CN115315522A - 用于生物指示器生长指示的固定ph指示剂 - Google Patents

用于生物指示器生长指示的固定ph指示剂 Download PDF

Info

Publication number
CN115315522A
CN115315522A CN202180022061.6A CN202180022061A CN115315522A CN 115315522 A CN115315522 A CN 115315522A CN 202180022061 A CN202180022061 A CN 202180022061A CN 115315522 A CN115315522 A CN 115315522A
Authority
CN
China
Prior art keywords
indicator
indicator dye
substrate
self
sterilization process
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180022061.6A
Other languages
English (en)
Inventor
杰弗里·M·弗林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shuwanuo Intellectual Property Co
Original Assignee
3M Innovative Properties Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 3M Innovative Properties Co filed Critical 3M Innovative Properties Co
Publication of CN115315522A publication Critical patent/CN115315522A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/22—Testing for sterility conditions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
    • A61L2/26—Accessories or devices or components used for biocidal treatment
    • A61L2/28—Devices for testing the effectiveness or completeness of sterilisation, e.g. indicators which change colour

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种整装配套式生物指示器。该生物指示器包括壳体，该壳体具有形成通向隔室的开口的至少一个液体不可透过的壁；多个测试微生物，该多个测试微生物设置在该壳体中；水性液体培养基，该水性液体培养基设置在可打开的容器中；和pH指示剂染料底物，该pH指示剂染料底物具有与pH指示剂染料底物结合的pH指示剂染料。该pH指示剂不设置在该水性液体培养基中或不与该水性液体培养基进行液体接触。该生物指示器还包括营养组合物，如果该测试微生物是活的，则该营养组合物促进该测试微生物的萌发和/或生长；该营养组合物可设置在该壳体中或设置在该可打开的容器中，该可打开的容器与该隔室选择性地流体连通。

Description

用于生物指示器生长指示的固定PH指示剂
技术领域
本公开一般涉及灭菌指示器，并且具体地涉及生物灭菌指示器和评估灭菌过程的功效的方法。
背景技术
在许多产业如健康护理产业中，以及在其他产业应用中，可能有必要监测用来对诸如医疗器械、仪器以及其他一次性和非一次性制品的设备进行灭菌的处理的有效性。在这些情况下，灭菌通常被定义为完全破坏诸如微生物(包括诸如病毒和孢子的结构)的所有能存活生物活性源的过程。作为标准操作，医院备有灭菌指示物，该指示物与一批制品放在一起以测试灭菌过程的致死率。已经使用了生物灭菌指示器和化学灭菌指示器。
一种标准类型的生物灭菌指示器包括已知量的测试微生物，例如嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)(以前称为嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus))或萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)(以前称为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))孢子，这些测试微生物抵抗特定灭菌过程的能力可比其他污染生物体大许多倍。在使指示器接受灭菌过程的处理之后，可在营养培养基中培养生物活性源(例如，孢子)，以确定生物活性源中的任一种生物活性源是否在灭菌过程后存活，其中源代谢和/或生长指示该灭菌过程不足以破坏所有生物活性源。
可用的化学灭菌指示器可以在灭菌过程结束时立即进行读数。但是，结果仅表明在灭菌处理过程中存在特定的条件，如存在特定的化学剂或温度，并潜在地表明已达到该条件一段时间。反之，生物活性源对实际存在的所有条件的反应，可能是对于在实现灭菌中灭菌处理如何有效的更直接且更可靠的测试。
发明内容
本公开一般涉及整装配套式生物指示器和评估灭菌过程的功效的方法。整装配套式生物指示器包括设置于其中的pH指示剂染料底物，该pH指示剂染料底物具有与pH指示剂染料底物结合的pH指示剂染料。本公开的方法可用于检测pH变化作为接受灭菌过程的处理的至少一种测试微生物的存活的指标。有利地，本公开的制品和方法的底物结合的pH指示剂染料允许使用这样的pH指示剂染料，如果该染料存在于具有测试微生物的溶液中，则原本可能对生物指示器中的测试微生物的萌发和/或生长产生负面影响。另选地或除此之外，在生物指示器中使用固定pH指示剂可允许使用比通常用于生物指示器中的更高(或更低)量的pH指示剂染料。甚至还有利地，使用底物结合的pH指示剂染料允许在生物指示器中处理干燥形式的pH指示剂染料，因此在储存期间在更长的时间内提供稳定性(例如，抗水解性)。此外，当pH指示剂染料底物结合的pH指示剂染料用于包括检测荧光酶底物或显色酶底物的酶催化产物的方法中时，其提供比先前可能的检测更快速的产物检测。
在一个方面，本公开提供了整装配套式生物指示器。整装配套式生物指示器可包括壳体，该壳体具有形成通向隔室的开口的至少一个液体不可透过的壁；多个测试微生物，所述多个测试微生物设置在所述壳体中；水性液体培养基，所述水性液体培养基设置在可打开的容器中，所述可打开的容器设置在所述壳体中；营养组合物，如果测试微生物是活的，则营养组合物促进测试微生物的萌发和/或生长；和pH指示剂染料底物，该pH指示剂染料底物设置在壳体中，该pH指示剂染料底物具有与pH指示剂染料底物结合的pH指示剂染料，其中pH指示剂不设置在水性液体培养基中或不与水性液体培养基进行液体接触。营养组合物可设置在壳体中或设置在可打开的容器中。
在上述实施方案中的任何实施方案中，pH指示剂染料底物可基本上不含水。在上述实施方案中的任何实施方案中，pH指示剂染料可基本上不含水。在上述实施方案中的任何实施方案中，pH指示剂染料底物可包含阳离子聚合物。在上述实施方案中的任何实施方案中，pH指示剂染料可选自百里酚蓝、金莲橙OO、甲基黄、甲基橙、溴酚蓝、溴甲酚绿、甲基红、溴百里酚蓝、酚红、氯酚红、中性红、萘酚酞、酚酞、百里酚酞、茜素黄、金莲橙O、硝基胺、三硝基苯甲酸、百里酚蓝、溴酚蓝、四溴苯酚蓝、溴甲酚绿、溴甲酚紫、甲基红、溴百里酚蓝、刚果红和甲酚红。在上述实施方案中的任何一个实施方案中，所述多个测试微生物可设置在载体上。在某些实施方案中，pH指示剂染料底物可以是载体。在上述实施方案中的任何实施方案中，水性液体培养基可包含促进测试微生物的萌发和/或生长的营养物质。在上述实施方案中的任何实施方案中，整装配套式生物指示器还可包括设置在壳体中的荧光酶底物或显色酶底物。
在另一方面，本公开提供了评估灭菌过程的功效的方法。该方法可包括将生物指示器定位在灭菌室中，其中整装配套式生物指示器包括：壳体，该壳体具有形成通向隔室的开口的至少一个液体不可透过的壁，多个测试微生物，所述多个测试微生物设置在隔室中；和基本上不含水的pH指示剂染料底物，该pH指示剂染料底物设置在隔室中，该pH指示剂染料底物具有与pH指示剂染料底物结合的基本上不含水的pH指示剂染料。pH指示剂染料基本上以第一状态存在于pH指示剂染料底物上，并且pH指示剂染料可转化成能够与第一状态光学区分的第二状态。该方法还可包括使灭菌室中的生物指示器接受灭菌过程的处理；在使所述灭菌室中的所述生物指示器接受所述灭菌过程的处理之后，在所述生物指示器的所述壳体中使所述测试微生物和所述pH指示剂染料底物与水性液体培养基和营养物质接触，所述营养物质促进所述测试微生物的萌发和/或生长；将所述生物指示器温育一定时间段；以及在将生物指示器温育所述时间段之后，观察pH指示剂染料以检测第二状态，其中检测到pH指示剂染料底物上pH指示剂染料的第二状态的存在指示灭菌过程缺乏功效，并且其中检测到pH指示剂染料底物上pH指示剂染料的第二状态的不存在指示灭菌过程的功效。
除非另外指明，否则本文所使用的所有科学和技术术语具有在本领域中普遍使用的含义。本文给出的定义旨在有利于理解本申请中频繁使用的某些术语，并无意排除那些术语在本公开上下文中的合理解释。除非另外指明，否则说明书和权利要求书中所使用的所有表达特征尺寸、量和物理特性的说明书和权利要求书中的数值在所有情况下均应理解成由术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则在上述说明书和所附权利要求书中列出的数值参数均为近似值，这些近似值可根据本领域的技术人员利用本文所公开的教导内容来寻求获得的期望特性而变化。最低程度上说，并且在不试图将等同原则的应用限制到权利要求书的范围内的前提下，至少应当根据所报告的有效位数并通过应用惯常的四舍五入法来解释每个数值参数。虽然在本发明的广泛范围内所示的数值范围和参数为近似值，但在具体实施例中所示的数值是尽可能准确地报告的。然而，任何数值都固有地包含一定的误差，这些误差必定是由在它们相应的试验测量中存在的标准偏差引起。
词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况或其他情况下，其他实施方案也可以是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其它实施方案是不可用的，且并非旨在将其它实施方案排除在本发明范围之外。
术语“包括”及其变型在说明书和权利要求书中出现这些术语的地方不具有限制的含义。
如本文所用，“一个”、“一种”、“该/所述”、“至少一种”和“一种或多种”可互换使用。因此，例如，底物可解释为表示“一种或多种”底物。
术语“和/或”意指所列要素中的一个或全部要素，或者所列要素中的任何两个或更多个要素的组合。
另外，在本文中，通过端点表述的数值范围包含该范围内所含的所有数值(例如，1至5包含1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
本发明的上述发明内容并非旨在描述本发明的每个公开的实施方案或每种实施方式。以下描述更具体地举例说明了例示性实施方案。在本申请全文的若干处，通过实施例列表提供了指导，这些实施例能够以各种组合使用。在每种情况下，所引用的列表都只用作代表性的组，并且不应被理解为排他性列表。
具体实施方式
在详细解释本公开的任何实施方案之前，应当理解，本发明在其应用中不限于下文说明中所提及或下文附图中所示出的构造细节和部件布置方式。本发明能够具有其他实施方案，并且能够以各种方式实践或实施。而且，应当理解，本文使用的措辞和术语是用于说明目的而不应视为限制性的。本文中“包括”、“包含”或“具有”以及其变型的使用意指涵盖其后所列举的项目及其等同形式以及附加的项目。应当理解，在不偏离本公开范围的情况下，可采用其它实施方案并且可进行结构变化或逻辑变化。此外，诸如“前”、“后”、“顶”、“底”等术语仅用于描述彼此相关的元件，而决不意味着叙述装置的特定方位，以指示或暗示装置的必要或所需方位，或指定在使用中如何使用、安装、显示或定位本文描述的本发明。
本公开一般涉及整装配套式灭菌指示器，并且具体涉及整装配套式生物灭菌指示器。整装配套式生物指示器包括评估其中包含的测试微生物的存活所必需的所有组分，并且可用于确定灭菌过程的致死性。本公开一般涉及生物灭菌指示器的构造，该构造实现至少以下功能中的一者或多者：提供与pH指示剂染料底物(例如，以高亲和力)结合的pH指示剂染料；在灭菌期间将液体(例如，水性液体培养基)与pH指示剂染料和一种或多种测试微生物分开容纳，并且在灭菌之后使液体和测试微生物与pH指示剂染料组合(即，结合到pH指示剂染料底物)；促进灭菌剂移动至生物灭菌指示器中容纳一种或多种测试微生物源的位置(例如，封闭端)；在灭菌期间将容纳液体的可打开的容器(例如易碎的安瓿，诸如玻璃安瓿)固定在与生物灭菌指示器中的测试微生物分离的位置；在生物灭菌指示器激活(例如通过使容器破碎)期间从可打开的容器释放液体；提供基本上恒定的灭菌剂路径；以及整体控制和/或帮助流体在生物灭菌指示器内流动(如，通过使用一个或多个内部排放口)。
加压蒸汽或其他通用灭菌剂可用于对在保健环境中所用的设备及补给品进行灭菌。可以用小型整装配套式指示器，如生物灭菌指示器检验灭菌处理的效果。这些指示器可以是生物指示器并且可包含生物活性源(例如，测试微生物)。
壳体
对于适用于整装配套式生物指示器的壳体的非限制性示例，请参见美国专利3,661,717；5,223,401和6,623,955；和美国专利申请公布2013/0302849和2014/0349335；这些中的每个全文以引用方式并入本文。一般来讲，壳体是指具有对灭菌剂不可透过的至少一个壁的容器，通常是指外部容器。所述至少一个壁形成贮存器，生物指示器的其他组分位于该贮存器中。壳体可设置于过程挑战装置内或可为过程挑战装置本身。在一些实施方案中，壳体可具有可用于产生平坦或大致平面的生物指示器的尺寸。本公开涵盖任何形状和尺寸的壳体。
壳体包含使得灭菌剂能够流动到壳体内部中的至少一个开口(灭菌剂路径)。在一些实施方案中，壳体可包括具有开口的主体和关闭该开口的盖件。在一些实施方案中，盖件可能能够完全密封壳体并且消除壳体内部与周围环境之间的任何流体连通(例如，关闭灭菌剂路径)。一般来讲，盖件具有打开位置，在该打开位置中，容器的盖件与主体之间存在开口(例如，间隙)，从而使得液体或气体(例如，灭菌剂)能够流入和流出壳体的内部。盖件还具有关闭位置，在该关闭位置中，开口被密封并且穿过该间隙的任何流体流均被消除。在其他实施方案中，盖件可包括通气口，即使存在盖件并且盖件处于关闭位置，这些通气口也使得灭菌剂能够传递到壳体的内部并且形成附加灭菌剂路径。然而，在其他优选的实施方案中，当盖件包括通气口时，将盖件置于关闭位置会同时关闭：(a)容器的盖件与主体之间的间隙以及(b)盖件上存在的通气口，从而基本上关闭灭菌剂路径。
在其他实施方案中，盖件可缺少通气口，并且当盖件处于打开位置时，唯一的灭菌剂路径可穿过壳体的盖件与主体之间的空间(或穿过另一个开口或通气口(如果主体上存在的话))。在一些实施方案中，如果通气口存在于壳体上，则它们位于盖件上。在除壳体的盖件与主体之间的开口之外不存在其他开口的实施方案中，则将盖件置于关闭位置会完全封住壳体的内部，从而阻止壳体的内部与周围环境之间的流体连通。在那些实施方案中，当盖件处于关闭位置时，可密封灭菌剂路径。
pH指示剂染料底物
本公开的整装配套式生物指示器包括设置在其中的pH指示剂染料底物(例如，设置在壳体的内部)。pH指示剂染料底物具有与pH指示剂染料底物结合的pH指示剂染料。pH指示剂染料可通过任何方式与pH指示剂染料底物结合，该方式包括但不限于共价结合、离子结合、疏水相互作用以及前述键合方式中的任何两者或更多者的组合。
优选地，pH指示剂染料以高亲和力与pH指示剂染料底物结合(即，在10mg的指示剂染料结合的底物用去离子水冲洗，并随后放置到1mL的去离子水中之后；小于10％，优选小于5％，并且更优选小于1％的指示剂染料在23℃下在1小时内释放到去离子水中)。
在一些实施方案中，pH指示剂染料底物可由多种材料形成，前提条件是其以高亲和力结合pH指示剂染料。如有必要，可修饰pH指示剂染料底物材料和/或其表面以结合pH指示剂染料。pH指示剂染料底物材料的示例包括但不限于棉、玻璃绒、布、非织造聚丙烯、非织造人造丝、非织造聚丙烯/人造丝共混物、非织造尼龙、非织造玻璃纤维或其他非织造纤维、滤纸、微孔疏水性和亲水性膜、玻璃纤维、开孔聚合物泡沫和半渗透塑料膜(例如，颗粒填充膜、热致相分离(TIPS)膜等)以及它们的组合。
合适的pH指示剂染料底物材料的示例是带电物质，例如，带阴离子电荷物质，该带阴离子电荷物质(例如，以高亲和力)结合具有中性pH(例如，约6.5至约7.5的pH)的溶剂中的带阳离子电荷的pH指示剂染料。另选地，合适的pH指示剂染料底物材料是带阳离子电荷物质，该带阳离子电荷物质(例如，以高亲和力)结合具有中性pH(例如，约6.5至约7.5的pH)的溶剂中的带阳离子电荷的pH指示剂染料。在某些实施方案中，其中pH指示剂染料底物材料包含阳离子聚合物，该阳离子聚合物选自聚酰胺聚合物、聚乙烯亚胺聚合物、聚偏二氟乙烯聚合物和前述阳离子聚合物中的任何两者或更多者的组合。
例如，在其中pH指示剂染料底物可用于结合溴甲酚紫(BCP)的实施方案中，底物可由带电荷的尼龙(诸如以商品名“MAGNAPROBE”(例如，0.45微米孔径，30cm×3m卷，目录号NP0HY00010，材料号1226566)购自宾夕法尼亚州特里沃斯的通用电气水处理技术公司(GEWater&Process Technologies,Trevose,Pa.)的重测、带电荷的转移膜)形成。在某些实施方案中，pH指示剂染料底物材料可以是例如通过疏水相互作用以高亲和力结合pH指示剂染料的疏水性材料。pH指示剂染料底物材料和pH指示剂染料的其他合适组合对于本领域普通技术人员将是显而易见的。
在一些实施方案中，预期可处理特定的pH指示剂染料底物材料(例如，通过接受等离子体、电晕处理或电子束工艺的处理以在底物材料上形成表面电荷)，以促进pH指示剂染料与pH指示剂染料底物的结合。另选地或除此之外，pH指示剂染料与pH指示剂染料底物的结合可在具有非中性pH的溶剂中进行，以便促进有利于染料与底物结合的离子条件。
在任何实施方案中，pH指示剂染料底物可基本上不含水。在任何实施方案中，与pH指示剂染料底物结合的pH指示剂染料可基本上不含水。如本文所用，“基本上不含水”是指底物或pH指示剂染料在已经通过干燥去除过量的水之后具有不大于约在允许与周围环境平衡之后脱水底物或染料的含水量的含水量。
pH指示剂染料底物的形状和尺寸被设计成在可与水性培养基和用于培养测试微生物的营养物质接触(例如，当生物指示器被激活时)的位置适配在生物指示器的壳体内部，该水性培养基与测试微生物进行流体接触，各自如本文所公开。在某些实施方案中，pH指示剂染料底物可为基本上平面的(例如，作为膜过滤器)。在一些实施方案中，例如，pH指示剂染料底物的形状和尺寸可被设计成(相对于生物指示器中的其他组分)类似于美国专利3,661,717中的滤纸16；美国专利5,223,401中的载体46或芯吸条76；或美国专利申请公布2013/03022849中的底物119。在一些实施方案中，pH指示剂染料底物可为纤维底物(例如，作为纱线)。在一些实施方案中，pH指示剂染料底物可为颗粒底物(例如，作为多孔的或无孔的珠粒)。
测试微生物(例如，孢子)
一般来讲，选择尤其耐受给定灭菌过程的测试微生物用于生物指示器。在某些实施方案中，本公开的生物指示器包括已知种类的微生物的活培养物，通常为微生物孢子的形式。至少部分地使用孢子(例如，细菌孢子)而不是微生物的营养体型，因为已知营养体微生物相对容易地被灭菌过程杀灭。相反，孢子对灭菌过程相对更耐受。另外，孢子还具有良好的存储特性并且能够多年保持其休眠状态。因此，标准化孢子菌株的种菌的灭菌提供在灭菌室中所有微生物已经发生失活的更高可信度。
本公开的整装配套式生物指示器包括设置在其中(例如，设置在壳体的内部中)的多个测试微生物。测试微生物可属于一个或多个物种。通常，生物指示器含有至少103、至少104、至少105、至少106、至少107或至少108个测试微生物。
仅作为示例，本公开将生物指示器中使用的微生物描述为“孢子”；然而应当理解，生物指示器的特定实施方案中使用的微生物的类型(例如，孢子)是针对能耐受所设想的特定灭菌过程来选择的(比通常存在于待灭菌的物品上的微生物的耐受性更大以使得测试微生物的失活指示灭菌成功)。因此，本公开的使用不同灭菌剂的不同实施方案可使用不同的微生物，这取决于特定实施方案有意采用的灭菌过程。
一般来讲，在特定系统中使用的测试微生物根据手头的灭菌过程进行选择。例如，对于蒸汽灭菌过程而言，可使用嗜热脂肪地芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌孢子。又如，对于环氧乙烷灭菌过程而言，可使用萎缩芽孢杆菌(以前称为枯草芽孢杆菌)孢子。在一些实施方案中，孢子可包括但不限于如下诸项中的至少一者：嗜热脂肪地芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、产孢梭菌(Clostridium sporogenes)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)或它们的组合物。
水性液体培养基
水性液体培养基设置在可打开的容器中，该可打开的容器设置在由壳体的所述至少一个壁形成的壳体的内部。在某些实施方案中，水性液体培养基的溶剂是水。在某些实施方案中，水性液体培养基可能已在其中溶解和/或悬浮营养组合物(如下文所述)，该营养组合物促进活的测试微生物的萌发和/或生长。在某些实施方案中，水性液体培养基可能已在其中溶解和/或悬浮如本文所公开的一种或多种酶底物。在某些实施方案中，水性液体培养基可能已在其中溶解和/或悬浮盐，该盐包括但不限于氯化钠、氯化钾、氯化钙等或它们的组合。在某些实施方案中，盐可包括用于在适用于测试微生物的萌发和/或生长的pH下缓冲水性液体培养基的缓冲剂(例如磷酸钠、磷酸钾)。在某些实施方案中，水性液体培养基可能已在其中溶解和/或悬浮选自以下的组分：如本文所公开的营养组合物、如本文所公开的酶底物、如本文所公开的盐、如本文所公开的缓冲剂以及前述组分中的任何两者或更多者的组合。
营养组合物
本公开的整装配套式生物指示器包括营养组合物，如果所述多个测试微生物中的一个测试微生物是活的，则该营养组合物促进所述多个测试微生物中的一个测试微生物的萌发和/或生长。最初可将适用于营养组合物的营养物质以干燥形式(例如，粉末形式、片剂形式、囊片形式、胶囊形式、膜或包衣、截留在小珠或其他载体中、另一种合适的形状或构型、或它们的组合)设置在生物指示器的内部提供。另选地或除此之外，合适的营养物质可设置在水性液体培养基中。
营养组合物可包含例如一种或多种糖，该一种或多种糖包括但不限于葡萄糖、果糖、右旋糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖等或它们的组合。另选地或除此之外，营养组合物可包含复合培养基，诸如蛋白胨、胰蛋白胨、植物蛋白胨、酵母提取物、大豆酪蛋白消化物、其他提取物、水解产物等或它们的组合。在其他实施方案中，营养组合物可包含一种或多种复合培养基组分和其他具体营养物质的组合。在一些实施方案中，营养组合物还可包含至少一种氨基酸，该至少一种氨基酸包括但不限于甲硫氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸和色氨酸中的至少一者。
作为整装配套式生物指示器的一部分，水性液体培养基通常在整个灭菌程序中存在于生物指示器中或生物指示器内，但是与测试微生物分离(例如，在可打开的容器中)直到期望的程度。生物指示器中的其他组分(例如，营养物质和/或酶底物和/或其他组分(例如，中和剂、缓冲液组分、盐))也可在整个灭菌程序中存在于生物指示器中或生物指示器内，但是与测试微生物分离(例如，在可打开的容器中)直到期望的程度。在完成灭菌过程并且使用生物指示器来确定灭菌的功效之后，将水性液体培养基放置成与测试微生物接触，从而产生混合物。在本公开中，将水性液体培养基放置成与测试微生物接触包括激活可打开的容器以使得水性液体培养基被释放并且接触测试微生物。该过程可包括将水性液体培养基与孢子混合，诸如手动或机械摇动生物指示器的壳体以使得水性液体培养基与测试微生物、营养物质和其他组分(如果存在的话)充分混合。
酶和酶底物
本公开的整装配套式生物指示器任选地包括能够催化酶底物的裂解以产生荧光可检测化合物的酶。在某些实施方案中，酶可存在于测试微生物中和/或测试微生物上，或者测试微生物能够产生此类酶，或两者。可用于本公开的生物指示器的酶包括胞外酶和胞内酶，这些酶的活性与通常用于监测灭菌功效的微生物(“测试”微生物或“测试孢子”)中的至少一种的活力关联。在该上下文中，“关联”意指超过背景的酶活性，可用于表明测试微生物中的至少一种测试微生物的存活。酶应为这样的酶，其在对测试微生物亚致死的灭菌循环之后在二十四小时内以及在优选实施方案中在一小时或更短时间内保持足够的活性以与酶的酶底物反应，而在对测试微生物致死的灭菌循环之后被灭活或活性明显降低。
合适的酶的示例包括α-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶、脂肪酶、酯酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、蛋白酶、氨肽酶、β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡糖醛酸酶、β-葡糖醛酸酶、磷酸水解酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、α-L-岩藻糖苷酶、亮氨酸氨肽酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、半胱氨酸氨肽酶、缬氨酸氨肽酶、β-木糖苷酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、葡聚糖酶、纤维二糖糖苷酶、纤维素酶、α-阿拉伯糖苷酶、聚糖酶、硫酸酯酶、丁酸盐、糖苷酶、阿拉伯糖苷以及上述酶中的任何两者或更多者的组合。
在本申请的上下文中，酶底物包括在酶对其起作用时会将其转化为酶修饰产物的一种物质或物质混合物。尽管优选的酶底物产生能够荧光检测的化合物，但是在其他实施方案中，酶促作用的产物可为发光或有色的材料。然而，在其他实施方案中，酶底物可由某化合物组成，该化合物在与酶反应时将产生产物，该产物将与附加化合物或组合物反应而产生发光、发荧光或有色的材料。优选地，如果酶底物要在灭菌期间包括在指示器装置中，则酶底物不应在灭菌或温育期间自发地分解或转化为可检测产物。例如，在用于监测蒸汽和干热灭菌的装置中，酶底物必须在约20℃与180℃之间的温度下稳定。还优选地，在酶底物要与常规生长培养基包括在一起的情况下，酶底物必须在生长培养基中稳定，例如不会在生长培养基中自发荧光。有利地，无论酶底物是荧光底物还是显色底物，(例如，以高亲和力)与pH指示剂染料底物结合的pH指示剂使得pH指示剂染料明显不可能会干扰酶反应产物的水性液体培养基的检测。
一般来讲，有两种基本类型的酶底物可用于本公开的生物指示器。第一类型的酶底物可为荧光的(或显色的)，并且可以以诸如AB的化学式给出。当通过酶对其起作用时，AB分解成产物A和B。B例如可为发荧光的或有色的。该类型的荧光酶底物的具体示例是包含4-甲基伞形酮基组分的盐。该类型的其他荧光酶底物包括7-酰氨基-4-甲基香豆素(7-AMC)、吲哚酚和荧光素的衍生物。该类型的显色酶底物的示例是5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐。在存在磷酸酶的情况下，酶底物将分解以形成靛蓝和磷酸盐。该类型的其他显色酶底物包括下列5-溴-4-氯-3-吲哚基、硝基酚和酚酞的衍生物。
第二类型的酶底物可以以例如化学式CD给出，该CD将由特异性的酶转化成C和D。然而，在这种情况下，C和D都不会发荧光或为有色的，但C或D中的任一者能够进一步与化合物Z反应而产生发荧光或有色的化合物，从而指示酶活性。该类型的具体荧光示例是氨基酸赖氨酸。在存在赖氨酸脱羧酶的情况下，赖氨酸失去CO2分子。由赖氨酸的酶促脱羧产生的产物是尸胺，其是强碱性的。可掺入诸如4-甲基伞形酮的碱性指示剂，并且该碱性指示剂将在存在强碱的情况下发荧光。该类型的显色酶底物将为2-萘基磷酸酯。磷酸酶与该酶底物反应而产生β-萘酚。释放的β-萘酚与包含1-重氮-4-苯甲酰氨基-2,5-二乙氧基苯(可以以“固蓝BB盐”从西格玛化工公司(Sigma Chemical)商购获得)的显色试剂反应而产生紫罗兰色。
如上所述，优选的酶底物在一些实施方案中是荧光酶底物，其在本文中被定义为能够经酶修饰(例如，通过水解或其他酶促作用)而给出衍生物荧光团的化合物，该衍生物荧光团具有明显改变的或增强的荧光。
本领域普通技术人员应当理解，合适的荧光化合物本身是非荧光或变荧光(meta-fluorescent)的(即，以与对应酶修饰产物明显不同(例如，在颜色或强度上)的方式发荧光)。就此而言，按照荧光技术用户已知的方式使用适当的激发波长和检测波长将通过酶修饰所形成的荧光信号与可存在的任何其他荧光分开。
合适的酶底物的非限制性示例可包括例如香豆素的衍生物(包括7-羟基香豆素(也称为伞形酮或7-羟基-2H-苯并吡喃-2-酮)衍生物)和4-甲基伞形酮(7-羟基-4-甲基香豆素)衍生物，包括例如：4-甲基伞形酮基α-D-吡喃葡萄糖苷、4-甲基伞形酮基α-D-半乳吡喃糖苷、庚酸4-甲基伞形酮酯、棕榈酸-4-甲基伞形酮酯、油酸-4-甲基伞形酮酯、乙酸-4-甲基伞形酮酯、壬酸-4-甲基伞形酮酯、辛酸-4-甲基伞形酮酯、丁酸-4-甲基伞形酮酯、4-甲基伞形酮基-β-D-纤维二糖苷、4-甲基伞形酮基乙酸酯、4-甲基伞形酮基磷酸酯、4-甲基伞形酮基硫酸酯、肉桂酸-4-甲基伞形酮基-β-三甲基氯化铵、4-甲基伞形酮基-β-D-N,N′,N″-三乙酰基壳三糖、4-甲基伞形酮基-β-D-木糖苷、4-甲基伞形酮基-N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷、4-甲基伞形酮基-N-乙酰基-α-D-氨基葡糖苷、4-甲基伞形酮基丙酸酯、4-甲基伞形酮基硬脂酸酯、4-甲基伞形酮基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷、4-甲基伞形酮基α-L-阿拉伯糖苷；4-甲基伞形酮基-β-D-N,N′-二乙酰基壳二糖苷、4-甲基伞形酮基反油酸酯、4-甲基伞形酮基-α-D-吡喃甘露糖苷、4-甲基伞形酮基-β-D-吡喃甘露糖苷、4-甲基伞形酮基-β-D-岩藻糖苷、4-甲基伞形酮基-α-L-岩藻糖苷、4-甲基伞形酮基-β-L-岩藻糖苷、4-甲基伞形酮基-α-D-半乳糖苷、4-甲基伞形酮基-β-D-半乳糖苷、4-三氟甲基伞形酮基-β-D-半乳糖苷、4-甲基伞形酮基-α-D-葡糖苷、4-甲基伞形酮基-β-D-葡糖苷、4-甲基伞形酮基-7,6-磺基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡糖苷、4-甲基伞形酮基-β-D-葡糖苷酸、6,8-二氟-4-甲基伞形酮基-β-D-葡糖苷酸、6,8-二氟-4-甲基伞形酮基-β-D-半乳糖苷、6,8-二氟-4-甲基伞形酮基磷酸酯、6,8-二氟-4-甲基伞形酮基-β-D-木二糖苷酸。第二酶底物也可以是7-酰氨基-4-甲基香豆素的衍生物，包括：Ala-Ala-Phe-7-酰氨基-4-甲基香豆素、Boc-Gln-Ala-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素盐酸盐、Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素、Boc-Val-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素盐酸盐、D-Ala-Leu-Lys-7-酰氨基-4-甲基香豆素、L-丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素三氟乙酸盐、L-甲硫氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素三氟乙酸盐、L-酪氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素、Lys-Ala-7-酰氨基-4-甲基香豆素二盐酸盐、N-对甲苯磺酰基-Gly-Pro-Arg-7-酰氨基-4-甲基香豆素盐酸盐、N-琥珀酰-Ala-Ala-Phe-7-酰氨基-4-甲基香豆素、N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe-7-酰氨基-4-甲基香豆素、N-琥珀酰-Ala-Phe-Lys-7-酰氨基-4-甲基香豆素乙酸盐、N-琥珀酰-Leu-Leu-Val-Tyr-7-酰氨基-4-甲基香豆素、D-Val-Leu-Lys-7-酰氨基-4-甲基香豆素、Fmoc-L-谷氨酸1-(7-酰氨基-4-甲基香豆素)、Gly-Pro-7-酰氨基-4-甲基香豆素氢溴酸盐、L-亮氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素盐酸盐、L-脯氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素氢溴酸盐；其它7-羟基香豆素衍生物包括3-氰基-7-羟基香豆素(3-氰基伞形酮)和7-羟基香豆素-3-羧酸酯例如7-羟基香豆素-3-羧酸乙酯、7-羟基香豆素-3-羧酸甲酯、3-氰基-4-甲基伞形酮和3-(4-咪唑基)伞形酮；荧光素的衍生物，包括：2′,7′-双-(2-羧乙基)-5-(和-6-)羧基荧光素、2′,7′-双-(2-羧丙基)-5-(和-6-)-羧基荧光素、5-(和6)-羧基萘荧光素、石荧光素、2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯、5(6)-羧基荧光素、5(6)-羧基荧光素二乙酸酯、5-(溴甲基)荧光素、5-(碘乙酰氨基)荧光素、5-([4,6-二氯三嗪-2-基]氨基)荧光素盐酸盐、6-羧基荧光素、伊红Y、二乙酸荧光素5-马来酰亚胺、荧光素-O′-乙酸、O′-(羧甲基)荧光素酰胺、蒽荧光素、玫瑰醇(rhodols)、卤代荧光素；罗丹明的衍生物，包括：四甲基罗丹明、羧基四甲基罗丹明、羧基-X-罗丹明、磺酰罗丹明101和罗丹明B；氟代葡糖胺衍生物；苯并蒽染料的衍生物，包括：半萘荧光酮、羧基半萘荧光酮、半萘荧光素、半萘并罗丹氟(seminaphthorhodafluors)；花菁的衍生物，包括磺化五甲川菁和庚甲川菁(septamethine cyanine)。
在一些实施方案中，要检测其活性的酶可选自α-D-葡糖苷酶、胰凝乳蛋白酶或脂肪酸酯酶。就嗜热脂肪芽孢杆菌而言，荧光酶底物优选地为4-甲基伞形酮基-α-D-葡糖苷、7-戊二酰苯丙氨酸-7-酰氨基-4-甲基香豆素或庚酸4-甲基伞形酮酯。如果要检测其活性的酶为α-L-阿拉伯呋喃糖酶(例如衍生自萎缩芽孢杆菌)，则优选的荧光酶底物为4-甲基伞形酮基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷。在优选的实施方案中，4-甲基伞形酮基α-D-吡喃葡萄糖苷为用于产生代谢活性的酶底物，并且酶为葡糖苷酶，诸如β-D-葡糖苷酶。
存在于水性液体培养基中的酶底物的浓度取决于特定酶底物和酶的种类、为能在视觉上或通过仪器检测而必须生成的酶产物的量以及为确定活性酶是否存在于反应混合物中而愿意等待的时间量。优选地，酶底物的量足以在灭菌循环之后约八小时的时间段内与存在的任何残余活性酶反应，使得产生至少10-8摩尔酶修饰产物。在酶底物是4-甲基伞形酮基衍生物的情况下，本发明人已发现，其在本文所公开的水性液体培养基中的浓度优选地在约10-5与10-3摩尔之间。在一些实施方案中，4-甲基伞形酮基-α-D-葡糖苷可例如以约0.05g/L至约0.5g/L(如约0.05g/L、约0.06g/L、约0.07g/L、约0.08g/L、约0.09g/L、约0.1g/L、约0.15g/L、约0.2g/L、约0.25g/L、约0.3g/L、约0.35g/L、约0.4g/L、约0.45g/L、约0.5g/L)的浓度用于水性混合物中。
任选组分
在一些实施方案中，水性液体培养基可包括缓冲溶液。缓冲溶液的离子条件应使得酶和酶底物不受影响。在一些实施方案中，缓冲溶液用作水性液体培养基的一部分，诸如磷酸盐缓冲液(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液、磷酸钾或磷酸氢二钾)、三(羟甲基)氨基甲烷-HCl溶液或乙酸盐缓冲液或本领域已知的适用于灭菌的任何其他缓冲液。适用于本发明生物指示器的缓冲液应与用作水性液体培养基的一部分的荧光酶底物和显色酶底物相容。在选择缓冲液时的另一个考虑是它们对酶活性的影响。例如，磷酸盐缓冲盐水包含相对较高浓度的无机磷酸盐，其是碱性磷酸酶的竞争性抑制剂。因此，对于该酶而言，建议使用Tris-HCl缓冲液。缓冲溶液的强度可为0.05M至0.5M，优选地0.05M至0.25M，更优选地0.05M至0.15M，甚至更优选地约0.1M。
在一些情况下，生物指示器的一个或多个部件(例如，壳体中的缝隙、用于孢子的pH指示剂染料底物和/或载体、容器的壁等)可保留残余的氧化性灭菌剂。这可伴随例如过氧化氢蒸气和其他蒸气灭菌剂(诸如臭氧和过乙酸)而出现。例如，某些载体材料(例如亲水性的那些，诸如玻璃纤维和纤维素材料)可保留残余的氧化性灭菌剂，特别是过氧化氢。在此上下文中，“残余的”是指抑制少量存活孢子生长的保留下来的灭菌剂的量。通常，这意味着每微克载体保留有超过10微克灭菌剂。在某些情况下，残余的灭菌剂的量可大于40微克灭菌剂/毫升生长培养基。作为比较，如果载体材料具有大于90°的接触角，则其为疏水性的，并且每微克载体通常保留有不超过10微克的灭菌剂。
因此，在一些实施方案中，生物指示器包含一种或多种中和剂，该一种或多种中和剂不是酶，也不是设置在生物指示器内的金属催化剂。中和剂为与残余的灭菌剂(如，过氧化氢)反应以中和其效果的化合物或材料，其中该中和剂不是酶，也不是金属催化剂。酶中和剂通常在高温下不稳定，因而是不可取的。
中和剂的合适示例包括含硫材料(例如甲硫氨酸、L-半胱氨酸、D-乙硫氨酸、S-甲基-L-半胱氨酸、S-苄基-L-半胱氨酸、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、L-胱硫醚、N-乙酰基-L-半胱氨酸、羧甲基半胱氨酸、D,L-高半胱氨酸、D,L-高半胱氨酸-硫代内酯、和硫代二丙酸)和非含硫材料(例如异抗坏血酸、铁氰化钾、和丙酮酸钠)。可使用这些中和剂的各种组合。优选的中和剂包括甲硫氨酸、L-半胱氨酸、D-乙硫氨酸、S-甲基-L-半胱氨酸、S-苄基-L-半胱氨酸、硫代硫酸钠、硫代二丙酸、异抗坏血酸、铁氰化钾、丙酮酸钠、以及它们的组合物。
pH指示剂染料
本公开的整装配套式生物指示器包括(例如，以高亲和力)与pH指示剂染料底物材料结合的pH指示剂染料。在所述方法的实施例的任一个中，指示剂染料可为适于检测生物活性的pH指示剂。可以根据本领域已知的标准选择指示染料，例如，pH范围、与生物活性的相容性以及溶解度。在一些实施例中，可以使用pH指示剂的盐形式，例如，以增大pH指示剂在水性混合物中的溶解度。合适的pH指示剂染料的非限制性示例包括例如百里酚蓝、金莲橙OO、甲基黄、甲基橙、溴酚蓝、溴甲酚绿、甲基红、溴百里酚蓝、酚红、氯酚红、中性红、萘酚酞、酚酞、百里酚酞、茜素黄、金莲橙O、硝基胺、三硝基苯甲酸、百里酚蓝、溴酚蓝、四溴苯酚蓝、溴甲酚绿、溴甲酚紫、甲基红、溴百里酚蓝、刚果红和甲酚红。在某些实施方案中，pH指示剂染料在pH为约中性的溶液中是阴离子型染料。
在一些实施方案中，pH指示剂染料在pH降低时产生颜色变化，从而指示测试微生物的生长。在一些实施方案中，pH指示剂染料是溴甲酚紫。例如，pH指示剂可用于检测生物活性诸如碳水化合物向酸性终产物的发酵(表明测试微生物的存活)和酶生物活性诸如α-D-葡糖苷酶酶活性。例如，这些活性可指示在生物指示器经灭菌过程处理之后存在或不存在活的孢子。例如，溴甲酚紫可以约0.03g/L的浓度用于水性混合物中。
溴甲酚紫和4-甲基伞形酮基-α-D-葡糖苷的组合表示根据本公开的制品或方法中的酶底物和pH指示剂染料的优选组合，但可以在本公开的范围内设想到其他组合。
整装配套式生物指示器
本文所述的pH指示剂染料结合的pH指示剂染料底物可用作对本领域中已知的多种生物指示器的修改，以产生根据本公开的整装配套式生物指示器。此外，本文所述的pH指示剂染料结合的pH指示剂染料底物可用作对评估灭菌过程的有效性的多种方法的修改。
例如，可修改美国专利3,661,717(其全文以引用方式并入本文)的整装配套式生物指示器，以提供与如本文所述的pH指示剂染料底物结合的pH敏感性染料指示剂，而不是将其提供在设置在内部容器(例如，易碎的安瓿)中的水性营养培养基中。任选地，pH指示剂染料底物的一部分可用作测试微生物(例如孢子)的载体。
此外，可修改美国专利5,223,401和6,623,955(两篇专利均全文以引用方式并入本文)的整装配套式生物指示器，以提供与如本文所述的pH指示剂染料底物结合的pH敏感性染料指示剂，而不是将其提供在设置在内部容器(例如，易碎的安瓿)中的水性营养培养基中。任选地，pH指示剂染料底物的一部分可用作测试微生物(例如孢子)的载体。
此外，可修改美国专利申请公布US 2013/0302849(其全文以引用方式并入本文)的整装配套式生物指示器，以提供与如本文所述的pH指示剂染料底物结合的pH敏感性染料指示剂，而不是将其提供在设置在内部容器(例如，易碎的安瓿)中的水性营养培养基中。例如，美国专利申请公布US 2013/0302849中公开的底物119可用作根据本公开的整装配套式生物指示器的pH指示剂染料底物。
本领域普通技术人员将认识到如何用本公开的pH指示剂染料结合的底物修改其他现有生物指示器，以得到本公开的制品和方法。
在本公开中，将孢子和培养基集合在一起的过程称为生物指示器的“激活”。即，术语“激活”及其变型形式在相对于生物指示器使用时，通常是指使一个或多个测试微生物(例如，孢子)与水性液体培养基(例如，包含营养物质和/或酶底物的液体培养基)流体连通。例如，当容纳水性液体培养基的生物指示器内的可打开的容器至少部分地打开(例如，破碎、穿孔、刺穿、压碎、断裂、破裂等)，使得培养基已被放置为与测试微生物流体连通时，生物指示器可被描述为已被“激活”。换句话说，当测试微生物已接受先前与测试微生物接触分离的水性液体培养基时，生物指示器已被激活。
评估灭菌过程的功效的方法
在另一方面，本公开提供了一种评估灭菌过程的功效的方法。在某些具体实施中，灭菌过程可以是旨在对制品或一组制品进行灭菌的过程。在某些具体实施中，该方法使用灭菌器进行。在某些具体实施中，该方法使用自动化灭菌器进行，该自动化灭菌器包括灭菌室并且被编程为使设置在灭菌室中的制品接受预定条件或旨在使制品无菌的一组条件的处理。
该方法包括将生物指示器定位在灭菌室中。生物指示器包括：壳体，该壳体具有形成通向如本文所公开的隔室的开口的至少一个液体不可透过的壁；多个测试微生物，所述多个测试微生物设置在壳体中；和pH指示剂染料底物，该pH指示剂染料底物设置在壳体中。
pH指示剂染料底物基本上不含水并且具有如本文所公开的与pH指示剂染料底物结合的pH指示剂染料。pH指示剂染料基本上以第一状态存在于pH指示剂染料底物上(例如，当染料主要为去质子化的时，具有与pH指示剂染料相关的颜色)。可将pH指示剂染料转化(例如，通过在水性液体培养基中质子化)成与第一状态光学区分的第二状态(例如，当染料主要为质子化的时，具有与pH指示剂染料相关的颜色)。当生物指示器定位在灭菌室中时(即，在使生物指示器接受灭菌过程的处理之前)，pH指示剂染料不设置在水性液体培养基中或不与水性液体培养基进行液体接触。
任选地，在该方法的任何具体实施中，生物指示器还可包括设置在可打开的容器中的水性液体培养基，该可打开的容器设置在壳体中，如上文所公开的。
任选地，在该方法的任何具体实施中，生物指示器还可包括如本文所述的营养组合物，该营养组合物促进所述多个测试微生物中的一个测试微生物的萌发和/或生长。
该方法还包括使灭菌室中的生物指示器接受灭菌过程的处理。灭菌过程可以是能够使测试微生物不能存活的任何灭菌过程。灭菌过程的非限制性示例包括将测试微生物放置成与灭菌剂诸如蒸汽、环氧乙烷、蒸气过氧化氢、臭氧、干热、电离辐射或它们的组合流体连通的灭菌过程。
在使灭菌室中的生物指示器接受灭菌过程的处理之后，该方法还包括在生物指示器的壳体中使测试微生物和pH指示剂染料与水性液体培养基和营养物质接触，该营养物质促进测试微生物的萌发和/或生长。在某些具体实施中，营养物质可在将生物指示器定位在灭菌室中之前设置在壳体中。在某些具体实施中，可在使灭菌室中的生物指示器接受灭菌过程的处理之后，将营养物质添加到壳体中(例如，作为液体或干燥组合物)。在某些具体实施中，营养物质可存在于水性液体培养基中。在其中生物指示器不包括容纳水性液体培养基的容器的某些具体实施中，水性液体培养基(例如，无菌水)可(例如，通过移液管)添加到壳体中。
在某些具体实施中，水性液体培养基可存在于可打开的(例如，易碎的)容器中的生物指示器中(或与之相邻)。在这些具体实施中，在生物指示器的壳体中使测试微生物和pH指示剂染料与水性液体培养基接触包括打开可打开的容器(例如，通过压碎易碎的容器)。在任何具体实施中，当生物指示器定位在灭菌室中时，营养物质可存在于生物指示器的壳体中(例如，作为干粉或胶囊，其溶解和/或悬浮在水性液体培养基中，或者溶解和/或悬浮在容纳在上述可打开的容器中的水性液体培养基中)。另选地或除此之外，营养物质可存在于水性液体培养基中，该水性液体培养基可在灭菌室中的生物指示器已经接受灭菌过程的处理之后(例如，通过移液管)添加到壳体中。
在生物指示器的壳体中使测试微生物和pH指示剂染料底物与包含营养物质的水性液体培养基接触之后，该方法还包括将生物指示器温育一段时间。将生物指示器温育一段时间包括在水性液体培养基与测试微生物和pH指示剂染料底物接触的同时在指定温度下温育生物指示器。指定温度可为本文所述的用于测试微生物和/或酶活性的任何合适的温育温度。在某些具体实施中，温育温度为约30℃和40℃。在某些具体实施中，温育温度为约52℃至65℃。
温育的时间段可以是适合于检测生物指示器中活测试微生物的指示的任何合适的温育时间段。pH指示剂染料从第一状态到第二状态的变化是活测试微生物的一种指示。与荧光酶底物或显色酶底物的酶反应产物的存在是活测试微生物的另一种指示。在某些实施方案中，指定时间段少于8小时，在一些实施方案中，少于1小时，在一些实施方案中，少于30分钟，在一些实施方案中，少于15分钟，在一些实施方案中，少于5分钟，并且在一些实施方案中，少于1分钟。在其他实施方案中，用于本公开的生物指示器的合适温育时间为10分钟至1小时、或10分钟至50分钟、或10分钟至30分钟、或10分钟至20分钟、或10分钟至25分钟、或15分钟至30分钟、或15分钟至25分钟、或15分钟至20分钟。
在将生物指示器温育所述时间段后，该方法还包括观察pH指示剂染料以检测第二状态。可目视观察或通过使用自动化检测器(例如，色度计)观察pH指示剂染料。观察pH指示剂染料以检测第二状态包括观察与pH指示剂染料底物结合的pH指示剂染料。检测到pH指示剂染料底物上pH指示剂染料的第二状态的存在指示灭菌过程缺乏功效。检测到pH指示剂染料底物上pH指示剂染料的第二状态的不存在指示灭菌过程的功效。
系统
在另一个方面，本公开提供了可用于确定灭菌过程的功效的系统。该系统包括根据本发明的整装配套式生物指示器的任何实施方案和自动读取器。自动读取器被构造为i)接收生物指示器的至少一部分，ii)将第一波长的电磁辐射引导到壳体中的水性液体培养基中，并且iii)检测或测量由荧光产物发射的第二波长的电磁辐射的量。因此，本领域普通技术人员应当认识到，自动读取器尤其包括尺寸被设计成接收生物指示器的位点(例如，室)、紫外电磁辐射源、用于检测和测量从生物指示器发射的荧光的光检测器、用于控制自动读取器的部件的至少一个微处理器。任选地，自动读取器还包括具有用于识别展现出荧光的生物指示器的算法的软件或固件，该荧光指示在经灭菌过程处理之后生物活性源完全失活或生物活性源的至少一部分存活。
通过以下实例举例说明本发明。应当理解，将根据如本文阐述的本发明的范围和精神，广义地解释特定的实例、材料、数量和工序。
实施例
实施例1：pH指示剂结合的pH指示剂染料底物的制备。
在室温下将3MTMATTESTTM1492V生物指示器中的具有大约1cm2面积的带电尼龙底物(GE MAGNAPROBE带电荷尼龙)浸没在3M ATTEST 1492V生物指示器中的安瓿培养基中达一分钟，期间基本上所有的溴甲酚紫从培养基中浓缩到pH指示剂染料底物上。从培养基中取出pH指示剂染料底物，用无菌去离子水冲洗，并在室温下干燥。pH指示剂染料结合的底物呈现深紫色。在pH指示剂染料底物干燥之后，将它们放置到生物指示器的壳体上，如针对美国专利申请公布2013/0302849的图1-图4中的“底物119”所示。
实施例2：生物指示器的制备。
用于该实施例的部件来自3M ATTEST 1492V生物指示器(描述于美国专利申请公布2013/0302849中并且从明尼苏达州圣保罗的3M公司(3M Company,St.Paul,MN)获得)。与可商购获得的1492V生物指示器相比，从该实施例中使用的生物指示器中移除容纳营养培养基和pH指示剂的易碎安瓿。如实施例1中所述制备pH指示剂结合的pH指示剂染料底物，并将其在由美国专利申请公布2013/0302849的底物119所示的位置处插入生物指示器(缺少营养培养基的安瓿)中。这些生物指示器用于评估蒸汽灭菌过程的功效，如下文所述。
虽然该实施例的生物指示器在其中不包括促进测试微生物的萌发和/或生长的营养物质或容纳水性液体培养基的可打开的容器，但本发明人认识到，这些部件都可以添加到实施例2的生物指示器中以产生整装配套式生物指示器。
实施例3：评估灭菌过程的功效。
将如实施例2中所述制备的生物指示器放置在自动蒸汽灭菌器的灭菌室中，并在
Figure BDA0003848933580000251
Lab 110蒸汽灭菌器(俄亥俄州门托的史帝瑞公司(STERIS,Mentor,OH))中接受121℃下的蒸汽处理达15分钟。来自实施例2的对照生物指示器未接受蒸汽灭菌过程的处理。在将指示器从灭菌器中取出之后，将大约0.5mL用于培养嗜热脂肪地芽孢杆菌的营养培养基(含有可发酵碳水化合物)移液到接受蒸汽处理的生物指示器中，并且将对照生物指示器和所有生物指示器在60℃下温育以允许孢子生长。温育之后，接受蒸汽灭菌过程的处理的生物指示器中的pH指示剂结合的pH指示剂染料底物保持深紫色。相比之下，未接受蒸汽灭菌过程的处理的生物指示器中的pH指示剂结合的pH指示剂染料底物呈现黄色。
参考实施例1：将pH指示剂染料浓缩到pH指示剂染料底物上。
将3MTMATTESTTM1492V生物指示器中的带电尼龙底物连同3MTMATTESTTM1492V生物指示器的安瓿中的大约0.5mL的营养培养基放置到比色管中。将具有培养基和底物的比色管在58℃下温育。在表1中示出的时间间隔(在使底物与培养基接触之后开始)处，使用ThermoScientificTMGENESYSTM20分光光度计(马萨诸塞州沃尔瑟姆的飞世尔科技公司(FisherScientific,Waltham,MA))测量营养培养基的吸光度(450nm)。
表1中的数据表明，在底物与营养培养基之间接触的前25分钟期间，从营养培养基中移除少于一半的pH指示剂染料。这表明，试图检测营养培养基中的荧光酶产物可能受到培养基中剩余的剩余pH指示剂染料的阻碍。相比之下，当pH指示剂染料与pH指示剂染料底物结合时，pH指示剂染料在检测营养培养基中的弱荧光信号方面将受到很少或不受到干扰。
表1：通过放置到培养基中的带电尼龙底物从营养培养基中移除(在58℃下)溴甲 酚紫pH指示剂染料的时间过程。
时间(min) A<sub>450</sub>
0.5 0.465±0.007
5 0.429±0.003
19 0.402±0.010
15 0.387±0.015
20 0.359±0.016
25 0.345±0.007
虽然在本发明的广泛范围内所示的数值范围和参数为近似值，但在具体实施例中所示的数值是尽可能准确地报告的。尽管如此，在各自测试过程中产生的标准偏差不可避免地导致所有数值固有地包括一定范围。
所有的标题是为了阅读者方便，而不应该用于限制该标题后面的正文的含义，除非如此规定。
本文引用的所有专利、专利申请、出版物以及核酸和蛋白质数据库条款的完全公开内容全部以引用方式并入本文，如同每个都单独引入一样。不脱离本发明的保护范围和精神的本发明的各种修改和更改对本领域内的技术人员将变得显而易见，并且应当理解本发明并非不当地限制于本文提出的示例性实施例。

Claims (15)

1.一种整装配套式灭菌过程生物指示器，所述整装配套式灭菌过程生物指示器包括：
壳体，所述壳体具有形成通向隔室的开口的至少一个液体不可透过的壁；
多个测试微生物，所述多个测试微生物设置在所述壳体中；
水性液体培养基，所述水性液体培养基设置在可打开的容器中，所述可打开的容器设置在所述壳体中；
营养物质，如果所述测试微生物是活的，则所述营养物质促进所述测试微生物的萌发和/或生长；
其中所述营养物质设置在所述壳体中或设置在所述容器中；和
pH指示剂染料底物，所述pH指示剂染料底物设置在所述壳体中，所述pH指示剂染料底物具有与所述pH指示剂染料底物结合的pH指示剂染料，其中所述pH指示剂不设置在所述水性液体培养基中或不与所述水性液体培养基进行液体接触。
2.根据权利要求1所述的整装配套式灭菌过程生物指示器，其中所述pH指示剂染料底物基本上不含水。
3.根据权利要求1所述的整装配套式灭菌过程生物指示器，其中所述pH指示剂染料基本上不含水。
4.根据前述权利要求中的任一项所述的整装配套式灭菌过程生物指示器，其中所述pH指示剂染料底物包含阳离子聚合物。
5.根据权利要求4所述的整装配套式灭菌过程生物指示器，其中所述阳离子聚合物包括聚酰胺聚合物或聚乙烯亚胺聚合物、聚偏二氟乙烯聚合物或前述阳离子聚合物中的任何两者或更多者的组合。
6.根据前述权利要求中的任一项所述的整装配套式灭菌过程生物指示器，其中pH指示剂染料在具有中性pH的溶剂中带阴离子电荷。
7.根据前述权利要求中的任一项所述的整装配套式灭菌过程生物指示器，其中所述pH指示剂选自百里酚蓝、金莲橙OO、甲基黄、甲基橙、溴酚蓝、溴甲酚绿、甲基红、溴百里酚蓝、酚红、氯酚红、中性红、萘酚酞、酚酞、百里酚酞、茜素黄、金莲橙O、硝基胺、三硝基苯甲酸、百里酚蓝、溴酚蓝、四溴苯酚蓝、溴甲酚绿、溴甲酚紫、甲基红、溴百里酚蓝、刚果红和甲酚红。
8.根据前述权利要求中的任一项所述的整装配套式灭菌过程生物指示器，其中所述多个测试微生物设置在载体上。
9.根据权利要求8所述的整装配套式灭菌过程生物指示器，其中所述pH指示剂染料底物是所述载体。
10.根据前述权利要求中的任一项所述的整装配套式灭菌过程生物指示器，其中所述测试微生物是选自以下的微生物：嗜热脂肪地芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、产孢梭菌、短小芽孢杆菌以及上述微生物中的任何两者或更多者的组合。
11.根据前述权利要求中的任一项所述的整装配套式灭菌过程生物指示器，其中所述水性液体培养基包含促进所述测试微生物的萌发和/或生长的所述营养物质。
12.根据前述权利要求中的任一项所述的整装配套式灭菌过程生物指示器，所述整装配套式灭菌过程生物指示器还包括设置在所述壳体中的荧光酶底物或显色酶底物。
13.根据权利要求12所述的整装配套式灭菌过程生物指示器，其中所述荧光酶底物或显色酶底物设置在所述可打开的容器中。
14.一种评估灭菌过程的功效的方法，所述方法包括：
将生物指示器定位在灭菌室中，其中所述整装配套式生物指示器包括：
壳体，所述壳体具有形成通向隔室的开口的至少一个液体不可透过的壁；
多个测试微生物，所述多个测试微生物设置在所述隔室中；和
基本上不含水的pH指示剂染料底物，所述pH指示剂染料底物设置在所述隔室中，所述pH指示剂染料底物具有与所述pH指示剂染料底物结合的基本上不含水的pH指示剂染料；
其中所述pH指示剂染料基本上以第一状态存在于所述pH指示剂染料底物上，并且其中所述pH指示剂染料能够转化成能够与所述第一状态光学区分的第二状态；
使所述灭菌室中的所述生物指示器接受所述灭菌过程的处理；
在使所述灭菌室中的所述生物指示器接受所述灭菌过程的处理之后，在所述生物指示器的所述壳体中使所述测试微生物和所述pH指示剂染料底物与水性液体培养基和营养物质接触，所述营养物质促进所述测试微生物的萌发和/或生长；
将所述生物指示器温育一定时间段；以及
在将所述生物指示器温育所述时间段后，观察所述pH指示剂染料以检测所述第二状态；
其中检测到所述pH指示剂染料底物上所述pH指示剂染料的所述第二状态的存在指示所述灭菌过程缺乏功效；
其中检测到所述pH指示剂染料底物上所述pH指示剂染料的所述第二状态的不存在指示所述灭菌过程的功效。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述生物指示器还包括水性液体培养基，所述水性液体培养基设置在可打开的容器中，所述可打开的容器设置在所述壳体中，其中在所述生物指示器的所述壳体中使所述测试微生物和所述pH指示剂染料底物与所述水性液体培养基接触包括打开所述可打开的容器。
CN202180022061.6A 2020-03-17 2021-02-22 用于生物指示器生长指示的固定ph指示剂 Pending CN115315522A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202062990483P 2020-03-17 2020-03-17
US62/990,483 2020-03-17
PCT/IB2021/051486 WO2021186267A1 (en) 2020-03-17 2021-02-22 Immobilized ph indicator for biological indicator growth indication

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115315522A true CN115315522A (zh) 2022-11-08

Family

ID=74844951

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180022061.6A Pending CN115315522A (zh) 2020-03-17 2021-02-22 用于生物指示器生长指示的固定ph指示剂

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20230110772A1 (zh)
CN (1) CN115315522A (zh)
WO (1) WO2021186267A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117210533B (zh) * 2023-11-08 2024-01-23 山东新华医疗器械股份有限公司 用于灭菌监测的双荧光体系生物指示剂

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3661717A (en) 1970-05-08 1972-05-09 Minnesota Mining & Mfg Unitary sterility indicator and method
US5073488A (en) * 1988-11-29 1991-12-17 Minnesota Mining And Manufacturing Company Rapid method for determining efficacy of a sterilization cycle and rapid read-out biological indicator
US5252484A (en) 1988-11-29 1993-10-12 Minnesota Mining And Manufacturing Company Rapid read-out biological indicator
US5223401A (en) 1988-11-29 1993-06-29 Minnesota Mining And Manufacturing Company Rapid read-out sterility indicator
US6436659B1 (en) * 2000-10-27 2002-08-20 Ethicon, Inc. Biological indicator for sterilization processes with double buffer system
CN102245217A (zh) * 2008-10-17 2011-11-16 3M创新有限公司 生物灭菌指示组合物、制品和方法
US8980622B2 (en) * 2009-07-20 2015-03-17 3M Innovative Properties Company Biological sterilization indicator and method of using same
US9034500B2 (en) 2010-04-02 2015-05-19 Toyota Jidosha Kabushiki Kaisha Laminated electrode-type battery, manufacturing method therefor, vehicle, and device
EP2635699B1 (en) 2010-11-01 2018-03-21 3M Innovative Properties Company Biological sterilization indicator and method of using same
WO2012061212A1 (en) * 2010-11-01 2012-05-10 3M Innovative Properties Company Method of detecting a biological activity
EP2999794B1 (en) * 2013-05-21 2018-03-28 3M Innovative Properties Company Nanostructured spore carrier
US9240528B2 (en) 2013-10-03 2016-01-19 Cree, Inc. Solid state lighting apparatus with high scotopic/photopic (S/P) ratio
EP3204054A1 (en) * 2014-10-10 2017-08-16 3M Innovative Properties Company Biological sterilization indicator with sterilant resistance modulator
US10907126B2 (en) * 2016-03-01 2021-02-02 Asp Global Manufacturing Gmbh Self-contained biological indicator

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021186267A1 (en) 2021-09-23
US20230110772A1 (en) 2023-04-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210038753A1 (en) Biological sterilization indicator with sterilant resistance modulator
CN101541944B (zh) 灭菌指示器
JP2799203B2 (ja) 滅菌サイクル効能測定法及び迅速読取生物学的インジケータ
US5770393A (en) Biological indicator for detection of early metabolic activity
JP2020508678A (ja) 蛍光による微生物の検出のための回復培地
CN112437676A (zh) 自含式生物指示器
CN115315522A (zh) 用于生物指示器生长指示的固定ph指示剂
US20230193347A1 (en) Biological Indicator with Test Microorganisms Enveloped by Wax Composition
US20230313261A1 (en) Biological Indicator Comprising Genetically-Modified Test Microorganism
US20230047207A1 (en) Self-Contained Biological Indicator with Salt Compound
WO2023021348A1 (en) Device, system, and method for determining the efficacy of a sterilization process
WO2022263950A1 (en) Biological indicator with adjusted resistance characteristics

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20240328

Address after: U.S.A.

Applicant after: Shuwanuo Intellectual Property Co.

Country or region after: U.S.A.

Address before: American Minnesota

Applicant before: 3M INNOVATIVE PROPERTIES Co.

Country or region before: U.S.A.