FI107167B - Menetelmä mikro-organismin kasvun ja kuolemisen määrittämiseksi - Google Patents

Description

107167

MENETELMÄ MIKRO-ORGANISMIEN KASVUN JA KUOLEMISEN MÄÄRITTÄMISEKSI

Keksinnön kohteena on menetelmä, joka mahdollistaa mikro-organismien kasvun ja kuolemisen määrittämisen valitun ajanjakson kuluessa kiinnostuksen kohteena 5 olevassa ympäristössä.

KEKSINNÖN TAUSTA

Tutkittaessa mikro-organismin kasvua ja kuolemista erityisten ympäristöjen vaikutuksen alaisena, esimerkiksi tuotanto- ja varastointiympäristöissä, jotka esimerkiksi voisivat olla jäähdytettyjä tai ei, tai sisältää kemikaaleja tai matriiseja, 10 esimerkiksi antibiootteja, mikrobisia toksiineja, raskasmetalleja ja seerumi-komplementtia, mikrobiviljelmiä inkuboidaan useimmiten tuntien tai päivien ajan. Näissä olosuhteissa kuolemista ja kasvua tapahtuu samanaikaisesti. Jos lisäksi jotkut , soluista lysoituvat, esimerkiksi seerumikomplementtia analysoitaessa, on vaikea I < .·: tietää mihin elävien solujen määrää olisi verrattava kokeen lopussa. Sopivia 15 menetelmiä tunnetaan elävien solujen lukumäärän määrittämiseksi, esimerkiksi lusiferaasin bioluminesenssia mittaamalla, mutta jollei enempää tietoa ole • · · : saatavissa, on mahdotonta arvioida missä määrin mikro-organismien kasvua tai/ja • · · • · · ’·' * kuolemista tapahtuu tai on tapahtunut.

• •I

Mikro-organismien kasvun määrä ja kuolemisen määrä erityisissä ympäristöissä on • · · • · ·;·’ 20 kiinnostavaa monilla aloilla. Mikro-organismien ja erityisesti vahingollisten ja/tai patogeenisten mikro-organismien kuolemisen määrä ja kasvun määrä ovat tärkeitä « · < ' ·; ·' lääketeollisuuden ja ihmiskäyttöön tarkoitettujen tuotteiden tuotantoa, varastointia ja .* ' * kuluttajille jakelua koskevien riskien arvioinnissa. Mikro-organismien kuolemisen • · · • ** ja kasvun määrien tunteminen on erityisen tärkeää erityissovellutuksissa, kuten 2 107167 antibioottien, desinfektioaineiden ja bakterisidisten tuotteiden kehittämisessä tai steriloinnin, desinfioinnin ja puhdistuksen valvonnassa.

Merkkigeenejä, jotka koodaavat luminoivia tai/ja fluoresoivia tuotteita on viety mikro-organismeihin mahdollistamaan elävien mikro-organismien määrän tai 5 eloonjäämisen määrittämistä (WO 96/23898, WO 98/14605, WO 98/30(715, WO 98/36081, US 5,824,468). Luminoivia ja fluoresoivia merkkiaineita on käytetty jopa samanaikaisesti (Fratamico et ai., Journal of Food Protection, Voi 50 No 10, 1997, 1167-1173). Luminoivia ja fluoresoivia merkkiaineita on kuitenkin käytetty ainoastaan mikro-organismien eloonjäämisen merkkiaineina, ja kahden eri 10 merkkiaineen käyttöä yhdessä mikro-organismissa mahdollistamassa kasvun ja kuolemisen määrien erottamista ei ole raportoitu.

KEKSINNÖN KOHDE JA YHTEENVETO

Käsillä olevan keksinnön kohteena on menetelmä, joka mahdollistaa mikro-, organismin kasvun ja kuolemisen määrittämisen valitun ajanjakson kuluessa . ·:'. 15 kiinnostuksen kohteena olevassa ympäristössä viemällä ainakin kaksi merkkigeeniä ; ‘ mainittuun mikro-organismiin. Menetelmä on tunnettu siitä, että a) mainitut merkkigeenit koodaavat luminoivia ja/tai fluoresoivia tuotteita, ja • · · • · · mainitun ajanjakson kuluessa mainitussa ympäristössä syntyy vähintään « · i kaksi seuraavista mainituista tuotteista: 20 i) olennaisesti pysyvä tuote, joka on syntynyt kiinnostuksen kohteena * * * olevassa ympäristössä olennaisesti tunnetussa suhteessa mainitun mikro-organismin niiden solujen kokonaismäärään, jotka ovat tai t I f :: ovat olleet elossa mainitun valitun ajanjakson kuluessa, • · • « : “ li) mainitussa kiinnostuksen kohteena olevassa ympäristössä millä • « • · « * 25 tahansa hetkellä mainitun valitun ajanjakson kuluessa elossa oleviin soluihin olennaisesti tunnetussa suhteessa läsnä oleva tuote, ja 3 107167 iii) olennaisesti pysyvä tuote, joka on syntynyt kiinnostuksen kohteena olevassa ympäristössä olennaisesti tunnetussa suhteessa mainitun mikro-organismin niiden solujen kokonaismäärään, jotka ovat kuolleet mainitun valitun ajanjakson kuluessa, ja 5 mainitut tuotteet voidaan mitata niiden luminesenssin ja/tai fluoresenssin perusteella; b) mainittua mikro-organismia inkuboidaan kiinnostuksen kohteena olevassa ympäristössä, ja mainittu luminesenssi ja/tai fluoresenssi todetaan mainitun valitun ajanjakson kuluttua, ja 10 c) mainitun mikro-organismin kasvun ja kuolemisen määrä määritetään perustuen ainakin kahteen seuraavista: i) luminesenssin tai fluoresenssin tunnettu suhde minkä tahansa mainitun valitun ajanjakson kuluttua elossa olevien solujen määrään, 15 ii) luminesenssin tai fluoresenssin tunnettu suhde niiden solujen , , kokonaismäärään, jotka ovat tai ovat olleet elossa minkä tahansa

< t I

;': mainitun valitun ajanjakson kuluessa, ja V· iii) luminesenssin tai fluoresenssin tunnettu suhde niiden solujen ‘ kokonaismäärään, jotka ovat kuolleet minkä tahansa mainitun • · · • · « 20 valitun ajanjakson kuluessa.

• · · « «· lyhyt kuvaus piirroksista • · • · · • · · - *;* Kuvio 1 esittää pGFP+luc*-plasmidia, joka sisältää sekä GFP:n että tulikärpäs-

I I

': * lusiferaasin geenejä.

• · « «· « « t < · · 4 107167

Kuvio 2 esittää fluoresenssia E. coli 'n kasvuvaiheen aikana, soluviljelmässä olevan etanolipitoisuuden funktiona, käytettäessä pGFP+luc*-plasmidia 30 °C:een lämpötilassa.

Kuvio 3 esittää luminesenssia E. coli 'n kasvuvaiheen aikana, soluviljelmässä olevan 5 etanolipitoisuuden funktiona, käytettäessä pGFP+luc*-plasmidia 30 °C:een lämpötilassa.

Kuvio 4 esittää maljauksen perusteella saatua elävien solujen määrää, ts. pesäkkeen muodostavia yksiköitä E. coli 'n kasvuvaiheen aikana, soluviljelmässä olevan etanolipitoisuuden funktiona, käytettäessä pGFP+luc*-plasmidia 30° C:een lämpö-10 tilassa.

Kuvio 5 esittää elävien solujen prosentuaalista määrää elävien/kuollejiden värjäykseen ja virtaussytometriseen määritykseen perustuen E. coli 'n kasvuvaiheen aikana, soluviljelmässä olevan etanolipitoisuuden funktiona, käytettäessä pGFP+luc*-plasmidia 30 °C:een lämpötilassa.

. ·, 15 Kuvio 6 esittää fluoresenssia ennen seerumikomplementin kanssa inkubointia ja sen t « t :' ': jälkeen E. coli 'n kasvuvaiheen aikana, soluviljelmässä olevan seerumi- '·/· komplementtipitoisuuden funktiona, käytettäessä pGFP+luc*-plasmidia 30 °C:een ': lämpötilassa.

• · · • · • · · :T: Kuvio 7 esittää luminesenssia ennen seerumikomplementin kanssa inkubointia ja 20 sen jälkeen E. coli ’n kasvuvaiheen aikana, soluviljelmässä olevan seerumi- • · ’···* komplementtipitoisuuden funktiona, käytettäessä pGFP+luc*-plasmidia 30 °C:een • · T lämpötilassa.

« • · · • · · ««t : ]": Kuvio 8 esittää maljauksen perusteella saatua elävien solujen prosentuaalista määrää E. coli'n kasvuvaiheen aikana, soluviljelmässä olevan seerumikomplementti-: /.: 25 pitoisuuden funktiona, käytettäessä pGFP+luc*-plasmidia 30 °C:een lämpötilassa.

5 107167

KEKSINNÖN YKSITYISKOHTAINEN KUVAUS

Käsillä olevan keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää mikro-organismin kasvun ja kuolemisen määrittämiseen valitun ajanjakson kuluessa missä tahansa erityisessä kiinnostuksen kohteena olevassa ympäristössä. Menetelmä on 5 käyttökelpoinen, jos mikro-organismiin voidaan viedä kaksi erilaista merkkigeeniä, jotka koodaavat luminoivia ja/tai fluoresoivia tuotteita, ja jos näiden tuotteet täyttävät vähintään kaksi seuraavista kolmesta kriteeristä: a) mainittu luminoiva tuote luminoi tai mainittu fluoresoiva tuote fluoresoi olennaisesti tunnetussa suhteessa mainitun mikro-organismin niiden solujen 10 määrään, jotka ovat elossa mainitun valitun ajanjakson aikana; b) mainittu luminoiva tuote luminoi tai mainittu fluoresoiva tuote fluoresoi olennaisesti tunnetussa suhteessa mainitun mikro-organismin niiden solujen määrään, jotka ovat tai ovat olleet elossa mainitun valitun ajanjakson aikana, ja 15 c) mainittu luminoiva tuote luminoi tai mainittu fluoresoiva tuote fluoresoi ‘. i.' olennaisesti tunnetussa suhteessa mainitun mikro-organismin niiden solujen ' määrään, jotka ovat kuolleet mainitun valitun ajanjakson aikana.

I i * < '; ‘ Tässä hakemuksessa käsite ’’mikro-organismi” tarkoittaa mitä tahansa mikro- • · · • » · ’•[t* organismia, johon merkkigeenit voidaan viedä siten, että ne toimivat keksinnön • · · i * * * 20 mukaisesti. ’’Mikro-organismi” voi siten tarkoittaa bakteereja, hiivaa tai sieniä.

« c *···' Käsite ’’merkkigeenin vieminen mikro-organismiin” tarkoittaa mitä tahansa • · · • · ”·* menetelmää, jolla merkkigeeni voidaan saada toimimaan mikro-organismissa • · · keksinnön mukaisesti. Yksi keino merkkigeenien viemiseksi mikro-organismiin on < « • · ':' yhdistelmäkannan luominen. Tämä voidaan tehdä muuntamalla kanta merkkigeenit «· ·. " 25 sisältävällä plasmidilla. Vaihtoehtoinen tapa viedä merkkigeenit bakteereihin on

< «I

vaihdettavien elementtien käyttäminen. Tässä tekniikassa merkkigeenit lisätään lisäyssekvenssien välissä siirtoplasmidissa. Sen jälkeen plasmidi viedään soluun 6 107167 käyttäen esimerkiksi transformaation konjugaatiota, ja kun se on solun si$ällä, lisäyssekvenssien ympäröimät geenit integroituvat bakteerikromosomiin. Integrointi on pysyvä, ts. ei tarvita valittavissa olevaa markkeria, kuten antibioottiresistenssiä.

Mikro-organismin kasvun ja kuolemisen määrittäminen saattaa olla kiinnostavaa 5 useissa erityisissä ympäristöissä. Lääkeainetutkimuksessa eri lääkeaineiden ja lääkkeeksi ehdotettujen aineiden, esimerkiksi antibioottien, vaikutus suoliston patogeenisten, mutta myös hyödyllisten mikro-organismien eloonjäämiseen on kiinnostavaa. Täten kiinnostus kohdistuu viime kädessä näiden mikro-organistnien käyttäytymiseen lääkeaineiden vaikutuksen alaisena olevassa fysiologisessa 10 ympäristössä.

Toinen laaja alue, jolla mahdollisuus määrittää erityisten mikro-organismien kaisvua ja kuolemista on kiinnostavaa, on kaikkien ihmiskäyttöön tarkoitettujen tuotteiden tuotanto, prosessointi, varastointi ja jakelu. Tällä alueella patogeenisten tai mahdollisesti vahingollisten mikro-organismien käyttäytyminen näiden tuotteiden 15 elämänkaaren eri ympäristöissä on erityisen kiinnostavaa ja koskee monia eri , tekijöitä, kuten lämpötilan, kosteuden tai valon sekä mahdollisen säilöntäaineiden ' i käytön jne. vaikutuksia.

,,. Lisäksi mikro-organismien kasvun ja kuolemisen määrät saattavat olla kiinnostavia ;1!1. ympäristöarvioinnissa, esimerkiksi arvioitaessa ympäristöpäästöjen vaikutusta.

··· « 1 « * ♦ « 20 Merkkigeenien koodaamat luminoivat tai fluoresoivat tuotteet tämän keksinnön eri . 1 · ·. suoritusmuodoissa voivat vaihdella niin kauan kuin niiden suhde joko elossa olevien « · · solujen kokonaismäärään tai niihin soluihin, jotka ovat tai ovat olleet elossa, tai niihin soluihin, jotka ovat kuolleet, on olennaisesti tunnettu. Kasvu ja kuoleminen

« ( I

voidaan määrittää, jos voidaan määrittää kaksi seuraavista: elossa olevat solut, 25 elossa olevat tai elossa olleet solut, tai kuolleet solut. Mitattu luminesenssi ja/tai !.'·« fluoresenssi voivat täten koskea esimerkiksi tuotetta, joka ilmentyy esimerkiksi konstitutiivisesti tai kunkin solun elinkaaren erityisen vaiheen (esimerkiksi 7 107167 lisääntymisen tai kuolemisen) laukaisemana ja joka on stabiili tai labiili, tai jonka luminesenssi tai fluoresenssi on riippuvainen tekijästä, joka liittyy esimerkiksi kunkin solun elinkaaren määrättyyn vaiheeseen. Riippuen mainitun tuotteen yksilöllisistä ominaisuuksista - miten se on tuotettu, onko tuote stabiili vai labiili, 5 sen luminesenssin tai fluoresenssin mahdollinen riippuvuus mainituista tekijöistä jne. - mitattu luminesenssi tai fluoresenssi voi olla suhteessa yhteen kolmesta tuntemattomasta, joista kahden on oltava tunnettuja, jotta mainittujen solujen kasvu ja kuoleminen voidaan määrittää.

Keksinnön erään erityisen suoritusmuodon mukaisesti Escherichia coli -kannan 10 kasvun ja kuolemisen määrittäminen eri kemikaalien tai matriisien vaikutuksen alaisena oli mahdollista kun laadittiin yhdistelmäkanta, joka ilmaisee sekä lusiferaasin että GFP:n. Kaiken kaikkiaan useiden eri kemikaalien ja matriisien, esim. CdCl2:n etanolin, kloramfenikoli-, rifampisiini- ja tetrasykliiniantibiootin, samoin kuin seerumikomplementin vaikutukset mainittuun E. coli -yhdistelmä-15 kantaan testattiin ja todettiin käyttökelpoiseksi.

, , Keksintöä kuvataan yksityiskohtaisemmin seuraavan tutkimuksen avulla, jossa sekä

i < i < I I

. ‘ j1. lusiferaasia että GFP:tä ilmentävän Escherichia coli -yhdistelmäkannan kasvu ja i ; \ i kuoleminen määritetään etanolin tai seerumikomplementin vaikutuksen alaisena.

t < * » i I 5 • · · • · · • · · . ·: , Yhteenveto tutkimuksesta • · · ,,, 20 Lusiferaasin ja vihreän fluoresoivan proteiinin geenit ovat viime aikoina herättäneet • · • * kiinnostusta merkkigeeneinä. Lusiferaasi on entsyymi, joka tuottaa luminesenssia »·· *, substraattilusiferiinin, molekulaarisen hapen ja ATP:n läsnäollessa. Vihreä

S · S

/>·’, fluoresoiva proteiini (GFP) tuottaa vihreää fluoresenssia, kun sitä aktivoidaan

I I I

./ valolla. GFP:stä on esitetty monia mutaatiomuotoja: joidenkin herätys- ja < · * « : 25 emissioaaltopituudet eroavat villin tyypin vastaavista, ja jotkut mutantit • « muodostavat pysyvämpiä proteiineja korkeammissa lämpötiloissa.

8 107167

Tuotimme E. coli ’sta yhdistelmäkannan, joka ilmentää sekä lusiferaasia että GFP:tä. Rakenteessamme käytimme GFP:n mutanttia, joka on pysyvämpi yli +30 °C:een lämpötiloissa ja joka kypsyy nopeammin kuin villi tyyppi. Lusiferaasi oli peräisin pohjois-amerikkalaisesta tulikärpäsestä, Photinus pyralis ista.

5 E. coli -kanta MC 1061 muunnettiin plasmidilla, joka sisälsi sekä GFP:n että tulikärpäslusiferaasin geenejä. Kuvio 1 kuvaa plasmidia yleensä. Sekvenssi on kuvattu oheisessa SEQUENCE LISTING -osassa. Sekvenssin olennaiset koodit ovat seuraavat: lac-promoottori 95-199 10 GFP 289-1008 tulikärpäslusiferaasi 1044-2696 β-laktamaasi 3251-4111

Rakenteessamme, katso kuvio 1, lusiferaasigeeni sijaitsee GFP-geenin vieressä, ja molemmat geenit transkriboituvat samaan suuntaan. Transkriptio alkaa GFP:n 15 edessä olevasta lac-promoottorista. Lac-promoottori on rakenteellisesti aktiivinen, , ; koska MC 1061-soluista puuttuu sen repressori. Plasmidissa on myös ampisilliini- :, resistenssin geeni (beetalaktamaasi).

; Muunnettua E. coli -kantaa kasvatettiin eri etanoli- tai seerumikomplementti- • · · : pitoisuuksien vaikutuksen alaisena.

»·· • · · * · · .···. 20 Menetelmät • · • « · t · · • · c • · · . Kasvuolosuhteet • · · 11 • · · < « «

( I

Yksi puhtaasta kasvatusmaljasta peräisin oleva pesäke siirrostettiin 5 ml:aan * * · . LB-kasvualustaa, jossa oli ampisilliinia (100 pg/ml), ja sitä kasvatettiin +37 °C;een

« M

lämpötilassa ravistimessa, 250 kierrosta minuutissa, noin kolmen tunnin ajan. Sen 25 jälkeen solujen määrä millilitrassa määritettiin virtaussytometrisesti käyttäen 9 107167 referenssinä fluoresoivia pallomaisia lateksihiukkasia. Sen jälkeen miljoona solua siirrettiin erlenmeyerpulloon, jossa oli 50 ml LB-kasvualustaa ja ampisilliinia. Viljelmää kasvatettiin yön yli ravistimessa, 190 kierrosta minuutissa, huoneenlämmössä, jotta estettäisiin viljelmän kasvu stationaarivaiheeseen yön 5 aikana. Aamulla viljelmä siirrettiin ravistimeen, jonka kierrosluku oli 330 kierrosta minuutissa, ja sitä kasvatettiin, kunnes saavutettiin stationaarivaihe, tai sitä käytettiin +30 °C:een lämpötilassa noin tunnin aikana tapahtuneen kasvun jälkeen etanolin tai seerumikomplementin vaikutuksen tutkimiseen kuten alla on kuvattu.

Kemikaalien vaikutus E. coli h lisääntymiseen 10 Yllä kuvatulla tavalla saatua viljelmää käytettiin etanolin tai seerumikomplementin vaikutuksen tutkimiseen seuraavasti:

Etanoli

Etanolia (Aa, Primalco Oy) laimennettiin puhtaaseen veteen, jotta saatiin 50, 45,25, 10, 5, 1 ja 0 prosentin etanolipitoisuudet, kun 500 μΐ mainittua liuosta lisättiin

« I I

15 500pl:aan mainittua viljelmää eppendorfputkessa. Seos pyörresekoitettiin ja sitä :' , inkuboitiin 5 minuuttia ennen fluoresenssin ja luminesenssin mittausta. Elävät solut laskettiin uudelleen maljaamalla ja myös elävien/kuolleiden värjäyksen avulla.

• · · : Elävät/kuolleet -menetelmässä käytetty cyto 9 -väriaine värjää kaikki solut, kun taas «·« • · « *·* * propidiumjodidi värjää vain kuolleet solut. Värjäyksen jälkeen solut viedään ^. o 20 virtaussytometrin läpi, jonka avulla kuolleet ja elävät solut voidaan erottaa toisistaan • « • ·· ja niiden suhde määrittää. (Virta et ai. (1998) Appi. Environ. Microbiol. 64:515-519.) • · · ' • · « • · ♦ * < I c : ·. Seerumikomplementti *

Seerumikomplementin vaikutusta mainittuun E. coli 'n yhdistelmäkantaan tutkittiin 25 käyttämällä 90 minuutin inkubointiaikaa kuten Virta et ai. (1990) Appi. Environ.

10 107167

Microbiol. 64:515-519 ovat kuvanneet käytettynä toiseen E. coli'n yhdistelmä-kantaan.

Fluoresenssin ia luminesenssin mittaukset

Mittaukset tehtiin yhdistetyllä fluoro- ja luminometrillä, Fluoroscan Ascent FL:llä, 5 jonka toimittaja on Labsystems Ltd. (Helsinki, Suomi). Solujen kasvua seurattiin samanaikaisesti virtaussytometrilla.

Mittauksia varten 100 μΐ bakteeriviljelmää pipetoitiin mikrotitrauslevyn kuoppiin. Fluoresenssi mitattiin käyttäen 485 nm herätykseen ja 510 nm emissioon. Mittausaika oli 20 ms. Fluoresenssin mittauksen jälkeen kuoppiin annosteltiin 10 100 μΐ lusiferiinia 0,1 M:ssa sitruunahappo-natriumsitraattipuskuria (pH 5,0) ja levyä ravistettiin kahden minuutin ajan (ravistushalkaisija 1 mm, 1 020 kierrosta minuutissa), jonka jälkeen luminesenssi merkittiin muistiin, mittausajan ollessa 1000 ms.

. (:': Maliaus 15 Näytteet laimennettiin maljausta varten 102—107 -kertaisesti käyttäen 150mM NaCl:a ja maljattiin L agar-maljoihin (L-broth, joka sisältää 1,6% agaria).

·»» : Pesäkkeet laskettiin kun näytteitä oli inkuboitu yön yli 37 °C:eessa.

• · · • « · ... Elävien/kuolleiden värjäys ia virtaussvtometrianalvvsi • i

IM

··»

Bakteereja lOOOmhsta soluviljelmää käytettiin elävien/kuolleiden solujen 20 värjäykseen ja virtaussytometrianalyysiin käyttäen mikroskopiaan ja * * * ·;·* kvantitatiiviseen analyysiin LIVE/DEAD BacLight viability kit -määrityssarjaa : ’·· (luettelonumero L-7005), jonka toimittaja on Molecular Probes Europe (Leiden, ' '· Alankomaat), ja Fluoresbrite-helmiä (halkaisija 1,8 pm), joiden toimittaja on 11 107167

Polysciences Inc. (Warrington, Pa), tavalla, jonka ovat kuvanneet Virta et ai. (1998) Appi. Environ. Microbiol. 64:515-519.

Tulokset

Kun viljelmät siirrettiin +30 °C:een lämpötilaan, solut kasvoivat logaritmisesti 1—4 5 tuntia, alkuperäisestä solukonsentraatiosta riippuen. Luminesenssi ja fluoresenssi nousivat logaritmisesti ja olivat olennaisesti vakiot solua kohden. Täten solujen määrä voitiin määrittää luminesenssin ja fluoresenssin perusteella.

Kun etanolia lisättiin eri pitoisuuksina kasvatusalustaan (katso kuvia 5 ja 6), kuoleminen oli hyvin lyhyen 5 minuutin inkubointiajan jälkeen enemmän tai 10 vähemmän merkityksetön etanolipitoisuuden ollessa alle 5 % ja tuli merkitsevämmäksi etanolipitoisuuden lisääntyessä, saavuttaen erittäin selvän merkitsevyyden kun etanolipitoisuudet olivat yli 10 %. Vastaavasti fluoresenssi (kuvio 2) oli etanolipitoisuudesta riippumatta olennaisesti vakio huolimatta vastaavasta maljauksen perusteella määritetystä alenevasta elävien solujen määrästä '15 (kuvio 4) ja elävien/kuolleiden solujen värjäyksen perusteella määritetystä elävien I i solujen prosentuaalisesta määrästä (kuvio 5), kun taas luminesenssi (kuvio 3) aleni dramaattisesti vastaten olennaisesti maljauksen perusteella määritettyä dramaattista alenemista (kuvio 4) ja elävien solujen prosentuaalista määrää (kuvio 5) etanoli-: : pitoisuuden lisääntyessä.

.···, 20 Seerumikomplementin vaikutus E.coli'n kasvuun ja kuolemiseen esitetään • · < ·"*: kuvissa 7—9. Fluoresenssi (kuvio 6) ja luminesenssi (kuvio 7) esitetään ennen • · · . (neliöt) ja jälkeen (ympyrät) 90 minuutin inkubointia seerumikomplementin kanssa.

• · · :' ' ‘: Fluoresenssi (kuvio 6) on hieman kohonnut inkuboinnin aikana riippumatta seerumipitoisuudesta, kun taas luminesenssi (kuvio7) alenee inkuboinnin aikana 25 seerumipitoisuutta lisättäessä. Luminesenssin aleneminen inkuboinnin aikana 107167 12 seerumipitoisuutta lisättäessä korreloi selvästi inkuboinnin jälkeen elossa olevien solujen prosentuaalisen määrän kanssa (kuvio 8).

• · · • · · • · · • ·· • · · • · · • · « • < • · • · · • · « • « « • i « • · · • · · < < • · · 13 107167

SEQUENCE LISTING

<110> LILIUS, Esa-Matti <120> A Method to Enable Assessment of Growth and Death of Micro-orgnaisms <130> pGFP+luc* -plasmid <140> <141> <160> 4 <170> Patentin Ver. 2.1

<210> 1 <211> 5051 <212> DNA

<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: pGFP+luc* plasmid <220> <221> promoter <222> (95)..(199) <223> lac promoter <220>

<221> CDS

<222> (289) . . (1008)

<223> GFP

<220>

<221> CDS

<222> (1044)..(2696) <223> firefly luciferase # j*j <220>

<221> CDS

<222> (3251) . . (4111) • <223> beta-lactamase

< t I

*· *· <400> 1 *j··· agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 60 ·*·*· acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 120 ·*;* tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgtggaa 180 ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagcttg 240 • ·;··* catgcctgca ggtcgactct agaggatccc cgggtaccgg tcgccacc atg gtg age 297

Met Val Ser • · · « * : i *·· aag ggc gag gag ctg ttc acc ggg gtg gtg ccc ate ctg gtc gag ctg 345 ΐ ‘,;· Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro lie Leu Val Glu Leu ...., 5 10 15

( I

« 4 1 gac ggc gac gta aac ggc cac aag ttc age gtg tcc ggc gag ggc gag 393 ;.<J Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu 20 25 30 35 • · f « « « « · * · 14 107167 ggc gat gcc acc tac ggc aag ctg acc ctg aag ttc ate tgc acc acc 441

Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe He Cys Thr Thr 40 45 50 ggc aag ctg ccc gtg ccc tgg ccc acc etc gtg acc acc ctg acc tac 489

Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr 55 60 65 ggc gtg cag tgc ttc age ege tac ccc gac cac atg aag cag cac gac 537

Gly Val Gin Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gin His Asp 70 75 80 ttc ttc aag tcc gcc atg ccc gaa ggc tac gtc cag gag ege acc ate 585

Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Vai Gin Glu Arg Thr He 85 90 95 ttc ttc aag gac gac ggc aac tac aag acc ege gcc gag gtg aag ttc 633

Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe 100 105 110 115 gag ggc gac acc ctg gtg aac ege ate gag ctg aag ggc ate gac ttc 681

Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg He Glu Leu Lys Gly He Asp Phe 120 125 130 aag gag gac ggc aac ate ctg ggg cac aag ctg gag tae aac tac aac 729

Lys Glu Asp Gly Asn He Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn 135 140 145 age cac aac gtc tat ate atg gcc gac aag cag aag aac ggc ate aag 777

Ser His Asn Val Tyr He Met Ala Asp Lys Gin Lys Asn Gly He Lys 150 155 160 gtg aac ttc aag ate ege cac aac ate gag gac ggc age gtg cag etc 825

Vai Asn Phe Lys He Arg His Asn He Glu Asp Gly Ser Val Gin Leu 165 170 175 gcc gac cac tac cag cag aac acc ccc ate ggc gac ggc ccc gtg ctg 873

Ala Asp His Tyr Gin Gin Asn Thr Pro He Gly Asp Gly Pro Val Leu 180 185 190 195 . Ctg ccc gac aac cac tac ctg age acc cag tec gcc ctg age aaa gac 921 I \ ] Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gin Ser Ala Leu Ser Lys Asp : : : 200 205 210 < l ccc aac gag aag ege gat cac atg gtc ctg ctg gag ttc gtg acc gcc 969 * * Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala ·:*·: 215 220 225

Ml : ί : gee ggg ate act etc ggc atg gac gag ctg tae aag taa agcggccgct 1018 ),, Ala Gly He Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys ::: 230 235 240 • ctagaactag tggatccccc gtacc atg gaa gac gcc aaa aac ata aag aaa 1070 . Met Glu Asp Ala Lys Asn He Lys Lys *:**: 245 • · · ggc ccg geg cca ttc tat ccg eta gag gat gga acc get gga gag caa 1118

Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gin 250 255 260 265 • · .··*. ctg cat aag get atg aag aga tac gcc ctg gtt cct gga aca att get 1166

Leu His Lys Ala Met Lys Arg Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr He Ala 270 275 280 ♦ · . . ttt aca gat gca cat ate gag gtg aac ate aeg tac geg gaa tac ttc 1214 : Phe Thr Asp Ala His He Glu Val Asn He Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe • ‘ 285 290 295 15 107167 gaa atg tee gtt egg ttg gca gaa get atg aaa cga tat ggg ctg aat 1262

Glu Met Ser Vai Arg Leu Ala Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn 300 305 310 aca aat cac aga atc gtc gta tgc agt gaa aac tet ett caa ttc ttt 1310

Thr Asn His Arg Ile Vai Vai Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gin Phe Phe 315 320 325 atg eeg gtg ttg ggc gcg tta ttt atc gga gtt gca gtt gcg ccc gcg 1358

Met Pro Vai Leu Gly Ala Leu Phe Ile Gly Vai Ala Vai Ala Pro Ala 330 335 340 345 aac gae att tat aat gaa cgt gaa ttg etc aac agt atg aac att tcg 1406

Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg Glu Leu Leu Asn Ser Met Asn Ile Ser 350 355 360 cag eet acc gta gtg ttt gtt tee aaa aag ggg ttg caa aaa att ttg 1454

Gin Pro Thr Vai Vai Phe Vai Ser Lys Lys Gly Leu Gin Lys Ile Leu 365 370 375 aac gtg caa aaa aaa tta cca ata atc cag aaa att att atc atg gat 1502

Asn Vai Gin Lys Lys Leu Pro Ile Ile Gin Lys Ile Ile Ile Met Asp 380 385 390 tet aaa acg gat tae cag gga ttt cag tcg atg tae acg ttc gtc aca 1550

Ser Lys Thr Asp Tyr Gin Gly Phe Gin Ser Met Tyr Thr Phe Vai Thr 395 400 405 tet cat cta eet ccc ggt ttt aat gaa tae gat ttt gta cca gag tee 1598

Ser His Leu Pro Pro Gly Phe Asn Glu Tyr Asp Phe Vai Pro Glu Ser 410 415 420 425 ttt gat cgt gae aaa aca att gca ctg ata atg aac tee tet gga tet 1646

Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser 430 435 440 act ggg tta eet aag ggt gtg gee ett eeg cat aga act gee tgc gtc 1694

Thr Gly Leu Pro Lys Gly Vai Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Vai 445 450 455 aga ttc tcg cat gee aga gat eet att ttt ggc aat caa atc att eeg 1742 *···' Arg Phe Ser His Ala Arg Asp Pro Ile Phe Gly Asn Gin Ile Ile Pro 460 465 470 gat act gcg att tta agt gtt gtt cca ttc cat cac ggt ttt gga atg 1790 *· · Asp Thr Ala Ile Leu Ser Vai Vai Pro Phe His His Gly Phe Gly Met 475 480 485 • · ;*{*; ttt act aca etc gga tat ttg ata tgt gga ttt cga gtc gtc tta atg 1838 ·* * Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu Ile Cys Gly Phe Arg Vai Vai Leu Met 490 495 500 505 • tat aga ttt gaa gaa gag ctg ttt tta cga tee ett cag gat tae aaa 1886

Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu Phe Leu Arg Ser Leu Gin Asp Tyr Lys • .;..j 510 515 520 ·***; att caa agt gcg ttg eta gta cca acc eta ttt tea ttc ttc gee aaa 1934 ···* Ile Gin Ser Ala Leu Leu Vai Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys 525 530 535 *..! age act ctg att gae aaa tae gat tta tet aat tta cac gaa att get 1982 ί · Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala *!* 540 545 550

• i > i I

tet ggg ggc gca eet ett tcg aaa gaa gtc ggg gaa gcg gtt gca aaa 2030 : Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser Lys Glu Vai Gly Glu Ala Vai Ala Lys ’· *: 555 560 565 16 107167 cgc ttc cat ctt cca ggg ata cga caa gga tat ggg etc act gag act 2078

Arg Phe His Leu Pro Gly lie Arg Gin Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr 570 575 580 585 aca tea get att ctg att aca ccc gag ggg gat gat aaa ccg ggc geg 2126

Thr Ser Ala lie Leu lie Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala 590 595 600 gtc ggt aaa gtt gtt cca ttt ttt gaa geg aag gtt gtg gat ctg gat 2174

Vai Gly Lys Vai Val Pro Phe Phe Glu Ala Lys Vai Val Asp Leu Asp 605 610 615 acc ggg aaa aeg ctg ggc gtt aat cag aga ggc gaa tta tgt gtc aga 2222

Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val Asn Gin Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg 620 625 630 gga cct atg att atg tcc ggt tat gta aac aat ccg gaa geg acc aac 2270

Gly Pro Met lie Met Ser Gly Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn 635 640 645 gcc ttg att gac aag gat gga tgg eta cat tet gga gac ata get tae 2318

Ala Leu lie Asp Lys Asp Gly Trp Leu His Ser Gly Asp lie Ala Tyr 650 655 660 665 tgg gac gaa gac gaa cac ttc ttc ata gtt gac cgc ttg aag tet tta 2366

Trp Asp Glu Asp Glu His Phe Phe lie Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu 670 675 680 att aaa tae aaa gga tac cag gtg gcc ccc get gaa ttg gag teg ata 2414 lie Lys Tyr Lys Gly Tyr Gin Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser lie 685 690 695 ttg tta caa cac ccc aac ate ttc gac geg ggc gtg gca ggt ctt ccc 2462

Leu Leu Gin His Pro Asn lie Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro 700 705 710 gac gat gac gcc ggt gaa ctt ccc gcc gcc gtt gtt gtt ttg gag cac 2510

Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His 715 720 725 . gga aag aeg atg aeg gaa aaa gag ate gtg gat tac gtc gcc agt caa 2558 ' ‘ Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys Glu lie Val Asp Tyr Val Ala Ser Gin 730 735 740 745 gta aca acc gcc aaa aag ttg cgc gga gga gtt gtg ttt gtg gac gaa 2606 * * Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu ·;··; 750 755 760 gta ccg aaa ggt ctt acc gga aaa etc gac gca aga aaa ate aga gag 2654 * Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly Lys Leu Asp Ala Arg Lys lie Arg Glu 765 770 775 ate etc ata aag gcc aag aag ggc gga aag tcc aaa ttg taa 2696

Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys Gly Gly Lys Ser Lys Leu ·;·«· 780 785 790 ·***: aatgtaactg tattcagcga tgacgaaatt ettagetatt gtaatactct aggggctgca 2756 ··· ggaattegat atcaagctta tcgataccgt cgacctcgag ggggggccct ttcgtctcgc 2816 « · t···. gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc 2876 • « < < · • ttgtctgtaa geggatgeeg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg 2936 cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga gagtgcacca 2996 » · • · · *· ‘* tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggeggeetta 3056 17 107167 agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga 3116 cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa 3176 tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt 3236 gaaaaaggaa gagt atg agt att caa cat ttc cgt gtc gcc ctt att ccc 3286

Met Ser lie Gin His Phe Arg Val Ala Leu lie Pro 795 800 ttt ttt gcg gca ttt tgc ctt cct gtt ttt get cac cca gaa aeg ctg 3334

Phe Phe Ala Ala Phe Cys Leu Pro Val Phe Ala His Pro Glu Thr Leu 805 810 815 gtg aaa gta aaa gat get gaa gat cag ttg ggt gca ega gtg ggt tac 3382

Val Lys Val Lys Asp Ala Glu Asp Gin Leu Gly Ala Arg Val Gly Tyr 820 825 830 835 ate gaa ctg gat etc aac age ggt aag ate ctt gag agt ttt ege ccc 3430 lie Glu Leu Asp Leu Asn Ser Gly Lys lie Leu Glu Ser Phe Arg Pro 840 845 850 gaa gaa cgt ttt cca atg atg age act ttt aaa gtt ctg eta tgt ggc 3478

Glu Glu Arg Phe Pro Met Met Ser Thr Phe Lys Val Leu Leu Cys Gly 855 860 865 gcg gta tta tcc cgt att gac gcc ggg caa gag caa etc ggt ege ege 3526

Ala Val Leu Ser Arg lie Asp Ala Gly Gin Glu Gin Leu Gly Arg Arg 870 875 880 ata cac tat tet cag aat gac ttg gtt gag tac tea cca gtc aca gaa 3574 lie His Tyr Ser Gin Asn Asp Leu Val Glu Tyr Ser Pro Val Thr Glu 885 890 895 aag cat ctt aeg gat ggc atg aca gta aga gaa tta tgc agt get gcc 3622

Lys His Leu Thr Asp Gly Met Thr Val Arg Glu Leu Cys Ser Ala Ala 900 905 910 915 ata acc atg agt gat aac act gcg gcc aac tta ctt ctg aca aeg ate 3670 lie Thr Met Ser Asp Asn Thr Ala Ala Asn Leu Leu Leu Thr Thr lie 920 925 930 gga gga ccg aag gag eta acc get ttt ttg cac aac atg ggg gat cat 3718 ' Gly Gly Pro Lys Glu Leu Thr Ala Phe Leu His Asn Met Gly Asp His _ 935 940 945 • · ·;·; gta act ege ctt gat cgt tgg gaa ccg gag ctg aat gaa gcc ata cca 3766

Val Thr Arg Leu Asp Arg Trp Glu Pro Glu Leu Asn Glu Ala lie Pro 950 955 960 ;*·*; aac gac gag cgt gac acc aeg atg cct gta gca atg gca aca aeg ttg 3814 • Asn Asp Glu Arg Asp Thr Thr Met Pro Val Ala Met Ala Thr Thr Leu 965 970 975 .·;··{ ege aaa eta tta act ggc gaa eta ctt act eta get tec egg caa caa 3862

Arg Lys Leu Leu Thr Gly Glu Leu Leu Thr Leu Ala Ser Arg Gin Gin ·*’*: 980 985 990 995 • · · tta ata gac tgg atg gag gcg gat aaa gtt gca gga cca ctt ctg ege 3910 ‘ : Leu lie Asp Trp Met Glu Ala Asp Lys Val Ala Gly Pro Leu Leu Arg 1000 1005 1010 . teg gcc ctt ccg get ggc tgg ttt att get gat aaa tet gga gcc ggt 3958 ....: Ser Ala Leu Pro Ala Gly Trp Phe lie Ala Asp Lys Ser Gly Ala Gly ‘ ’ 1015 1020 1025 Φ · • « Φ 18 107167 gag cgt; ggg tct cgc ggt ate att gca gca ctg ggg cca gat ggt aag 4006

Glu Arg Gly Ser Arg Gly lie lie Ala Ala Leu Gly Pro Asp Gly Lys 1030 1035 1040 ccc tcc cgt ate gta gtt ate tae aeg aeg ggg agt cag gca act atg 4054

Pro Ser Arg Ile Vai Val lie Tyr Thr Thr Gly Ser Gin Ala Thr Met 1045 1050 1055 gat gaa ega aat aga cag ate get gag ata ggt gee tea ctg att aag 4102

Asp Glu Arg Asn Arg Gin lie Ala Glu lie Gly Ala Ser Leu lie Lys 1060 1065 1070 1075 cat tgg taa ctgtcagacc aagtttactc atatataett tagattgatt 4151

His Trp taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 4211 ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 4271 aaggatette ttgagatcct ttttttctgc gegtaatetg ctgcttgcaa acaaaaaaac 4331 caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 4391 taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag 4451 gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 4511 cagtggctgc tgccagtggc gataagtegt gtcttaccgg gttggactca agaegatagt 4571 taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 4631 agegaaegae ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga getatgagaa agcgccacgc 4691 ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc eggtaagegg cagggtcgga acaggagagc 4751 gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 4811 acctctgact tgagegtega tttttgtgat getegteagg ggggcggagc ctatggaaaa 4871 , acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 4931 ][[ tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg 4991 ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaageggaag 5051 • · ·:··· <2io> 2 <211> 239 <2i2> prt <213> Artificial Sequence : : ; <223> Description of Artificial Sequence: pGFP+luc* ' plasmid <400> 2 ’ϊ**ϊ Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro lie Leu ... 15 10 15 * S Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly “* 20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe lie : .· 35 40 45 . · · ·. Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr ...· 50 55 60 * Leu Thr Tyr Gly Val Gin Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys ·:··· 65 70 75 80 . , Gin His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gin Glu : ·.: 85 90 95

Arg Thr lie Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 19 107167

Vai Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Vai Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Vai Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gin Lys Asn 145 150 155 160

Gly Ile Lys Vai Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175

Vai Gin Leu Ala Asp His Tyr Gin Gin Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190

Pro Vai Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gin Ser Ala Leu 195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Vai Leu Leu Glu Phe 210 215 220

Vai Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235

<210> 3 <211> 550 <212> PRT

<213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: pGFP+luc* plasmid <400> 3

Met Glu Asp Ala Lys Asn lie Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro 15 10 15

Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gin Leu His Lys Ala Met Lys Arg 20 25 30

Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr lie Ala Phe Thr Asp Ala His lie Glu 35 40 45

Val Asn lie Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala 50 55 60

Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg lie Val Val 65 70 75 80

Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gin Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu 85 90 95

Phe lie Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp lie Tyr Asn Glu Arg 100 105 110 , Glu Leu Leu Asn Ser Met Asn He Ser Gin Pro Thr Val Val Phe Val " 115 120 125 ;'''< Ser Lys Lys Gly Leu Gin Lys He Leu Asn Val Gin Lys Lys Leu Pro ; 130 135 140 ;* He He Gin Lys He He He Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gin Gly • "* 145 150 155 160 ·;··: Phe Gin Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe 165 170 175

Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr He ·.. 180 185 190

Ala Leu He Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val * 195 200 205

Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp 210 215 220 .·:··· Pro He Phe Gly Asn Gin He He Pro Asp Thr Ala He Leu Ser Val 225 230 235 240 ·***: Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu *;* 245 250 255 ·.*· He Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu ! '.· 260 265 270 ··· Phe Leu Arg Ser Leu Gin Asp Tyr Lys He Gin Ser Ala Leu Leu Val 275 280 285 . Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu He Asp Lys Tyr ....: 290 295 300

Asp Leu Ser Asn Leu His Glu He Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser ;*·.♦ 305 310 315 320 *· ’· Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly He 325 330 335 20 107167

Arg Gin Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala lie Leu lie Thr 340 345 350

Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Vai Gly Lys Vai Val Pro Phe 355 360 365

Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val 370 375 380

Asn Gin Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met lie Met Ser Gly 385 390 395 400

Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu He Asp Lys Asp Gly 405 410 415

Trp Leu His Ser Gly Asp He Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe 420 425 430

Phe He Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu He Lys Tyr Lys Gly Tyr Gin 435 440 445

Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser He Leu Leu Gin His Pro Asn He 450 455 460

Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu 465 470 475 480

Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys 485 490 495

Glu He Val Asp Tyr Val Ala Ser Gin Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu 500 505 510

Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly 515 520 525

Lys Leu Asp Ala Arg Lys He Arg Glu He Leu He Lys Ala Lys Lys 530 535 540

Gly Gly Lys Ser Lys Leu 545 550

<210> 4 <211> 286 <212> PRT

<213> Artificial Sequence <223> Description of Artificial Sequence: pGFP+luc* plasmid <400> 4

Met Ser He Gin His Phe Arg Val Ala Leu He Pro Phe Phe Ala Ala 15 10 15 , :; Phe Cys Leu Pro Val Phe Ala His Pro Glu Thr Leu Val Lys Val Lys ; 20 25 30 ;' Asp Ala Glu Asp Gin Leu Gly Ala Arg Val Gly Tyr He Glu Leu Asp 35 40 45

Leu Asn Ser Gly Lys He Leu Glu Ser Phe Arg Pro Glu Glu Arg Phe * 50 55 60 *;··; Pro Met Met Ser Thr Phe Lys Val Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Ser 65 70 75 80

Arg He Asp Ala Gly Gin Glu Gin Leu Gly Arg Arg He His Tyr Ser 85 90 95

Gin Asn Asp Leu Val Glu Tyr Ser Pro Val Thr Glu Lys His Leu Thr * 100 105 110

Asp Gly Met Thr Val Arg Glu Leu Cys Ser Ala Ala He Thr Met Ser 115 120 125 ♦:··: Asp Asn Thr Ala Ala Asn Leu Leu Leu Thr Thr He Gly Gly Pro Lys 130 135 140 ♦***: Glu Leu Thr Ala Phe Leu His Asn Met Gly Asp His Val Thr Arg Leu *:* 145 150 155 160 · « Asp Arg Trp Glu Pro Glu Leu Asn Glu Ala He Pro Asn Asp Glu Arg • 165 170 175 ··· Asp Thr Thr Met Pro Val Ala Met Ala Thr Thr Leu Arg Lys Leu Leu :...· 180 185 190 • Thr Gly Glu Leu Leu Thr Leu Ala Ser Arg Gin Gin Leu He Asp Trp 195 200 205

Met Glu Ala Asp Lys Val Ala Gly Pro Leu Leu Arg Ser Ala Leu Pro :\· 210 215 220 *· *· Ala Gly Trp Phe He Ala Asp Lys Ser Gly Ala Gly Glu Arg Gly Ser 225 230 235 240 21 107167

Arg Gly Ile Ile Ala Ala Leu Gly Pro Asp Gly Lys Pro Ser Arg Ile 245 250 255

Vai Vai Ile Tyr Thr Thr Gly Ser Gin Ala Thr Met Asp Glu Arg Asn 260 265 270

Arg Gin Ile Ala Glu Ile Gly Ala Ser Leu Ile Lys His Trp 275 280 285 i • · • 4 • · · • · · • « · • ♦ · • « ( ♦ « · • · • · · • · ·«« • · · 4 · 1 4 · • « « · « « 4 41 • 4 » > > » 4 • 4 4 4 4 4 4 4 « 4 4

Claims (5)

22 107167

1. Menetelmä, joka mahdollistaa mikro-organismin kasvun ja kuolemisen määrittämisen valitun ajanjakson kuluessa kiinnostuksen kohteena olevassa ympäristössä viemällä ainakin kaksi merkkigeeniä mainittuun mikro-organismiin, 5 joka menetelmä on tunnettu siitä, että a) mainitut merkkigeenit koodaavat luminoivia ja/tai fluoresoivia tuotteita, ja että mainitun ajanjakson kuluessa mainitussa ympäristössä syntyy vähintään kaksi seuraavista mainituista tuotteista: i) olennaisesti pysyvä tuote, joka on syntynyt kiinnostuksen kohteena 10 olevassa ympäristössä olennaisesti tunnetussa suhteessa mainitun mikro- organismin niiden solujen kokonaismäärään, jotka ovat tai ovat olleet elossa mainitun valitun ajanjakson kuluessa, ii) mainitussa kiinnostuksen kohteena olevassa ympäristössä millä tahansa hetkellä mainitun valitun ajanjakson kuluessa elossa oleviin soluihin 15 olennaisesti tunnetussa suhteessa läsnä oleva tuote, ja iii) olennaisesti pysyvä tuote, joka on syntynyt kiinnostuksen kohteena olevassa ympäristössä olennaisesti tunnetussa suhteessa mainitun mikro-organismin niiden solujen kokonaismäärään, jotka ovat kuolleet mainitun • · valitun ajanjakson kuluessa, ja että • · · : 20 mainitut tuotteet voidaan mitata niiden luminesenssin ja/tai fluoresenssin perusteella; .···. b) mainittua mikro-organismia inkuboidaan kiinnostuksen kohteena olevassa ·· · ympäristössä, ja mainittu luminesenssi ja/tai fluoresenssi todetaan mainitun valitun 4 4 . · · \ ajanjakson kuluttua, ja että ·: "i 25 c) mainitun mikro-organismin kasvun ja kuolemisen määrä määritetään perustuen :.' · · ainakin kahteen seuraavista: 107 Ί 67 23 i) luminesenssin tai fluoresenssin tunnettu suhde minkä tahansa mainitun valitun ajanjakson kuluttua elossa olevien solujen määrään, ii) luminesenssin tai fluoresenssin tunnettu suhde niiden solujen kokonaismäärään, jotka ovat tai ovat olleet elossa minkä tahansa mainitun 5 valitun ajanjakson kuluessa, ja iii) luminesenssin tai fluoresenssin tunnettu suhde niiden solujen kokonaismäärään, jotka ovat kuolleet minkä tahansa mainitun valitun ajanjakson kuluessa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu mikro-10 organismi on gram-negatiivinen bakteeri, esimerkiksi Escherichia coli.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että a) yksi luminoivaa tuotetta koodaava merkkigeeni on lusiferaasi, jota käytetään millä tahansa mainittuun ajanjaksoon sisältyvällä hetkellä elossa olevien solujen lukumäärän määrittämiseen, ja 15 b) toinen, fluoresoivaa tuotetta koodaava merkkigeeni on vihreä fluoresoiva proteiini (GFP), jota käytetään mainitun mikro-organismin mainitun valitun « I I ,' v ajanjakson kuluessa elossa olevien tai elossa olleiden solujen kokonaismäärän :' määrittämiseen. • · • ·

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainitut * · o 20 merkkigeenit viedään mainittuun mikro-organismiin plasmidissa.

. 5. Patenttivaatimusten 3 ja 4 mukaisten menetelmien mukainen menetelmä, • · .··*. tunnettu siitä, että mainittu plasmidi on pGFP+luc* (SEQ ID NO: 1). • · · i < « • · · • I a 24 107167