KR0163168B1 - 멸균 사이클의 효능을 빠르게 측정하기 위한 방법 및 고속판독의 생물학적 지시계 - Google Patents
멸균 사이클의 효능을 빠르게 측정하기 위한 방법 및 고속판독의 생물학적 지시계Info
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Abstract
내용 없음
Description
제1도는 폐쇄 장치(closure device)(26)를 제거한 본 발명의 멸균 지시계에 대한 구체예의 단면도이다.
제2도는 폐쇄 장치(26)가 포함된 제1도의 멸균 지시계의 분해 사시도이다.
제3도는 폐쇄 부위에 덮개(56)가 있는 본 발명의 지시계에 대한 바람직한 구체예의 단면도이다.
제4도는 제3도의 지시계의 분해 투시도이다.
제5도는 개구부위에 덮개(86)가 있는 본 발명의 멸균 지시계의 다른 바람직한 구체예의 단면도이다.
제6도는 제5도의 멸균 지시계의 분해 투시도이다.
제7도는 다양한 시간동안 멸균 사이클에 노출시킨 이후에 본 발명의 멸균지 시계의 배양 시간과 상대적인 형광도를 나타낸 그래프이다.
제8도는 다양한 시간 동안 멸균 사이클에 노출시킨 이후에 본 발명의 멸균 지시계의 배양 시간과 상대적인 형광도를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 멸균 사이클의 효능을 빠르게 측정하기 위한 방법에 관한 것이며, 특히 본 발명은 멸균 효능을 모니터하는데 일반적으로 사용되는 적어도 한 종류의 미생물(이하 시험 미생물로 정의함)의 생존과 활성이 연관될 수 있는 효소를 이용한다. 시험 미생물에 치사량 이하인 멸균 사이클 후 효소는 비교적 단시간(정상적으로 8시간 이하) 내에 효소 기질과 충분히 반응할 수 있도록 남아 있어야 한다. 그러나, 이 효소는 시험 미생물에 치사량인 멸균 사이클 후에는 불활성화되거나 활성이 현저히 감소한다. 또한, 본 발명은 상기 효소를 포함한 생물학적 멸균 지시계에 관한 것이다.
멸균의 효능을 측정하는데 사용하는 생물학적 지시계(biological indicator)와 화학적 지시계는 당업계에서 잘 공지되어 있다. 통상적인 생물학적 지시계에서는, 자연적인 오염에 의해 존재하게 되는 대부분의 유기체보다 멸균 공정에 몇배 더 내성이 있는 시험 유기체를 담체로 피복하여 멸균시킬 물체와 함께 멸균기에 넣는다. 멸균 사이클을 완료한 후, 이 담체를 영양 배지 중에서 배양하여 멸균 공정에서 생존한 시험 유기체가 존재하는지의 여부를 결정한다. 일반적으로 검출할 수 있는 수의 유기체 중식에는 최소한 24시간이 걸린다. 이 기간 동안에, 예상되는 멸균 물건은 검역해야만 한다.
그러나, 빈번히 시행하는 경우, 병원에서는 예상되는 멸균 물건을 적당하게 검역할 공간을 확보하지 못하고 있으며, 또한 실제 검역 가능한 물건 자체의 수도 충분치 않다. 그 결과, 예상되는 물건은 멸균이 적당하고 이후의 실험실 자료로 확인될 것이라는 가정하에 보관해 둔다.
시판되고 있는 화학적 지시계는 색 변화, 또는 고체에서 액체 상태로의 변화에 의해 멸균도를 나타내는 화학 물질을 사용하고 있다. 상기 화학적 지시계의 장점은 그 결과가 멸균 사이클의 종결에 의해 알려진다는 점이다. 그러나, 상기 결과는 미합중국 특히 제4,448,548호에 기술된 장치에서와 같이, 일정 기간 동안 특정 온도에 도달하거나 미국 특허 제4,348,209호에서와 같이 산화 에틸렌 가스가 존재하는 것만을 나타낸다. 상기 장치는 시험 유기체를 불활성화시키는데 필요한 모든 조건이 이루어졌는지의 여부는 나타내지 못한다. 단지 생존한 유기체만이 멸균 작용에 필요한 물리적 및 화학적 변수의 실제 관계를 감지할 수 있다. 따라서, 멸균 기술에 있어서 생물학적 시험이 가장 정확한 멸균 시험이라는 것이 인정되고 있다.
그러나, 빠른 결과를 제공하면서, 또한 시간, 온도 및 습기, 화학 물질 또는 방사선량의 상호 관련된 변수를 포함하여 멸균에 필요한 모든 변수가 이루어졌다는 높은 확신을 제공하는 멸균 지시계의 필요성은 여전히 남아 있다.
본 발명은 멸균 매체가 증기, 건조열, 방사선, 산화에틸렌 또는 기타 기체 또는 액체 작용제인 멸균 사이클의 효능을 측정하는 방법으로서, 통상의 생물학적 지시계의 신뢰성을 화학적 지시계의 속도에 근접한 속도와 조합시킨 멸균 사이클의 효능 측정 방법을 제공한다. 본 발명은 대부분의 경우, 8시간 이내에 멸균 실패를 나타낼 수 있는 멸균 효능의 지시 장치 및 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 하기의 a) 및 b)를 포함한다:
a) 멸균을 모니터하는데 일반적으로 사용되는 적어도 하나의 미생물의 생존력과 관련된 활성을 갖는 활성 효소원을 멸균 사이클에 적용시키는 단계; 및
b) 멸균 사이클의 완결 후, 잔류 활성 효소와 반응하여 검출 가능한 효소-변형 산물을 생성할 수 있는 효소의 기질 시스템의 유효량을 효소원과 배양하는 단계.
그 후 반응 혼합물을 형광계와 색도계 등으로 측정하여, 효소 변형 산물의 존재를 결정한다. 예정된 시간(효소와 기질의 종류, 각각의 농도 및 배양 조건에 따라 결정됨)내에 백그라운드 상에서 측정 가능한 효소 변형 산물의 존재는 멸균의 실패를 나타낸다. 예정된 시간내에 측정 가능한 효소 변형 산물의 부재는 시험 유기체에 치사량인 멸균 사이클을 나타내며 따라서 적합하다.
활성 효소원은 유기체로부터 분리한 정제 효소이거나, 또는 미생물이며, 이것은 그 자체가 멸균을 모니터하는데 일반적으로 사용되는 것일 수 있다(예: 바실러스 스테로서모필러스(Bacillus stearothermophilus) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis). 상기 미생물을 효소원으로 사용하는 경우, 본 발명의 방법은 다음 단계 c)를 포함할 수 있다:
c) 멸균 사이클의 완결 후 생존한 임의의 미생물을, 배양시 생존 미생물의 증식을 촉진할 수 있는 수성 영양 배지, 및 미생물 증식에 대한 반응으로 검출 가능한 변화를 일으킬 수 있는 검출기 물질과 함께, 생존 미생물의 증식을 촉진시키는데 적합한 조건하에서 배양하는 단계.
본 발명은 또한 상술한 방법을 실시함에 있어서 유용한 고속 판독 멸균 지시계를 제공한다. 하나의 그러한 멸균 지시계는 하기 a)와 b)를 포함한다:
a) 개구를 덮는 가스 투과성, 박테리아-불투과성 장치가 있는, 액체 불투과성이며 실질적으로 가스-비흡수성인 벽을 갖는 외부 용기로서, 이 용기는 그 내부에 적어도 하나의 개구(opening)를 갖는다.
b) 멸균을 모니터하는데 일반적으로 사용되는 적어도 하나의 미생물의 생존력과 활성이 관련되어 있는 분리된 활성 효소의 측정 가능한 양이 외부 용기내에 포함되어 있다.
기타 고속 판독이 가능한 멸균 지시계는 하기 a), b) 및 c)를 포함한다:
a) 적어도 하나의 개구를 내부에 포함하며, 그 개구를 덮고 있는 가스-투과성, 박테리아-불투과성 장치를 지니며, 액체 불투과성이며 실질적으로 가스 비흡수성인 벽을 갖는 외부 용기;
b) 외부 용기 내에 포함되어 있으며, 멸균을 모니터하는데 일반적으로 사용되는 적어도 하나의 미생물의 생존력과 관련이 있는 활성을 가진 측정 가능한 농도의 활성 효소원; 및
c) 외부 용기 내에 포함되어 있으며, 활성 효소와 반응하여 측정 가능한 효소-변형 산물을 생성할 수 있는 유효량의 효소 기질 시스템.
본 발명이 멸균 사이클의 효능을 빠르게 측정할 수 있는 것은 하기 1)과 2)의 발견에 기초한다:
1) 생존력이 효소 활성과 관련이 있는 시험 미생물을 거의 사멸시키는데 충분한 멸균 사이클 이후에도 어떤 효소는 활성 상태로 남아 있다는 사실; 및
2) 마지막 멸균 사이클 이후에, 효소 활성은 그 효소에 대한 기질 시스템을 비교적 단시간 내에(일반적으로는 약 8시간 이내) 측정 가능한 농도의 산물로 전환시키는데 충분하다는 사실.
시험 미생물을 효소원과 함께 또는 효소원으로 사용하는 경우, 매우 적은 수의 시험 미생물이 마지막 멸균 사이클에서도 생존할 수 있다. 그러나 불활성화된 미생물과 연관된 효소 활성이 멸균 실패를 나타내는데는 충분하다.
본 발명의 효소 측정법은 마지막 멸균 사이클에서 실패에 대한 안전 수단으로 작용하는데, 그 이유는 본 발명의 효소가 시험 미생물보다도 멸균 조건에 더 내성이 있기 때문이다. 불완전한 멸균 사이클에서, 측정 가능한 효소-변형 산물, 즉 효소 활성의 존재는 동일한 멸균 조건하에 처리하고 적어도 24시간 동안 영양 배지로 배양하는 경우, 시험 미생물의 생존 또는 생존력을 예측하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 실시예 유용한 효소는 세포외 및 세포내 효소를 비롯한 효소이며, 이것의 활성은 멸균 효능을 모니터하는데 일반적으로 사용되는 하나 이상의 미생물(이하 시험 미생물로 정의함)의 생존력과 상관관계가 있다. 상관관계는 백그라운드 위의 효소 활성이 시험 미생물의 장래의 증식을 예측하는데 사용될 수 있는 것을 의미한다. 이 효소는 시험 미생물에 치사량 이하인 멸균 사이클 이후에는 충분히 활성이 남아 있어서 24시간 이내에(바람직하게는 8시간 이하) 그 효소에 대한 기질 시스템과 반응하지만, 시험 미생물에 치사량인 멸균 사이클 이후에는 불활성화되거나 그 활성이 현저하게 감소하는 것이어야 한다.
하기의 시험은 본 발명의 멸균 모니터 장치 및 방법에 유용한 필수 요건을 갖는 효소들을 규명하는데 유용한 것으로 밝혀졌다. 이 효소는 1×106시험 미생물의 집단을 약 6log만큼 감소시키는데 충분한 멸균 조건에 처리하는 경우, 그 효소의 기질 시스템과 반응시켜서 측정시 백그라운드와 동일한 잔류 효소 활성을 갖게 된다; 그러나, 1×106시험 미생물의 집단을 1log 이상 6log 이하만큼 감소시키는데 충분한 멸균 조건에 처리하는 경우 이 효소는 효소 기질 시스템과 반응에 의해 측정시 백그라운드보다 더 큰 효소 활성을 갖는다. 효소 기질 시스템은 효소의 작용에 의해 측정 가능한(즉, 형광 또는 유색) 효소-변형 산물을 생성하는 물질, 또는 물질의 혼합물이다. 효소 활성은 생성된 측정 가능한 효소-변형 산물의 양으로 측정한다. 바람직하게는, 이 효소는 시험 미생물의 집단을 6log만큼 감소시키는데 불충분한 멸균 조건 이후에 충분한 활성을 갖고 있어서 효소 기질 시스템과 반응하여 24시간 이내에 (바람직하게는, 8시간 이하, 가장 바람직하게는 2시간 이내) 측정 가능한 양의 효소 변형 산물을 생성하는 것이다.
바람직하게는, 시험 미생물의 집단을 6log만큼 감소시키는데 불충분한 멸균조건 이후에 효소의 활성은 백그라운드보다 적어도 2퍼센트 이상이며, 더 바람직하게는, 적어도 5퍼센트 이상이며, 가장 바람직하게는 백그라운드 보다 적어도 10퍼센트 이상이다. 본 발명의 목적을 위하여 백그라운드로 정의한 잔류 효소활성 레벨은, 효소 전체가 비가역적으로 불활성화된 이후 효소 기질의 산물의 자발적인 전환에 의해 수득되는 것보다 높을 수 있다는 것이 이해된다.
상술한 시험을 만족하는 것으로 밝혀진 효소는 포자-형성 미생물의 가수분해 효소를 포함하나다. 상기 효소는 β-D-글루코시다제, α-D-글루코시다제, 알칼리성 포스파타제, 산성 포스파타제, 부티레이트 에스테라제, 카프릴레이트 에스테라제 리파아제, 미리스테이트 리파아제, 루이신 아미노펩티다제, 발린 아미노펩티다제, 키모트립신, 포스포히드롤라제, α-D갈락토시다제, β-D-갈락토시다제, α-L-아라비노푸라노시다제, N-아세틸-β-글루코사미니다제, β-D-셀로바이오시다제, 알라닌 아미노펩티다제, 프롤린 아미노펩티다제, 티로신 아미노펩티다제, 페닐아라닌 아미노펩티다제, β-D-글루쿠로니다제 및 지방산 에스테라제 등으로, 이것은 칸디다(Candida), 바실러스(Bacillus) 및 클로스트리디움(Clostridium) 종의 포자 형성 미생물로부터 유도된다.
특히 유용한 바실러스 스테로서모필러스의 효소는 α-D-글루코시다제, β-D-글루코시다제, 알칼리성 포스파타제, 산성 포스파타제, 부티레이트 에스테라제, 카프릴레이트 에스테라제 리파아제, 루이신 아미노펩티다제, 키모트립신, 포스포히드롤라제, α-D-가락토시다제, β-D-갈락토시다제, 알라닌 아미노펩티다제, 티로신 아미노펩티다제, 및 페닐알라닌 아미노 펩티다제 및 지방산 에스테라제를 포함한다. 특히 유용한 바실러스 서브틸리스의 효소는 α-L-아라비노푸라노시다제, β-D-글루코시다제, N-아세틸-β-글루코사미니다제, β-D-셀로바이오시다제, 알라닌 아미노 펩티다제, 프롤린 아미노펩티다제, 티로신 아미노펩티다제, 루이신 아미노펩티다제, 및 페닐알라닌 아미노펩티다제를 포함한다.
바실러스 서브틸리스의 β-D-글루코시다제 및 α-L-아라비노푸라노시다제는 산화에틸렌 멸균을 모니터하는데 특히 유용하다. 바실러스 스테로서모필러스의 α-D-글루코시다제는 증기 멸균 상태로 모니터하는데 특히 유용하다.
활성 효소원으로서는 다음과 같은 것들을 들 수 있다;
1) 적당한 미생물로부터 정제, 분리된 효소;
2) 효소가 유전 공학에 의해 첨가되거나 또는 고유한 미생물; 또는
3) 포자기 또는 증식기 동안 효소가 첨가된 미생물로서 그 결과, 효소가 미생물속에 삽입되거나 결합된 것, 예컨대 포자기 동안 포자내에 삽입되어 포자에 효소가 첨가된다. 본 발명의 실시에 유용한 효소원으로서 사용되는 미생물은 포자나 발육 상태에 있는 박테리아 또는 균류가 바람직하다. 특히 바람직한 효소원은 바실러스 클로스트리디움, 뉴로스포라(Neurospora) 및 칸디다(Candida) 종의 미생물이다.
미생물을 활성 효소원으로 사용하는 경우, 본 발명의 방법은 수용성 영양 배지 중에서 멸균 사이클의 완료 후 생존한 미생물을 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 단계는 멸균 상태가 지시계 내의 모든 미생물을 사멸시키는데 충분한지의 여부와 멸균 상태가 멸균기 내의 모든 물건을 멸균시키는데 충분한지의 여부를 나타내는 통상적인 기법에 의해 확인한다. 미생물의 증식을 효소 시험 결과를 확인하기 위하여 통상적인 방식으로 사용하는 경우, 이 미생물은 멸균 상태를 모니터하는데 통상적으로 사용되는 것이어야 한다. 이러한 통상적으로 사용되는 미생물은 일반적으로 자연 오염물질에 존재하는 대부분의 유기체보다도 멸균 공정에 몇 배 더 내성이 있다. 박테리아 포자는 미생물 생활 주기 중 가장 내성이 있는 형태로 인정되고 있다. 포자는 장치, 화학 물질 및 방법의 멸균 효능을 측정하는 모든 시험에 있어서 선택되는 생활형이다. 바실러스(Bacillus)와 클로스트리디아(Clostridia) 종의 포자는 포화 증기, 건조열, 감마선 방사 및 산화에틸렌을 사용한 멸균 공정을 모니터하는데 가장 일반적으로 사용된다.
멸균 상태를 모니터하는데 일반적으로 사용하는 특히 바람직한 미생물은 바실러스 스테로서모필러스와 바실러스 서브틸리스이다. 바실러스 스테로서모필러스는 증기 멸균 상태하에서 멸균도를 모니터하는데 특히 유용하다. 효소 α-D-글루코시다제는 바실러스 스테로서모필러스의 포자에서 확인되었으며, 이것의 예인 ATCC 8005와 ATCC 7953 등은 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션(Rockville, Maryland)으로부터 이용 가능하다. 바실러스 서비틸리스는 가스 및 건열 멸균 상태를 모니터하는데 특히 유용하다. 효소 β-D-글루코시다제는 바실러스 서브틸리스(예: ATCC 9372)에서 발견되었다.
또 다르게는, 분리된 효소를 사용하거나, 효소원으로 사용된 미생물이 자연적인 오염 물질보다 멸균 상태에 대해 내성이 적은 경우에는 멸균 상태를 모니터하는데 일반적으로 사용되는 다른 미생물을 효소원과 함께 멸균 사이클에 노출시킬 수 있다. 또한, 상기 경우에 있어서, 본 발명의 방법은 멸균 사이클 이후에 남아있는 생존 미생물을 수용성 영양 배지로 배양하여 멸균 효능을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
본 명세서에서는 주로 단일 효소 및/또는 미생물종의 관점에서 기술하고 있지만, 본 발명은 다수의 효소 및/또는 미생물 종의 사용에 대해서도 마찬가지로 언급되어야 한다. 예를 들면, 단일의 멸균 지시계는 3가지 유형의 분리효소(상기 3가지 유형의 미생물로부터 추출될 수 있다)를 포함하며, 제1효소는 내열성이 있으며, 제2효소는 가스 멸균 매체에 내성이 있고, 제3효소는 방사선(예: 감마선 및 베타선)에 내성이 있다. 유사하게는, 단일의 멸균 지시계는 3종의 미생물을 포함할 수 있는데, 제1종은 내열성이 있으며, 제2종은 가스 멸균 매체에 내성이 있고, 제3종은 방사선에 내성이 있다.
본 출원에서는, 효소 기질 시스템은 효소에 의해 자을 받아서 효소 변형 산물로 전환되는 물질 또는 물질의 혼합물로 정의된다. 일반적으로, 효소 변형 산물은 발광성, 형광성, 발색 또는 방사능 물질이다. 그러나, 효소 기질 시스템은 효소와 반응할 때 부가의 화합물 또는 조성물과 반응하여 발광성, 형광성, 발색 또는 방사능 물질을 산출하는 생성물을 생성하는 화합물로 구성될 수 있다. 바람직하게는 기질 시스템이 멸균시 지시계 장치내에 포함되어 있는 경우, 기질은 멸균시 또는 배양시 자연적으로 파괴되거나 측정 가능한 물질로 전환되지 않아야 한다. 예를 들면, 스팀 및 건열 멸균을 모니터하는 장치에 있어서, 기질은 약 20 내지 180℃ 사이의 온도에서 안정해야만 한다. 또한, 바람직하게는 효소 기질 시스템이 통상적인 성장 배지 내에 포함되어 있는 경우, 성장 배지내에서는 예컨대, 장연적으로 형광을 나타내지 않고, 성장 배지 내에서 안정해야만 한다.
선행 기술은 통상적으로 이용 가능하게 공지되었으며, 각종 효소적 방법에 사용되는, 다양한 기원의 효소를 측정하기 위한 수많은 형광 및 발생 기질을 포함한다(M. Roth, Methods of Biochemical Analysis, Vol. 17, D. Block, Ed, Interscience Publishers. New York, 1969, p.189; S. Udenfriend. Fluorescence Assay in Biology and Medicine. Academic Press. New York, 1962, p.312; and D.J.R. Lawrence, Fluorescence Techniques for the Enzymologist, Methods in Enzymology, Vol. 4, S.P. Colowick and N.O. Kaplan. Eds., Academic Press, New York, 1957, p.174).
두가지 기본적인 유형의 효소 기질 시스템이 특정 효소의 검출용으로 기술되어 있다. 첫 번째 유형의 기질 시스템은 형광체 또는 색원체일 수 있으며, AB 등의 화학식으로 나타낼 수 있다. 효소 작용에 의해 AB는 A+B으로 분해되며, B는 예컨대 형광성 또는 유색일 수 있다. 이러한 유형의 형광체 기질의 구체적인 예로는 4-메틸움벨리페릴 포스페이트가 있다. 효소 포스파타제의 존재시, 기질은 4-메틸움벨리페론과 포스페이트로 분해될 것이다. 기타 상기 유형의 형광체 기질은 4-메틸움벨리페릴, 7-아미도-4-메틸쿠마린, 인독실 및 플루오레세인의 유도체가 있으며, 이것은 하기에 기술하였다. 이러한 유형의 색원체 기질의 예로는 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트가 있다. 포스파타제의 존재시, 이 기질은 인디고블루와 포스페이트로 분해될 것이다. 기타 상기 유형의 색원체 기질은 5-브로모=-4-클로로-3-인돌릴, 니트로페놀 및 페놀프탈레인의 유도체를 포함하며, 하기에 기술하였다.
효소 검출용으로 일반적으로 사용되는 두 번째 유형의 기질 시스템은 화학식 CD로 나타내며, 가령 이것은 특정한 효소에 의해 C+D로 전환될 것이다. 그러나 C나 D 어느 것도 형광성 또는 유색이 아닐 것이며, 단, D는 화합물 Z와 더 반응하여 형광성 또는 유색의 화합물을 제공하며, 따라서 효소 활성을 나타내게 된다. 이러한 유형의 특정한 형광체의 예로는 아미노산 리신을 들 수 있다. 효소 리신 디카르복실라제의 존재시, 리신은 CO2한 분자를 이탈시킨다. 남아있는 리신의 부분을 카다베린이라고 부르는데, 이것은 강 염기이다. 4-메틸움벨리페론같은 염기성 지시계는 강염기의 존재하에 결합되어 형광을 발할 것이다. 이러한 유형의 색원체 기질에는 2-나프틸 포스페이트가 있다. 효소 포스파타제는 기질과 반응하여 β-나프톨을 생성한다. 방출된 β-나프톨은 1-디아조-4-벤조일아미노-2,5-디에톡시 벤젠을 포함한 색원체 시야(시그마 케미칼에서 Fast Blue BB Salt로 시판함)과 반응하여 보라색을 나타낸다. 기타 이러한 유형의 실례는 하기에서 나프틸 유도체로 기술되어 있다.
따라서, 상기 내용으로부터, 여러 방법을 통하여 미생물 중의 특정 효소 존재를 측정하는 것이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
바람직한 효소 기질 시스템은 형광체이며, 본 명세서에서는 효소에 의해 변형되어(예: 가수분해) 다소 변화되거나 또는 증가된 형광성을 갖는 유도체 형광단을 생성할 수 있는 화합물로 정의한다.
형광체 화합물은 그 자체가 비-형광체이거나 메타-형광체(즉, 상응하는 효소-변형 산물과는 색 또는 강도면에서 명백하게 상이한 방식으로 형광을 나타내는 형광체)이며, 여기(excitation) 및 검출에 적당한 과장은, 형광 기기 사용자에게 잘 공지된 방법으로, 존재할 수 있는 기타 형광체로부터 효소 변형에 의해 나타나는 형광 시그날을 분리하는데 사용된다.
종래의 기술은 공지되고 통상적으로 이용 가능한 다양한 기원의 효소에 대한 수많은 형광체 기질을 포함하는데, 이것은 효소학적 방법에서 사용된다. 그 중에서 형광체 4-메틸움벨리페릴 유도체(가수분해되어 4-메틸움벨리페론이 됨); 7-아미드-4-메틸-쿠마린(영국 특허 제1,547,747호와 유럽 특허 제0,000,063호(Ajinomoto)를 참고로 함); 디아세틸 플루오레세인 유도체; 및 플루오레스카민이 있다.
유용한 4-메틸울벨리페릴 유도체는 다음 화합물을 포함한다:
4-메틸움벨리페릴-2-아세트아미도-4 ;
6-0-벤질리덴-2-데옥시-β-D-글루코피라노사이드 ;
4-메틸움벨리페릴 아세테이트 ; 4-메틸움벨리페릴-N-아세틸-β-D-갈락토사미니드 ; 4-메틸 움벨리페릴-N-아세틸-α-D-글루코사미니드 ; 4-메틸움벨리페릴-N-아세틸-β-D-글루코사미니드 ; 2'-(4-메틸움벨리페릴)-α-D-N-아세틸뉴라민산 ; 4-메틸움벨리페릴 α-L-아라비노푸라노사이드 ; 4-메틸움벨리페릴 α-L-아라비노사이드 ; 4-메틸움벨리페릴 부티레이트 ; 4-메틸움벨리페릴 β-D-셀로바이오사이드 ; 메틸움벨리페릴-β-D-N,N'-디아세틸 키토바이오사이드 ; 4-메틸움벨리페릴 엘라이데이트 ; 4-메틸움벨리페릴 β-D-푸코사이드 ; 4-메틸움벨리페릴 α-L-푸코사이드 ; 4-메틸움벨리페릴 β-L-푸코사이드 ; 4-메틸움벨리페릴 α-D-갈락토사이드 ; 4-메틸움벨리페릴 β-D-갈락토사이드 ; 4-메틸움벨리페릴 α-D-글루코사이드 ; 4-메틸움벨리페릴 β-D-글루코사이드 ; 4-메틸움벨리페릴 β-D-글루쿠로나이드 ; 4-메틸움벨리페릴 P-구아니디노벤조에이트 ; 4-메틸움벨리페릴 헵타노에이트 ; 4-메틸움벨리페릴 α-D-만노피라노사이드 ; 4-메틸움벨리페릴 β-D-만노피라노사이드 ; 4-메틸움벨리페릴 올레에이트 ; 4-메틸움벨리페릴 팔미테이트 ; 4-메틸움벨리페릴 포스페이트 ; 4-메틸움벨리페릴 프로피오네이트 ; 4-메틸움벨리페릴 스테아레이트 ; 4-메틸움벨리페릴설페이트 ; 4-메틸움벨리페릴 β-D-N,N',N-트리아세틸키토트리오스 ; 4'-메틸움벨리페릴 2,3,5-트리-O-벤조일-α-L-아라비노푸라노사이드 ; 4-메틸움벨리페릴-P-트리메틸암모늄 신나메이트 클로라이드 ; 및 4-메틸움벨리페릴 β-D-크실로사이드.
유용한 7-아미도-4-메틸쿠마린 유도체는 하기의 화합물을 포함한다:
L-알라닌-7-아미도-4-메틸쿠마린 ;
L-프롤린-7-아미도-4-메틸쿠마린 ;
L-티로신-7-아미도-4-메틸쿠마린 ;
L-루이신-7-아미도-4-메틸쿠마린 ;
L-페닐알라닌-7-아미도-4-메틸쿠마린 ; 및
7-글루타릴 페닐알라닌-7-아미도-4-메틸쿠마린.
유용한 7-아미도-4-메틸쿠마린의 펩타이드 유도체는 하기의 화합물을 포함한다.
N-t-BOC-lle-Glu-Gly-Arg-7-아미도-4-메틸쿠마린 ;
N-t-BOC-Leu-Ser-Thr-Arg-7-아미도-4-메틸쿠마린 ;
N-CBZ-Phe-Arg-7-아미도-4-메틸쿠마린 ;
Pro-Phe-Arg-7-아미도-4-메틸쿠마린 ;
N-t-BOC-Val-Pro-Arg-7-아미도-4-메틸쿠마린 ; 및
N-글루타릴-Gly-Arg-7-아미도-4-메틸쿠마린.
유용한 디아세틸 플루오레세인 유도체는 플루오레세인 디아세테이트, 플루오레세인 디-(β-D-갈락토피라노사이드), 및 플루오레세인 디라우레이트를 포함한다.
활성을 측정할 효소가 예컨대, 바실러스 스테로서모필러스의 α-D-글루코시다제, 키모트립신, 또는 지방산 에스테라제인 경우, 형광체 효소 기질은 가장 바람직하게는 4-메틸움벨리페릴-α-D-글루코사이드, 7-글루타릴페닐알라닌-7-아미도-4-메틸쿠마린, 또는 4-메틸움벨리페릴 헵타노에이트이다. 활성을 측정할 효소가 에컨대, 바실러스 서브틸리스에서 유도된 α-L-아라비노푸라노시다제인 경우, 가장 바람직한 형광체 효소 기질은 4-메틸움벨리페릴-α-L-아라비노푸라노사이드이다. 활성을 측정할 효소가 바실리서 서브틸리스에서 유도된 β-D-글루코시다제인 경우, 가장 바람직한 형광체 효소 기질은 4-메틸움벨리페릴-β-D글루코사이드이다.
다른 유용한 효소 기질 시스템은 효소에 의해 변형되어 유도체 색소단을 생성하거나, 또는 다른 화합물과 반응하여 유도체 색소단(이 색소단은 상이하거나 더 강한 색을 갖는다)을 제공할 수 있는 색원체 화합물이다. 색원체 화합물 그 자체는 상응하는 효소변형 산물과는 색이나 강도의 면에서 명확하게 상이하게 유색이거나 무색이다. 색도측정기 사용자에게 잘 공지된 방식으로, 적당한 여기 및 검출 파장을 사용하여, 존재할 수 있는 어떤 다른 색으로부터 효소 변형에 의해 전개된 발색 시그날을 분리한다.
수많은 색원체 기질이 효소학적 방법에서 사용되고 있다. 그 중 유용한 색원체 기질은 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 유도체; 니트로페닐 유도체; 인독실 유도체; 및 페놀프탈레인 유도체이다.
유용한 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 유도체는 5-브로모-6-클로로-3-인돌릴 아세테이트, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 아세테이트, 5-브로모-4-클로로-3-인독실-β-D-갈락토피라노사이드, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-1,3-디아세테이트, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-푸코피라노사이드, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루코피라노사이드, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루쿠론산, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트, 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 설페이트이다.
유용한 니트로페닐 유도체는 p-니트로페놀과 O-니트로페놀 유도체를 포함한다. 특히 유용한 p-니트로페놀은 디에틸-p-니트로페닐 포스페이트 ; 디-p-니트로페닐 포스페이트 ; p-니트로페닐-2-아세트아미도-2-데옥시-3-O-β-칼락토피라노실-β-글루코피라노사이드 ; p-니트로페닐-2-아세트아미도-2-데옥시-β-글루코피라노사이드 ; p-니트로페닐 아세테이트 ; p-니트로페닐-N-아세틸-β-D-글루코사미니드 ; p-니트로페닐-β-D-N,N'-디아세틸 키토바이오사이드 ; p-니트로페닐-α-글루코피라노사이드 ; p-니트로페닐-β-말토사이드 ; p-니트로페닐-α-말토사이드 ; p-니트로페닐-α-만노피라노사이드 ; p-니트로페닐-β-만노피라노사이드 ; p-니트로페닐 미리스테이트 ; p-니트로페닐팔미테이트 ; p-니트로페닐 포스페이트 ; 비스(p-니트로페닐)포스페이트 ; 트리스(p-니트로페닐)포스페이트 ; p-니트로페닐-β-글루코피라노사이드 ; p-니트로페닐-β-글루쿠로나이드 ; α-p-니트로페닐글리세린 ; p-니트로페닐-α-람노피라노사이드 ; p-니트로페닐 스테아레이트 ; p-니트로페닐설페이트 ; p-니트로페닐-2, 3, 4, 6-테트라-o-아세틸-β-글루코사미니드 ; p-니트로페닐 티미딘 모노포스페이트 ; p-니트로페닐-2,3,4-트리-o-아세틸-β-글루쿠론산 메틸에스테르 ; 및 p-니트로 페닐 발러레이트이다.
특히 유용한 O-니트로페놀류는 O-니트로페닐 아세테이트, O-니트로페닐-β-글루코사이드 및 O-니트포페닐-β-D-글루코피라노사이드이다. 기타 특히 유용한 니트로페닐 유도체는 니트로페닐-β-푸코피라노사이드 ; 니트로페닐-α-갈락토피라노사이드 ; 니트로페닐-β-갈락토피라노사이드 ; 니트로페닐 부티레이트 ; 니트로페닐 카프레이트 ; 니트로페닐 카프로에이트 ; 니트로페닐 카프릴레이트 ; 니트로페닐 라우레이트 ; 및 니트로페닐 프로피오네이트이다.
유용한 인독실 유도체는 인독실-아세테이트; 인독실-β-D글루코사이드; 3-인독실 설페이트; 3-인독실 포스페이트를 포함한다.
유용한 페놀프탈레인 유도체는 다음과 같다:
페놀프탈레인 디부티레이트 ; 페놀프탈레인 디포스페이트 ; 페놀프탈레인 디설페이트 ; 페놀프탈레인 글루쿠론산 ; 페놀프탈레인 모노-β-글루코시드유론산 ; 페놀프탈레인 모노-β-글루쿠론산 ; 및 페놀프탈레인 모노-포스페이트.
상술한 색원체 기질 모두는 적당한 효소와 직접 반응하여 색소단을 생성할 것이다.
1-나프틸, 2-나프틸 및 나프틸-AS-BI유도체를 포함한 부가의 효소기질은, 유도체 효소 변형 산물의 색원체 시약과 더 반응하여 색소단을 생성하는 경우 유용하게 이용된다. 상기 색원체 시약으로는 디아조화 염료(예, 1-디아조-4-벤조일아미노-2, 5-디에톡시벤젠(시그마 케미칼사에서 Fast Blue BB Salt로 시판됨), 1-디아조-4-벤조일아미노-2,5-디에톡시벤젠, p-디아조-2,5-디에톡시-N-벤조일알라닌, 4-클로로-2-메틸벤젠 디아조늄 클로라이드, 및 O-아미노 아조톨루엔 디아조늄염이 있다.
특히 유용한 1-나프틸 유도체는 1-나프틸-N-아세틸-β-D-글루코사미니드를 포함한다.
특히 유용한 2-나프틸 유도체는 2-나프틸-포스페이트 ; 2-나프틸-부티레이트 ; 2-나프틸-카프릴레이트 ; 2-나프틸-미리스테이트 ; L-루이실-2-나프틸아미드; L-발릴-2-나프틸아미드 ; L-시스틸-2-나프틸아미드 ; N-벤조일-DL-아르기닌-2-나프틸아미드 ; N-글루타릴-페닐알라닌-2-나프틸-아민 ; 2-나프틸-포스페이트 ; 6-Br-2-나프틸-α-D-갈락토피라노사이드 ; 2-나프틸-β-D-갈락토피라노사이드 ; 2-나프틸-2-D-글루코피라노사이드 ; 6-브로모-2-나프틸-β-D-글루코피라노사이드 ; 6-브로모-2-나프틸-2-D-만노피라노사이드 ; 및 2-나프틸-α-L-푸코피라노사이드를 포함한다.
특히 유용한 나프틸-AS-BI 유도체는 나프틸-AS-BI-포스페이트 ; 및 나프틸-AS-BI-β-D-글루쿠로나이드를 포함한다.
활성을 측정할 효소가 예컨대, 바실러스 스테로서모필러스에서 유도된 α-D-글로코시다제인 경우, 색원체 효소 기질은 가장 바람직하게는 P-니트로페닐-α-글루코피라노사이드이다. 또한 활성을 측정할 효소가 바실러스 서브틸리스에서 유도된 α-L-아라비노푸라노시다제인 경우는, P-니트로페닐-α-L-아라비노푸라노사이드가 가장 바람직한 색원체 효소 기질이다. 활성을 측정할 효소가 바실러스 서브틸스에서 유도된 β-D-글루코시다제인 경우는, p-니트로페닐-β-D-글루코피라노사이드가 가장 바람직한 색원체 효소기질이다.
본 발명의 방법을 수행하기 위해서는, 작동자가 활성을 측정할 효소와 효소기질에 관해 필수적으로 지식이 있어야 하며, 여기서 효소 기질은 효소와 반응하여 형광성, 색 등에 의해 측정될 수 있는 산물을 생성하여야 한다(참고, M. Roth, Method of Biochemical Analysis, Vol. 7, D. Glock, Ed., Interscience Publishers, New York, N.Y., 1969).
사용하기에 적당한 효소 기질은 활성을 연구하고 있는 효소의 종류에 의해 결정될 것이다. 바람직한 수많은 형광체 및 색원체 효소 기질과, 그 기질과 반응하여 다소 변화되거나 증가된 형광성 또는 색을 갖는 산물을 생성하는 효소를 하기에서 나열하고 있다.
효소와 그것의 적당한 효소 기질은 완충 수용액 중에서 반응한다. 완충용액의 이온 조건은 효소와 효소 기질에 영향을 주지 않아야 한다. 바람직하게는 포스페이트 완충 염수용액, 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄-HCl-용액, 또는 아세테이트 완충액 등의 등장성 완충액이 선택된다. 상기의 바람직한 등장성 완충액은 대부분의 형광체 및 색원체 효소 기질과 혼화할 수 있다. 완충액 선택시 다른 고려사항은 효소 활성에 대한 영향이다. 예를 들면, 인산염 완충 식염수는 고농도의 무기 포스페이트를 포함하는데, 이것은 알칼리성 포스파타제의 강력한 경제적 억제제이다. 따라서 상기 효소의 경우, Tris-HCl 완충액이 적당하다.
반응 혼합물 중에 존재하는 효소기질의 농도는 특정한 기질과 효소의 종류, 기기에 의해 또는 가시적으로 측정할 수 있도록 생성되는 효소-산물의 양, 반응혼합물 중에 활성 효소가 존재하는지 여부를 결정하기 위해 기다려야 하는 시간 등에 따라 결정된다. 바람직하게는, 효소기질의 양은 멸균 사이클 후 약 8시간 이내에 잔류한 활성 효소와 반응하는데 충분하여, 적어도 1×10 몰의 효소-변형 산물이 생성될 수 있는 양이다. 효소 기질이 4-메틸움벨리페릴 유도체인 경우, 완충 수용액 중의 농도는 약 1×10 내지 1×10 몰 사이인 것이 바람직하다.
또한 효소 기질을 함유한 수용액은 어떤 염기성 형광체 기질의 자동 형광발생을 방지하기 위하여, pH를 약 5.0 내지 9.5, 바람직하게는 약 7.5로 조절하는 것이 바람직하다.
완충 수용액 중의 효소 기질은, 멸균 사이클로 효소원을 처리한 후, 그 활성을 측정할 수 있도록 효소원과 함께 배양한다. 일부 효소의 활성이 남아 있다고 간주하고, 측정가능한 양의 효소변형 산물을 방출하는데 충분한 상태에서 그리고 충분한 시간동안 배양시킨다.
일반적으로, 공지된 방법에 의해 측정될 수 있는 산물의 양은 적어도 1×10 몰이다. 바람직하게는, 적어도 1×10 몰, 더 바람직하게는 약 1×10 내지 1×10 몰의 효소변형 산물을 생성할 수 있도록 배양조건이 충분해야 한다. 검출 가능한 양의 효소 변형 산물을 생성하는데 필요한 배양 시간과 온도는, 효소 및 기질의 종류, 및 반응 혼합물 중에 존재하는 각각의 농도에 따라 결정된다. 일반적으로, 필요한 배양시간은 약 1분 내지 12시간이며, 배양 온도는 약 20∼70℃이다. 바람직하게는, 바실러스 서브틸리스 또는 바실러스 스테로서모필러스가 효소원인 경우, 필요한 배양시간은 약 10분 내지 3시간이며, 필요한 배양 온도는 각각 약 30 내지 40℃ 및 약 52 내지 65℃이다.
일반적으로 생화학적 분석에 사용될 수 있는 효소 변형 산물을 측정하기 위한 방법으로는 측광법, 전위차법, 비중법, 열량계법, 전기전도법 및 전류법 등이 있다. 본 발명의 목적을 위해서는 검출가능한 효소 변형산물의 측정에 형광법과 분광광도법이 바람직하다. 예를 들면, 특정한 효소 기질은 4-메틸움벨리페릴 유도체를 포함할 수 있는데, 이것은 효소와 작용시 형광법으로 모니터할 수 있는 움벨리 페론을 산출하고, 또는 상기 기질은 니트로페놀이나 그와 유사한 유형의 유도체를 포함할 수 있는데, 이것은 효소와 작용하여 색도 측정법으로 모니터할 수 있는 유색의 산물을 산출한다.
본 발명의 방법은 매우 빠른 효소활성 검출법을 제공하는데, 이것은 미생물의 생존이 가능한 상태를 예측하며, 따라서 멸균 효능을 예측하는데 사용할 수 있다. 일반적으로 사용되는 효소 측정시험은 약 10분 내지 3시간, 대개는 약 30분 내지 90분 동안의 비교적 짧은 배양 시간으로 분광광도법 등에 의해 검출하는데 충분한 효소변형 산물을 제공할 수 있다.
본 발명의 방법을 실시하는데 유용한 가장 간단한 형태의 멸균도 지시계는 액체 불투과성이고 실질적으로 가스-비 흡수성인 벽으로 이루어진 용기내에 활성 효소원을 포함하고 있다. 상기의 용기는 적어도 하나의 개구를 갖고 있어서, 멸균 매체가 들어와서 효소와 접촉할 수 있도록 하며, 가스-투과성, 박테리아-비투과성 장치가 개구를 덮고 있다. 선택적으로, 지시계는 용기내에 하기의 것들을 포함할 수 있다.
1) 효소원으로서 또는 효소원에 첨가되어 멸균 효능을 모니터하는데 일반적으로 사용되는 미생물;
2) 활성 효소원 단독 또는 멸균 내성 미생물과의 조합물을 피복한 담체;
3) 활성 효소에 대한 기질 및 효소와 그것의 기질용 수용성 반응배지; 및
4) 멸균내성 미생물을 사용하는 경우, 영양 증식배지 및 증식 지시계.
멸균 지시계는 미합중국 특허 번호 제3,346,464호; 제3,585,112호; 제3,846,242호; 제4,291,122호; 제4,461,837호; 제4,416,984호; 제4,596,773호; 제3,440,144호; 제4,528,268호; 제2,854,384호; 제3,239,429호; 제3,752,743호; 제4,304,869호; 제4,579,823호; 및 제4,580,682호에 기술된 것과 유사하며, 본 발명의 실시예 유용한 효소를 멸균 내성 미생물 대신에, 또는 그것에 부가하여 함유하는 경우 유용하게 사용될 수 있다.
하기의 서술은 출원인의 바람직한 구체예에 관한 것이다. 하기 장치의 여러 가지 변형이 가능하며 이것은 본 발명의 범위에서 벗어나지 않을 것이다.
제1도와 제2도를 참고로, 바람직한 멸균 지시계는 실린더형 관(10)내에 외부용기가 있으며, 이것은 가스-비흡수성 및 액체 불투과성 벽(12)과 개구 말단(14)을 포함하고 있다. 관(10)은 미리 결정된 양의 분리된 활성 효소 및/또는 미리 결정된 수의 생존 미생물을 함유하는 필터 페이퍼 스트립과 같은 효소 담체(16)를 포함한다. 또한 관(10)은 완충액(20) 중에 용해 또는 현탁된 적당한 효소 기질과, 선택적으로, 수용성 영양 증식배지를 함유하는 부서지기 쉬운 유리 앰플의 봉합된 개압성 내부 용기(18)를 포함한다. 바람직하게는, 이 효소 기질은 약 20 내지 180℃ 온도에서 안정하며, 따라서 활성효소와 반응하여 발광성, 형광성, 유색 또는 방사능 물질을 생성할 수 있다. 수용성 영양 배지는 배양시 미생물과 접촉할 때 생존 미생물의 증식을 촉진할 수 있다. 내부용기(18)는 외부용기(10)내에 바싹 달라 붙어 유지되어 있어서 외부 용기 체적중 조금도 채워지지 않은 채로 남아있지 않는 것이 바람직하다. 유리앰플(18)은 필터페이퍼 담체(16)에 의해 관(10)의 벽(12)으로부터 분리되어 있다. 관(10)의 개구 말단(14)은 가스-투과성, 박테리아-비투과성 폐쇄부(22)(예: 시이트)로 장치되어 있다. 시이트(22)는 구멍(28)을 거쳐 캡(제1도에서는 제거되어 있음)과 같은 폐쇄 장치(26)를 수단으로 하여, 열 봉합 또는 접착 봉합으로 관(10)의 개구말단(14)을 봉한다. 가스 멸균제로 멸균하는 동안, 시이트(22)를 투과하여 외부 용기의 속을 거쳐 효소 딤체(16)에 접촉한다.
제2도에서 볼 수 있는 바와 같이, 제1도의 장치는 관(10)의 개구말단(14)으로 활성 효소 담체(16)와 플랜지형 유리 앰플(18)을 차례로 삽입하고, 개구말단(14)상에 시이트(22)를 올려 놓음으로써 시이트(22)로 관의 개구 말단(14)을 봉한 후 관(10)을 막을 때 시이트(22)상에 캡(26)을 올려놓는다.
외부용기(10)는 증기 멸균기 중의 고온에 견딜 수 있는 물질로 제조되었다. 일반적으로 통상적인 스팀 멸균기는 121∼135℃의 온도이다. 또한 용기(10)의 벽은 가스와 액체에 대해 거의 불투과성이어야 한다. 외부 용기(10)는 생존 미생물 또는 분리된 활성효소로 피복되는 담체(16)를 포함하며, 그 안에 잔류한 활성 효소가 개압성 내부용기(18) 중에 포함한 효소 기질과 반응하는데, 상기 외부용기는 지시계 장치를 분리하지 않고도 형광이나 색의 변화를 가시적으로 관찰할 수 있도록 반투명(투명도 포함됨)한 것이 바람직하다. 또한 충분히 변형 가능하여, 외압으로 외부 구획(10)이 변형되었을 때 개압성 내부 구획(18)이 파열될 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 용기(10)는 사출주형 또는 폴리 카르보네이트, 폴리프로필렌, 폴리아미드, 폴리메틸펜텐 및 각종 폴리에스테르를 비롯한 압출에 적합한 물질로 이루어질 수 있다. 폴리프로필렌이 바람직한 물질이다. 상기 물질들은 증기 또는 건열 멸균 사이클에 충분히 내성이 있으며 가스 멸균매체에 비흡수성이며, 액체-불투과성, 반투명 또는 투명하고, 변형성이 있다.
폐쇄 장치(26)는 멸균온도에 견딜 수 있는 임의의 물질로 이루어질 수 있다. 용기(10)의 경우, 적당한 물질은 폴리 카르보네이트, 폴리프로필렌, 폴리아미드, 폴리메틸펜텐 및 각종 폴리에스테르류이며, 그 중 폴리프로필렌이 바람직하다.
일반적으로 본 발명에 사용되는 분리된 활성 효소 및/또는 미생물은 적당한 담체(16)로 수송된다. 그러나 효소 및/또는 미생물이 외부 용기(10)의 내벽이나 내부용기(18)의 외벽으로 수송되는 것도 고려된다. 그러나 분리된 효소 및/또는 미생물은 동일한 또는 별도의 효소 담체로 수송되는 것이 바람직하다. 효소 담체는 필터 페이퍼 등 흡수성 있는 것이 바람직하며, 미생물 증식이나 효소 활성을 억제하지 않아야만 한다. 직물, 부직 폴리프로필렌, 레이온 또는 나일론 및 미공성 중합체 물질 등 시이트-유사 물질이 특히 바람직하다. 그러나, 금속 호일 물질, 예컨대 알루미늄 또는 스테인레스 스티도 사용되며, 유리(예: 유리 비드 또는 유리 섬유), 자기 또는 플라스틱도 사용된다. 또한, 효소 담체는 플라스틱이나 유리 이면(backing) 스트립에 보유된 페이퍼 등의 물질의 배합물로 이루어질 수 있다.
재생성을 위하여, 외부 용기(10)는 소정 양의 활성 효소를 포함하는 것이 바람직하다. 이것은 염 분류법, 크로마토그래피 및 전기영동 등의 일반적인 단백질 정제법을 사용하여 효소를 분리함으로써 용이하게 달성된다(참고, Colowick, S., 및 Kaplan, N.O. (Eds), Methods in Enzymology, Academic Press, New York, Vols.Ⅰ-Ⅶ, 1957-1964).
바람직하게는, 분리 효소의 초기 농도는 약 1×10 내지 5×10 유니트, 더 바람직하게는 약 1×10 내지 5×10 유니트, 및 가장 바람직하게는 약 1×10 내지 1×10 유니트이다. 미생물을 사용하는 경우, 소정의 수의 미생물을 사용하는 것이 바람직하다. 이것은 공지된 부피의 포자농도를 갖는 포자 현탁액을 제조하고, 소정의 현탁액 소량으로 담체(16)(예: 필터 페이퍼)를 습윤화시키고 및 담체를 건조시킴으로써 박테리아나 균류 포자를 얻을 수 있다. 이 방법은 담체성에 포함된 적당한 수의 포자를 용이하게 측정할 수 있도록 한다. 또한 기타 방법도 사용할 수 있다. 미생물을 효소원으로 사용하는 경우, 사용되는 미생물 집단은 그 유기체 중의 효소활성에 의해 결정된다. 이 효소 활성은 배양조건과 미생물 균주의 선택에 따라 결정되지만, 미생물 집단에 의해 조절될 수도 있다. 미생물이 바실러스 스테로서모필러스이거나 바실러스 서브틸리스인 경우, 충분한 효소를 생성하는데 필요한 미생물의 수는 약 1×10 내지 1×10 이다. 효소원이 바실러스 스테로서모필러스인 경우는 약 1×10 내지 1×10 의 미생물이 바람직하다. 효소원이 바실러스 서브틸리스인 경우는 약 1×10 내지 1×10 의미생물이 바람직하다.
미생물을 활성 효소원으로 사용하는 경우, 장치의 배양은 측정 가능한 효소 변형 산물을 생성하는데 필요한 시간 이후 계속 지속하여, 통상적인 기술에 의해 멸균 상태가 지시계 중의 모든 미생물을 충분히 죽일 수 있는지 여부를 확인하며, 또한 멸균기 중의 모든 품목이 충분히 멸균되었는지를 나타낸다. 미생물의 증식을 효소시험 결과를 확인하기 위한 통상저인 방식에 사용하는 경우 미생물은 멸균 상태를 모니터하는데 사용하는 것 중 하나일 것이다. 미생물을 사용하면 자연적인 오염물질이 있는 대부분의 유기체를 사용하는 것보다 멸균 공정에 몇 배 더 내성을 갖는다. 바람직한 미생물은 바실러스 스테로서모필러스와 바실러스 서브틸리스이다.
선택적으로, 분리 효소를 사용하거나, 활성 효소원으로서 사용하는 미생물이 자연적인 오염물보다 멸균 상태에 더 많은 내성을 갖지 않는다면, 멸균 상태를 모니터하는데 일반적으로 사용되는 다른 미생물이 용기(10)내에 포함될 수 있다. 상기의 장치에서 분리효소나 유용한 효소를 유출해 내는 미생물을 사용하여 배양이후 10분 내지 3시간 이내에 효소 활성도를 판독할 수 있으며, 미생물을 사용하면 적어도 24시간 동안 영양 배지 중에서 더 배양하여 효소 활성도 결과를 확인할 수 있다.
정상적으로는, 적당한 효소 기질의 수용액이 개압성 내부 용기(18) 중에 포함된다. 그러나 건조형(dry form)의 효소 기질이 효소 담체(16)를 거쳐 외부 용기(10)중에 포함되도록 하는 것도 고려되었다. 사실상, 활성 효소와 그것의 기질은 동일한 담체(16)에서 건조형으로 존재할 수 있다. 이러한 구조에서는, 내부 용기(18)가 활성 효소와 그것의 기질이 반응하는데 필요한 반응 배지를 운반하는 것이 바람직하다.
멸균을 모니터하는데 일반적으로 사용하는 미생물은 장치 중에 포함되어 있으며(활성 효소원으로서, 또는 활성 효소원에 부가하여 제공됨), 통상적인 방법으로 미생물 생존의 확인하는 것이 요구되며, 내부 용기(18)는 효소 기질 및 영양 증식 배지 용액을 함유한다. 영양 증식배지는 대부분의 형광체 및 색원체 효소 기질과 상용하는 것이 바람직하며 이것은 효소에 대한 경쟁적 억제제가 아니다. 본 발명에 유용한 영양 배지의 종류는 널리 공지되어 있다. 바람직한 영양배지의 예는 대두(soybean)-카제인 소화 브로쓰(broth), 트리글로콜레이트와 덱스트로즈 트립톤(Difco Laboratories, Inc.)의 수용액이다. 글루코즈가 없는 변형된 트립틱 소이 브로쓰 염기(tryptic soy broth base)가 특히 바람직하다. 오염을 피하기 위하여, 일반적으로 상기 수용성 영양배지는 내부 구획 중에 넣은 후에 멸균한다. 일반적으로 공지된 미생물 증식 지시계(생존 미생물의 존재하에 색이 변화한다)는 적어도 한 용기내에 존재하는 것이 바람직하다. 증식 지시계 물질은 수용성 영양배지 중에 용해되어 색을 띄며(미생물 증식에 따라) 그 결과 색의 변화를 외부 용기의 투명한 벽을 통해 쉽게 관찰 할 수 있다. 또한 증식 지시계 물질은 효소 변형산물의 색이나 발광성에 방해를 받지않도록 선택하는 것이 바람직하다. 본 발명에 사용되는 증식 지시계 물질은 널리 공지되어 있으며, pH-민감성 염료 지시계(예: 브롬티물 블루, 브롬 크레졸 퍼플, 페놀 레드 등), 산화-환원 염료 지시계(예: 메틸렌블루 등)를 포함한다. 상기의 물질은 pH, 산화-환원 포텐셜 등의 변화로 미생물 증식 현상에 반응하여 변색이 진행된다.
효소 기질 수용액을 포함하며 및/또는 수용성 영양배지를 포함하는 내부 용기(18)는 가스와 액체의 불투과성 물질이며 효소 기질 및/또는 영양배지가 외부 용기로 들어갈 수 있도록 압력을 사용하여 개방(예: '개압성')할 수 있다. 내부 용기는 상기와 같이, 플랜지형 물질(예: 유리)이 바람직하며, 외부 용기가 변형될 때 내부 용기가 파열 또는 분쇄되도록 그와 함께 작용하여 외부 용기내에 바르게 수송되는 것이 바람직하다. 또 다른 구체예에 있어서, 내부 용기는 압력을 사용하여 플러그를 열고 내부 용기의 함유물을 방출시킬 수 있도록 플러그로 봉한다. 또 다른 구체예에 있어서, 덮개(26)는 미합중국 특허 제4,304,869호에 기술된 대로, 앰플 파쇄 장치를 포함하고 있으며, 상기의 덮개는 덮개 장치를 가압하여 앰플을 파쇄시킬 수 있도록 덮개 장치의 하루를 따라 탭을 장치한다. 유사하게, 본 발명의 장치는 외부 용기(10)의 하부에 배치한 앰플 파쇄용 핀을 갖는 시스템에서 사용한다.
활성 효소를 함유한 외부 용기(10)는 멸균제(예: 증기, 산화에틸렌)가 멸균시 활성 효소원과 접촉할 수 있도록 그 안에 적어도 하나의 개구를 갖는다. 상기의 개구는 일반적으로 폐쇄되었거나 가스-투과성, 박테리아-불투과성 장치로 막혀 있다. 적당한 장치는 면, 유리울, 직물, 부직 웨브(web)와 같은 섬유로 제조된 덮개부(22)를 포함하는데, 상기의 재료는 프로필렌, 나일론, 폴리프로필렌/레이온, 나일론, 유리 또는 기타 직물, 필터 페이터, 미공성 소수성 및 친수성 필름, 개방 세포의 중합성 발포체 및 반투과성 플라스틱 필름으로 이루어졌다(미합중국 특허 제3,346,464호). 섬유성 또는 세포성 물질은 상기 물질이 멸균 가스를 쉽게 투과할 수 있기 때문에 바람직하다. 바람직한 덮개부의 물질은 나일론 웨브, 미공성 소수성 필름 또는 유리 섬유, 부직 웨브 등의 소수성 물질을 포함한다. 특히 바람직한 것은 상표명, Celgard K-442 Microporous Film으로 Celanese Separations Products(카롤로스, 노스캘리포니아 소재)에서 시판하는 미공성 소수성 필름이다. 효과적으로, 섬유 또는 세포형 덮개부는 박테리아와 균류용 필터로 제공되며 따라서 기공의 사이즈가 약 0.5 마이크론 이하여야 한다(예: 약 0.5마이크론 이상의 크기를 갖는 입자를 관통하지 못하도록 할 수 있다). 선택적으로 덮개 장치는 박테리아 불투과성인 구불구불한 경로일 수 있다(참고, 미합중국 특허 제4,461,837호, 1988년 9월 27일 출원된 공개류중인 미합중국 특허 출원 U.S.S.N. 249,982호).
본 발명의 멸균 지시계로 바람직한 구체적 실례는 제3도와 제4도에 서술되어 있다. 이 장치는 가스-비흡수성 및 액체 불투과성 벽(42)과 개구 말단(44)을 갖는 외부 용기(40)를 포함한다. 외부 용기(40)는 적당한 효소 기질 수용액(50)을, 바람직하게는 수용성 영양배지와의 혼합물로 포함하는 개압성 내부 용기(48)를 포함한다. 외부 용기(40)의 개구 말단(44)은 가스-투과성, 박테리아-불투과성 덮개부(52)에 의해 덮혀 있다. 그와 함께, 그 장치간의 유사성은 제1도에 도시하였다. 제3도와 제4도의 장치에서 효소 담체(46)를 외부 용기(40)의 폐쇄된 바닥 말단에 놓고, 차단물(47)을 효소 담체(46)와 개압성 내부용기(48) 사이에 플러그처럼 배치한다. 차단물(47)은 비형광성 물질로 구성되는 것이 바람직하며, 면, 레이온, 폴리프로필렌, 폴리프로필렌/레이온 혼합물, 나일론 또는 유리 등과 같은 직물로 이루어진 부직 웨브로서 형광체 효소 기질과 함께 사용한다. 가장 바람직한 차단물(47)은 폴리프로필렌 부직 웨브로 형성되는데 이것은 3M(st, Paul, MN)에서 상표명 Thinsulate 200-B brand Thermal Insulation으로 시판하고 있다.
차단물(47)은 효소 담체(46)와 내부용기(48)를 분리하기 위해 제공되며, 따라서 앰플(48)을 참체(46) 상에 배치하는 경우 냉각 반점을 제거한다. 농축물은 담체(46) 중에 포함된 효소의 활성에 작용한다. 차단물(47)은 소수성 물질로 이루어지는 것이 바람직하며, 그 결과 효소변형 산물은 효소 담체 주위에 농축되며 차단물의 이면에 있는 용기의 면으로 빠르게 확산되지 않도록 한다. 지시계의 저부에 고농도의 효소 활성산물을 유지하여, 내부용기(48)의 총 함유물과 담체(46)가 반응하는 경우보다도 단기간 배양 이후에 발광성이나 색이 측정될 수 있는지를 확인한다. 일반적으로, 실시예 1에서 기술하는 바대로, 차단물(47)이 집적된 바람직한 장치는 10분 이내에 멸균 효능에 대한 타당성 있는 정보를 제공한다. 상기의 차단물을 사용하지 않은 유사 장치는 타당한 멸균 효능 정보를 제공하는데 약 2시간이 소요된다.
덮개(56)는 상단(57)과 지지형 측벽(59)으로 구성되어 있다. 덮개는 하부에 동공의 몸체 개구를 가지며, 이것은 덮개의 내경이 외부 용기(40)의 외경과 동일하여 덮개(56)가 외부 용기(40)의 개구 말단(44)에 마찰력으로 맞물리게 된다. 측벽(59)내의 절단으로 다수 창(58)을 제공하는 것이 바람직하다. 지시계 장치가 멸균시킬 적재물에 위치하는 경우, 덮개(56)는 외부 용기의 외부 측벽(42)이 창(58)을 차단하지 못하도록 외부 용기 중에 개구를 장치한다. 상기 배치에 있어서, 멸균기 중의 멸균제는 창(58)을 통해 용기(40)로 흘러 들어간다. 멸균 사이클의 완료 후, 덮개를 가압함으로써 삽입하여 외부 용기의 측벽(42)이 상단(57)의 내면과 맞물리게 됨으로써 창(58)이 차단되도록 한다. 따라서 용기(40)의 내부는 외부 환경으로부터 밀폐된다.
제5도와 제6도는 본 발명의 바람직한 멸균 지시계의 예를 나타내고 있다. 이 장치는 제3도와 제4도의 장치와 같이 가스-비흡수성 및 액체 불투과성 벽(72)과 개구 말단(74)을 갖는 외부 용기(70); 효소 기질(80)의 수용액을 포함하는 외부 용기(70) 내의 개압성 내부 용기(78)(상기의 효소 기질은 영양증식 배지와 혼합물이 바람직함); 가스 투과성, 박테리아 불투과성 덮개부(82)를 포함하며, 외부 용기의 개구 말단(74)은 캡(86)으로 덮혀 있다. 외부 용기(70) 내의 효소 담체(77)는 예컨대, 접착성 또는 열 봉합으로 위크(wick) 스트립(76)에 붙어 있다. 위크 스트립은 필터 페이퍼, 직물 또는 레이온 등을 흡수성 물질로 제조될 수 있다. 또한 위크 스트립은 플라스틱이나 유리 배킹 스트립에 보유된 페이퍼와 같은 물질의 조합물로 형성될 수 있다. 위크 스트립(76)은 폴리에틸렌 피복 페이퍼로부터 제조되는 것이 바람직하며, 위크 스트립의 크기와 그 위에 효소 담체의 배치는 내부 용기가 파열될 때 그 안의 액체가 외부 용기의 저부와 효소 담체(77) 아래에 포함되도록 한다. 효소 기질 용액(80)은 위크 스트립(76)에서 효소 담체(77)로 상향 이동한다. 효소 담체(77)상의 효소 변형 산물의 농축물과 그것의 존재는 담체를 내부 용기(78) 중에 존재하는 전체 용액에 담체를 노출시키는 경우보다도 더 단시간내에 검출된다.
사용할 때, 제3도와 제4도에 도시한 멸균 지시계는 증기나 산화에틸렌 가스로 멸균시킬 많은 품목과 함께 멸균 챔버 중에 배치한다. 지시계가 멸균기내에 있는 경우, 덮개(56)는 열린 상태에 있어서, 창(58)이 개방되어 멸균제가 들어오는 것을 가능하게 한다. 멸균제가 챔버로 유입되면 멸균제는 덮개부(52)를 투과하고 차단물(47)을 통과하여 효소를 불활성화시키고 담체(46)에 존재하는 시험 미생물을 죽인다. 멸균 사이클의 말기에, 멸균제는 여과 공기로 대치된다. 멸균 지시계를 멸균기로부터 제거하고, 덮개(56)를 차단창(58)으로 완전히 삽입하고, 유리 앰플(48)을 손가락 압력으로 깨뜨려서 효소 기질과 영양 증식 배지 수용액이 효소 담체(46)에 접촉하도록 한다. 지시계를 적당한 배양 조건(예: 약 56℃에서 약 10분 내지 2시간)에 놓는다. 멸균제에 의해 불활성화되지 않은 효소는 그것의 기질과 반응하여 바람직하게 변색되거나 형광성의 효소-변형 산물을 산출한다. 변색이나 형광성의 발현은 외부 용기(40)의 투명한 벽(42)을 통해 분광 광도법으로 관찰 또는 측정한다. 이것은 멸균 사이클이 담체(46)상의 모든 활성 효소를 불활성화시키지는 않았다는 것을 나타낸다. 활성 효소의 존재는 시험 미생물의 생존과 궁극적으로는 과증식을 예견하며, 멸균 사이클의 멸균기내의 모든 품목을 완전히 불활성화하는데 불충분하다는 것을 나타낸다. 임의의 변색이나 형광성의 부재는 멸균 사이클이 담체(46)상의 모든 효소를 불활성화시는데 충분하며, 따라서, 멸균기내의 모든 품목을 충분히 멸균시켰다는 것을 나타낸다. 이 장치를 더 배양하면(56℃에서 약 24 내지 48시간) 미생물 생존에 대한 초기 예상이 증식 배지 중의 변색에 의해 확인될 수 있다.
본 발명 지시계의 형광성을 모니터하는 바람직한 방법은 본 발명에서 기술한 장치에 대해 구체적으로 고안한 형광계(fluorimeter)이다. 형광계는 소량의 형광산물과 그 백그라운드 또는 비-형광을 가시적으로 식별하고자 할 때 직면하게 되는 주관적인 해석을 제거한다. 형광계는 주어진 배양기간내에 형광성 산물의 최소량을 검출하기 위해 측정될 수 있다.
본 발명의 장치와 함께 사용하도록 고안된 특히 바람직한 형광계는 주위 빛을 차단하도록 고안된 챔버를 포함하는 반면, 지시계의 외부 용기는 그 안에 효소 담체가 365㎚ 과장의 자외선 빛을 방출할 수 있도록 배치하며 광전다이오드는 460㎚ 파장 부위에서 임의의 산출 형광을 측정할 수 있다. 형광계는 적어도 1.0×10 M의 4-메틸움벨리페론을 검출할 수 있도록 계측한다.
비-형광성 또는 음성(negative) 반응 장치와 형광성 양성 반응 장치를 구분하는데 몇 가지 방법이 사용될 수 있다. 첫 번째 방법에서는, 1×10 M의 4-메틸움벨리페론에 의해 생성된 형광과 동일한 형광성 허용한계를 형광계로 설정하였다. 충분한 활성 효소를 갖는 시험 샘플을 기질이 허용한계를 초과할 수 있도록 전환시키고, 그후 효소 담체가 기질과 약 56℃에서 15분동안 반응하도록 하는 경우, 형광계는 발광(붉은 색)에 의해 양성 반응 샘플을 나타낸다. 효소와 그것의 기질의 반응에 의해 생성된 형광성 산물이 15분 배양 이후에 허용 한계를 초과하지 않는다면, 형광계는 녹색 빛으로 음성 반응 또는 비형광성 샘플을 나타낸다.
두 번째 방법에서는, 형광계는 배양기의 초기에 초기 형광을 측정한다. 형광계 챔버는 장치 중에서 시험된 특정한 효소에 대한 최적 온도로 가열한다.
효소 α-D-글루코시다제가 바실러스 스테로서모필러스로부터 유도된 경우, 온도는 56℃이다. 배양기 중에, 형광계는 형광을 계속 모니터하고, 초기 형광에 대해 강도가 적어도 5% 증가하여, 붉은 빛을 검출하는 경우, 양성 반응의 형광 샘플을 나타낼 것이다. 기존의 배양기 내에 5% 이하의 증가는 형광계는 녹색 빛으로 음성 반응 또는 비-형광 샘플을 나타낼 것이다.
본 발명의 멸균 지시계는 주로 산화 에틸렌, 증기 등과 같은 멸균 매체에 대하여 기술하였다. 그러나, 지시계는 상기의 용도로 제한되지 않으며, 건열, 방사선, 산화 프로필렌, 메틸브로마이드, 오존, 이산화염소, 포름알데히드 및 기타 가스 및 액체 제제 등, 기타 멸균 매체의 효능을 나타내는데 또한 사용될 수 있다.
본 발명은 하기의 비-제한적인 실시예에 의해 기술되며, 여기에서 모든 퍼센트는 특별한 언급이 없는 한 중량%이다.
[실시예 1]
이 실시예는 본 발명이 효소 측정법의 결과와 통상적인 포지생존 검출법의 결과의 형광성 간의 상관관계를 기술하고 있다. 본 실시예는 또한 제3도와 제4도에 도시된 장치로 수득할 수 있는 몇 배 빠른 판독을 기술하고 있으며, 상기 장치는 앰플(48)과 효소 담체(46)간의 차단물(47)을 사용하고 있다.
ATCC 7953으로 통상적으로 시판되는 바실러스 스테로서모필러스는 트립틱 소이 브로쓰 중의 58℃에서 하룻밤(16시간)동안 증식시킨다. 이 배양물을 8g/ℓ의 영양 브로쓰, 4g/ℓ의 효모 추출물, 0.1g/ℓ의 염화망간 및 20g/ℓ이 아가(pH 7.2)로 구성된 아가판(plate)의 표면에 접종시키는데 사용한다. 판은 72시간 동안 58℃에서 배양한다. 포자를 판으로부터 긁어내어 멸균 증류수에 현탁시켰다. 4℃, 7000rpm에서 20분동안 원심 분리함으로써 성장성 찌꺼기로부터 분리해 낸다. 상층액을 제거하고 포자를 멸균 증류수로 재현탁시켰다. 이러한 세처법을 몇 회 반복한다. 바실러스 스테로서모필러스 포자를 직경 6.35㎜(1/4인치)인 필터페이퍼 디스크상에 1.6×10 포자/디스크 빈도로 피복하였다(상표명 SS #903 등급의 필터 페이퍼, Schleicher Schuell, Inc., Keene, NH). 이것은 수중에 1×10 포자/㎖의 농도로 바실러스 스테로서모필러스 포자의 현탁액을 제조하고 각 필터 페이퍼 디스크상에 이 현택액 10㎕를 피펫팅(pipetting)한 후 건조시킴으로써 제조한다. 장치는 제3도와 제4도에서 기술한 바대로 외부구획(40)의 하부에 포자가 피복된 스트립(46)가 효소 기질을 함유한 앰플(48)과 포자 스트립 사이에 차단물(47)로 이루어졌다. 중량이 200g/sq.m이고 직경이 1.75(11/16인치)인 폴리프로필렌 송풍형 미세섬유물질(상표명, Thinsulate 200-B brand Thermal Insulation, 3M, St., Paul, MN)을 차단물(47)로 사용한다. 0.1g의 4-메틸움벨리페릴 α-D-글루코사이드 뿐만 아니라, L-알라닌 0.17g과 박테리아의 펩톤 17g(Sigma Chemical Company, St., Louis, MO시판)으로 구성된 영양배지 0.67㎖를 포함한 앰플(48)을 물 1ℓ당 200㎕의 N,N-디메틸포름아미드와 0.03g의 브로모 크레졸 퍼플 pH 지시계 염료를 용해시켰다. 효소기질과 영양 배지 용액의 pH를 0.1N 수산화나트륨을 이용하여 7.6으로 조절한다.
외부 바이얼(vial)(40)과 캡(56) 둘다 폴리프로필렌으로부터 제조된다. 외부 바이얼은 길이 5.08㎝(2.0 인치), 외경 85.㎜(0.335 인치) 및 내경 77.0㎜(0.303 인치)이다. 캡은 길이 1.275㎜(0.510 인치) 및 내경 83.3㎜(0.328 인치)이다. 내부 앰플(48)은 유리로 제조되며, 길이 3.96㎝(1.56 인치), 외경 65.5㎜(0.258 인치)이며, 벽의 두께는 2.5㎜(0.010 인치)이다. 덮개부(52)는 폴리프로필렌으로 이루어졌으며 직경이 1.27㎜(1/2 인치)이다(Celanese Seperations Products, Charlotte, N. C.의 상표명 Celgord K-442 Microporous Film).
두 번째 장치는 차단물(47)이 결핍된 것 이외에는 첫 번째 장치와 동일한다.
상기 두 가지 형의 장치의 5단위 배치를 금속 기기단에 올려놓고 중력 치환 스팀 멸균기(상표명, Amsco Eagle Model 2013 멸균기, American Sterilizer Company, Erie, PA) 중의 132℃에서 0.5, 1.0, 2.0, 2.5 및 3.0분 동안 노출시킨다. 노출 이후 효소 기질과 영양 배지를 포함하는 내부 앰플을 파쇄하고 단위를 56℃에서 배양한다. 자외선 광(λ=366㎚)을 이용하여 10분, 20분, 30분, 60분, 120분, 180분 및 240분 동안 배양한 이후에 형광을 가시적으로 판독하기 위하여 바이얼에 빛을 조사한다. 또한 보라색으로부터 노란색으로의 변색에 의해 나타나는 포자 증식은 56℃에서 24시간 동안 배양한 이후에 가시적으로 결정한다.
그 결과를 상기 표 I에 기록하였다.
* 하나 이상의 오류 양성 반응은 마지막 멸균 사이클에서 포자 불활성화 이후 잔류 효소 활성 결과를 나타난다.
표 1의 데이터는 활성의 α-D-글루코시다제의 존재가 본 발명의 방법에 의해 생존가능한 포자를 검출하는 것보다 훨씬 더 빠르게 검출할 수 있음을 나타내고 있으며, 상기 장치 중의 활성효소의 검출은 장치내의 궁극적인 포자 증식을 예측하는데 사용할 수 있다.
또한 표1은 데이터는 장치 1을 사용하여(앰플과 포자 스트립 사이에 차단물을 지님) 24시간 동안 배양한 이후 포자 증식을 나타내는 모든 단위에 대해 10분 이후에 효소 활성이 검출될 수 있는 것을 나타내고 있으며, 장치 2는(차단물 없음), 24시간 동안 배양한 이후에 포자증식을 나타내는 모든 단위에 효소 활성을 검출하기 위하여 2시간 배양이 필요하다.
[실시예 2]
제5도와 제6도에 기술한 바대로, 위크(76)상에 효소 담체(77)를 갖는 장치를 제작한다. 실시예 1에 따라 제조한 포자 스트립을 0.10㎜ 두께로 폴리프로필렌 피복된 페이퍼(6.35㎜×28.58㎜)의 한 말단에 가열 봉합한다. 비이온성 계면활성제(상표명, Tween 80 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레이트, ICI Americas, Inc., Wilmington, Delawar)를 5㎖/ℓ 포함하는 앰플(78)은, 효소기질, 영양성분 및 지시계 뿐만 아니라 포자담체의 습윤성 제공을 위하여, 실시예 1의 용액 중에 포함한다. 덮개부는 필터 페이퍼이다.
5단위 배치 장치를 금속 기기단에 놓고 132℃에서 중력 치환 중기 멸균기(Amsco Eagle Moded 2013 멸균기, American Sterilizer Company, Erie, PA) 중에서 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 및 3.0분 동안에 노출시킨다.
노출 이후, 내부 앰플을 파쇄하고 장치를 56℃에서 배양한다. 자외선 빛(λ=366㎚)을 사용하여 10분, 20분, 30분, 60분, 120분, 180분 및 240분 동안 배양한 후 형광을 가시적으로 판독하기 위하여 바이얼에 빛을 조사한다. 또한 보라색으로부터/노란색으로 변색됨으로써 나타나는 포자증식을 24시간 동안 배양한 이후에 가시적으로 결정한다.
그 결과는 표 2에 기록하였다.
* 하나 이상의 오류 양성 반응은 마지막 멸균 사이클중 포자 불활성화 이후에 잔류한 효소 활성 결과를 나타낸다.
표 2의 데이터는 24시간 표준 포자 증식에 비해 본 발명의 효소 검출법과 장치를 사용하여 훨씬 더 빠른 포자 생존을 검출할 수 있다.
[실시예 3]
본 실시예는 바실러스 스테로서모필러스와 관련된 몇 가지 효소를 기술하고 있으며, 이것은 본 발명의 실시에 유용하다.
본 실시예에서 효소 기질 키트(상표명, API-XYM System, API Analytab Products, Plainview, NY)를 사용한다. 이 키트는 19가지의 상이한 탈수된 개별적으로 미세흡반(microcupules)류에 포장된 색원체 효소 기질 19로 구성된다. 각 미세흡반에 수용성 샘플을 첨가하여 기질을 다시 수화시킨다. 시험 키트는 필요한 간격동안 배양하고 반응은 시스템에 검출시약을 첨가한 후 가시화된다.
실시예 1의 장치 1에 따라 제조된 장치를 실시예 1에서 사용한 증기 멸균기 중의 120℃에서 1분 또는 3분동안 노출시켰다. 상기 장치를 사용하는 경우 바실러스 스테로서모필러스 포자는 1분 노출에서 생존하였으며 3분 후 죽었다. 노출이후, 포자 스트립을 효소 기질 키트 중에 각 미세흡반에 무균적으로 옮겨 50㎕의 멸균 증류수를 각 웰에 첨가하였다. 포자 스트립을 포함한 제1키트를 1분 동안 노출시키고, 포자 스트립을 포함한 제2키트를 3분동안 노출시키고 제3키트 포자 스트립을 노출시키지 않는다.
비노출된 스트립을 함유한 키트는 56℃에서 배양시켰다. 노출된 포자 스트립을 함유한 키트는 7시간동안 56℃에서 배양시켰다. 배양 이후에, 검출시약 A와 B(상표명, API-XYM System)를 첨가하여 각 키트의 미세흡반에서 발생하는 임의의 효소 반응의 색변화를 관찰한다.
각 키트의 미세흡반에 있어서 색 관찰은 표 3에 기록하였다. 1분 노출이후 용이하게 측정될 수 있는 활성을 나타내며, 3분 노출이후 전혀 또는 거의 활성이 감소된 효소의 수를 제시하였다. 몇 가지 효소는 바실러스 스테로서모필러스에 내인성이 있으며, 이것은 비 노출상태에서 측정 가능한 활성을 나타내지는 않았다. 비 노출상태에서 측정 가능한 활성을 나타내지 않는 몇 가지 기타 효소(미리스테이트 리파아제, 발린 아미노펩티다제, 키모트립신 및 β-글루쿠로니다제 포함)는 열에 노출시킴으로써 명확하게 활성화된다. 이것은 1분동안 노출시킨 후에 측정 가능한 활성 및 3분 노출 후 무활성 또는 감소활성을 나타내는 효소들이 본 발명에 유용하게 사용되며, 더욱이 비노출 상태에서 효소 활성이 검출되지 않는 경우, 유용하게 사용한다.
-=색 변화무
VW = 색 변화 매우 약함
+1 + 색 변화 약함
+ 2, 3, 4 = 색 변화 약함, 색 변화 중간(색 변화가 증가될수록 수가 증가함)
+5=색 변화 강
표 3은 바실러스 스테로서모필러스 중에 존재하는 효소의 포자증식을 검출하기 이전에 치사량 이하의 멸균 노출이후 충분한 활성을 갖는다는 것을 나타낸다. 상기 효소는 알칼리 포스파타제, 부티레이트 에스테라제, 카프릴레이트 에스테라제 리파아제, 미리스테이트 리파아제, 루이신 아미노펩티다제, 발린 아미노펩티타제, 키모트립신, 산성 포스파타제, 포스포 히드롤라제, α-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제 및 α-글루코시다제, β-글루코시다제이다.
[실시예 4]
실시예 1에 따라 제조한 바실러스 스테로서모필러스 포자는 상표명, SS #591 A 등급 필터 페이퍼로 Schleicher and Schuell, Inc(Keene)에서 시판하는 필터 페이퍼로 제조한 담체 6.35×28.58㎜(1/4×3/8 인치) 상에 농도 1.0×10 , 7.5×10 , 1.0×10 , 1.7×10 , 2.8×10 포자/담체로 피복 및 건조한다. 제3도와 제4도에 보여지고 실시예 1의 장치 1에 기술되어 있는 것처럼, 상기 포자 스트립을 사용하여 장치를 조립한다.
3단위 배치의 장치를 금속기기단에 놓고 132℃에서 중력 치환중기 멸균기(상표명, Amso Eagle Model 2013 증기 멸균기로 American Steriliger Company, Erie, PA에서 시판)중에서 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 및 3.0분 동안 노출시켰다. 노출 이후, 내부용기를 파쇄하여 장치를 56℃에서 배양하였다. 자외선 빛(λ=366㎚)을 사용하여 10분, 20분, 30분, 60분, 120분, 180분, 240분, 300분 및 360분 동안 배양한 후 형광을 가시적으로 검출하기 위하여 바이얼에 빛을 조사한다. 또한 자주색에서 노란색으로 변색함으로써 나타난 포자 증식을 24시간 배양 이후에 가시적으로 결정하였다.
그 결과는 표 4에 기록하였다.
* 마지막 멸균 사이클의 포자 불활성 후에 잔류 효소 활성으로 기인된 하나 이상의 오류 양성 반응을 나타낸다.
표 4는 낮은 포자 빈도에도 유기체 증식이 측정되기 전에 효소 활성(즉, 형광)에 의해 표자생존을 예측할 수 있었음을 설명하고 있다.
[실시예 5]
이 실시예는 바실러스 스테로서모필러스 포자의 다른 균주를 사용하는 장치에 대하여 판독시간을 비교한다. 시험된 균주는 다음과 같다; ATCC 8005(미합중국 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션, Rockvile, Maryland; 시판되고 있는 3개의 다른 생물학적 지시계에 함유된 미생물을 증식함으로써 생성된 포자), ATTEST , 생물학적 지시계(3M, St. Paul, MN), Proof Plus , 생물학적/화학적 지시계(American Sterilizer Co., Erie, PA) 및 Assert 생물학적/화학적 지시계(Surgicot, Smithtown, NY), NCTC 10003(National Collection of Type Culture, Colindale, London, England), German Earthspore(함부르그 위생 연구소, Hamburg, Germany; 5분 동안 121℃에 노출된 후 트립틱 소이 브로스(tryptic soy broth)에서 5분 노출은 흙에 존재하는 모든 식물성 유기체를 죽이는게 사용되었으며, B. 스테로서모필러스만 남게 된다; 스칸디나비아 균주는 Stateus Institute, Falkehelse, Oslo, Norway에 의해 생성된 포자스트립으로부터 분리해 낸 것이다.)
모든 포자를 실시예 1에서 Pharmacia Fine Chemicals AB(Uppsala, Sweden)의 Percoll 상표명으로 시판되는 밀도경사에서, 4℃에서 5시간 동안 11,000rpm으로 원심분리했다. 원심분리한 후에, 포자를 멸균 증류수에 재현탁시켰다. German Earthspore에 있어서, 두 개의 뚜렷한 세포층을 원심분리 동안 밀도 경사에서 분리해냈다. 층 접촉 현미경을 사용하여, 바닥층은 주로 포자였고, 위층은 주로 식물성 세포 및 소량의 포자를 포함한 식물성 찌꺼기였음을 알았다.
포자를 피복하여 담체당 최소한 1×10 의 빈도로 필터 페이퍼(SS 591A급 필터페이퍼)의 6.35×28.58㎜(1/4×3/8 인치) 스트립상에서 건조하였다. 장치를 장치 1, 실시예 1에서와 마찬가지로 조립했는데, ATCC 8005 포자를 사용하는 장치의 배치에서, 사용된 효소 기질이며, ATCC 8005 포자에 대한 베티-D-갈락토시다아제의 효소 활성을 측정하기 위해 4-메틸움벨리페릴-알파-D-글루코사이드 대신에 200㎕ N,N-메틸포름아미드에 용해된 4-메틸움벨리페릴-베티-D-갈락토사이드 0.1g/1(Sigma 사제)인 것은 예외였다. 세 개의 단위 배치를 Amsco Eagle 모델 2013 증기 멸균기에서 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 및 3.0분동안 132℃에 노출시켰다. 노출 후, 내부 앰플을 쪼개어 단위들을 56℃에서 배양했다. 자외선(λ=366㎚)을 이용하여 배양 10분, 20분, 30분, 60분, 120분, 180분 및 240분 후의 시각판독 형광도에 대한 바이얼을 설명했다. 또한 보라색에서 노란색에 이르는 변색으로 배양 24시간 후에 포자증식을 육안으로 측정했다.
그 결과를 표 5에 수록한다.
* 하나 이상의 오류 양성 반응은 마지막 멸균 사이클 중 포자 불활성화 이후에 잔류한 효소 활성 결과를 나타낸다.
표 5는 시험된 B. 스테로서모필러스의 모든 균주가 포자 생존에 관련된 효소활성(알파-D-글루코시다아제 또는 베타-D-갈락토시다아제)을 갖고 있음을 보여준다. 포자가 생존한 대부분 단위에서, 배양 2시간 내에 형광도를 측정하였고, 많은 유니트에서 배양 10분 후에 형광도를 측정했다. German Earthspore로부터 식물성 세포를 주로 구성하는 세포층은 치사량 이하의 노출 후에 효소 생존을 갖고 있었다. 이것은 식물성 세포와 관련된 알파-D-글루코시다아제가 본 발명에 사용됨을 가리킨다. 스칸디나비아균주를 갖는 여러 단위가 효소 생존을 갖고 있었으며, 계속 배양시 유기체가 증식되지 않았다. 이것은 전에 관찰된 것이며, 마지막 사이클에서 발생된다. 효소는 포자보다 약간 오랫동안 활성을 유지하는데, 이것은 멸균기에서 품목들을 확실히 멸균시키는 사이클을 더욱 모니터함으로써 또 다른 안전성 여지를 제공한다.
[실시예 6]
바실러스 스테로서모필러스 포자를 형광판독시간을 비교하기 위한 다양한 물질 위에 피복시켰다. B. 스테로서모필러스 포자를 실시예 1에 기술한 대로 수득하고, 에탄올에 현탁시킨 후 하기 물질의 6.35×28.58㎜(1/4×3/38 인치) 스트립당 대략 1×10 포자로 배치하였다; 폴리프로필렌/레이온 부직웨브, Kendall Fiver Products Division사의 Novonette 부직포 #149-190로서 시판됨; 나일론 부직웨브, Kendall Fiber Products Division(Boston, MA)사의 Novonette 부직포 #149-000으로 시판됨; 미공성 소수성 필름, Celanese Separations Products(Charlotte, NC)사의 Celgard 미공성 소수성 필름 2500; 미공성 소수성 필름, Celanese Separations Products사의 Celgard 미공성 소수성 필름 3401; 알루미늄박, Reynolds, Metals Company(Richmond, VA)로부터 시판됨; 필터페이퍼, Schleicher Schuell사의 SS 591 A급 필터 페이퍼; 필터페이퍼, Schleicher Schuell사의 SS 903 급 필터 페이퍼; 유리섬유 부직 웨브, Manning Paper Company, Division of Hammer Mill Paper Co., (Troy, NY)사의 Manniglas #1267 부직 유리 섬유제제, 현탁된 포자의 10㎕, 즉, 1×10 포자를 실시예 1에서 기술한 것처럼 동일 디멘젼의 폴리프로필렌 바이얼에 배치했다.
포자스트립을 사용하는 장치를 실시예 1, 장치 1처럼 제3도 및 제4도에서 기술한대로 조립하되, Crown Zellerback Corp.(Camas, Washington)사의 0.5 oz Celestra 부직 폴리프로필렌으로 시판 중인 폴리프로필렌 부직 스클림(Scrim)의 지름이 1.75mm(11/16 인치)인 조각을 포자스트립 46 및 외부 바이얼의 바닥사에서 끼운 점은 예외였다. 이렇게 끼워 넣음으로써 앰플 48이 쪼개질 때 포자 스트립을 영양 배지로 적셔주는데, 스크림이 소수성 나일론 웨브, 미공성 소수성 필름, 알루미늄박 또는 유리섬유 부직 웨브를 지나서 영양배지를 끌어올리기 위해 위크 역할을 하기 때문이다. 포자로 피복된 바이얼을 사용하는 장치를, 장치가 어떤 포자 스트립이나 차단물도 포함하지 않는 것외에는, 실시예 1과 마찬가지로 조립했다. 상기 지시계의 세 개 단위 배치를 Amsco Eagle 모델 2013 증기 멸균기에서 132℃에 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 및 3.0분 동안 노출시켰다. 노출 후, 효소 기질용액을 함유하는 앰플 및 영양배지를 쪼개고, 장치를 56℃에서 배양하여, Ultraviolet Products, Inc., (San Gabriel, CA)사의 Blak-Ray Lamp, 모델 UV L-21로 시판중인 장파 U.V.선(λ=366)를 사용하여 1시간 동안 15분마다 형광도를 측정한 후 16시간 동안 1시간 간격으로 계속 측정하였다. 24시간 동안 배양을 계속한 후, 그 장치는 증식(황색) 또는 비중식(보라색)으로 판독되었다.
그 결과를 표 6에 수록한다.
* 마지막 멸균 사이클에서 포자 불활성화 이후 잔류 효소의 활성 결과를 나타내는 하나 이상의 오류 양성 반응을 나타낸다.
증기 노출을 이겨낸 담체상에 피복된 포자에 대한 모든 지시계에 있어서, 포자생존(효소 활성에 의한)을 15분내에 측정하였다. 포자가 바이얼상에 직접 피복된 지시계는 활성 알파-D-글루코시다아제, 즉 포자생존의 모든 경우를 측정하기 위해서 최고 2시간을 필요로 했다. 확실한 판독이 될 때까지 연장된 시간은 포자-피복된 바이얼 지시계에서, 배지의 전체 부피가 형광도에 대해 모니터되어야 한다는 사실의 결과이다. 대조적으로 포자 스트립 및 앰플과 포자 스트립 사이에 차단물을 사용하는 장치에 있어서, 포자 스트립만이 형광도로 관찰된다. 차단물은 반-투과성막으로서 작용하여 소량의 배지 및 효소 기질이 포자담체와 접촉하게 한다. 앰플 전량과 효소가 반응하기보다는 담체의 일부분상의 효소와 효소 기질이 반응함을 매우 짧은 시간 후에 관찰할 수 있다.
[실시예 7]
ATCC 9373 바실러스 서브틸리스를 트립틱 소이 브로스에서 37℃에서 하루밤(16시간) 증식했다. 이 배양을 사용하여 8g/ℓ 영양 브로스, 0.011g/ℓ 황산망간 및 pH 7.2에서 20g/ℓ 아가로 구성된 아가판 표면을 접종시켰다. 상기 판을 6일 동안 37℃로 배양하고, 포자를 판으로부터 긁어내어 멸균 증류수에 현탁했다. 7000rpm, 4℃에서 20분 동안 상기 현탁액을 원심 분리함으로써 포자를 성장성 찌꺼기와 분리했다. 상층액을 붓고, 포자를 멸균 증류수에 재현탁시켰다. 이런 세정과정을 여러 번 반복했다.
바실러스 서브틸리스 포자를 6.35×28.58mm SS 591A급 필터 페이퍼 스트립상에 1.0×10 빈도로 피복시켰다. 장치를 이들 포자스트립으로 제3도 및 제4도에 따라서 실시예 1, 장치 1에서 기술된 대로 조립했다. 이들 장치의 세단위 배치를 30분동안 54℃ 및 50% 상대습도로 미리 맞추었다. 장치를 다시 54℃ 및 50% 상대습도로 15, 30, 60 및 120분 동안 3M Co, St, Paul, Minnesota에서 시판중인 Steri-Vac 400B 가스 멸균기의 600㎎/ℓ의 산화 에틸렌에 노출시켰으며, 그것은 Association for the Advancement of Medical Instrumentation, Standard for BIER/EO Gas Vessels, AAMI BEOU-3/82에 따라서 변형된 것이다. 노출 후, 내부 앰플을 장치로부터 제거하고, 하기 내용 이외에 내부 앰플에 포함된 것과 동일한 용액 0.67㎖를 외부 바이얼에 피펫하였다. 상기 용액은 브로모크레졸퍼플 pH 지시계 염료 대신에 2,3,5-트리페닐테트라졸리옴 클로라이드(ICN Pharmaceuticals Inc., Cleveland Ohio에서 시판함) 0.03g/ℓ와 4-메틸움벨리페릴-α-D-글루코사이드 대신에 4-메틸움벨리페릴-β-D글루코사이드(Sigma에서 시판)를 포함한다. 상기 장치를 37℃에서 배양하였으며, 자외선 빛(λ=366㎚)을 사용하여 30분, 60분, 90분, 120분, 180분, 240분 및 300분 후 형광성을 가시적으로 측정한다. 또한, 무색으로부터 붉은색으로 변색됨으로써 포자 증식은 24 및 168시간 배양 이후에 가시적으로 측정한다.
그 결과를 상기 표 7에 기록하였다.
* 표시는 멸균 주기 말기에서 포자 불활성화 이후에 효소 활성이 잔류된 결과인 것 같이 보이는 하나 또는 그 이상의 오류 양성 반응을 나타낸다.
표 7은 포자가 15분간의 산화 에틸렌 노출에도 잔존하는 장치에서 활성-β=D-글로코시다제와 4-메틸올벨리페릴-β-D글로코사이드와의 반응에서 유래한 형광은 90분간의 배양 처리후에 시각적으로 되었다는 것을 예시한다. 효소는 120분간의 산화 에틸렌 노출후에 완전히 불활성화된 바, 이것은 120분간의 산화에틸렌 노출이 완전하고도 효과적인 멸균 주기라는 것을 나타내는 것이다. 특징의 잔류 효소 활성이 30 및 60분간의 멸균 주기 말기에서 3 및 4시간의 배양 후에 검출되었다.
[실시예 8]
실시예 7에서 설명된 바와 같이 수득된 ATCC 9372 바실러스 서브틸리스 포자를 1.0×10 개의 빈도로 6.36×28.58mm인 SS 591 A Grade Filter Paper 스트립에 덮었다.
제3도와 4도에서 나타난 바와 같이, 그리고 실시예 1의 장치 1에서 설명된 바와 같이, 이러한 포자 스트립을 이용하여 장치를 모았다. 상기 장치의 3개의 단위 배치를 50% 상대 습도에서 30분간 54℃로 예비 조절하였다. 다음 실시예 7에서 설명된 바와 같이 상기 장치를 54℃, 50% 상대 습도의 개량된 Steri-Vac 400 B Gas Steriliger에서 600㎎/ℓ의 산화 에틸렌에 15, 30, 60 및 120분간 노출시켰다. 노출 후, 포자 스트립을 상기 장치에서 제거하고, 버지니아주 알렉산드리아 소재의 Dynatech Laboratories에서 상품명 Dynatech Micro FLUOR System으로 시판되는 96개의 미세적정판의 각 벽에 전이하였다. 각 벽은 17g/ℓ 박테리아성 펩톤, 0.17g/ℓ L-알라닌, 0.03g/ℓ 트리페닐 테트라졸리움 클로라이드 및 0.1g/ℓ 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코사이드를 함유한 200㎕ 용액을 담고 있다.
상기 판의 3개 음성 대조 벽은 포자 스트립 없이 영양 배지와 효소 기질을 담고 있다.
상기 판은 37℃에서 0, 60, 120, 180 및 240분간 배양 처리한 후, 각 벽의 형광도를 미네소타주 세인트 폴 thow의 3M사로부터 상품명 3M Fluoro FAST 96 Fluorometer로 시판되는 형광계로 측정하였다. 이 결과를 3개 벽에 대한 평균 상대 형광도로서 표 8에 기재하였다.
실시예 7의 결과는 바실러스 서브틸리스 포자가 이번 실시예에서 설명된 15분간의 산화 에틸렌 노출에도 생존하고 적어도 30분간 노출 후에 죽는다는 것을 나타낸다. 15분간 노출된 포자 스트립을 포함하는 벽에 의해 지적된 바와 같이, 효소 β-D-글루코시다제의 활성 및 이에 따른 B. 서브틸리스 유기체의 생존은 3시간 배양처리 후에 음성 대조 백그라운드 수준 형광보다 적어도 2.5배의 상대 형광도 상승에 의해 적시된다. 마찬가지로, 비노출 대조체에서, 오직 1시간의 배양 처리 후에 음성 대조체의 백그라운드 수준 형광보다 2.5배 더 크게 상대 형광도가 상승하였다는 것은 효소 활성과 포자 생존을 나타내는 것이다.
그러나, 적어도 30분간 산화 에틸렌 멸균법에 노출된 스트립은 3시간 배양 후에 음성 대조체보다 2.5배 작은 상대 형광 값을 가졌다. 따라서, 이것은 효소 활성만이 잔류되고 생존된 포자가 없어졌다는 것을 나타낸다.
제7도는 표 8에 수록된 결과를 그림으로 나타낸 것이다. 상기 도면에서, 선 A, B, C 및 D는 제각기 15, 30, 60 및 120분간 노출된 장치를 나타내고 선 E는 음성 대조체를 나타낸다.
[실시예 9]
실시예 7에서 수득한 ATCC 9372 바실러스 서브틸리스 포자를 1.0×10 개의 빈도로 6.35×28.58mm(1/4×3/8인치)인 SS 591 A Grade Filter Paper 스트립에 덮었다.
제3도와 제4도에서 나타난 바와 같이, 그리고 실시예 1의 장치에서 설명된 바와 같이, 이러한 포자 스트립을 이용하여 장치를 모았다. 상기 장치의 3개의 단위 배치를 50% 상대 습도에서 30분간 54℃로 예비 조절하였다. 다음 실시예 7에서 설명된 바와 같이 상기 장치를 54℃, 50% 상대 습도의 개량된 Steri-Vac 400B Gas Steriliger에서 600㎎/ℓ의 산화 에틸렌에 15, 30, 60 및 120분간 노출시켰다. 노출 후, 포자 스트립을 상기 장치에서 제거하고, 버지니아주 알렉산드리아 소재의 Dynatech Laboratories에서 상품명 Dynatech Micro FLUOR System으로 시판되는 96개의 벽 미세적정 판의 각 벽에 전이하였다. 각 벽은 17g/ℓ 박테리아성 펩톤, 0.17g/ℓ L-알라닌, 0.03g/ℓ 트리페닐 테트라졸리움 클로라이드 및 Sigma 제품인 0.1g/ℓ 4-메틸움벨리페릴-α-D-아라비노푸라노사이드를 함유한 200㎖ 용액을 담고 있다. 상기 판의 3개 음성 대조 벽은 포자 스트립 없이 영양 배지와 효소 기질을 담고 있다. 상기 판을 37℃에서 0, 60, 120, 180 및 240분간 항온 처리한 후, 각 벽의 형광도를 미네소타주 세이트 폴 소재의 3M사로부터 상품명 3M Fluoro FAST 96 Fluorometer로 시판되는 형광계로 측정하였다.
이 결과를 3개 벽에 대한 평균 상대 형광도로서 평균 상대 형광도가 15, 30, 60 및 120분간 노출된 포자 그리고 음성 대조체를 함유한 각 벽의 항온 처리 시간에 대하여 플롯팅된 제8도에 나타내었다. 상기 도면에서 F, G, H 및 J는 제각기 15, 30, 60 및 120분간 노출된 장치를 표시하며 X는 음성 대조체를 나타내는 것이다.
실시예 7의 결과는 바실러스 서브티리스 포자가 상기 설명된 형태의 15분간의 산화 에틸렌 노출에도 생존하고 적어도 30분간 노출 후에 죽는다는 것을 나타낸다. 이 실시예서, α-D-아리비노푸라노시다제는 120분간의 주기에도 활성을 가지고 있으며. 이것은 완전하고도 효과적인 멸균 주기라고 판단된다. 이러한 수준에서의 형광을 백그라운드 수준으로 생각되며, 이 수준보다 높은 이러한 수준은 멸균이 실패하였다는 것을 가르키는 것이다. 예를 들어, 3시간의 배양 후에, 15분 및 120분간 노출된 스트립 간의 상대 형광 단위(RFU)에서의 차이는 2166이다. 이러한 차이는 현저한 것이고 15분간은 이용된 산화에틸렌 조건에 대하여 불완전한 멸균 주기인 것이다. 이용된 산화에틸렌 조건에 대하여 불완전한 멸균 주기인 것이다. 그러나 30분 및 120분간 노출된 스트립간의 차이는 745RFU 밖에 되지 않는다. 이러한 차이는 심한 것으로 간주되지 않으며 30분간의 멸균 주기 말기에서 효소 활성이 잔조하고 있다는 것을 나타낸다.
[실시예 10]
실시예 1에서 수득한 바실러스 스테아로서모필러스 포자체(ATCC 7953) 한번 세척한 후 증류수에 1×10 포자체/㎖ 빈도로 현탁시켰다. 하기 공정을 이용하여 효소 α-D-글루코시다제를 정제하였다. 상기 현탁액(200㎖)을 10mM 아세테이트 완충액과 5mM CaCl를 함유한 pH 6.2인 용액에 대하여 4℃에서 하루밤 동안 투석시켰다. 다음 불용성 잔류물을 원심분리로 제거하였다. 상징액을 고체 황산 알루미늄으로 분획하였다. 20∼60% 황산 알루미늄으로부터의 침전물을 필터 패드를 가진 Buchner 깔때기에서 수거하였다. 상기 필터 패드는 캘리포니아 롬포크 소재의 Man Ville Specialty Product Group 제품인 Celite Filter Aid의 현탁액(100g/ℓ)을 2장의 Whatman No. 1 여과지에 통과시킴으로써 제조되었다. 여과 후, 상기 Celite Filter Aid 패드를 10mM 아세테이트 완충액 및 5mM CaCl를 함유한 pH 6.2의 20㎖ 용액에 현탁시키고 4℃에서 4시간 교반하였다. Celite Filter Aid를 여과하여 용해 효소로부터 제거하였다. 밝은 갈색의 효소 용액을 10mM 아세테이트 완충액과 5mM CaCl를 함유한 4L의 용액에 대하여 4℃에서 밤새 투석하였다. 투석된 용액을 투석 튜빙(tubing)으로부터 수거하고 여과하여 불용성 파쇄 잔류물을 제거하였다.
상기 투석된 용액을 pH 6.2로 조절하고 2배 부피의 냉각된 아세톤(-20℃)을 교반하면서 첨가하였다. 이 아세톤-효소 용액을 -20℃에서 6시간 정치하였다. 밝은 갈색 침전물을 4℃에서 중력 여과법으로 수집하고 10mM 아세테이트 완충액과 5mM CaCl를 함유한 pH 6.2인 10㎖ 용액에 용해하였다. 이 결과로 나타난 밝은 호박색 용액에 pH 4.6인 0.1M 아세테이트 완충액을 첨가하여 pH 5.5로 조정하였다. 이 용액을 다시 2배 부피의 냉각 아세톤(-20℃)으로 처리하고 20℃로 밤새 저장하였다. 여과물을 중력 여과법으로 수집하고 10mM 아세테이트 완충액과 5mM CaCl를 함유한 pH 6.2인 10㎖의 용액에 용해하였다. 밝은 호박색 용액을 50mM 인산염 완충액과 5mM EDTA를 함유한 pH 6.2인 4L용액(완충액 A)에 대하여 4℃에서 24시간 마다 완전히 완충액을 바꾸면서 48시간 동안 투석하였다.
상기 투석된 샘플의 5㎖를 뉴저지주 프스카타웨이 소재의 Pharma-Cia, Inc. 제품인 DEAE-Sephadex Beads로 채워진 컬럼(2.5×30cm)에 적하하고, pH 6.2인 50mM 인산염 완충액과 5mM EDTA로 평형화시켰다. 이 컬럼을 연속하여 a) 완충액 A 500㎖ 및 b) 완충액 A에서 0∼0.8M NaCl 선형 구배 200㎖로 세척하였다. 유속을 약 5㎖/60분으로 유지하였다. 나타난 활성 분획물을 수집하고 증류수 4L에 대하여 24시간 마다 완전히 바꾸면서 48시간 투석하였다. 소액성 분획물을 150mM 포스페이트 완충액과 5mM EDTA를 함유한 pH 6.2인 3㎖ 용액(완충액 B)에 현탁시켰다. 이 현탁액을 Pharmacia, Inc. 제품의 Sephadex G-100 Beads로 채운 컬럼(2.5×30cm)을 통해 약 15㎖/60분의 유속으로 완충액 B로써 통과시켰다.
활성 분획물을 수집하고 4L의 증류수에 대하여 투석하였다. 다음, 상기 투석된 분획물을 소액화시켰다.
SS 903 Grade Filter Paper인 7개의 6.35×3/8 인치) 스트립을 0.02M의 정제된 α-D-글루코시다제를 함유한 증류수 현탁액으로 포화시켰다. 동일한 형태 및 규격의 7개 다른 종이 스트립을 실시예 1에서 수득한 B. 스테아로서모필러스 포자체 1×10 포자체/㎖ 용액으로 포화시키고 증류수에 현탁시켰다. 모든 캐리어 스트립을 주위 온도(20℃)에서 밤새 공기 건조시켰다.
제3도 및 제4도에 나타난 그리고 실시예 1에서 설명된 장치 1과 같이, 이러한 포자체를 이용하여 장치를 모았다. 이러한 장치를 Amsco Eagle Model 2013 Steriliger로서 시판되는 중력 치환 중기 멸균기에서 132℃와 469.4㎏/㎠(33psi)에 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5 및 3.0분 동안 노출하였다.
노출 후, 효소 기질과 영양 배지를 함유하는 내부 앰플을 파쇄하고 단위체를 56℃에서 24시간 동안 배양하였다. 형광을 시각적으로 판독하기 위해 자외선(λ=366㎚)을 사용하여 유리병에 조사하였다. 3M Fluoro FAST 96 Fluorometer를 사용하여 366㎚에서 각 장치의 상대 형광도를 측정하고 그 결과를 표 9에 수록하였다.
+ 표시는 시각적으로 관측된 것을 나타내고, - 표시는 시각적으로 관측되지 않은 것을 표시한다.
표 9에 나타난 결과는 정제된 효소를 사용한 장치가 B. 스테아로서모필러스를 사용한 장치와 동일한 시각적 관측 형광 및 거의 동일한 측정 형광도를 가진다는 것을 나타내고 있다. 따라서, 이 실시예는 포자에서 유도되어 포자를 가지고 있는 것이 아닌 정제된 효소 단독의 활성이 포자 생존을 검출하는데 효과적이라는 사실을 보여주는 것이다.
Claims (12)
- a) 멸균을 모니터하는데 일반적으로 사용되는 적어도 한 종류의 미생물의 생존력과 관련이 있는 활성을 갖는 효소의 측정 가능 양을 제공하는 활성 효소원을 멸균 사이클로 처리하는 단계; b) 상기 멸균 사이클의 완결 이후에, 임의의 잔류 활성 효소와 반응하여 측정 가능한 효소-변형 산물을 생성할 수 있는 유효량의 효소 기질 시스템과 상기 효소를, 상기 임의의 잔류 활성 효소와 상기 기질의 반응을 촉진시키기에 충분한 조건하에서 그리고 충분한 시간 동안 배양하는 단계를 포함하여 멸균 사이클의 유효성을 빠르게 측정하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 활성 효소원 포자 또는 증식 상태 중의 박테리아 또는 균류인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 활성 효소가 미생물로부터 분리된 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 효소가 하기 a)와 b)를 만족하는 효소인 방법: 1) 1×106의 시험 미생물 집단을 6log만큼 감소시키기에 충분한 멸균 사이클로 처리한 경우, 측정 가능한 효소-변형 산물을 생성하기 위해 상기 활성 효소와 반응할 수 있는 유효량의 효소 기질 시스템과의 반응으로 측정되는 활성이 백그라운드(background)와 동일하며; b) 1×106의 상기 시험 미생물 집단을 1log 이상 내지 6log 이하만큼 감소시키기에 충분한 멸균 사이클로 처리한 경우, 상기 유효량의 효소 기질 시스템과의 반응으로 측정되는 활성이 상기 백그라운드보다 더 큰 효소인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 효소는 포자-형성 미생물로부터 유래하는 β-D-글루코시다제, α-D-글루코시다제, 알칼리성 포스파타제, 산성 포스파타제, 부티레이트 에스테라제, 카프릴레이트 에스테라제 리파아제, 미리스테이트 리파아제, 루이신 아미노펩티다제, 발린 아미노펩티다제, 키모트립신, 포스포히드롤라제, α-D-갈락토시다제, β-D-갈락토시다제, α-L-아라비노푸라노시다제, β-D-글루쿠로니다제, N-아세틸-β-글루코사미니다제, β-D-셀로비오시다제, 알라닌 아미노펩티다제, 프롤린 아미노펩티다제, 티로신 아미노펩티다제, 페닐알라닌 아미노펩티다제 및 지방산 에스테라제인 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 활성 효소원이 바실러스 스테로서모필러스 또는 바실러스 서브틸리스인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 효소 기질 시스템이 상기 효소 또는 효소 기질 시스템과 발광성, 형광성, 색 또는 방사능이 상이한 효소-변형 산물로 효소 작용으로 변형될 수 있는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 효소 기질 시스템이 형광체이며 4-메틸움벨리페릴 유도체, 7-아미도-4-메틸쿠마린 유도체, 디아세틸플루오레세인 유도체 및 플루오레스카민으로 구성된 군중에서 선택된 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 박테리아 또는 균류가 멸균을 모니터하는데 일반적으로 사용되는 것이며, 하기 c)의 단계를 추가로 포함하는 방법: c) 상기 멸균 사이클을 완료한 이후에, 생존한 박테리아 또는 균류의 증식을 촉진시킬 수 있는 영양 배지 수용액과 함께 배양하고 상기의 생존한 박테리아 또는 균류의 증식을 촉진시키기에 적합한 상태하에 상기 박테리아 또는 균류의 증식에 반응하여 검출 물질이 측정 가능한 변화를 야기할 수 있는 방법.
- a) 액체 불투과성 및 가스 비-흡수성 벽을 가지며, 적어도 하나의 개구를 그 안에 갖고 있는 외부 용기; b) 상기의 개구를 덮는 가스-투과성, 박테리아 불투과성 수단; 및 c) 외부 용기내에 함유되며, 멸균을 모니터하는데 일반적으로 사용되는 한 종류 이상의 미생물의 생존력과 관련된 활성을 지닌, 분리된 측정 가능한 양의 활성 효소로 구성된 멸균 지시계.
- a) 액체 불투과성 및 가스 비-흡수성 벽을 가지며, 적어도 하나의 개구를 그 안에 갖고 있는 외부 용기; b) 상기의 개구를 덮는 가스-투과성, 박테리아 불투과성 수단; c) 외부 용기내에 함유되며, 멸균을 모니터하는데 일반적으로 사용되는 한 종류 이상의 미생물의 생존력과 관련된 활성을 지닌, 측정 가능한 농도의 활성 효소원; 및 d) 외부 용기내에 함유되며, 측정 가능한 효소-변형 산물을 생성하기 위해 활성 효소와 수용액 중에서 반응할 수 있는 유효량의 효소 기질로 구성된 멸균 지시계.
- 제11항에 있어서, 상기 활성 효소원이 멸균을 모니터하는데 일반적으로 사용되는 박테리아 또는 균류이고, 효소 기질은 배양시 상기 박테리아 또는 균류의 증식을 촉진시킬 수 있는 영양 배지 수용액, 및 상기 박테리아 또는 균류의 증식에 대해 반응하여 가시적인 색 변화를 일으킬 수 있는 검출 물질과 함께, 봉합된 개방성, 가스 및 액체 투과성 내부 용기 내에 함유되어 있는 지시계.
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