物成与孢子接触包括激活(例如打碎或以其他方式打开)易碎容器以使液体组合物被释放并且接触测试微生物。该过程可包括将液体组合物与测试微生物混合，诸如手动或机械摇动生物指示器的壳体以使得液体组合物与孢子充分混合。
在本公开中，将测试微生物(例如孢子)和培养基集合在一起的过程称为生物指示器的“激活”。即，术语“激活”及其变型形式在相对于生物指示器使用时，通常是指使一个或多个测试微生物(例如，孢子)与液体组合物(包含例如所关注的孢子的营养培养基和酶底物)流体连通。例如，当含有液体组合物的生物指示器内的易碎容器至少部分地破碎、穿孔、刺穿、压碎、断裂、破裂等，使得培养基已被放置为与测试微生物流体连通时，该生物指示器可被描述为已被“激活”。换句话说，当测试微生物已接触先前与测试微生物单独地容纳的液体组合物时，生物指示器已被激活。
在一些实施方案中，在激活之后通过将液体组合物与测试微生物混合而产生的混合物在已完成灭菌循环之后在生物指示器的壳体内保持分离，并且在激活期间或之后未向其添加附加试剂或组分。如果测试微生物是活的并且生长，则测试微生物所产生的酶催化酶底物裂解，从而产生能够荧光检测的化合物。这意味着相同容器(壳体)中的相同溶液用于三个单独事件：(a)测试微生物萌发和/或生长(如果测试微生物是活的话)，(b)酶底物的酶解，从而产生能够荧光检测的化合物，以及(c)能够荧光检测的化合物的荧光检测。
本发明人已开发了用于整装配套式生物指示器的液体组合物，使得上述三个事件可在对裂解和荧光检测使用相同萌发/生长溶液的相同容器中发生。在某些实施方案中，液体组合物包含测试微生物、荧光酶底物、促进测试微生物萌发和/或生长的营养物质、以及有助于检测通过涉及荧光酶底物和与测试微生物相关的酶反应产生的能够荧光检测的化合物的另外的盐化合物。
先前显示(2018年7月27日提交的美国临时专利申请第62/711,007号(代理人案卷号79760US002))调节用于整装配套式生物指示器的液体组合物的pH可以有助于检测生物指示器中使用的能够荧光检测的化合物。现在已知的是，添加盐化合物可具有加成效应(除了pH效应之外)并因此改善催化酶底物以产生能够荧光检测的化合物的酶的检测(例如，通过增加酶的活性和/或通过使荧光信号稳定和/或通过改善在生物指示器接触灭菌过程后检测酶活性和检测测试微生物生长的相关性)。
在本公开的制品、系统或方法的某些实施方案中，合适的酶底物包括但不限于包含荧光团组分的酶底物，该荧光团组分选自4-甲基-5-氟-2H-苯并吡喃-2-酮、4-甲基-6-氟-2H-苯并吡喃-2-酮、4-甲基-8-氟-2H-苯并吡喃-2-酮、4-甲基-6,8-二氟-2H-苯并吡喃-2-酮、4-甲基-6-氯-2H-苯并吡喃-2-酮以及4-甲基乙酸酯-6-氟-2H-苯并吡喃-2-酮。
在一些实施方案中，液体组合物可包含盐化合物。另选地或除此之外，盐化合物可以以干粉形式设置在生物指示器的壳体内，任选地与测试微生物混合。在这些可供选择的实施方案中，当如本文所述激活生物指示器时，盐化合物易于与液体组合物混合。
当溶解于液体组合物中时，盐化合物的离子状态(例如，浓度)应以妨碍酶活性检测的方式使得酶和酶底物基本上不受影响。在一些实施方案中，盐化合物用作液体组合物的一部分，诸如磷酸盐缓冲液(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液、磷酸钾或磷酸氢二钾)、三(羟甲基)氨基甲烷-HCl溶液或乙酸盐缓冲液或本领域已知的适用于灭菌的任何其他缓冲液。适用于本发明生物指示器的盐化合物应与用作液体组合物的一部分的荧光酶底物和显色酶底物相容。在选择盐化合物时的另一个考虑是它们对酶活性的影响。例如，磷酸盐缓冲液可包含相对较高浓度的无机磷酸盐，其是碱性磷酸酶的竞争性抑制剂。因此，对于该酶而言，建议使用Tris-HCl缓冲液。
在某些实施方案中，当溶解于液体组合物中时(在激活生物指示器之前或之后)，盐化合物的浓度可以是至少约0.5mM、至少约1.0mM、至少约2.0mM、至少约3.0mM、至少约4.0mM、至少约5.0mM、至少约7.5mM、至少约10.0mM、至少约15mM、至少约20mM、至少约25mM、至少约30mM、至少约40mM或至少约45mM。在某些实施方案中，当溶解于液体组合物中时(在激活生物指示器之前或之后)，盐化合物的浓度可以是大于0.5mM、大于1.0mM、大于2.0mM、大于3.0mM、大于4.0mM、大于5.0mM、大于7.5mM、大于10.0mM、大于15mM、大于20mM、大于25mM、大于30mM、大于40mM或大于45mM。在某些实施方案中，当溶解于液体组合物中时(在激活生物指示器之前或之后)，盐化合物的浓度可以是至多约5mM、至多约10mM、至多约15mM、至多约20mM、至多约25mM、至多约30mM、至多约35mM、至多约40mM、至多约45mM或至多约50mM。在某些实施方案中，当溶解于液体组合物中时(在激活生物指示器之前或之后)，盐化合物的浓度可以是小于5mM、小于10mM、小于15mM、小于20mM、小于25mM、小于30mM、小于35mM、小于40mM、小于45mM或小于50mM。在某些实施方案中，当溶解于液体组合物中时(在激活生物指示器之前或之后)，盐化合物的浓度可以是约0.5mM至约50mM、约0.5mM至小于10mM、或大于10mM至约50mM。在某些实施方案中，当溶解于液体组合物中(在激活生物指示器之前或之后)的盐化合物的浓度为10mM时，盐化合物不是磷酸钾。
存在于液体组合物中的酶底物的浓度取决于特定底物和酶的种类、为能在视觉上或通过仪器检测而必须生成的酶产物的量以及为确定活性酶是否存在于反应混合物中而愿意等待的时间量。优选地，酶底物的量足以在灭菌循环之后约八小时的时间段内与存在的任何残余活性酶反应，使得产生至少10-8摩尔酶修饰产物。在酶底物是4-甲基伞形酮基衍生物的情况下，本发明人已发现，其在水性缓冲溶液中的浓度优选地在约10-5与10-3摩尔之间。
尽管使用缓冲溶液可以有助于提供酶与其底物的稳定反应条件，但是缓冲溶液是不需要的。因此，在一些实施方案中，液体组合物仅包含被调节至合适的pH但未添加缓冲体系的溶液。然而，在其他实施方案中，液体组合物包含缓冲溶液。
在一些实施方案中，生物指示器可包含可有利于检测测试微生物(例如，孢子)的另一种代谢活性的附加指示剂化合物(除可产生能够荧光检测的化合物的酶底物之外)。该附加代谢活性也可为酶活性。指示剂化合物的非限制性示例包括显色酶底物(例如，在可见光谱中可观察到)、pH指示剂、氧化还原指示剂、化学发光酶底物、染料、以及上述指示剂化合物中的任何两种或更多种的组合。
在一些实施方案中，附加指示剂是pH指示剂，其在pH降低时产生颜色变化，从而指示测试微生物的生长。在一些实施方案中，pH指示剂是溴甲酚紫。pH指示剂可用于检测第二生物活性诸如碳水化合物向酸性终产物的发酵(表明测试微生物的存活)，和酶生物活性诸如α-D-葡糖苷酶酶活性。例如，这些活性可指示在生物指示器接触灭菌过程之后存在或不存在活的测试微生物。例如，溴甲酚紫可以约0.03g/L的浓度用于水性混合物中。4-甲基伞形酮基-α-D-葡糖苷可例如以约0.05至约0.5g/L(如约0.05g/L、约0.06g/L、约0.07g/L、约0.08g/L、约0.09g/L、约0.1g/L、约0.15g/L、约0.2g/L、约0.25g/L、约0.3g/L、约0.35g/L、约0.4g/L、约0.45g/L、约0.5g/L)的浓度用于水性混合物中。
溴甲酚紫和4-甲基伞形酮基-α-D-葡糖苷的组合表示根据本公开的酶底物和附加指示剂的优选组合，但可以在本公开的范围内设想到其他组合。在又一其他实施方案中，生物指示器不包含pH指示剂。
在一些情况下，生物指示器的一个或多个部件(例如，壳体中的缝隙、孢子的底物或载体、容器的壁等)可保留残余的氧化性灭菌剂。这可伴随例如过氧化氢蒸气和其他蒸气灭菌剂(诸如臭氧和过乙酸)而出现。例如，某些载体材料(例如亲水性的那些，诸如玻璃纤维和纤维素材料)可保留残余的氧化性灭菌剂，特别是过氧化氢。在此上下文中，“残余的”是指抑制少量存活孢子生长的保留下来的灭菌剂的量。通常，这意味着每微克载体保留有超过10微克灭菌剂。在某些情况下，残余的灭菌剂的量可大于40微克灭菌剂/毫升生长培养基。作为比较，如果载体材料具有大于90°的接触角，则其为疏水性的，并且每微克载体通常保留有不超过10微克的灭菌剂。
因此，在一些实施方案中，生物指示器包含一种或多种中和剂，该一种或多种中和剂不是酶，也不是设置在生物指示器内的金属催化剂。中和剂为与残余的灭菌剂(如，过氧化氢)反应以中和其效果的化合物或材料，其中该中和剂不是酶，也不是金属催化剂。酶中和剂通常在高温下不稳定，因而是不可取的。
中和剂的合适示例包括含硫材料(例如甲硫氨酸、L-半胱氨酸、D-乙硫氨酸、S-甲基-L-半胱氨酸、S-苄基-L-半胱氨酸、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、L-胱硫醚、N-乙酰基-L-半胱氨酸、羧甲基半胱氨酸、D,L-高半胱氨酸、D,L-高半胱氨酸-硫代内酯、和硫代二丙酸)和非含硫材料(例如异抗坏血酸、铁氰化钾、和丙酮酸钠)。可使用这些中和剂的各种组合。优选的中和剂包括甲硫氨酸、L-半胱氨酸、D-乙硫氨酸、S-甲基-L-半胱氨酸、S-苄基-L-半胱氨酸、硫代硫酸钠、硫代二丙酸、异抗坏血酸、铁氰化钾、丙酮酸钠、以及它们的组合物。
灭菌过程
本公开的生物指示器可用于监测一种或多种类型的灭菌工序的有效性，所述灭菌工序包括使用各种灭菌剂诸如蒸汽(例如，加压蒸汽)、蒸气相过氧化氢(其可包括或可不包括过氧化氢等离子体)、环氧乙烷气体、干热、环氧丙烷气体、甲基溴化物、二氧化氯、甲醛和过乙酸(单独使用或结合另一种材料的蒸气相使用)、臭氧、辐射以及它们的组合的灭菌工序。
在灭菌过程中的至少一些过程中，在过程中包括或者可遇到高温，例如50℃、60℃、100℃、121℃、132℃、134℃、135℃等。另外，可在单个给定灭菌循环内的不同阶段处或在不同灭菌循环中遇到高压和/或真空，例如15psi(1×105Pa)。
在蒸汽为灭菌剂的情况下，灭菌温度可包括121℃、132℃、134℃、135℃。本发明生物指示器适用于每个上述温度下的蒸汽灭菌循环，并且对于每个温度而言，该循环可具有选自重力、预真空(“pre-vac”)和蒸汽喷冲压力脉冲(SFPP)的不同空气去除过程。这些循环中的每个循环可具有不同接触时间，这取决于待灭菌的器械/装置的类型。在本公开中，预真空和SFPP也被标记为动态空气去除(DAR)循环。
下面示出了可在其中使用本发明生物指示器的示例性蒸汽灭菌循环的表格表示：
在本公开中，术语“T重力”灭菌循环是指灭菌温度为T℃并且因蒸汽驱替而从灭菌室去除(调理)空气的蒸汽过程。在这种情况下，当蒸汽进入室时，重力引起更重的气体(空气)经由灭菌器排放管离开室。一般来讲，重力循环需要更多的接触时间，因为空气去除方法本质上更被动。例如，“121重力”循环是在重力调理下于121℃进行的蒸汽灭菌。
“T预真空”灭菌循环是指灭菌温度为T℃并且通过机械抽真空与蒸汽注入相结合来进行空气去除的蒸汽过程。作为该调理方法的结果，灭菌室中的压力可在抽空循环期间降至低于大气压值并且可在引入蒸汽时升至正压力。例如，“121预真空”灭菌循环是指灭菌温度为121℃并且经由抽真空来进行调理的蒸汽过程。
“T SFPP”灭菌循环是指灭菌温度为T℃并且通过一系列加压和蒸汽喷冲来进行调理的蒸汽过程。在SFPP过程期间，室中的压力未降至低于大气压(未抽真空)。例如，“121SFPP循环是指灭菌温度为121℃并且经由蒸汽喷冲压力脉冲来进行调理的蒸汽过程。
在本公开中，“动态空气去除”循环是指使用预真空或SFPP调理的灭菌循环。
在其他实施方案中，本公开的生物指示器可用于监测使用氧化性灭菌剂的蒸气相灭菌工序的有效性。在一些实施方案中，生物指示器可用于监测本领域已知的任何过氧化氢灭菌工序的有效性。更优选地，生物指示器可用于监测过氧化氢蒸气相灭菌工序的有效性。
虽然含水过氧化氢(H2O2)作为灭菌剂具有长期的使用史，但在过去的十年中已形成了蒸气相过氧化氢(VPHP)灭菌的概念。此过程为杀灭宽泛范围的微生物的低温灭菌过程，所述微生物包括常用作挑战生物体以评价和验证医院中的灭菌循环的有效性的产细菌内生袍子的细菌。过氧化氢的主要优点为其短接触循环时间(几分钟)。此外，在过氧化氢灭菌过程结束时，仅空气和水保留在室中。显然，本文所述的生物指示器的新型特征促进了快速读出式过氧化氢生物指示器的开发。
一般来讲，灭菌过程包括将本公开的生物指示器放置在灭菌器中。在一些实施方案中，灭菌器包括灭菌室，灭菌室可被尺寸确定成容纳多个待灭菌的制品，并且装备有从灭菌室中排出空气和/或其他气体的装置和用于向灭菌室添加灭菌剂的装置。整装配套式生物指示器可定位在灭菌器中最难以灭菌的区域中。另选地，生物指示器可定位在过程挑战装置中以模拟灭菌条件，其中可能不会像更有利的灭菌情形那样直接地递送灭菌剂。
可在将灭菌室中存在的任何空气或其他气体的至少一部分排出室后，将灭菌剂加入室中。另选地，也可在不排放室的情况下将灭菌剂加入室中。一系列的排放步骤可以用来确保灭菌剂到达灭菌室中所有需要的区域并且接触所有需要的待灭菌制品，包括生物指示器。
整装配套式生物指示器能够确定选自以下十一个循环的幂集的一个或多个蒸汽灭菌循环的功效：121℃重力、121℃预真空、121℃SFPP、132℃重力、132℃预真空、132℃SFPP、134℃预真空、134℃SFPP、135℃重力、135℃预真空和135℃SFPP，优选地在小于1小时内进行。
酶活性的检测和成功灭菌过程的确定
在另一个方面，本公开提供了用于确定灭菌过程的功效的方法。在任何实施方案中，该方法使设置在壳体中的多个测试微生物接触灭菌过程；合适的测试微生物可以是本文所述的任何测试微生物。在一些实施方案中，测试微生物可设置在本文所公开的灭菌过程指示器的任何实施方案中。另选地，测试微生物可设置在容器(例如，管)中或基底(例如，纸条、载玻片或纱线)上。使测试微生物接触灭菌过程包括将其上(或其中)设置有测试微生物的制品放置到容器(例如，自动灭菌器)中，在该容器中进行灭菌过程。
在该方法的任何实施方案中，测试微生物包含和/或能够产生能与酶底物反应以生成荧光产物的酶，如本文所述。
在使测试微生物接触灭菌过程之后，该方法包括使多个测试微生物与液体组合物接触。液体组合物可为根据本公开的任何合适的液体组合物(例如，水性液体组合物)。使多个测试微生物与液体组合物接触包括将测试微生物放置成与酶底物发生液体接触。在使多个测试微生物与液体组合物接触之后，多个测试微生物和液体组合物的所得混合物还包含营养组合物、酶底物和盐化合物。营养组合物、酶底物和盐化合物可以是本文所述的任何合适的营养组合物、酶底物和盐化合物。在某些实施方案中，营养组合物、酶底物和盐化合物中的任何一种或全部可以在与测试微生物形成混合物之前设置在液体组合物中。
在其中测试微生物设置在容器(例如，管)中的某些实施方案中，将测试微生物放置成与酶底物发生液体接触可包括(例如通过移液管)将液体组合物添加到包含测试微生物的容器中。任选地，在将液体组合物移液到容器中之前，液体组合物包含如本文所述的营养组合物、酶底物和盐化合物中的任何一种或全部。在其中测试微生物设置在根据本公开的整装配套式灭菌过程指示器中的某些实施方案中，将测试微生物放置成与酶底物发生液体接触可包括致动(例如，压碎或以其他方式打开)含有液体组合物的该容器以释放如本文所述的液体组合物。任选地，在将测试微生物放置成与酶底物发生液体接触之后，可(例如通过手动或机械搅拌或涡流作用)混合这些组分。
在使测试微生物与液体组合物接触之后，多个测试微生物和液体组合物的所得混合物包含营养组合物、酶底物和盐化合物；它们每个如本文所述。营养组合物促进测试微生物的萌发和/或生长。在某些实施方案中，盐化合物以本文所述的一定浓度存在于混合物中(例如至少5mM且至多50mM；前提条件是当浓度等于10mM时，盐化合物不是磷酸钾)。
在使测试微生物与液体组合物接触之后，该方法包括将混合物温育一定时间段。将混合物温育一定时间段包括在指定温度下温育混合物。指定温度可为本文所述的用于测试微生物和/或酶活性的任何合适的温育温度。时间段可为本文所述的任何合适的温育时间段。在某些实施方案中，指定时间段少于8小时，在一些实施方案中，少于1小时，在一些实施方案中，少于30分钟，在一些实施方案中，少于15分钟，在一些实施方案中，少于5分钟，并且在一些实施方案中，少于1分钟。在其他实施方案中，用于本公开的生物指示器的合适温育时间为10分钟至1小时、或10分钟至50分钟、或10分钟至30分钟、或10分钟至20分钟、或10分钟至25分钟、或15分钟至30分钟、或15分钟至25分钟、或15分钟至20分钟。
在将混合物温育一定时间段期间和/或之后，该方法包括检测混合物中形成的荧光产物。检测荧光产物包括将第一电磁辐射(例如，电磁能的紫外光谱内的辐射)引导到混合物中并且检测由混合物中的荧光产物发射的第二电磁辐射(例如，电磁能的紫外光谱或可见光谱内的辐射)，如本文所述。在某些实施方案中，检测由荧光产物发射的电磁辐射包括使用自动检测器(例如，如本文所述的自动读取器)来检测电磁辐射。
在任何实施方案中，检测荧光产物包括检测由荧光产物发射的荧光的量。在任何实施方案中，可将所检测的荧光的量与阈值量进行比较。在任何实施方案中，可将在第一指定时间段之后检测的荧光的第一量与在第二指定时间段之后检测的荧光的第二量进行比较。在某些实施方案中，检测到至少阈值量的荧光产物指示灭菌过程缺乏功效(即，多个测试微生物和/或与它们相关的酶活性未全部被灭菌过程灭活(例如，杀灭))。
在某些实施方案中，根据本公开的方法可用于确定使用灭菌剂的灭菌过程的功效，该灭菌剂选自：蒸汽、环氧乙烷气体、过氧化氢蒸气、甲基溴化物、二氧化氯、甲醛、过乙酸、臭氧、电离辐射以及上述灭菌剂中的任何两种或更多种的组合。
如先前部分中所提及，在指示器接触灭菌过程之后，可将测试微生物在营养培养基中温育，以确定在灭菌过程中是否有任何测试微生物存活，其中测试微生物生长指示灭菌过程不足以杀死所有的测试微生物。
在一些实施方案中，生物指示器的盖件可在灭菌期间在第一位置中联接到生物指示器的主体，该第一位置保持生物指示器的内部与周围环境之间的流体连通，从而使得灭菌剂能够到达生物指示器的内部。灭菌之后，为了激活生物指示器，可将盖件进一步按压到管上(例如，按压到生物指示器的内部不再与周围环境流体连通的第二位置)以保持无菌并且降低液体组合物的蒸发速率。如先前所提及，液体组合物在灭菌期间在易碎容器中保持与测试微生物分开，但在灭菌之后通过使易碎容器破碎、穿孔、刺穿、压碎、断裂、破裂等释放到壳体的内部中，作为激活的一部分。
在本公开的一些实施方案中，关闭生物指示器(例如，使生物指示器的一部分(诸如盖件)相对于另一部分移动以密封内部)可包括或引起包含液体组合物的易碎容器的破碎、穿孔等，使得关闭生物指示器引起生物指示器的激活。
激活之后，将通过将液体组合物放置成与测试微生物接触而产生的混合物继续在一定条件下温育一定时间段，所述条件将足以释放可检测量的酶修饰产物，当然假定任何测试微生物均保持活性。一般来讲，可通过已知方法检测的产物的量为至少10-8摩尔。优选地，温育条件足以生成至少10-8摩尔的能够荧光检测的化合物，更优选地，约10-6摩尔至10-5摩尔的能够荧光检测的化合物。产生可检测量的能够荧光检测的化合物所需的温育时间和温度将取决于酶和底物的种类以及各自存在于反应混合物中的浓度。一般来讲，所需的温育时间介于约1分钟与12小时之间，并且温育介于约20℃与70℃之间。优选地，在枯草芽孢杆菌或嗜热脂肪地芽孢杆菌是酶的来源的情况下，温育时间为约10分钟至3小时，或10分钟至1小时，或15分钟至1小时，或15分钟至30分钟，或15分钟至25分钟，并且温育温度分别为约30℃至约40℃以及约52℃至65℃。
为检测测试微生物中的可检测变化，可在液体组合物和测试微生物进行了组合后立即测定生物指示器以获得基线读数。之后，能够检测任何偏离基线读数的可检测变化。生物指示器可连续地或间断地进行监测和测量。在一些实施方案中，可以在测量可检测变化之前执行温育步骤的一部分或全部。在一些实施方案中，温育可在一个温度下(例如，在37℃、在50℃-60℃等温度下)进行，而可检测变化的测量可在另一不同的温度下(例如，在室温、25℃或37℃)进行。在其他实施方案中，温育和荧光测量可在相同温度下进行。
生物指示器的读出时间(即用来确定灭菌过程的有效性的时间)可以在一些实施方案中少于8小时，在一些实施方案中，少于1小时，在一些实施方案中，少于30分钟，在一些实施方案中，少于15分钟，在一些实施方案中，少于5分钟，并且在一些实施方案中，少于1分钟。在其他实施方案中，本公开的生物指示器的读出时间为10分钟至1小时，或10分钟至50分钟，或10分钟至30分钟，或10分钟至20分钟，或10分钟至25分钟，或15分钟至30分钟，或15分钟至25分钟，或15分钟至20分钟。将指示存在活测试微生物(即，灭菌过程失败)的高于基线读数的荧光的检测可根据本领域已知的任何方法来进行，包括曲线下面积(在时间与荧光强度的关系图中)、监测曲线的斜率变化、使用荧光的阈值等或其两种或更多种技术的组合。
本公开的生物指示器的优点之一是单种类型可用于各种灭菌条件。以下工作示例示出了单种类型的生物指示器可用于所有下列蒸汽灭菌循环：121℃重力、121℃预真空、121℃SFPP、132℃重力、132℃预真空、132℃SFPP、134℃预真空、134℃SC FPP、135℃重力、135℃预真空和135℃SFPP。为此，生物指示器可用于选自上述集合的循环的任何子集。即，单个生物指示器能够确定一个或多个灭菌循环的功效，该一个或多个灭菌循环选自121℃重力、121℃预真空、121℃SFPP、132℃重力、132℃预真空、132℃SFPP、134℃预真空、134℃SFPP、135℃重力、135℃预真空和135℃SFPP的幂集。
除了能够确定任何上述灭菌循环的功效之外，生物指示器还能够在少于一小时内完成该操作。实际上，在一些实施方案中，生物指示器的读出时间少于1小时，在一些实施方案中，少于30分钟，在一些实施方案中，少于15分钟，在其他实施方案中，读出时间为10分钟至1小时，或10分钟至50分钟，或10分钟至30分钟，或10分钟至20分钟，或10分钟至25分钟，或15分钟至30分钟，或15分钟至25分钟，或15分钟至20分钟。
试剂盒
在另一个方面，本公开提供了可用于确定灭菌过程的功效的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包括i)多个测试微生物，该多个测试微生物包含和/或能够产生能催化酶底物的裂解的酶，ii)酶底物，iii)包含酶底物的液体组合物，和iv)有效量的盐化合物；其中当溶解于液体组合物中时，盐化合物以在液体组合物中至少0.5mM且至多50mM的盐化合物的浓度存在；前提条件是当浓度等于10mM时，盐化合物不是磷酸钾。通过酶使酶底物裂解的产物能够通过该产物的荧光来检测。
在另一个实施方案中，试剂盒包括本公开的整装配套式生物指示器的任何实施方案。
实施例
实施例1：在蒸汽灭菌过程中添加盐化合物的生物指示器
I型生物指示器(添加了盐化合物的带有孢子的BI)。
使用来自商业1492V生物指示器(明尼苏达州圣保罗的3M公司(3M Company,St.Paul,MN))的组分来组装这些实施例的生物指示器。在液体孢子形成培养基中产生嗜热脂肪地芽孢杆菌的孢子。将孢子在无菌去离子水中洗涤，并且重悬于无菌磷酸盐缓冲溶液(pH 7.2)中。调节溶液中磷酸盐缓冲液的浓度，使得当孢子在生物指示器激活期间在从安瓿中释放的营养培养基(约0.5mL)中再悬浮时，营养培养基中磷酸盐缓冲液的浓度变成在表1和表2中列出的浓度之一。将孢子悬浮液的等分试样移液到聚丙烯膜载体(大约0.065mm厚和5mm直径)上，并且孢子群落为每个载体约1×106个菌落形成单位(CFU/载体)。用本文所述的载体替换商业生物指示器的孢子载体，并且如美国专利10,047,334所示组装生物指示器。
II型生物指示器(添加了盐化合物的带有营养培养基的BI)。
使用来自商业1492V生物指示器(明尼苏达州圣保罗的3M公司(3M Company,St.Paul,MN))的组分来组装这些实施例的生物指示器，不同之处在于用含有蛋白胨、氨基酸、可发酵碳水化合物、溴甲酚紫、300mg/L 4-甲基伞形酮基-α-D-吡喃葡萄糖苷和具有在表2中指定的浓度之一的磷酸钾缓冲液(pH 7.2)的无菌培养基的安瓿替换商业生物指示器中的营养培养基的安瓿。培养基适合嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus.)的生长和检测。在液体孢子形成培养基中产生嗜热脂肪地芽孢杆菌的孢子。洗涤孢子并重悬于无菌去离子水中。将孢子悬浮液的等分试样移液到聚丙烯膜载体(大约0.065mm厚和5mm直径)上，并且孢子群落为每个载体约1×106个菌落形成单位(CFU/载体)。用本文所述的载体替换商业生物指示器的孢子载体，并且如美国专利10,047,334所示组装生物指示器。
将来自实施例1的五个组装好的I型和II型整装配套式生物指示器置于蒸汽抗力测试仪(型号101；纽约州罗切斯特市的H&W技术公司(H&W Technology；Rochester,NY))中，其中使它们接触蒸汽121℃预真空灭菌循环。在将生物指示器从灭菌器中取出之后，根据制造商的说明书将液体培养基的安瓿压破，从而激活生物指示器，并且使用购自明尼苏达州圣保罗的3M公司(3M Company(St.Paul,MN))的自动判读仪(型号490H)将生物指示器在60℃下温育24分钟。然后将生物指示器转移到培养箱中大约7天，用于指示孢子的萌发和生长(即，生长培养基的颜色从紫色变为黄色)。表1示出荧光阳性的百分比。磷酸钾缓冲液对阳性生长的生物指示器的影响在表2中示出。
表1.磷酸钾缓冲液离子强度对荧光阳性结果百分比的影响。每个报告的数据点是 五个I型整装配套式单个生物指示器的百分比。
表2.磷酸钾缓冲液离子强度对阳性生长结果百分比的影响。每个报告的数据点是 五个II型整装配套式单个生物指示器的百分比。
数据表明在磷酸钾的最高浓度下，与更低百分比的存活率相关的荧光阳性的百分比更高。
实施例2-5：在过氧化氢灭菌过程中添加盐化合物的生物指示器的用途
I型生物指示器(添加了盐化合物的带有孢子的BI)。
使用来自商业1295生物指示器(明尼苏达州圣保罗的3M公司(3M Company,St.Paul,MN))的组分来组装这些实施例的生物指示器。在液体孢子形成培养基中产生嗜热脂肪地芽孢杆菌的孢子。将孢子在无菌去离子水中洗涤，并且重悬于无菌磷酸盐缓冲溶液(pH 7.2)中。调节溶液中磷酸盐缓冲液的浓度，使得当孢子在生物指示器激活期间在从安瓿中释放的营养培养基(约0.6mL)中再悬浮时，营养培养基中磷酸盐缓冲液的浓度变成在表3和表4中列出的浓度之一。将孢子悬浮液的等分试样移液到聚丙烯膜载体(大约0.065mm厚和5mm直径)上，并且孢子群落为每个载体约1×107个菌落形成单位(CFU/载体)。用本文所述的载体替换商业生物指示器的孢子载体，并且如美国专利10,047,334所示组装生物指示器。
II型生物指示器(添加了盐化合物的带有营养培养基的BI)。
使用来自商业1295生物指示器(明尼苏达州圣保罗的3M公司(3M Company,St.Paul,MN))的组分来组装这些实施例的生物指示器，不同之处在于用含有蛋白胨、氨基酸、可发酵碳水化合物、溴甲酚紫、300mg/L 4-甲基伞形酮基-α-D-吡喃葡萄糖苷和具有在表3和表4中指定的浓度之一的磷酸钾缓冲液(pH 7.2)的无菌培养基的安瓿替换商业生物指示器中的营养培养基的安瓿。培养基适合嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus.)的生长和检测。在液体孢子形成培养基中产生嗜热脂肪地芽孢杆菌的孢子。洗涤孢子并重悬于无菌去离子水中。将孢子悬浮液的等分试样移液到聚丙烯膜载体(大约0.065mm厚和5mm直径)上，并且孢子群落为每个载体约1×107个菌落形成单位(CFU/载体)。用本文所述的载体替换商业生物指示器的孢子载体，并且如美国专利10,047,334所示组装生物指示器。
将组装好的I型整装配套式生物指示器置于过氧化氢抗力测试仪容器(TheSterilucentTMPSD-85过氧化氢灭菌器(明尼苏达州明尼阿波利斯的Sterilucent公司(Sterilucent Inc.,Minneapolis,MN))中，其中它们在55C的温度和0.05kPa的压力下接触59％的过氧化氢水溶液蒸汽不同长度的时间(如表3所示的1秒、5秒、10秒、和15秒)。在将生物指示器从抗力测试仪中取出之后，将液体培养基的安瓿压破，从而激活生物指示器，并且使用购自明尼苏达州圣保罗的3M公司(3M Company(St.Paul,MN))的自动判读仪(型号490H)测量荧光。记录通过自动判读仪检测到的出现阳性荧光的时间(以分钟为单位)。数据在表3中示出。数据表明无论过氧化氢接触时间如何，转为荧光阳性的时间与磷酸钾缓冲液的浓度成反比。
表3.磷酸钾缓冲液离子强度对出现荧光阳性结果的时间的影响。数据报告生物指 示器转为荧光阳性的平均时间(以分钟为单位)。每个报告的数据点是五个I型整装配套式 单个生物指示器的平均值。
数据指示在磷酸钾的最高浓度下出现阳性结果的荧光时间更快。
实施例6-9：在过氧化氢灭菌过程中添加盐化合物的生物指示器的用途
将四十个组装好的II型整装配套式生物指示器置于过氧化氢抗力测试仪容器(The SterilucentTMPSD-85过氧化氢灭菌器(明尼苏达州明尼阿波利斯的Sterilucent公司(Sterilucent Inc.,Minneapolis,MN))中，其中它们在55℃的温度和0.05kPa的压力下接触59％的过氧化氢水溶液蒸汽不同长度的时间(如表3所示的1秒、5秒、10秒、和15秒)。在将生物指示器从灭菌器中取出之后，根据制造商的说明书将液体培养基的安瓿压破，从而激活生物指示器，并且将生物指示器在60℃下温育大约7天。然后观察生物指示器对孢子萌发和生长的指示(即，生长培养基的颜色从紫色变为黄色)。表4示出阳性生长生物指示器的百分比。
表4.磷酸钾缓冲液离子强度在接触过氧化氢灭菌剂后对阳性生长的影响。每个报 告的数据点是四十个II型整装配套式单个生物指示器的百分比。
数据指示在磷酸钾的最高浓度下更低的存活率百分比(通过生长指示)。
实施例10-12.盐化合物对检测孢子酶活性的影响。
由在1mL去离子水中包含0.1mg 4-甲基伞形酮(4-MU)的生长培养基构成的液体组合物含有蛋白胨、氨基酸、可发酵碳水化合物和溴甲酚紫的混合物，其有助于嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的生长和检测，将该液体组合物置于容器中。在对照I和对照II中，根据需要使用HCl或NaOH分别将液体组合物pH值调节到7和8。在实施例10中，样品溶液另外含有盐化合物KH2PO4/K2HPO4以产生最终为8的pH值和0.025M的浓度。在实施例11中，样品溶液另外含有盐化合物(NH4)2CO3以产生最终为8的pH值和0.01M的浓度。在实施例12中，样品溶液另外含有Tris-HCl以产生最终为8的pH值和0.01M的浓度。根据《CRC化学物理手册》(CRC Handbook of Chemistry and Physics)(第56版，第D-134页)描述的标准程序获得使用这些盐的水溶液，该水溶液提供在25℃下的边际pH值。(除非另有说明，否则用于制备这些样品的所有化学品均购自密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))。
如实施例1所述制备嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)孢子收获物。收获后，通过离心洗涤孢子收获物并悬浮于去离子水中(如美国专利10,047,334所示及所述；该文献全文以引用方式并入本文中。将孢子悬浮液(约108CFU/mL)添加到容纳上述样品溶液的每个容器中，从而产生每毫升液体组合物中约1×106个菌落形成单位的最终样品孢子浓度。
使用由HORIBA JOBIN YVON公司制造的Fluoromax-4分光荧光计(购自新泽西州爱迪生的HORIBA科学仪器事业部(HORIBA Scientific,Edison,NJ))采集这些样品溶液的荧光光谱。使用的激发波长为360nm。在450nm的发射波长下测量荧光强度。动力学测量每个样品溶液的荧光强度(单位为相对荧光单位(RFU))，其作为100秒增量的时间函数，总共2小时。
在表5中报告的荧光强度测量结果(作为对照的百分比)为三次重复测量的平均值。在表中报告的所有荧光强度测量结果的一个标准偏差是所测量的荧光强度的±10％。Vmax表示表征在测定前10分钟荧光信号随时间的线性增加的斜率。
为了使生长培养基溶液具有恒定pH，加入盐对Vmax、荧光强度以及荧光强度随时间增长保持稳定方面产生可测量的影响。取决于盐系统，对Vmax和荧光强度的影响可增加或减少。加入(NH4)2CO3对酶活性不具有影响，但是与对照系统(无盐)相比，不导致荧光强度随时间增长的更好的稳定性。加入KH2PO4/K2HPO4显著提高酶活性，并且提供在开始动力学测定后稳定多达2小时的荧光强度。使用Tris盐导致酶活性的显著抑制。
表5.嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)α-葡糖苷酶活性的动力学检测 结果。
实施例13-15
使用类似于在实施例10-12中使用的液体组合物的液体组合物来制备容纳实施例13-15的溶液的容器。在对照中，根据需要使用HCl或NaOH将溶液pH值调节到7。在实施例13中，溶液另外含有缓冲液盐系统KH2PO4/K2HPO4以产生最终为8的pH值和025M的浓度。在实施例14中，样品溶液另外含有(NH4)2CO3以产生最终为8的pH值和0.01M的浓度。在实施例15中，样品溶液另外含有Tris-HCl以产生最终为8的pH值和0.01M的浓度。根据《CRC化学物理手册》(CRC Handbook of Chemistry and Physics)(第56版，第D-134页)描述的标准程序获得使用这些盐的水溶液，该水溶液提供在25℃下的边际pH值。(除非另有说明，否则用于制备这些样品的所有化学品均购自密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO))。
使用由HORIBA JOBIN YVON公司制造的Fluoromax-4分光荧光计(购自新泽西州爱迪生的HORIBA科学仪器事业部(HORIBA Scientific,Edison,NJ))采集这些4-MU水溶液的荧光光谱。使用的激发波长为360nm。在450nm的发射波长下测量荧光强度。数据在表6中示出。
盐的存在对由4-MU底物测量的荧光强度无影响，而pH对4-MU的强度有非常显著的影响。对于360nm的激发波长，当培养基溶液为pH＝8时，与pH＝7相比，在450nm的发射波长下测量的荧光强度平均高4.5倍。
表6.盐对4-MU荧光的影响。
Claims (19)
1.一种整装配套式生物指示器，所述整装配套式生物指示器包括：
壳体，所述壳体包含：
多个测试微生物，所述测试微生物包含和/或能够产生能催化酶底物的裂解的酶；
所述酶底物；
营养组合物，其中所述营养组合物促进所述测试微生物的萌发和/或生长；
包含液体组合物的容器，其中所述容器适于允许所述液体组合物与所述测试微生物之间的选择性流体连通；和
有效量的盐化合物；其中当溶解于所述液体组合物中时，所述盐化合物以在所述液体组合物中至少0.5mM且至多50mM的所述盐化合物的浓度存在；前提条件是当所述浓度等于10mM时，所述盐化合物不是磷酸钾；
其中通过所述酶使所述酶底物裂解产生能够荧光检测的化合物。
2.根据权利要求1所述的整装配套式生物指示器，其中所述盐化合物选自任何离子的盐，所述任何离子的盐选自：乙酸盐；硼酸盐；柠檬酸盐；碳酸盐；碳酸氢盐；磷酸盐；磷酸氢盐；磷酸二氢盐；氯化物；硫酸盐；N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸盐；N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸；3-(环己基氨基)-2-羟基-1-丙磺酸；N-环己基-2-氨基乙磺酸盐；咪唑
盐；2-(N-吗啉基)乙磺酸盐；3-(N-吗啉基)丙磺酸；三(羟甲基)甲基甘氨酸，2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇；以及前述盐中的任何两种或更多种的组合。
3.根据前述权利要求中的任一项所述的整装配套式生物指示器，其中所述酶选自：α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、脂肪酶、酯酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、蛋白酶、氨肽酶、胰凝乳蛋白酶、β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖醛酸酶、β-葡糖醛酸酶、磷酸水解酶、钙蛋白酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、α-L-岩藻糖苷酶、亮氨酸氨肽酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、半胱氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、β-木糖苷酶、葡聚糖酶、纤维二糖糖苷酶、纤维素酶、α-阿拉伯糖苷酶、聚糖酶、硫酸酯酶、丁酯酶、糖苷酶、阿拉伯糖苷酶以及上述酶中的任何两种或更多种的组合。
4.根据前述权利要求中的任一项所述的整装配套式生物指示器，其中所述酶底物包括4-甲基伞形酮的衍生物或7-氨基-4-甲基香豆素的衍生物。
5.根据前述权利要求中的任一项所述的整装配套式生物指示器，其中所述酶包括α-D-葡糖苷酶，其中所述酶底物包括4-甲基伞形酮基-α-D-吡喃葡萄糖苷。
6.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
壳体；
多个测试微生物，所述测试微生物包含和/或能够产生能催化酶底物的裂解的酶；
营养组合物，其中所述营养组合物促进所述测试微生物的萌发和/或生长；
所述酶底物，其中所述酶底物包含能够荧光检测的组分；
液体组合物；和
有效量的盐化合物；其中当溶解于所述液体组合物中时，所述盐化合物以在所述液体组合物中至少0.5mM且至多50mM的所述盐化合物的浓度存在；前提条件是当所述浓度等于10mM时，所述盐化合物不是磷酸钾。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述营养组合物、所述酶底物、所述液体组合物、所述盐化合物和所述多个测试微生物中的一种或多种设置在所述壳体中。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的试剂盒，其中所述液体组合物设置在易碎容器中。
9.一种试剂盒，所述试剂盒包括根据权利要求1至5中的任一项所述的整装配套式生物指示器。
10.一种确定灭菌过程的功效的方法，所述方法包括：
使设置在壳体中的多个测试微生物接触所述灭菌过程；
其中所述多个测试微生物包含和/或能够产生能与酶底物反应以生成荧光产物的酶；
在使所述测试微生物接触所述灭菌过程之后，使所述多个测试微生物与液体组合物接触；
其中使所述多个测试微生物与所述液体组合物接触包括将所述测试微生物放置成与荧光酶底物发生液体接触；
其中，在使所述测试微生物与所述液体组合物接触之后，所述多个测试微生物和所述液体组合物的所得混合物包含营养组合物、所述酶底物和盐化合物；
其中所述盐化合物以至少0.5mM且至多50mM的浓度存在于所述混合物中；前提条件是当所述浓度等于10mM时，所述盐化合物不是磷酸钾；
其中所述营养组合物促进所述测试微生物的萌发和/或生长；
将所述混合物温育一定时间段；以及
检测在所述混合物中的所述荧光产物；
其中检测到至少阈值量的所述荧光产物指示所述灭菌过程缺乏功效。
11.根据权利要求10所述的方法，其中将所述混合物温育一定时间段包括在指定温度下温育所述混合物。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的方法，其中所述时间段是指定时间段，其中所述指定时间段小于或等于180分钟，其中在所述指定时间段之后检测到小于阈值量的所述荧光产物指示所述灭菌过程的功效。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述指定时间段小于或等于180分钟。
14.根据权利要求10至13中的任一项所述的方法，其中所述酶选自：α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、脂肪酶、酯酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、蛋白酶、氨肽酶、胰凝乳蛋白酶、β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖醛酸酶、β-葡糖醛酸酶、磷酸水解酶、纤溶酶、凝血酶、胰蛋白酶、钙蛋白酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、α-L-岩藻糖苷酶、亮氨酸氨肽酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷、半胱氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、β-木糖苷酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、葡聚糖酶、纤维二糖苷、纤维素酶、α-阿拉伯糖苷酶、聚糖酶、硫酸酯酶、丁酯酶、糖苷酶、阿拉伯糖苷以及上述酶中的任何两种或更多种的组合。
15.根据权利要求10至14中的任一项所述的方法，其中所述多个测试微生物包括多种测试微生物，其中所述测试微生物是由选自以下的微生物产生的孢子：嗜热脂肪地芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、产孢梭菌、短小芽孢杆菌或上述微生物中的任何两种或更多种的组合。
16.根据权利要求10至15中的任一项所述的方法，其中检测所述荧光产物包括定量由所述荧光产物发射的荧光。
17.根据权利要求10至16中的任一项所述的方法，其中所述灭菌过程是使用灭菌剂的5过程，所述灭菌剂选自：蒸汽、环氧乙烷气体、过氧化氢蒸气、甲基溴化物、二氧化氯、甲醛、过乙酸、臭氧、电离辐射以及上述灭菌剂中的任何两种或更多种的组合。
18.一种系统，所述系统包括：
根据权利要求1至5中的任一项所述的整装配套式生物指示器；和
自动读取器，所述自动读取器被构造为：
接收所述生物指示器的至少一部分；
将第一波长的电磁辐射引导到所述壳体中的所述液体组合物中；并且
检测或测量由所述荧光产物发射的第二波长的电磁辐射的量。
19.根据权利要求18所述的系统，其中所述整装配套式生物指示器适于用于确定选自以下的任何蒸汽灭菌过程的功效：121℃重力过程、121℃预真空过程、121℃SFPP过程、132℃重力过程、132℃预真空过程、132℃SFPP过程、134℃预真空过程、134℃SFPP过程、135℃重力过程、135℃预真空过程和135℃SFPP过程。
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