CN102245217A - 生物灭菌指示组合物、制品和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种灭菌指示组合物，其包含：多个灭菌过程抗性孢子，所述孢子在其萌发和初始长出期间含有活性蛋白酶；和萌发培养基，其包含至少一种标记的蛋白酶底物和至少一种供所述孢子萌发的营养物；其中所述培养基基本上不含a)所述多个孢子所含的活性蛋白酶以外的任何活性蛋白酶，和b)所述至少一种标记的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物、任何来源于所述多个孢子的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物、以及任何不与所述标记的蛋白酶底物竞争所述活性蛋白酶的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物；并且其中所述至少一种标记的蛋白酶底物包含能被所述活性蛋白酶切割且标记有一种或多种染料基团的肽，所述染料基团中的至少一种在所述肽被所述活性蛋白酶切割时会发生可检测变化，并且其中所述标记的蛋白酶底物至少在用于温育所述孢子的温度下是稳定的。本发明还公开了包含所述组合物的灭菌过程指示器、以及用所述组合物和指示器确定灭菌过程的有效性的方法。

Description

生物灭菌指示组合物、制品和方法
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2008年10月17日提交的美国临时申请号61/196414的权益，该临时申请以引用方式全文并入本文。
背景技术
主要在卫生保健行业中，但同样在许多其他行业应用中，有必要对用于器材如医疗器械、仪器和其他非一次性制品进行灭菌的过程的有效性进行监控。在这些情形中，灭菌一般定义为完全破坏包括诸如病毒和孢子的结构在内的所有的活微生物的过程。作为标准操作，医院会将灭菌状况指示器与一批物品放在一起以测试灭菌过程的致死率。生物灭菌指示器和化学灭菌指示器都一直得到利用。
标准类型的生物灭菌指示器包括已知数量的试验微生物，例如嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)孢子，这些孢子对灭菌过程的抵抗力比大多数污染性生物强许多倍。在指示器暴露于灭菌过程后，将孢子在营养培养基中进行温育，以确定是否有任何孢子从该灭菌过程存活下来，如有孢子长出则表明灭菌过程不足以破坏所有的微生物。在另一个例子中，在进行了灭菌过程后，测定可与孢子存活力相关联的酶的活性。尽管这方面已取得了进展，但进行确切测定所需的时间可能过长。
现有的化学灭菌指示器可在灭菌过程结束时立即进行读数。但是，结果仅表明存在某种特定条件，例如表明存在某种特定化学品或一定时间段的某个温度。
通常认为，活生物对所有实际存在的条件的反应，是检验灭菌过程实现灭菌有效性的更直接可靠的试验。因此，对于能指示灭菌过程的有效性而在灭菌过程完成后又没有过长的延迟时间的生物灭菌指示器，一直存在着需求。
发明内容
本发明提供生物灭菌组合物、包含该组合物的灭菌指示器以及用该指示器确定灭菌过程的有效性的方法。该组合物包含能抵抗灭菌过程的、在其萌发和初始长出期间含有活性蛋白酶的孢子，例如从灭菌过程存活下来的孢子。在某些实施例中，该活性蛋白酶如果存在的话，可在一段短的温育时间期间和/或之后被检测到。该活性蛋白酶是在标记的蛋白酶底物的存在下检测到的。该底物标记有一种或多种染料基团，所述染料基团中的至少一种在该底物的肽部分被该活性蛋白酶切割时会发生可检测的变化。该标记的蛋白酶底物至少在用于温育所述孢子的温度下是稳定的，并且在某些实施例中，优选在灭菌温度下是稳定的。
因此，在一个实施例中，提供灭菌指示组合物，其包含：
多个灭菌过程抗性孢子，所述孢子在其萌发和初始长出期间含有活性蛋白酶；
包含至少一种标记的蛋白酶底物和至少一种供所述孢子萌发的营养物的萌发培养基；
其中该培养基基本上不含a)该多个孢子所含的活性蛋白酶以外的任何活性蛋白酶，和b)该至少一种标记的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物、任何来源于该多个孢子的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物、以及任何不与该标记的蛋白酶底物竞争该活性蛋白酶的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物；并且
其中该至少一种标记的蛋白酶底物包含能被该活性蛋白酶切割且标记有一种或多种染料基团的肽，所述染料基团中的至少一种在该肽被该活性蛋白酶切割时会发生可检测变化，并且其中该标记的蛋白酶底物至少在用于温育所述孢子的温度下是稳定的。
在另一个实施例中，提供灭菌过程指示器，其包含：
载体，其承载多个灭菌过程抗性孢子，所述孢子在其萌发和初始长出期间含有活性蛋白酶；
微生物不能透过并且不能透过灭菌剂的容器，该容器含有萌发培养基，该萌发培养基包含至少一种标记的蛋白酶底物和至少一种供所述孢子萌发的营养物；
其中该培养基基本上不含a)该多个孢子所含的活性蛋白酶以外的任何活性蛋白酶，和b)该至少一种标记的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物、任何来源于该多个孢子的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物、以及任何不与该标记的蛋白酶底物竞争该活性蛋白酶的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物；并且
其中该至少一种标记的蛋白酶底物包含能被该活性蛋白酶切割且标记有一种或多种染料基团的肽，所述染料基团中的至少一种在该肽被该活性蛋白酶切割时会发生可检测变化，并且其中该标记的蛋白酶底物至少在用于温育所述孢子的温度下是稳定的；并且
其中该载体靠近该容器并且与该萌发培养基隔开。
在又一个实施例中，提供确定灭菌过程的有效性的方法，该方法包括：
提供灭菌过程指示器，其包含：
载体，其承载多个灭菌过程抗性孢子，所述孢子在其萌发和初始长出期间含有活性蛋白酶；
微生物不能透过且不能透过灭菌剂的容器，该容器含有萌发培养基，该萌发培养基包含至少一种标记的蛋白酶底物和至少一种供所述孢子萌发的营养物；
其中该培养基基本上不含a)该多个孢子所含的活性蛋白酶以外的任何活性蛋白酶，和b)该至少一种标记的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物、任何来源于该多个孢子的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物、以及任何不与该标记的蛋白酶底物竞争该活性蛋白酶的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物；并且
其中该至少一种标记的蛋白酶底物包含能被该活性蛋白酶切割且标记有一种或多种染料基团的肽，所述染料基团中的至少一种在该肽被该活性蛋白酶切割时会发生可检测变化，并且其中该标记的蛋白酶底物至少在用于温育所述孢子的温度下是稳定的；并且
其中该载体靠近该容器且与该萌发培养基隔开；
将该灭菌过程指示器放置在灭菌箱中；
将该灭菌过程指示器暴露于灭菌剂；
将该多个灭菌过程抗性孢子和该萌发培养基进行组合；
用该萌发培养基温育所述孢子；
并且
测量该可检测变化，如果存在的话。
定义
术语“含有活性蛋白酶”和“…所含的活性蛋白酶”是指孢子内、芽孢外被中和/或孢子上的活性蛋白酶。
术语“基本上不含任何活性蛋白酶”是指任何竞争性活性蛋白酶的含量足够低，使得由来自孢子的活性蛋白酶所引起的可检测变化可进行测量，和/或由竞争性活性蛋白酶所引起的可检测变化与不存在竞争性活性蛋白酶时的可检测变化相比不超过10％。
术语“基本上不含任何蛋白酶底物”是指任何竞争性蛋白酶底物的含量足够低，使得与不存在竞争性蛋白酶底物时相比，可检测变化下降不超过10％，和/或任何竞争性蛋白酶底物不会显著延迟可检测变化出现所需的时间。对于某些实施例，显著延迟是可检测变化出现所需的时间增加超过2倍。
在说明书和权利要求书中出现的术语“包括”及其变型(如包含、含有等)没有限制意义。
如本文所用，除非上下文另行明确指出，“一个”、“所述”、“至少一个”和“一个或多个”可互换使用。
另外在本文中，以端点表示的数值范围包括该范围内所包含的任何数值(例如550-600nm包括550、551、575、583、592、600等)。
本发明的上述发明内容并非意图描述本发明的每一个公开的实施例或每种实施方式。以下“具体实施方式”更具体地举例说明了示例性实施例。
附图简述
图1是本发明的灭菌指示器的一个实施例的截面图，其中盖26未示出。
图2是图1的灭菌指示器的分解透视图，其中包括盖26。
具体实施方式
如上所指出，现提供了生物灭菌指示器组合物，其能在孢子萌发和初始长出期间，使用至少在用于温育所述孢子(例如用于孢子的萌发和初始长出)的温度下稳定的、染料标记的蛋白酶底物来检测活孢子。对于某些实施例，优选地所述温度高达至少37℃，更优选地高达至少50℃，甚至更优选地高达至少60℃。孢子用包含标记的蛋白酶底物的萌发培养基进行温育。
至少在部分上，由于组合物的培养基部分基本上不含任何活性蛋白酶(当萌发培养基与孢子互相接触时孢子所含有的活性蛋白酶以外的活性蛋白酶)，从而在活孢子萌发和长出的初始阶段提供显著的灵敏度。因此，由活孢子不包含的活性蛋白酶的存在所引起的染料标记的任何基线水平的可检测变化被减至最低。组合物还基本上不含原位产生或在孢子内从头产生的、会与标记的蛋白酶底物竞争的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物。这使得活孢子所含有的任何活性蛋白酶可以作用于标记的蛋白酶底物，从而避免可检测变化的水平的损失和/或可检测变化的出现上的时间延迟。
生物灭菌指示器组合物可有利地用于生物灭菌指示器，如本文中所述的那些。所述组合物和含有所述组合物的指示器可用于确定灭菌过程的有效性，如用于本文所述的确定灭菌过程的有效性的方法中。
目前有多种已知和通用的灭菌过程，包括例如暴露于蒸汽、干热、气态或液态化学品如环氧乙烷、过氧化氢和过氧乙酸，以及辐射。多个灭菌过程抗性孢子是根据所要用的灭菌过程来选择。例如，对于蒸汽灭菌过程，可使用嗜热脂肪地芽孢杆菌(Gb.stearothermophilus)(以前称嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus))。在另一个例子中，对于环氧乙烷灭菌过程，可使用萎缩芽孢杆菌(B.atrophaeus)(以前称枯草芽孢杆菌(B.subtilis))。对于某些实施例，包括上述组合物、指示器和方法实施例中的任何一个在内，多个灭菌过程抗性孢子选自嗜热脂肪地芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、以及它们的组合。对于这些实施例中的某些，多个灭菌过程抗性孢子选自嗜热脂肪地芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、以及它们的组合。已估计，芽孢杆菌属菌种的休眠孢子中约10-20％的蛋白质是小的酸溶性蛋白质，这些蛋白质能结合DNA而增加DNA对各种损害剂的抗性。在孢子萌发期间，在这期间被活化的序列特异性内切蛋白酶(GPR)引发了这些蛋白质的降解。参见Y.Carrillo-Martinez和P.Setlow，J.Bacteriology，176，5357-5363(1994)。
仅以举例方式来说，本发明将用于生物灭菌指示器的微生物描述为“孢子”，但是应理解，要对用于生物灭菌指示器的具体实施例的微生物类型(例如孢子)加以选择，使其对所设想的具体灭菌过程具有高度的抗性。因此，本发明的不同实施例可使用不同的微生物，这取决于具体实施例所意图的灭菌过程。
在暴露于对该多个灭菌抗性孢子亚致死的灭菌过程后，蛋白酶保持足够活性，使得能在用该萌发培养基温育时与该标记的蛋白酶底物反应。对于某些实施例，包括上述组合物、指示器和方法实施例中的任何一个在内，该活性蛋白酶当经历了刚好足以将至少1×105个孢子的群体降低到零个孢子的灭菌过程时只具有本底水平(background level)的活性，所述零个是由无孢子长出测得；而当经历了足以将至少1×105个孢子的群体降低至少一个对数单位但降低到大于零个孢子的群体的灭菌过程时，具有大于本底水平的活性的活性水平；其中活性水平由如下方法测量：使有效量的至少一种标记的蛋白酶底物与活性蛋白酶反应，以产生一种或多种染料基团中的至少一种的可检测变化，并测量该可检测变化。本底活性的源包括例如标记底物的自水解或其他降解途径，其中产生的信号不是由于该多个灭菌抗性孢子的萌发所致。对于某些实施例，该至少一种标记的蛋白酶底物的有效量，是足以与存在的任何活性蛋白酶反应以产生可测量的可检测变化的量。这种可检测变化是在8小时内、优选地在1小时内、更优选地在30分钟内、甚至更优选地在15分钟内可测量的。对于某些实施例，包括上述组合物、指示器和方法实施例中的任何一个在内，该活性蛋白酶是萌发特异性蛋白酶。这种蛋白酶也称为GPR。
该标记的蛋白酶底物在例如温育温度和/或灭菌温度的温度下是稳定的，使得在活性蛋白酶存在下暴露于该温度期间或之后，该标记的蛋白酶底物发生可被观察到或测量到的可检测变化。对于某些实施例，包括上述组合物、指示器和方法实施例中的任何一个在内，优选地，该标记的蛋白酶底物在高达至少37℃的温度(例如温育温度)下是稳定的。对于这些实施例中的某些，更优选地，该标记的蛋白酶底物在高达至少50℃的温度下是稳定的。对于这些实施例中的某些，甚至更优选地，该标记的蛋白酶底物在高达至少60℃的温度下是稳定的。
在所用的灭菌过程中的至少一些中，该过程中包括或者可遇到高温，例如50℃、100℃、121℃、132℃、134℃等。因此，对于某些实施例，包括上述组合物、指示器和方法实施例中的任何一个在内，该标记的蛋白酶底物在灭菌温度下是稳定的。
对于某些实施例，包括上述组合物、指示器和方法实施例中的任何一个在内，该标记的蛋白酶底物在高达至少121℃的温度下是稳定的。对于这些实施例中的某些，该标记的蛋白酶底物在高达至少132℃的温度下是稳定的。对于这些实施例中的某些，该标记的蛋白酶底物在高达至少134℃的温度下是稳定的。
本文所述的组合物、指示器和方法包括至少一种标记的蛋白酶底物。这种底物包含当被活性蛋白酶接触时被该活性蛋白酶切割的肽。对于某些实施例，包括上述实施例中的任何一个在内，该标记的蛋白酶底物是标记的蛋白质，其中该蛋白质被该活性蛋白酶切割。该蛋白质中由上述肽占据的位点被该活性蛋白酶切割。对于这些实施例中的某些，该标记的蛋白酶底物选自标记的酪蛋白、标记的胶原、标记的明胶、标记的纤维蛋白原以及它们的组合。这些底物中的每一种都基本上不含任何活性蛋白酶。对于这些实施例中的某些，该标记的蛋白酶底物是标记的酪蛋白。
对于某些实施例，包括上述实施例中的任何一个在内，所述肽含有选自以下的氨基酸序列：AA1-Glu-AA2-Ala-AA3-Glu-Phe、AA4-Glu-Phe-AA5-AA6-Glu-AA7、以及它们的组合；其中AA1为Tyr、Leu、Phe、或Glu；AA2为Ile或Val；AA3为Ser、Gln、或Asn；AA4为Thr、Ala、Glu、或Gln；AA5为Ala、Gly、或Ser；AA6为Ser、Thr、或Asn；AA7为Thr或Phe。具有这些氨基酸序列切割位点的肽，容易被孢子萌发和初始长出期间所产生的活性蛋白酶(如萌发特异性蛋白酶)切割。
该肽标记有一个或多个染料基团，这些染料基团中的至少一个在该肽被切割时发生可检测变化。可用于此目的的染料基团是已知的，在例如美国专利号7,256,012(Wei等人)和7,410,769(Burroughs-Tencza)中有描述。可用作标记染料的一些非限制性例子包括荧光素、四甲基罗丹明、罗丹明B、丽丝胺、罗丹明X、德克萨斯红、花菁染料、氟硼荧染料、alexa染料和其他通常可获自Invitrogen Corp(Carlsbad，CA)的荧光染料。也可使用本领域技术人员知道的其他染料。
简言之，至少一个染料基团连接到该蛋白酶底物。染料基团可具有可以目视方式观察的或者以光学方式测量的特性。例如，染料基团可具有可观察的颜色；染料基团可在某一特定波长处具有最大吸光度、在某一特定波长或波长范围内具有某个吸光度水平、具有某些色坐标值等，这可通过分光光度法和/或比色法测量；或者染料基团可在某一特定波长或波长范围内发光，或以某一特定强度发光，这可通过荧光测定法和/或发光测定法测量。对于某些实施例，当该蛋白酶底物完整时，该染料基团足够靠近至少一个第二基团，以使该第二基团调节该染料基团的荧光和/或吸收光谱。该第二基团可以是例如另一染料基团、荧光能量转移接纳体、发色光吸收化合物或猝灭剂。对该染料基团的荧光或光吸收的调节可通过各种机制进行，例如染料二聚化和/或能量转移机制，后者可包括非辐射性能量转移、辐射性能量转移、分子内能量共振转移等等。当该底物被该活性蛋白酶切割时，调节作用减低或消除，从而造成该染料基团出现可检测变化，例如光学变化，如荧光强度变化、颜色变化、颜色强度变化等等。
对于某些实施例，包括上述组合物、指示器和方法实施例中的任何一个在内，优选地该可检测变化是荧光强度的变化。对于这些实施例中的某些，荧光的波长为500nm-600nm，优选550nm-600nm。这个波长范围是有利的，因为这种荧光不会被通常在较短波长(如小于500nm或小于400nm的波长)处出现的萌发培养基的吸光度或荧光所遮掩，或者被遮掩的程度会明显低得多。
使萌发培养基和灭菌过程抗性孢子保持隔开但又互相紧邻，以便在需要时容易将该培养基与孢子进行组合，例如在暴露于灭菌过程后进行组合并进行温育以确定是否存在任何活孢子，或者在暴露于灭菌过程后进行组合但不进行温育以确定可检测变化的基线或本底水平。例如，可测量某一特定波长处的吸光度或荧光的本底水平。因此，对于某些实施例，包括上述组合物、指示器和方法实施例中的任何一个在内，该多个灭菌过程抗性孢子和该萌发培养基相互隔开又相互邻近。
对于某些实施例，包括上述组合物、指示器和方法实施例中的任何一个在内，该萌发培养基是含水溶液或悬浮液。该培养基含有至少一种标记的蛋白酶底物和至少一种供孢子萌发的营养物，它们可溶解或悬浮于该含水培养基中。底物在该培养基中的浓度取决于所用的标记的蛋白酶底物、该活性蛋白酶切割该底物的速率。当可检测水平不太容易观察到或测量到或者该速率相对较低时，需要更高的浓度。优选地，底物的量足以在将孢子暴露于灭菌过程后在短时间内与任何存在的活性蛋白酶反应。所述短时间小于8小时，优选小于1小时，更优选小于30分钟，甚至更优选小于15分钟。对于这些实施例中的某些，该标记的蛋白酶底物的浓度为至少0.01mg/mL。对于这些实施例中的某些，该标记的蛋白酶底物的浓度为至少0.1mg/mL。
该培养基含有至少一种能诱导孢子(如果是活的话)萌发和初始长出并同时产生活性蛋白酶的营养物。该营养物包括一种或多种糖类，例如葡萄糖、果糖、纤维二糖等。该营养物还可包括盐，如氯化钾、氯化钙等。对于某些实施例，该营养物还包括至少一种氨基酸，例如甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸中的至少一者。该萌发培养基还可包含一种或多种伴随该营养物的其他材料。例如，可包括能帮助诱导孢子的萌发和活性蛋白酶的释放的溶菌酶。可以使用用于诱导灭菌过程抗性孢子的萌发和初始长出的这种营养物和材料以及本领域公知的其他营养物的各种量。培养基成分和浓度是已知的，在例如WO 99/05310(Tautvydas)以及Zechman等人，J.Food Sci.，56，5，第1408-14011页(1991)(也称为Zechman和Pflug，1991)中有描述。
或者，对于某些实施例，该萌发培养基为干燥的形式。该至少一种标记的蛋白酶底物和至少一种营养物可分别进行干燥或者一起进行干燥，以按所需的形状在支撑膜上或在载体材料上形成膜或层，或者分别进行复合或一起进行复合而成为干燥固体，以形成片剂、胶囊形片剂或胶囊剂。可将任何这些形式保持接近孢子，并可在适当的时间加入水或含水缓冲液，以用所产生的培养基悬浮液或溶液温育孢子。当重悬或溶解时，所产生的培养基可为液体或凝胶。可用于本文描述的组合物、指示器和方法实施例中的干燥形式的培养基的另外实施例，在2008年10月17日提交的、标题为Biological Sterilization Indicator，System，and Methods of Using Same(生物灭菌指示器、系统及其使用方法)的共同待审的美国专利申请系列号61/196,438(Chandrapati等人)中有描述。
该萌发培养基还可包含缓冲剂以将pH保持在所需范围内。在一个实例中，可将pH保持在某一特定范围内，以控制该至少一种染料的最大吸光度和最大发射。例如，可获自Roche Molecular Biochemicals(德国曼海姆)的试卤灵染料-标记(N-(试卤灵-4-羰基)哌啶-4-碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯，在小于7的pH下分别在467nm和559nm处具有最大吸光度和最大发射，但在大于7的pH下分别在574nm和584nm处具有最大吸光度和最大发射。对于某些实施例，包括上述组合物、指示器和方法实施例中的任何一个在内，该标记的蛋白酶底物是标记的酪蛋白，其中该标记是上述的试卤灵染料-标记。
当用该萌发培养基温育所述孢子时，可使用高于室温的温育温度。对于某些实施例，温育温度为至少37℃。对于某些实施例，优选温育温度为至少50℃或高达至少60℃。对于某些实施例，温育温度为50-60℃。
如上所指出，本发明提供的灭菌过程指示器包括载体，所述载体承载多个能抵抗灭菌过程的、在其萌发和初始长出期间含有活性蛋白酶的孢子。对于某些实施例，该载体是片状材料如纸张、织造布、非织造布、塑料、聚合物材料(例如聚丙烯、聚乙烯、聚苯乙烯等)、微孔聚合物材料、金属箔、玻璃、瓷器、陶瓷等、或者它们的组合。对于某些实施例，所述片状材料可吸水或可被湿润，以有助于在适当的时间快速地使该萌发培养基与孢子紧密接触。
该灭菌过程指示器还包括容器，其含有该萌发培养基而又不让灭菌剂或任何微生物进入其中。如上所指出，该载体接近该容器，以便在要开始温育时容易使该载体所承载的孢子与该萌发培养基接触。该容器可容易地通过移除塞子、将其压破或刺穿来打开，以使孢子与培养基接触。该容器可装配有塞子，或者该容器的至少一部分可以是易破材料如玻璃，或者是其他的可通过物理压力破坏但又足够坚韧以在制造、保藏、运输和灭菌条件中保持完整的材料。
已知的生物灭菌过程指示器构造，如美国专利号5,073,488(Matner等人)中所描述的那些构造，可用于上述的组合物。也可使用其他的指示器构造，如2008年10月17日提交的、标题为Biological SterilizationIndicator，System，and Methods of Using Same(生物灭菌指示器、系统及其使用方法)的美国专利申请系列号61/196,438(Chandrapati等人)中所描述的那些构造。本文描述的灭菌过程指示器的一个实施例在图1和2中示出。该指示器包括具有开放腔14的壳体10，该开放腔由不透气体和液体的壁12所界定。这些结构的另选实施例在2008年10月17日提交的、标题为Biological Sterilization Indicator，System，and Methodsof Using Same(生物灭菌指示器、系统及其使用方法)的美国专利申请系列号61/196,438(Chandrapati等人)中示出。该壳体示出为圆形管，但也可使用其他已知的构形。该壁优选是透明的，或者是半透明的，只要该腔内的颜色变化可目视观察到、在某一特定波长处的吸光度可测量到或者在某一特定波长处的荧光强度可测量到。该壁的合适材料可包括玻璃、聚碳酸酯、聚丙烯、聚酯等。对于某些实施例，该壳体的至少一个壁能透射至少550-600nm、优选至少500-600nm的波长范围内的入射光的至少90％。该腔包含载体16，例如纸张、玻璃、或聚合物片材，该载体承载着预定数量的灭菌过程抗性活孢子。
图中示出容器18在腔14内，该容器装着萌发培养基20。或者，容器18可设置在腔14外部并邻近该腔。密封的容器18可以是易破的安瓿，或者也可以是装有塞子或其他机构的容器，所述机构当被触发时能让萌发培养基20接触载体16及其上所承载的孢子。容器18示出为细长的安瓿，但也可使用其他已知的构形。
图中示出载体16在容器18和壳体10的壁12之间，以便容易透过壁12确定可检测变化。或者，壁12的一部分可用作载体16。可以采用载体16的其他布置方式，例如可采用靠近底壁12A布置的方式。可基于壳体10的形状将载体16成形为适合此布置方式，或者底壁12A本身可用作载体16。对于某些实施例，载体16能透射至少550-600nm、优选至少500-600nm的波长范围内的入射光的至少90％。腔14的开口15提供有透气但不透过微生物的闭合构件22，其可通过粘合剂、热密封等粘附到壳体10。或者，可用具有孔口28的盖26将闭合构件22保持在开口15上。在暴露于灭菌剂期间，灭菌剂穿过闭合构件22进入腔14而与载体16上的孢子接触。这些结构的另选实施例在2008年10月17日提交的、标题为Biological Sterilization Indicator，System，andMethods of Using Same(生物灭菌指示器、系统及其使用方法)的美国专利申请系列号61/196,438(Chandrapati等人)中示出。
本文所提供的确定灭菌过程的有效性的方法包括提供灭菌过程指示器的上述实施例中的任何一个，并将该灭菌过程指示器放置在灭菌箱中。灭菌器(许多是可市售获得的)包括灭菌箱，其尺寸通常被设置成可容纳多个待灭菌的制品，并装配有用以将空气和/或其他气体从中排出并将灭菌剂加入其中的装置。该灭菌过程指示器当放在该灭菌箱中时可邻近待灭菌的制品放置。
所述方法包括将该灭菌过程指示器暴露于灭菌剂。可在将灭菌箱中存在的任何空气或其他气体的至少一部分排出灭菌箱后，将灭菌剂加入到灭菌箱。或者，可不对灭菌箱进行排气就将灭菌剂加入到灭菌箱。通常采用一系列的排气步骤，以确保灭菌剂达到灭菌箱内的所有区域并接触待灭菌的制品的所有区域。当将灭菌剂加入到灭菌箱时，在灭菌剂达到灭菌箱内的所有区域的条件下灭菌剂还接触到孢子。
所述方法还包括将该多个灭菌抗性孢子和该萌发培养基进行组合，从而使孢子和萌发培养基互相接触。这可在灭菌过程完成后进行，也就是说在提供了这样的条件后进行，所述条件使得灭菌剂达到灭菌箱内的所有区域并在一定温度下保持一定的时间，该温度和时间据认为足以杀灭灭菌箱内存在的任何微生物。可如上文所述，将培养基和孢子进行组合，并将该组合物进行温育。可在用该萌发培养基温育所述孢子的同时，连续地或间歇地监测和测量可检测变化，如荧光变化。或者，可先进行温育步骤的一部分或全部，然后再测量可检测变化。再者，可在一个温度下(例如在50-60℃下)进行温育，然后在另一个温度下(例如在室温下或在37℃下)进行可检测变化的测量。
所述方法还包括测量一个或多个连接到标记的蛋白酶底物中所包含的肽的染料基团中的至少一个的可检测变化(如果存在的话)。活孢子(如果存在的话)一旦接触培养基和温育条件，会快速活化其中所含的、能切割该肽的蛋白酶。可通过测量某一特定波长处的吸光度、测量某一特定波长处的荧光强度、目视评估颜色变化等，来测量所产生的染料基团的可检测变化。这些测量可便利地使用已知的仪器如荧光计、发光计、分光光度计、比色计等来进行。对于某些实施例，优选地通过测量某一特定波长处的荧光强度来测量可检测变化。
对于某些实施例，包括上述方法实施例中的任何一个在内，所述方法还包括通过测量用该萌发培养基温育所述孢子之后所引起的如果存在的可检测变化，与用该萌发培养基温育所述孢子之前相比较，来确定在将灭菌过程指示器暴露于灭菌剂之后是否有活孢子存在。例如，将孢子和萌发培养基进行组合之后立即测得的该组合的荧光强度可当作基线荧光。在将该组合进行温育之后，比该基线荧光强的荧光强度可表明有活孢子存在。对于某些实施例，比该基线荧光强至少10％、优选至少5％的荧光强度表明有活孢子存在。对于这些实施例中的某些，确定是否存在少至100个活孢子，并且其中温育进行不超过8小时。对于这些实施例中的某些，优选温育进行不超过1小时。对于这些实施例中的某些，更优选温育进行不超过30分钟。对于这些实施例中的某些，甚至更优选温育进行不超过15分钟。
或者，对于某些实施例，所述方法还包括通过测量可检测变化(如果存在的话)的速率，如荧光强度变化的速率，来确定在将该灭菌过程指示器暴露于灭菌剂之后是否有活孢子存在。例如，在将孢子和萌发培养基进行组合并开始温育步骤之后，可在温育期间连续地或间歇地测量可检测变化，从而确定可检测变化的速率。对于某些实施例，可检测灭菌抗性孢子的萌发，作为温育期间信号增加的速率。相对于温育时间，这个速率可以是线性速率、指数速率等。速率常数可用作孢子的萌发的指标。
或者，对于某些实施例，所述方法还包括通过在指定的时间对可检测变化进行最后一次测量，来确定在将灭菌过程指示器暴露于灭菌剂后是否有活孢子存在。如果存在的话，则可检测变化(例如荧光强度)会比此前对该产品确立的基线(例如基线荧光)高，例如高至少5-10％。例如，在将孢子与萌发培养基进行组合并开始温育步骤后，可在温育结束时测量可检测变化(如荧光)。最后一次荧光测量可用作孢子的萌发的指标。
因此，使用上述组合物和指示器的本发明方法可对活孢子的存在足够灵敏，以在短时间内提供关于孢子的指示。另外，即使当存在的活孢子数目相对较低时，也能提供该指示。
对于某些实施例，包括上述方法实施例中的任何一个在内，所述方法还包括将待灭菌的制品与该灭菌过程指示器一起放置在灭菌箱中。对于这些实施例中的某些，所述方法还包括确定该灭菌过程对于该制品的灭菌是否有效。无活孢子的指示结果可用来确定该灭菌过程对于该制品的灭菌是有效的，而活孢子的指示结果可用来确定该过程不是有效的。因此，使用上述的组合物、指示器和方法实施例，可在相对较短时间内作出有关经历了灭菌过程的制品的灭菌状况的评估。
示例性实施例
1.一种灭菌指示组合物，其包含：
多个灭菌过程抗性孢子，所述孢子在其萌发和初始长出期间含有活性蛋白酶；
萌发培养基，其包含至少一种标记的蛋白酶底物和至少一种供所述孢子萌发的营养物；
其中该培养基基本上不含a)该多个孢子所含的活性蛋白酶以外的任何活性蛋白酶，和b)该至少一种标记的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物、任何来源于该多个孢子的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物、以及任何不与该标记的蛋白酶底物竞争该活性蛋白酶的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物；并且
其中该至少一种标记的蛋白酶底物包含肽，所述肽能被该活性蛋白酶切割且标记有一种或多种染料基团的，所述染料基团中的至少一种在该肽被该活性蛋白酶切割时会发生可检测变化，并且其中该标记的蛋白酶底物至少在用于温育所述孢子的温度下是稳定的。
2.根据实施例1所述的组合物，其中该多个灭菌过程抗性孢子选自嗜热脂肪地芽孢杆菌(Gb.stearothermophilus)、萎缩芽孢杆菌(B.atrophaeus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、以及它们的组合。
3.根据实施例1或实施例2所述的组合物，其中该活性蛋白酶当经历了刚好足以将至少1×105个孢子的群体降低到零个孢子的灭菌过程时只具有本底水平的活性，所述零个是由无孢子长出测得；并且
当经历了足以将至少1×105个孢子的群体降低至少一个对数单位但降低到大于零个孢子的群体的灭菌过程时，具有大于本底水平的活性的活性水平；
其中活性水平由如下方法测量：
使有效量的至少一种标记的蛋白酶底物与活性蛋白酶反应，以产生一种或多种染料基团中的至少一种的可检测变化，并
测量该可检测变化。
4.根据实施例1、2和3中任一项所述的组合物，其中该活性蛋白酶是萌发特异性蛋白酶。
5.根据实施例1-4中任一项所述的组合物，其中该标记的蛋白酶底物在用于温育所述孢子的至少60℃的温度下是稳定的。
6.根据实施例1-5中任一项所述的组合物，其中该标记的蛋白酶底物在灭菌温度下是稳定的。
7.根据实施例1-6中任一项所述的组合物，其中该标记的蛋白酶底物在高达至少121℃的温度下是稳定的。
8.根据实施例7所述的组合物，其中该标记的蛋白酶底物在高达至少132℃的温度下是稳定的。
9.根据实施例1-8中任一项所述的组合物，其中该标记的蛋白酶底物是标记的蛋白质，其中该蛋白质被该活性蛋白酶切割。
10.根据实施例9所述的组合物，其中该标记的蛋白酶底物选自标记的酪蛋白、标记的胶原、标记的明胶、标记的纤维蛋白原、和它们的组合，以上的任一者都基本上不含任何活性蛋白酶。
11.根据实施例10所述的组合物，其中该标记的蛋白酶底物是标记的酪蛋白。
12.根据实施例1-11中任一项所述的组合物，其中该肽含有选自以下的氨基酸序列：AA1-Glu-AA2-Ala-AA3-Glu-Phe、AA4-Glu-Phe-AA5-AA6-Glu-AA7、和它们的组合；其中AA1为Tyr、Leu、Phe、或Glu；AA2为Ile或Val；AA3为Ser、Gln、或Asn；AA4为Thr、Ala、Glu、或Gln；AA5为Ala、Gly、或Ser；AA6为Ser、Thr、或AsnAA7为Thr或Phe。
13.根据实施例1-11中任一项所述的组合物，其中该可检测变化是荧光强度的变化。
14.根据实施例13所述的组合物，其中该荧光具有550-600nm的波长。
15.根据实施例1-14中任一项所述的组合物，其中该多个灭菌过程抗性孢子和该萌发培养基相互隔开又相互邻近。
16.根据实施例1-15中任一项所述的组合物，其中该萌发培养基是含水溶液或悬浮液。
17.根据实施例1-15中任一项所述的组合物，其中该萌发培养基为干燥的形式。
18.一种灭菌过程指示器，其包括：
载体，其承载多个灭菌过程抗性孢子，所述孢子在其萌发和初始长出期间含有活性蛋白酶；
微生物不能透过且不能透过灭菌剂的容器，该容器含有萌发培养基，所述萌发培养基包含至少一种标记的蛋白酶底物和至少一种供所述孢子萌发的营养物；
其中该培养基基本上不含a)该多个孢子所含的活性蛋白酶以外的任何活性蛋白酶，和b)该至少一种标记的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物、任何来源于该多个孢子的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物、以及任何不与该标记的蛋白酶底物竞争该活性蛋白酶的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物；并且
其中该至少一种标记的蛋白酶底物包含能被该活性蛋白酶切割且标记有一种或多种染料基团的肽，所述染料基团中的至少一种在该肽被该活性蛋白酶切割时会发生可检测变化，并且其中该标记的蛋白酶底物至少在用于温育所述孢子的温度下是稳定的；并且
其中载体邻近容器且与萌发培养基隔开。
19.根据实施例18所述的指示器，其中该多个灭菌过程抗性孢子选自嗜热脂肪地芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、生孢梭菌、凝结芽孢杆菌、以及它们的组合。
20.根据实施例18或实施例19所述的指示器，其中该活性蛋白酶当经历了刚好足以将至少1×105个孢子的群体降低到零个孢子的灭菌过程时只具有本底水平的活性，所述零个是由无孢子长出测得；并且
当经历了足以将至少1×105个孢子的群体降低至少一个对数单位但降低到大于零个孢子的群体的灭菌过程时，具有大于本底水平的活性的活性水平；
其中活性水平由如下方法测量：
使有效量的至少一种标记的蛋白酶底物与活性蛋白酶反应，以产生一种或多种染料基团中的至少一种的可检测变化，并
测量所述可检测变化。
21.根据实施例18、19和20中任一项所述的指示器，其中该活性蛋白酶是萌发特异性蛋白酶。
22.根据实施例18-21中任一项所述的组合物，其中该标记的蛋白酶底物在用于温育所述孢子的至少60℃的温度下是稳定的。
23.根据实施例18-22中任一项所述的指示器，其中该标记的蛋白酶底物在灭菌温度下是稳定的。
24.根据实施例18-23中任一项所述的指示器，其中该标记的蛋白酶底物在高达至少121℃的温度下是稳定的。
25.根据实施例24所述的指示器，其中该标记的蛋白酶底物在高达至少132℃的温度下是稳定的。
26.根据实施例18-25中任一项所述的指示器，其中该标记的蛋白酶底物是标记的蛋白质，其中该蛋白质被该活性蛋白酶切割。
27.根据实施例26所述的指示器，其中该标记的蛋白酶底物选自标记的酪蛋白、标记的胶原、标记的明胶、标记的纤维蛋白原、以及它们的组合，以上每一种都基本上不含任何活性蛋白酶。
28.根据实施例27所述的指示器，其中该标记的蛋白酶底物是标记的酪蛋白。
29.根据实施例18-28中任一项所述的指示器，其中该肽含有选自以下的氨基酸序列：AA1-Glu-AA2-Ala-AA3-Glu-Phe、AA4-Glu-Phe-AA5-AA6-Glu-AA7、和它们的组合；其中AA1为Tyr、Leu、Phe、或Glu；AA2为Ile或Val；AA3为Ser、Gln、或Asn；AA4为Thr、Ala、Glu、或Gln；AA5为Ala、Gly、或Ser；AA6为Ser、Thr、或Asn；AA7为Thr或Phe。
30.根据实施例18-29中任一项所述的指示器，其中该可检测变化是荧光强度的变化。
31.根据实施例30所述的指示器，其中该荧光具有550-600nm的波长。
32.根据实施例18-31中任一项所述的指示器，其中该萌发培养基是含水溶液或悬浮液。
33.根据实施例18-31中任一项所述的指示器，其中该萌发培养基为干燥的形式。
34.一种确定灭菌过程的有效性的方法，所述方法包括：
提供灭菌过程指示器，其包括：
载体，其承载多个灭菌过程抗性孢子，所述孢子在其萌发和初始长出期间含有活性蛋白酶；
微生物不能透过且不能透过灭菌剂的容器，该容器含有萌发培养基，该萌发培养基包含至少一种标记的蛋白酶底物和至少一种供所述孢子萌发的营养物；
其中该培养基基本上不含a)该多个孢子所含的活性蛋白酶以外的任何活性蛋白酶，和b)该至少一种标记的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物、任何来源于该多个孢子的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物、以及任何不与该标记的蛋白酶底物竞争该活性蛋白酶的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物；并且
其中该至少一种标记的蛋白酶底物包含肽，所述肽能被该活性蛋白酶切割且标记有一种或多种染料基团，所述染料基团中的至少一种在该肽被该活性蛋白酶切割时会发生可检测的变化，并且其中该标记的蛋白酶底物至少在用于温育所述孢子的温度下是稳定的；并且
其中该载体邻近该容器且与该萌发培养基隔开；
将该灭菌过程指示器放置在灭菌箱中；
将该灭菌过程指示器暴露于灭菌剂；
将该多个灭菌过程抗性孢子和该萌发培养基进行组合；
用该萌发培养基温育所述孢子；
并且
测量该可检测变化，如果存在的话。
35.根据实施例34所述的方法，所述方法还包括通过测量将用该萌发培养基温育所述孢子之后所引起的如果存在的可检测变化，与用该萌发培养基温育所述孢子之前的相比较，来确定在将该灭菌过程指示器暴露于灭菌剂之后是否有活孢子存在。
36.根据实施例34所述的方法，所述方法还包括通过测量将用该萌发培养基温育所述孢子之后所引起的如果存在的可检测变化的速率，与用该萌发培养基温育所述孢子之前的相比较，来确定在将该灭菌过程指示器暴露于灭菌剂之后是否有活孢子存在。
37.根据实施例35或实施例36所述的方法，其中确定是否存在少至100个活孢子，并且其中温育所述孢子进行不超过8小时。
38.根据实施例37所述的方法，其中温育所述孢子进行不超过1小时。
39.根据实施例38所述的方法，其中温育所述孢子进行不超过30分钟。
40.根据实施例34-39中任一项所述的方法，其中温育所述孢子在至少60℃的温度下进行。
41.根据实施例34-40中任一项所述的方法，所述方法还包括将待灭菌的制品与该灭菌过程指示器一起放置在灭菌箱中。
42.根据实施例41所述的方法，所述方法还包括确定该灭菌过程对于该制品的灭菌是否有效。
43.根据实施例40-42中任一项所述的方法，其中该多个灭菌过程抗性孢子选自嗜热脂肪地芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、生孢梭菌、凝结芽孢杆菌、以及它们的组合。
44.根据实施例34-43中任一项所述的方法，其中该活性蛋白酶当经历了刚好足以将至少1×105个孢子的群体降低到零个孢子的灭菌过程时只具有本底水平的活性，所述零个是由无孢子长出测得；并且
当经历了足以将至少1×105个孢子的群体降低至少一个对数单位但降低到大于零个孢子的群体的灭菌过程时，具有大于本底水平的活性的活性水平；
其中活性水平由如下方法测量：
使有效量的该至少一种标记的蛋白酶底物与该活性蛋白酶反应，以产生该一种或多种染料基团的至少一种中的可检测变化，并且
测量该可检测变化。
45.根据实施例34-44中任一项所述的方法，其中该活性蛋白酶是萌发特异性蛋白酶。
46.根据实施例34-45中任一项所述的方法，其中该标记的蛋白酶底物在用于温育所述孢子的至少60℃的温度下是稳定的。
47.根据实施例34-46中任一项所述的方法，其中该标记的蛋白酶底物在灭菌温度下是稳定的。
48.根据实施例34-47中任一项所述的方法，其中该标记的蛋白酶底物在高达至少121℃的温度下是稳定的。
49.根据实施例48所述的方法，其中该标记的蛋白酶底物在高达至少132℃的温度下是稳定的。
50.根据实施例34-48中任一项所述的方法，其中该标记的蛋白酶底物是标记的蛋白质，其中该蛋白质被该活性蛋白酶切割。
51.根据实施例50所述的方法，其中该标记的蛋白酶底物选自标记的酪蛋白、标记的胶原、标记的明胶、标记的纤维蛋白原、和它们的组合，以上每一种都基本上不含任何活性蛋白酶。
52.根据实施例51所述的方法，其中该标记的蛋白酶底物是标记的酪蛋白。
53.根据实施例34-52中任一项所述的方法，其中该肽含有选自以下的氨基酸序列：AA1-Glu-AA2-Ala-AA3-Glu-Phe、AA4-Glu-Phe-AA5-AA6-Glu-AA7、和它们的组合；其中AA1为Tyr、Leu、Phe、或Glu；AA2为Ile或Val；AA3为Ser、Gln、或Asn；AA4为Thr、Ala、Glu、或Gln；AA5为Ala、Gly、或Ser；AA6为Ser、Thr、或Asn；AA7为Thr或Phe。
54.根据实施例34-53中任一项所述的方法，其中该可检测变化是荧光强度的变化。
55.根据实施例44所述的方法，其中该荧光具有550-600nm的波长。
56.根据实施例34-55中任一项所述的方法，其中该多个灭菌过程抗性孢子和该萌发培养基相互隔开又相互邻近。
57.根据实施例34-56中任一项所述的方法，其中该萌发培养基是含水溶液或悬浮液。
58.根据实施例34-56中任一项所述的组合物，其中该萌发培养基为干燥的形式。
下面的实例进一步说明本发明的目的和优点，但这些实例中列举的具体材料及其量以及其他条件和细节不应被解释为是对本发明的不当限制。
实例
孢子悬浮液
嗜热脂肪地芽孢杆菌(也称为嗜热脂肪芽孢杆菌)的孢子悬浮液按已知的方法来制备，如美国专利号5,418,167(Matner等人)的实例1中所述的方法。这些方法和本领域技术人员知道的另选方法的修改方案，也可用于制备这些悬浮液。
实例1
蛋白酶检测
在无菌冲洗用水(Baxter，Deerfield，IL)中进行嗜热脂肪地芽孢杆菌孢子悬浮液的稀释。将所得的稀释孢子制品(1μL)以1×106个孢子、1×105个孢子、1×104个孢子、1×103和0个孢子的最终群体如下所述在读板机中进行试验。使孢子在37℃培养箱中干燥20分钟。然后将孢子在100uL的由以下组分组成的培养基中复水：50uL的GFK(1mg/mL葡萄糖、1mg/mL果糖、3.3mg/mL氯化钾)、25uL的Tris缓冲液(含0.2mMCaCl)和25uL的4mg/mL标记的蛋白酶底物(Calbiochem、标记有N-(试卤灵-4-羰基)哌啶-4-碳酸的酪蛋白，蛋白酶底物(EMD Chemicals，Gibbstown，NJ))。将每个所得的混合物加入到板的孔中。随后将板放在50℃预热的Synergy 4读板机(BioTech，Winooski，VT)中并温育480分钟。在此过程中，于520nm处激发后，于580nm的发射波长处以每孔共读取96个读数的时间间隔读取荧光强度读数。结果的汇总在表1中示出。
表1.不同孢子群体在不同时间的荧光强度
  时间(小时)   0   1.0E+03   1.0E+04   1.0E+05   1.0E+06
  0   0   0   0   0   0
  0.5   -2518.5   -5425   -2860   30764.5   66762
  1   -3106.5   -1542.5   9260.5   65782.5   66762
  4   -2292   4999.5   53773   71862.5   66762
  8   471.5   25551.5   62521.5   71862.5   66762
通过从所有读数减去初始零时间读数，将数据归一化到初始零时间读数。结果说明，例如，检测到活性蛋白酶并且此酶与样本中存在的活孢子数目有相关性。
实例2
标记的蛋白酶底物对于暴露于灭菌温度的稳定性
在无菌冲洗用水(Baxter，Deerfield，IL)中进行嗜热脂肪地芽孢杆菌孢子悬浮液的稀释。将所得的稀释孢子制品(1μL)以1×106个孢子和0个孢子的最终群体进行试验。使孢子在37℃培养箱中干燥20分钟。然后将孢子在100uL的由以下组分组成的培养基中复水：50uL的GFK(1mg/mL葡萄糖、1mg/mL果糖、3.3mg/mL氯化钾)、25uL的Tris缓冲液(含0.2mM CaCl)和25uL的如实例1中的4mg/mL标记的蛋白酶底物，该培养基事先在AMSCO Scientific SG-120 Eagle/CenturySeries蒸汽灭菌器(Steris，Mentor，OH)中进行15分钟121℃(250℉)真空辅助循环。同时对没有经历灭菌条件的培养基(非高压灭菌的蛋白酶培养基)进行测试，作为阳性对照。将每个所得的混合物放在板的孔中，随后将板放在50℃预热的Synergy 4读板机(BioTech，Winooski，VT)中并温育180分钟。在此过程中，于520nm处激发后，于580nm的发射波长处以每孔共读取36个读数的时间间隔读取荧光强度读数。结果的汇总在表2中示出。
表2.在对培养基进行和不进行高压灭菌的情况下，0个孢子和10 6 个孢子的群体在不同时间的荧光强度
Figure BPA00001387905000271
通过从所有读数减去初始零时间读数，将数据归一化到初始零时间读数。结果说明，例如，蛋白酶底物即使在暴露于灭菌过程之后，也保持了其被活性蛋白酶切割并产生荧光的能力。
实例3
灭菌过程将至少10 5 个孢子的群体降低到零个孢子之后的蛋白酶 活性
将两个玻璃小瓶—一个含有1mL的嗜热脂肪地芽孢杆菌孢子悬浮液，另一个含有1mL的具有标记的蛋白酶底物的培养基—放入灭菌器中，并在AMSCO Scientific SG-120 Eagle/Century Series蒸汽灭菌器(Steris，Mentor，OH)中进行15分钟121℃(250℉)真空辅助循环。随后对所得的经灭菌的孢子和培养基进行试验，确定是否存在蛋白酶底物。同时对未经高压灭菌的孢子悬浮液进行测试，作为阳性对照。使孢子在37℃培养箱中干燥20分钟。然后将孢子在100uL的由以下组分组成的经灭菌的培养基中复水：50uL的GFK(1mg/mL葡萄糖、1mg/mL果糖、3.3mg/mL氯化钾)、25uL的Tris缓冲液(含0.2mM CaCl)和25uL的如实例1中的4mg/mL标记的蛋白酶底物。将所得的混合物分别加入到板的孔中。随后将板放在50℃预热的Synergy 4读板机(BioTech，Winooski，VT)中并温育180分钟。在此过程中，于520nm处激发后，于580nm的发射波长处以每孔共读取36个读数的时间间隔读取荧光强度读数。结果的汇总在表3中示出。
表3.未经高压灭菌的以及与高压灭菌培养基一起进行高压灭菌 的0个孢子和10 5 个孢子的群体在不同时间的荧光强度
Figure BPA00001387905000281
通过从所有读数减去初始零时间读数，将数据归一化到初始零时间读数。结果说明，例如，灭菌过程导致的死孢子没有可检测水平的可水解蛋白酶底物的蛋白酶。另一方面，活孢子能够产生大量的活性蛋白酶，这由荧光的增加测得。
孢子当经历了刚好足以将至少1×105个孢子的群体降低到零个孢子的灭菌过程后，其任何活性蛋白酶只具有本底水平的活性。
实例4
将孢子暴露于亚致死灭菌循环之后检测活性蛋白酶
通过将嗜热脂肪地芽孢杆菌的悬浮液以E5-E6的浓度涂布在聚丙烯载体上，制备生物指示器。在37℃下干燥20分钟后，将生物指示器暴露于常用的灭菌条件：a)132℃，AMSCO EAGLE 2013型蒸汽灭菌器(Steris，Mentor OH)，b)132℃真空辅助循环，在Joslyn蒸汽灭菌生物指示器材抗力检测器(Joslyn Steam Biological Indicator EvaluatorResistometer，BIER)容器(Steris，Mentor OH)中。灭菌后，使生物指示器与含有如实例1-3中的GFK和标记的蛋白酶底物、但加有0.1mg/ml的羟基芘三磺酸的培养基接触，然后在50℃的温育温度下，于520nm处激发后，于580nm的发射波长处以30分钟和60分钟的时间间隔读取荧光强度读数。用带有温度控制器的96孔样本荧光测量装置，在60℃的温育温度下，于530nm处激发后，于560nm的发射波长处以30分钟和60分钟的时间间隔读取荧光强度读数。结果的汇总在表4-6中示出。
表4.在灭菌条件a)下一分钟和三分钟之后，在50℃的温育温度 下30分钟和60分钟后的荧光变化。
  在灭菌器中的时间   30分钟时荧光强度的变化   60分钟时荧光强度的变化
  1分钟   32,716   42,116
  3分钟   -319   311.4
  0(阳性对照)   67,751   100,429
  0(阴性对照)   -345   -78.5
表5.在灭菌条件a)下一分钟和三分钟之后，在60℃的温育温度 下30分钟和60分钟后的荧光变化。
  在灭菌器中的时间   30分钟时荧光强度的变化   60分钟时荧光强度的变化
  1分钟   3,847   5,620
  3分钟   -360   -141
表6.在灭菌条件b)下一分钟和三分钟之后，在50℃的温育温度 下30分钟和60分钟后的荧光变化。
  在灭菌器中的时间   30分钟时荧光强度的变化   60分钟时荧光强度的变化
  1分钟   22,248   54,285
  3分钟   341   815
  0(阴性对照)   -468   -182
在所有上述情况中，活性蛋白酶都是在暴露于1分钟时间的亚致死灭菌循环后进行检测。这些样本中活孢子的独立证据是基于酸敏感性染料羟基芘三磺酸进行观测。
实例5
利用荧光标记短肽序列作为生物指示剂进行蛋白酶检测
按照Y.Carrillo-Martinez和P.Setlow，J.Bacteriol.1994年9月，176(17)，5357-5363，从枯草芽孢杆菌小酸溶性芽孢蛋白(SASP)中的萌发蛋白酶(GPR)切割位点选择具有以下序列的肽：Tyr-Glu-Ile-Ala-Ser-Glu-Phe，其中该切割位点是Glu和Ile之间的酰胺键。
首先，如下用一个四甲基罗丹明(TMR)标记对该肽进行标记：TMR-Tyr-Glu-Ile-Ala-Ser-Glu-Phe-Lys-酰胺这是用Genemed SynthesisInc(San Antonio，TX)的固相肽合成进行，其中还加入Lys残基以供随后连接上第二个染料基团。该标记肽通过高效液相色谱法(HPLC)纯化至99％纯度，并通过基质辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱进行确认。
随后，将上述单标记肽在含水溶液(100mM碳酸氢钠水溶液，pH9)中与5，6-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯(Molecular Probes，Eugene，OR)反应，以制备以下的双标记肽：
TMR-Tyr-Glu-Ile-Ala-Ser-Glu-Phe-Lys(TMR)-酰胺。所得的反应混合物通过HPLC进行纯化，并收集馏分供进行GPR酶促切割和荧光试验。
将嗜热脂肪地芽孢杆菌孢子制品在GFK(1mg/ml葡萄糖、1mg/ml果糖、3.3mg/ml氯化钾)中进行稀释至2.5×106的最终群体，并立即加入50uL培养基，该培养基每孔由45uL的Tris缓冲液(含0.2mM CaCl)和5uL的上述双标记的蛋白酶底物组成。随后将板放入50℃预热的Synergy 4读板机(BioTeck Instruments Inc，Winoski，VT)中并温育长达300分钟，其中荧光激发是在520nm波长处进行，发射是在580nm波长处进行。该时间进程中选定的所得荧光数据点汇总如下。
  分钟   无孢子   2.5E+06个孢子
  0   0.0   0.0
  30   145.0   242.0
  45   198.0   532.5
  60   269.0   782.5
  90   385.0   1168.0
  120   484.0   1442.0
  180   568.0   1909.5
  240   634.0   2257.0
  300   673.0   2443.0
这些结果表明，利用荧光标记肽序列进行的蛋白酶活性检测与样本中活细胞的存在是相关联的。
在不脱离本发明的范围和精神的前提下，本发明的各种修改和更改对本领域的技术人员而言将是显而易见的。应理解，本发明并不意图受本文给出的说明性实施例和实例的不当限制，这些实例和实施例仅以举例的方式给出，本发明的范围旨在仅受本文给出的权利要求书的限定。
本文引述的专利、专利文件和出版物的全部公开内容以其整体或者其各自的被指定的部分通过引用并入本文，犹如各自都单独地并入本文。

Claims (20)

1.一种灭菌指示组合物，其包含：
多个灭菌过程抗性孢子，所述孢子在其萌发和初始长出期间含有活性蛋白酶；
萌发培养基，其包含至少一种标记的蛋白酶底物和至少一种供所述孢子萌发的营养物；
其中所述培养基基本上不含a)所述多个孢子所含的活性蛋白酶以外的任何活性蛋白酶，和b)所述至少一种标记的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物、任何来源于所述多个孢子的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物、以及任何不与所述标记的蛋白酶底物竞争所述活性蛋白酶的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物；并且
其中所述至少一种标记的蛋白酶底物包含能被所述活性蛋白酶切割且标记有一种或多种染料基团的肽，所述染料基团中的至少一种在所述肽被所述活性蛋白酶切割时会发生可检测变化，并且其中所述标记的蛋白酶底物至少在用于温育所述孢子的温度下是稳定的。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多个灭菌过程抗性孢子选自嗜热脂肪地芽孢杆菌(Gb.stearothermophilus)、萎缩芽孢杆菌(B.atrophaeus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、以及它们的组合。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述活性蛋白酶当经历了刚好足以将至少1×105个孢子的群体降低到零个孢子的灭菌过程时只具有本底水平的活性，所述零个孢子是由无孢子长出测得；并且
当经历了足以将至少1×105个孢子的群体降低至少一个对数单位但降低到大于零个孢子的群体的灭菌过程时，具有大于本底水平的活性的活性水平；
其中活性水平由如下方法测量：
使有效量的所述至少一种标记的蛋白酶底物与所述活性蛋白酶反应，以产生所述一种或多种染料基团中的至少一种的可检测变化，并且
测量所述可检测变化。
4.根据权利要求1、2和3中任一项所述的组合物，其中所述活性蛋白酶是萌发特异性蛋白酶。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述标记的蛋白酶底物在用于温育所述孢子的至少60℃的温度下是稳定的。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述标记的蛋白酶底物是标记的蛋白质，其中所述蛋白质被所述活性蛋白酶切割。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述标记的蛋白酶底物选自标记的酪蛋白、标记的胶原、标记的明胶、标记的纤维蛋白原、以及它们的组合，以上每一种都基本上不含任何活性蛋白酶。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述可检测变化是荧光强度的变化。
9.一种灭菌过程指示器，其包括：
载体，其承载多个灭菌过程抗性孢子，所述孢子在其萌发和初始长出期间含有活性蛋白酶；
不能透过微生物且不能透过灭菌剂的容器，所述容器含有包括至少一种标记的蛋白酶底物和至少一种供所述孢子萌发的营养物的萌发培养基；
其中所述培养基基本上不含a)所述多个孢子所含的活性蛋白酶以外的任何活性蛋白酶，和b)所述至少一种标记的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物、任何来源于所述多个孢子的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物、以及任何不与所述标记的蛋白酶底物竞争所述活性蛋白酶的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物；并且
其中所述至少一种标记的蛋白酶底物包含能被所述活性蛋白酶切割且标记有一种或多种染料基团的肽，所述染料基团中的至少一种在所述肽被所述活性蛋白酶切割时会发生可检测变化，并且其中所述标记的蛋白酶底物至少在用于温育所述孢子的温度下是稳定的；并且
其中所述载体邻近所述容器且与所述萌发培养基隔开。
10.根据权利要求9所述的指示器，其中所述多个灭菌过程抗性孢子选自嗜热脂肪地芽孢杆菌、萎缩芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、生孢梭菌、凝结芽孢杆菌、以及它们的组合。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的指示器，其中所述活性蛋白酶当经历了刚好足以将至少1×105个孢子的群体降低到零个孢子的灭菌过程时只具有本底水平的活性，所述零个孢子是由无孢子长出测得；并且
当经历了足以将至少1×105个孢子的群体降低至少一个对数单位但降低到大于零个孢子的群体的灭菌过程时，具有大于本底水平的活性的活性水平；
其中活性水平由如下方法测量：
使有效量的所述至少一种标记的蛋白酶底物与所述活性蛋白酶反应，以产生所述一种或多种染料基团中的至少一种的可检测变化，并且
测量所述可检测变化。
12.根据权利要求9、10和11中任一项所述的指示器，其中所述活性蛋白酶是萌发特异性蛋白酶。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的组合物，其中所述标记的蛋白酶底物在用于温育所述孢子的至少60℃的温度下是稳定的。
14.根据权利要求9-13中任一项所述的指示器，其中所述标记的蛋白酶底物是标记的蛋白质，其中所述蛋白质被所述活性蛋白酶切割。
15.一种确定灭菌过程的有效性的方法，所述方法包括：
提供灭菌过程指示器，其包括：
载体，其承载多个灭菌过程抗性孢子，所述孢子在其萌发和初始长出期间含有活性蛋白酶；
不能透过微生物且不能透过灭菌剂的容器，所述容器含有包括至少一种标记的蛋白酶底物和至少一种供所述孢子萌发的营养物的萌发培养基；
其中所述培养基基本上不含a)所述多个孢子所含的活性蛋白酶以外的任何活性蛋白酶，和b)所述至少一种标记的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物、任何来源于所述多个孢子的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物、以及任何不与所述标记的蛋白酶底物竞争所述活性蛋白酶的蛋白酶底物以外的任何蛋白酶底物；并且
其中所述至少一种标记的蛋白酶底物包含能被所述活性蛋白酶切割且标记有一种或多种染料基团的肽，所述染料基团中的至少一种在所述肽被所述活性蛋白酶切割时会发生可检测变化，并且其中所述标记的蛋白酶底物至少在用于温育所述孢子的温度下是稳定的；并且
其中所述载体邻近所述容器且与所述萌发培养基隔开；
将所述灭菌过程指示器放置在灭菌箱中；
将所述灭菌过程指示器暴露于灭菌剂；
将所述多个灭菌过程抗性孢子和所述萌发培养基进行组合；
用所述萌发培养基温育所述孢子；
并且
如果存在的话，测量所述可检测变化。
16.根据权利要求15所述的方法，所述方法还包括通过测量用所述萌发培养基温育所述孢子之后所引起的如果存在的可检测变化，与用所述萌发培养基温育所述孢子之前相比较，来确定在将所述灭菌过程指示器暴露于灭菌剂之后是否有活孢子存在。
17.根据权利要求15所述的方法，所述方法还包括通过测量用所述萌发培养基温育所述孢子之后所引起的如果存在的可检测变化的速率，与用所述萌发培养基温育所述孢子之前相比较，来确定在将所述灭菌过程指示器暴露于灭菌剂之后是否有活孢子存在。
18.根据权利要求16或权利要求17所述的方法，其中确定是否存在少至100个活孢子，并且其中温育所述孢子进行不超过8小时。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的方法，所述方法还包括将待灭菌的制品与所述灭菌过程指示器一起放置在所述灭菌箱中。
20.根据权利要求19所述的方法，所述方法还包括确定所述灭菌过程对于所述制品的灭菌是否有效。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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