JPH05137594A - 微生物代謝を検出する方法及びキツト - Google Patents
微生物代謝を検出する方法及びキツトInfo
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- JPH05137594A JPH05137594A JP3298945A JP29894591A JPH05137594A JP H05137594 A JPH05137594 A JP H05137594A JP 3298945 A JP3298945 A JP 3298945A JP 29894591 A JP29894591 A JP 29894591A JP H05137594 A JPH05137594 A JP H05137594A
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 微生物代謝を迅速に検出することができ、し
かも全自動化が可能である微生物代謝の検出方法及びキ
ットを提供することにある。 【構成】 培地、微生物の存在下で微生物の代謝に応答
して変化する吸光度スペクトルを有する第一色素、及び
第一色素の変化または未変化の吸光度スペクトルの一つ
と重なる励起スペクトルまたは発光スペクトルを有する
第二色素を組み合わせる工程（前記の培地は代謝微生物
を含むことについて分析される試料溶液を含む）、及び
試料中の代謝微生物の不在を示す第二色素の蛍光発光の
未変化または試料中の代謝微生物の存在を示す変化を観
察する工程を含むことを特徴とする微生物代謝の検出方
法。
かも全自動化が可能である微生物代謝の検出方法及びキ
ットを提供することにある。 【構成】 培地、微生物の存在下で微生物の代謝に応答
して変化する吸光度スペクトルを有する第一色素、及び
第一色素の変化または未変化の吸光度スペクトルの一つ
と重なる励起スペクトルまたは発光スペクトルを有する
第二色素を組み合わせる工程（前記の培地は代謝微生物
を含むことについて分析される試料溶液を含む）、及び
試料中の代謝微生物の不在を示す第二色素の蛍光発光の
未変化または試料中の代謝微生物の存在を示す変化を観
察する工程を含むことを特徴とする微生物代謝の検出方
法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は流体試料中の微生物代謝
を検出する方法及びキットに関する。更に詳細には、本
発明は、生物荷重（bioload)及び生物負荷(bioburden)
の測定に於いてだけでなく抗菌感受性試験及び微生物同
定技術のために微生物代謝の検出を利用して体液、食
品、水中の微生物の存在を測定する。
を検出する方法及びキットに関する。更に詳細には、本
発明は、生物荷重（bioload)及び生物負荷(bioburden)
の測定に於いてだけでなく抗菌感受性試験及び微生物同
定技術のために微生物代謝の検出を利用して体液、食
品、水中の微生物の存在を測定する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】微生物
の存在の検出、それらの計数、同定、及び抗菌剤に対す
る感受性は、診断微生物学者の主要な目標である。本発
明はこれらの領域の夫々に適用し得る微生物代謝の検出
法を利用する。体液（血液、尿、髄液、膿瘍浸出液）中
の細菌の早期検出は最も重要である。血液中の細菌の通
常の検出法は、その液体５mlを培地に接種し、細菌増殖
の指示である濁度の発現を待つことである。びんが微生
物増殖を示す濁度またはその他の変化について毎日調べ
られる。この方法は労力を要し遅いものであるが、それ
は殆どの生物の検出を可能にする。生物が一旦検出され
ると、生物を含む培地の少量のアリコートが、適当な増
殖培地を含むペトリ皿に移される。続いて分離されたコ
ロニーが同定に使用され、抗生物質感受性について試験
するのに使用される。
の存在の検出、それらの計数、同定、及び抗菌剤に対す
る感受性は、診断微生物学者の主要な目標である。本発
明はこれらの領域の夫々に適用し得る微生物代謝の検出
法を利用する。体液（血液、尿、髄液、膿瘍浸出液）中
の細菌の早期検出は最も重要である。血液中の細菌の通
常の検出法は、その液体５mlを培地に接種し、細菌増殖
の指示である濁度の発現を待つことである。びんが微生
物増殖を示す濁度またはその他の変化について毎日調べ
られる。この方法は労力を要し遅いものであるが、それ
は殆どの生物の検出を可能にする。生物が一旦検出され
ると、生物を含む培地の少量のアリコートが、適当な増
殖培地を含むペトリ皿に移される。続いて分離されたコ
ロニーが同定に使用され、抗生物質感受性について試験
するのに使用される。
【０００３】1970年代の半ばに、血液中の生物活性の検
出のための放射線測定技術が開発された。その方法で
は、血液の試料がC14 を含む炭素及びエネルギー源を含
む適当な増殖培地に接種される。接種培地が適当な期間
にわたってインキュベートされ、ガス雰囲気の一部がC
14O2について分析される( 1972年７月に発行された米国
特許第3,676,679 号）。この技術を利用する市販の装置
がベクトン・ディキンソン（Becton Dickinson) 、ジョ
ンストン(Johnston)研究所(383ハイレン・ロード、トウ
ソン、メリーランド21204)から入手し得る。その系の欠
点は、放射性物質を取り扱うことの必要による危険性、
試料のヘッドスペースへの隔膜中のニードルの複数の入
口に起因する環境汚染、及び全自動化の欠如を含む。最
近、ガス雰囲気中のCO2 の検出の非放射線測定法がベク
トン・ディキンソンにより導入され、放射性物質を取り
扱うことの必要をなくした。
出のための放射線測定技術が開発された。その方法で
は、血液の試料がC14 を含む炭素及びエネルギー源を含
む適当な増殖培地に接種される。接種培地が適当な期間
にわたってインキュベートされ、ガス雰囲気の一部がC
14O2について分析される( 1972年７月に発行された米国
特許第3,676,679 号）。この技術を利用する市販の装置
がベクトン・ディキンソン（Becton Dickinson) 、ジョ
ンストン(Johnston)研究所(383ハイレン・ロード、トウ
ソン、メリーランド21204)から入手し得る。その系の欠
点は、放射性物質を取り扱うことの必要による危険性、
試料のヘッドスペースへの隔膜中のニードルの複数の入
口に起因する環境汚染、及び全自動化の欠如を含む。最
近、ガス雰囲気中のCO2 の検出の非放射線測定法がベク
トン・ディキンソンにより導入され、放射性物質を取り
扱うことの必要をなくした。
【０００４】体液中の生物の理想的な検出系は、完全に
自動化され( ハンド・オフ) 、微生物の存在を迅速に検
出し、非侵入性のサンプリングを有するべきである。工
業上の試料（食品、化粧品、水と医薬品の試料、水）中
の微生物の検出及び計数は技術の異なる経過を辿った。
試料を分析する通常の方法は、水及び廃水の検査に関す
る標準法（Standard Methods for the Examination of
Water and Water Waste(1985) 、第７編、APHA,AWWA,WP
CF(PP860-866))であるプレート・カウント法である。こ
の方法により、試料は均質化され、滅菌水で希釈され
る。ホモジネートの10-1〜10-4の夫々の十進法の希釈液
が栄養素培地と一緒にペトリ皿に注がれる。その皿が24
〜48時間インキュベートされ、プレート上のコロニーの
数が数えられる。別法として、幾つかの研究所は現在自
動化コロニーカウンターを使用する。いずれにしても、
標準プレート・カウント(SPC) 法は極めて時間を浪費
し、費用がかかり、長すぎる。更に、コロニー形成単位
は、推測される所望の安全パラメーターと常に相関関係
があるとは限らない。
自動化され( ハンド・オフ) 、微生物の存在を迅速に検
出し、非侵入性のサンプリングを有するべきである。工
業上の試料（食品、化粧品、水と医薬品の試料、水）中
の微生物の検出及び計数は技術の異なる経過を辿った。
試料を分析する通常の方法は、水及び廃水の検査に関す
る標準法（Standard Methods for the Examination of
Water and Water Waste(1985) 、第７編、APHA,AWWA,WP
CF(PP860-866))であるプレート・カウント法である。こ
の方法により、試料は均質化され、滅菌水で希釈され
る。ホモジネートの10-1〜10-4の夫々の十進法の希釈液
が栄養素培地と一緒にペトリ皿に注がれる。その皿が24
〜48時間インキュベートされ、プレート上のコロニーの
数が数えられる。別法として、幾つかの研究所は現在自
動化コロニーカウンターを使用する。いずれにしても、
標準プレート・カウント(SPC) 法は極めて時間を浪費
し、費用がかかり、長すぎる。更に、コロニー形成単位
は、推測される所望の安全パラメーターと常に相関関係
があるとは限らない。
【０００５】インピーダンス、コンダクタンス、濁度、
CO2 、ATP 測定等を含む種々の別の技術が、工業上の試
料中の微生物の速い検出及び計数のために導入されてき
た。インピーダンス法及びコンダクタンス法は、細菌代
謝の結果としての増殖培地の電気的性質の変化を測定す
る。インピーダンス及びコンダクタンスの両方は、それ
自体を完全自動化にし、プレート・カウント法で可能で
あるよりも非常に速い微生物の検出をもたらす。これら
の方法の制限は、迷走電気干渉に対する信号の感度、温
度変動に対する感度、データが正確であることを確実に
するための可視のバック・アップのないことを含み、そ
の結果として偽陽性(false positives)がしばしば見ら
れることがある。
CO2 、ATP 測定等を含む種々の別の技術が、工業上の試
料中の微生物の速い検出及び計数のために導入されてき
た。インピーダンス法及びコンダクタンス法は、細菌代
謝の結果としての増殖培地の電気的性質の変化を測定す
る。インピーダンス及びコンダクタンスの両方は、それ
自体を完全自動化にし、プレート・カウント法で可能で
あるよりも非常に速い微生物の検出をもたらす。これら
の方法の制限は、迷走電気干渉に対する信号の感度、温
度変動に対する感度、データが正確であることを確実に
するための可視のバック・アップのないことを含み、そ
の結果として偽陽性(false positives)がしばしば見ら
れることがある。
【０００６】濁度法では、或る吸光度を得るのに必要と
される時間が記録される。増殖曲線が誘導される。その
系の欠点は、試料中の濁った物質による妨害を含み、希
釈の必要を生じる。その方法はインピーダンスより遅い
がSPC より速い傾向がある。理想的な系は、完全に自動
化され、微生物を迅速に検出、計数し、可視のバック・
アップ能力を有するべきである。
される時間が記録される。増殖曲線が誘導される。その
系の欠点は、試料中の濁った物質による妨害を含み、希
釈の必要を生じる。その方法はインピーダンスより遅い
がSPC より速い傾向がある。理想的な系は、完全に自動
化され、微生物を迅速に検出、計数し、可視のバック・
アップ能力を有するべきである。
【０００７】細菌同定に最も普通の技術は生物の生化学
的性質に関する。夫々の生物は特異な組みの酵素を有す
る。増殖培地中の一連の化学反応を行うことにより、生
物は生物の生化学的フィンガープリントを有効に与える
陽性反応及び陰性反応の組み合わせにより同定し得る。
典型的な同定反応は、炭水化物醗酵、クエン酸塩及び尿
素の如き基質の利用、硫化水素、インドール、リシンデ
カルボキシラーゼ等の生産、または抗菌剤から得られる
抑制を含む。反応結果物が、培地中の可視の色の変化ま
たは濁度の存在により測定される。
的性質に関する。夫々の生物は特異な組みの酵素を有す
る。増殖培地中の一連の化学反応を行うことにより、生
物は生物の生化学的フィンガープリントを有効に与える
陽性反応及び陰性反応の組み合わせにより同定し得る。
典型的な同定反応は、炭水化物醗酵、クエン酸塩及び尿
素の如き基質の利用、硫化水素、インドール、リシンデ
カルボキシラーゼ等の生産、または抗菌剤から得られる
抑制を含む。反応結果物が、培地中の可視の色の変化ま
たは濁度の存在により測定される。
【０００８】殆どの場合の着色試薬はpH指示薬であり、
これは化学反応により生じるアルカリ度または酸性度を
測定する。発色のその他の機構は、色素原の酵素開裂で
ある。API20(アナリタブ・プロダクツ(Analytab Produc
ts) 、プレイン・ビュー、ニューヨーク) 、エンテロチ
ューブ(Enterotube)II( ロシュ・ダイアグノスチス(Roc
he Diagnostis)、ナットリィ、ニュージャージィ) 、ミ
ニテク(Minitek)(BBLミクロバイオロジカル・システム
ズ(Microbiological systems) 、コッキィズビル、メリ
ーランド) の如き幾つかの手動式の系が、この原理に基
く。
これは化学反応により生じるアルカリ度または酸性度を
測定する。発色のその他の機構は、色素原の酵素開裂で
ある。API20(アナリタブ・プロダクツ(Analytab Produc
ts) 、プレイン・ビュー、ニューヨーク) 、エンテロチ
ューブ(Enterotube)II( ロシュ・ダイアグノスチス(Roc
he Diagnostis)、ナットリィ、ニュージャージィ) 、ミ
ニテク(Minitek)(BBLミクロバイオロジカル・システム
ズ(Microbiological systems) 、コッキィズビル、メリ
ーランド) の如き幾つかの手動式の系が、この原理に基
く。
【０００９】陽性試験及び陰性試験は、システムズ・デ
ータ・ベースの使用により生物同定に関連させ得るプロ
フィール数を生じる。結果は通常12〜18時間で得られ、
かなりの量の手動操作が必要とされる。過去10年の傾向
は、技術時間に関して労力を軽減し、或る場合には結果
を得るための時間を短縮するため、これらの試験の自動
化に関するものであった。オートバク(Autobac)IDS系(
ゼネラル・ダイアグノスチス(General Diagnostis)、モ
ーリス・プレインズ、ニュージャージィ) は半自動化系
であり、固定した35度の角度で光散乱により微生物増殖
を測定する( 米国再発行特許第28,801号) 。オートミク
ロビック・システム(Automicrobic System)(バイテク・
システム(Vitek System)社、ヘーゼルウッド、ミズーリ
ー) は完全自動化系である( ギブソン(Gibson)らの米国
特許第3,957,583 号、チャールズ(Charles) らの米国特
許第4,118,280 号、及びチャールズらの米国特許第4,11
6,775 号) 。細菌懸濁液がカードキュベットの小さいウ
ェルに抜き取られる。カードが、吸光度の変化を監視す
る機械に挿入される。カードが検出スロット中に自動的
に移動され、30分毎に監視される。アバンテージ・ミク
ロバイオロジィ・センター(Avantage Microbiology Cen
ter)( アボット・ラボラトリィズ(Abbott Laboratorie
s) 、アービング、テキサス) は光学密度または濁度の
変化を使用する。アメリカン・ミクロスキャン(America
n MicroScan)( バクスター・ヘルス・ケアー・コーポレ
ーション(BaxterHealth Care Corp.)、ウェスト・サク
ラメント、カリフォルニア) は、多くの液体系蛍光アッ
セイを含むマルチウェル・トレーの夫々のウェルを走査
する自動化系を有する。単一の光源がウェル中に通され
る。夫々のウェルの蛍光が順番に読み取られる。得られ
る蛍光強度の情報が、確率法を使用する解読用コンピュ
ーターに移される( 米国特許第4,448,534 号) 。
ータ・ベースの使用により生物同定に関連させ得るプロ
フィール数を生じる。結果は通常12〜18時間で得られ、
かなりの量の手動操作が必要とされる。過去10年の傾向
は、技術時間に関して労力を軽減し、或る場合には結果
を得るための時間を短縮するため、これらの試験の自動
化に関するものであった。オートバク(Autobac)IDS系(
ゼネラル・ダイアグノスチス(General Diagnostis)、モ
ーリス・プレインズ、ニュージャージィ) は半自動化系
であり、固定した35度の角度で光散乱により微生物増殖
を測定する( 米国再発行特許第28,801号) 。オートミク
ロビック・システム(Automicrobic System)(バイテク・
システム(Vitek System)社、ヘーゼルウッド、ミズーリ
ー) は完全自動化系である( ギブソン(Gibson)らの米国
特許第3,957,583 号、チャールズ(Charles) らの米国特
許第4,118,280 号、及びチャールズらの米国特許第4,11
6,775 号) 。細菌懸濁液がカードキュベットの小さいウ
ェルに抜き取られる。カードが、吸光度の変化を監視す
る機械に挿入される。カードが検出スロット中に自動的
に移動され、30分毎に監視される。アバンテージ・ミク
ロバイオロジィ・センター(Avantage Microbiology Cen
ter)( アボット・ラボラトリィズ(Abbott Laboratorie
s) 、アービング、テキサス) は光学密度または濁度の
変化を使用する。アメリカン・ミクロスキャン(America
n MicroScan)( バクスター・ヘルス・ケアー・コーポレ
ーション(BaxterHealth Care Corp.)、ウェスト・サク
ラメント、カリフォルニア) は、多くの液体系蛍光アッ
セイを含むマルチウェル・トレーの夫々のウェルを走査
する自動化系を有する。単一の光源がウェル中に通され
る。夫々のウェルの蛍光が順番に読み取られる。得られ
る蛍光強度の情報が、確率法を使用する解読用コンピュ
ーターに移される( 米国特許第4,448,534 号) 。
【００１０】微生物の同定に好ましい系は、完全に自動
化され、迅速に(２〜３時間で）同定し、着色した読み
取りの可視のバックアップを有し、簡単な接種を可能に
するべきである。抗菌感受性を試験するのに使用された
従来法は、キルビィ（Kirby)及びバウエル(Bauer) によ
り記載された標準化ディスク拡散法( バウエル、キルビ
ィ著、1966年、American J.Clinical Pathol. 、45巻、
４号、493 頁) であった。この方法及びその後の改良法
によれば、コロニーが採取され、液体中で懸濁されて前
もって決められた濁度を生じ、ペトリ皿中の栄養素寒天
の上に筋状に並べられる。異なる抗菌剤で含浸された紙
ディスクが接種された寒天表面の上に置かれ、薬剤が寒
天中に拡散させられ、紙ディスクのまわりに勾配を形成
する。細菌が増殖するにつれて、それらは寒天表面上に
可視のフィルムを形成する。しかしながら、抗生物質が
含浸されたディスクのまわりでは、生物がその薬剤に感
受性である場合に、増殖が抑制される。ディスクのまわ
りの抑制の領域は感受性の程度に比例する。その方法の
欠点は、必要とされる長いインキュベーション時間(18
時間)、標準化の欠如、及び定量化の欠如である。
化され、迅速に(２〜３時間で）同定し、着色した読み
取りの可視のバックアップを有し、簡単な接種を可能に
するべきである。抗菌感受性を試験するのに使用された
従来法は、キルビィ（Kirby)及びバウエル(Bauer) によ
り記載された標準化ディスク拡散法( バウエル、キルビ
ィ著、1966年、American J.Clinical Pathol. 、45巻、
４号、493 頁) であった。この方法及びその後の改良法
によれば、コロニーが採取され、液体中で懸濁されて前
もって決められた濁度を生じ、ペトリ皿中の栄養素寒天
の上に筋状に並べられる。異なる抗菌剤で含浸された紙
ディスクが接種された寒天表面の上に置かれ、薬剤が寒
天中に拡散させられ、紙ディスクのまわりに勾配を形成
する。細菌が増殖するにつれて、それらは寒天表面上に
可視のフィルムを形成する。しかしながら、抗生物質が
含浸されたディスクのまわりでは、生物がその薬剤に感
受性である場合に、増殖が抑制される。ディスクのまわ
りの抑制の領域は感受性の程度に比例する。その方法の
欠点は、必要とされる長いインキュベーション時間(18
時間)、標準化の欠如、及び定量化の欠如である。
【００１１】抗菌感受性の更に普通の方法は最小阻止濃
度(MIC) である。MIC は、栄養素培養液中で薬剤の連続
希釈液をつくり、夫々の希釈液を細菌の標準化懸濁液で
接種することにより測定される。インキュベーション後
に、種々の希釈液が濁度について調べられる。MIC は、
試験生物の肉眼的増殖を阻止する最低の抗生物質濃度と
して規定される。マイクロチューブのトレーが、マイク
ロ−メディア・システムズ（Micro-Media Systems)( ポ
トマック、ミズーリー) 、ミクロスキャン(MicroScan)
(バクスター・ヘルスケアー、ウェスト・サクラメン
ト、カリフォルニア) 、パスコ・ラボラトリィズ(Pasco
Laboratories)( ウィート・リッジ、コロラド) 、セプ
ター(Sceptor)(BBL 、ヒューストン、テキサス) により
提供されるような種々の抗生物質の凍結溶液または乾燥
溶液と共に市販されている。これらのトレーは手動で接
種され、16〜18時間インキュベートされ、しばしば手動
で読み取られる。
度(MIC) である。MIC は、栄養素培養液中で薬剤の連続
希釈液をつくり、夫々の希釈液を細菌の標準化懸濁液で
接種することにより測定される。インキュベーション後
に、種々の希釈液が濁度について調べられる。MIC は、
試験生物の肉眼的増殖を阻止する最低の抗生物質濃度と
して規定される。マイクロチューブのトレーが、マイク
ロ−メディア・システムズ（Micro-Media Systems)( ポ
トマック、ミズーリー) 、ミクロスキャン(MicroScan)
(バクスター・ヘルスケアー、ウェスト・サクラメン
ト、カリフォルニア) 、パスコ・ラボラトリィズ(Pasco
Laboratories)( ウィート・リッジ、コロラド) 、セプ
ター(Sceptor)(BBL 、ヒューストン、テキサス) により
提供されるような種々の抗生物質の凍結溶液または乾燥
溶液と共に市販されている。これらのトレーは手動で接
種され、16〜18時間インキュベートされ、しばしば手動
で読み取られる。
【００１２】また、微生物の同定に使用されたのと同じ
自動化系がMIC検出に使用される。本発明は、微生物の
存在を検出し、微生物を計数し同定し、微生物の抗菌感
受性を試験するための迅速で、有効な感度の良い手段を
得るために蛍光技術を利用する。蛍光は、その固有の感
度により検出法として魅力的である。検出の下限は数千
分の一からppm の十分の一までの範囲である。少数の微
生物が蛍光分析により迅速に検出し得る。コウムラ(Kou
mura) らは、４−メチルウンベリフェリルホスフェート
及び４−メチルウンベリフェリルガラクトシドの如き特
定のウンベリフェロン誘導体を使用して衛生量の種々の
食品、飲料、水及びトイレ用品を測定した（米国特許第
4,591,554 号、1986年) 。センシタイター(Sensititer)
( ギブコ・ラボラトリィズ(Gibco Laboratories)、アン
ドバー、マサチューセッツ) は、微生物により作用され
るまで非蛍光性である蛍光基質( 例えば、ウンベリフェ
ロン及びクマリン誘導体) を使用する。アメリカン・ミ
クロスキャン( バクスター・ヘルスケアー社、ウェスト
・サクラメント、カリフォルニア) は、４−メチルウン
ベリフェリル化合物及び７−アミド−４−メチルクマリ
ン化合物からなる一連の蛍光助剤基質及び指示薬を使用
して微生物を迅速に（２〜４時間で）同定し、それらの
抗菌パターンを迅速に（６〜８時間で）測定する。
自動化系がMIC検出に使用される。本発明は、微生物の
存在を検出し、微生物を計数し同定し、微生物の抗菌感
受性を試験するための迅速で、有効な感度の良い手段を
得るために蛍光技術を利用する。蛍光は、その固有の感
度により検出法として魅力的である。検出の下限は数千
分の一からppm の十分の一までの範囲である。少数の微
生物が蛍光分析により迅速に検出し得る。コウムラ(Kou
mura) らは、４−メチルウンベリフェリルホスフェート
及び４−メチルウンベリフェリルガラクトシドの如き特
定のウンベリフェロン誘導体を使用して衛生量の種々の
食品、飲料、水及びトイレ用品を測定した（米国特許第
4,591,554 号、1986年) 。センシタイター(Sensititer)
( ギブコ・ラボラトリィズ(Gibco Laboratories)、アン
ドバー、マサチューセッツ) は、微生物により作用され
るまで非蛍光性である蛍光基質( 例えば、ウンベリフェ
ロン及びクマリン誘導体) を使用する。アメリカン・ミ
クロスキャン( バクスター・ヘルスケアー社、ウェスト
・サクラメント、カリフォルニア) は、４−メチルウン
ベリフェリル化合物及び７−アミド−４−メチルクマリ
ン化合物からなる一連の蛍光助剤基質及び指示薬を使用
して微生物を迅速に（２〜４時間で）同定し、それらの
抗菌パターンを迅速に（６〜８時間で）測定する。
【００１３】シャッファー（Shaffar)の米国特許第4,49
5,293 号(1985 年１月22日に発行)は、アッセイ溶液中
でリガンドを蛍光測定する方法を開示しており、この場
合、アッセイ溶液により発光された蛍光の強さは、測定
されるリガンドとリガンドの存在下でアッセイ溶液の透
過性の変化を生じることができる試薬系との相互作用に
より生じた透過性の変化に関係する。これは、試薬系中
の一つの色素が特定のリガンドと相互作用する二つの色
素系の例である。相互作用する色素は、リガンドとの相
互作用の際に変化する光学スペクトルを有し、それによ
り第二色素からの蛍光発光を行う。それにより、その方
法は、生活系に毒性であり得るが測定リガンドでは有効
である色素濃度で試料中のリガンドの存在及び量を測定
する。
5,293 号(1985 年１月22日に発行)は、アッセイ溶液中
でリガンドを蛍光測定する方法を開示しており、この場
合、アッセイ溶液により発光された蛍光の強さは、測定
されるリガンドとリガンドの存在下でアッセイ溶液の透
過性の変化を生じることができる試薬系との相互作用に
より生じた透過性の変化に関係する。これは、試薬系中
の一つの色素が特定のリガンドと相互作用する二つの色
素系の例である。相互作用する色素は、リガンドとの相
互作用の際に変化する光学スペクトルを有し、それによ
り第二色素からの蛍光発光を行う。それにより、その方
法は、生活系に毒性であり得るが測定リガンドでは有効
である色素濃度で試料中のリガンドの存在及び量を測定
する。
【００１４】本発明は二つの色素蛍光発光系を利用する
ものであり、この系はリガンドを検出または測定するの
ではなく、微生物増殖を可能にし、またはそれを検出
し、この情報を微生物の検出、計数、同定、及び感受性
試験に利用する。
ものであり、この系はリガンドを検出または測定するの
ではなく、微生物増殖を可能にし、またはそれを検出
し、この情報を微生物の検出、計数、同定、及び感受性
試験に利用する。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、増殖培
地、微生物の存在下で微生物の代謝に応答して変化する
吸光度スペクトルを有する第一色素、及び第一色素の変
化または未変化の吸光度スペクトルの一つと重なる励起
スペクトル及び／または発光スペクトルを有する第二色
素を組み合わせる工程（その増殖培地は代謝微生物を含
むことについて分析される試料溶液を含む）を含む微生
物代謝の検出方法が提供される。第二色素の蛍光発光
は、試料中の代謝微生物の不在を示して変化しないか、
または試料中の代謝微生物の存在を示して変化するかに
ついて観察される。
地、微生物の存在下で微生物の代謝に応答して変化する
吸光度スペクトルを有する第一色素、及び第一色素の変
化または未変化の吸光度スペクトルの一つと重なる励起
スペクトル及び／または発光スペクトルを有する第二色
素を組み合わせる工程（その増殖培地は代謝微生物を含
むことについて分析される試料溶液を含む）を含む微生
物代謝の検出方法が提供される。第二色素の蛍光発光
は、試料中の代謝微生物の不在を示して変化しないか、
または試料中の代謝微生物の存在を示して変化するかに
ついて観察される。
【００１６】更に、本発明は、増殖培地；微生物の存在
下で微生物の代謝に応答して変化する吸光度スペクトル
を有する第一色素；及び第一色素の未変化または変化し
た吸光度スペクトルの一つと重なる励起スペクトル及び
／または発光スペクトルを有する第二色素を含む微生物
代謝の検出キットを提供する。代謝微生物を含まない増
殖培地への第一色素及び第二色素の添加は、第二色素の
観察される蛍光発光の変化を生じない。微生物を含む増
殖培地への第一色素及び第二色素の添加は、第二色素の
観察される蛍光発光の変化を生じる。
下で微生物の代謝に応答して変化する吸光度スペクトル
を有する第一色素；及び第一色素の未変化または変化し
た吸光度スペクトルの一つと重なる励起スペクトル及び
／または発光スペクトルを有する第二色素を含む微生物
代謝の検出キットを提供する。代謝微生物を含まない増
殖培地への第一色素及び第二色素の添加は、第二色素の
観察される蛍光発光の変化を生じない。微生物を含む増
殖培地への第一色素及び第二色素の添加は、第二色素の
観察される蛍光発光の変化を生じる。
【００１７】本発明のその他の利点は、本発明が添付図
面に関連して考慮される場合に以下の詳細な説明を参考
にして良く理解されるようになるので、容易に理解され
る。本発明の微生物代謝の検出法は、一般に、増殖培
地、微生物の存在下で微生物の代謝に応答して変化する
吸光度スペクトルを有する第一色素（代謝色素）、及び
第一色素の変化または未変化の吸光度スペクトルの一つ
と重なる励起スペクトル及び／または発光スペクトルを
有する第二蛍光色素（分析色素）を組み合わせる工程を
含み、その増殖培地は代謝微生物を含むことについて分
析される試料溶液を含む。組み合わされた溶液は、試料
中の代謝微生物の不在を示して分析色素の蛍光発光に変
化を生じないか、または試料中の代謝微生物の存在を示
して分析色素の発光に変化を生じるかについて観察され
る。本発明を微生物の検出、計数、及び抗菌感受性試験
に使用せしめるのは、試料中の代謝微生物を検出する本
発明のこの能力及び微生物代謝と増殖の直接の関係であ
る。即ち、本発明は、一般に、微生物代謝を監視するこ
とにより蛍光検出の増大された正確さを微生物増殖を監
視する増大された速度と組み合わせる可能性を与え、こ
れは従来技術より優れた利点を本発明に与える。
面に関連して考慮される場合に以下の詳細な説明を参考
にして良く理解されるようになるので、容易に理解され
る。本発明の微生物代謝の検出法は、一般に、増殖培
地、微生物の存在下で微生物の代謝に応答して変化する
吸光度スペクトルを有する第一色素（代謝色素）、及び
第一色素の変化または未変化の吸光度スペクトルの一つ
と重なる励起スペクトル及び／または発光スペクトルを
有する第二蛍光色素（分析色素）を組み合わせる工程を
含み、その増殖培地は代謝微生物を含むことについて分
析される試料溶液を含む。組み合わされた溶液は、試料
中の代謝微生物の不在を示して分析色素の蛍光発光に変
化を生じないか、または試料中の代謝微生物の存在を示
して分析色素の発光に変化を生じるかについて観察され
る。本発明を微生物の検出、計数、及び抗菌感受性試験
に使用せしめるのは、試料中の代謝微生物を検出する本
発明のこの能力及び微生物代謝と増殖の直接の関係であ
る。即ち、本発明は、一般に、微生物代謝を監視するこ
とにより蛍光検出の増大された正確さを微生物増殖を監
視する増大された速度と組み合わせる可能性を与え、こ
れは従来技術より優れた利点を本発明に与える。
【００１８】培地は、試験される微生物の増殖を促進す
るように選ばれる。培地は単に炭水化物を含んでもよ
い。また、例えば、広いスペクトルの微生物の増殖を促
進し得る増殖培地が微生物検出試験及び計数試験に使用
されてもよく、この場合、液体試料は患者から得られ、
微生物の同定及び数は未知である。一方、既知の同定の
特別な微生物が試験される場合、増殖培地はその微生物
の増殖を促進するように選ぶことができる。即ち、微生
物がそれらの増殖を促進するために特定の栄養素を必要
とする場合には、増殖培地はこれらの栄養素を含むよう
に選ぶことができる。本発明に利用し得る増殖培地の例
は、ミュラー−ヒントン（Mueller-Hinton) 、コロンビ
ア・ブロース、ブレインハートインフュージョン、トリ
プチック(tryptic) 大豆ブロース、シェドラーズ(Schae
dlers)ブロースである。
るように選ばれる。培地は単に炭水化物を含んでもよ
い。また、例えば、広いスペクトルの微生物の増殖を促
進し得る増殖培地が微生物検出試験及び計数試験に使用
されてもよく、この場合、液体試料は患者から得られ、
微生物の同定及び数は未知である。一方、既知の同定の
特別な微生物が試験される場合、増殖培地はその微生物
の増殖を促進するように選ぶことができる。即ち、微生
物がそれらの増殖を促進するために特定の栄養素を必要
とする場合には、増殖培地はこれらの栄養素を含むよう
に選ぶことができる。本発明に利用し得る増殖培地の例
は、ミュラー−ヒントン（Mueller-Hinton) 、コロンビ
ア・ブロース、ブレインハートインフュージョン、トリ
プチック(tryptic) 大豆ブロース、シェドラーズ(Schae
dlers)ブロースである。
【００１９】代謝色素は、そのスペクトルの性質がその
物理化学的環境に対する生化学的変化に応答するように
選ばれる。即ち、微生物が培地からの栄養素を代謝する
際に、微生物代謝は代謝色素の物理化学的環境を変化さ
せることができ、第一色素の吸光度スペクトルをシフト
し得る。これは分析色素の発光スペクトルの消光または
未消光を生じる。次いで研究者は代謝微生物の存在また
は不在を示す分析色素の蛍光発光の消光または未消光を
観察する。
物理化学的環境に対する生化学的変化に応答するように
選ばれる。即ち、微生物が培地からの栄養素を代謝する
際に、微生物代謝は代謝色素の物理化学的環境を変化さ
せることができ、第一色素の吸光度スペクトルをシフト
し得る。これは分析色素の発光スペクトルの消光または
未消光を生じる。次いで研究者は代謝微生物の存在また
は不在を示す分析色素の蛍光発光の消光または未消光を
観察する。
【００２０】増殖培地が特定の微生物により代謝される
時に増殖培地の物理化学的性質を変化させる特定の栄養
素を含む場合、代謝色素の物理化学的環境の変化は特定
の型の微生物の代謝を示すことができ、そして使用され
た分析色素の発光の観察される変化及び特定の型の微生
物の同定が結果として生じる。また、異なる特定の栄養
素を含む幾つかの異なる培地が利用し得る。組み合わさ
れた試料は分析色素の発光の変化または変化の不在につ
いて観察され、同定フィンガープリントが幾つかの観察
に基いて特定の微生物に関してつくることができる。
時に増殖培地の物理化学的性質を変化させる特定の栄養
素を含む場合、代謝色素の物理化学的環境の変化は特定
の型の微生物の代謝を示すことができ、そして使用され
た分析色素の発光の観察される変化及び特定の型の微生
物の同定が結果として生じる。また、異なる特定の栄養
素を含む幾つかの異なる培地が利用し得る。組み合わさ
れた試料は分析色素の発光の変化または変化の不在につ
いて観察され、同定フィンガープリントが幾つかの観察
に基いて特定の微生物に関してつくることができる。
【００２１】代謝色素の物理化学的環境は、培地のpHを
変化させることにより変化させることができる。代謝色
素は、環境のpHの変化に応答して変化する吸光度スペク
トルを有するように選ばれる。ブロムチモールブルー
は、pHに応答してその吸光度スペクトルを変化する色素
の例である。ブロムチモールブルーは、先に開発された
市販の同定系で有効であることが実証された。また、ブ
ロムクレシルパープルが使用し得る。両方の色素は易水
溶性であり、有効濃度で無毒であり、中性付近のpKa を
有し、高い吸光係数を有し、安価であり、可視の色変化
を有し、好ましい分析色素と良好な重なりを有し、本発
明に従って迅速同定試験に関して作用することが示され
た。好適であるその他のpH指示薬化合物の例はフェノー
ルレッド及びクロロフェノールレッドである。
変化させることにより変化させることができる。代謝色
素は、環境のpHの変化に応答して変化する吸光度スペク
トルを有するように選ばれる。ブロムチモールブルー
は、pHに応答してその吸光度スペクトルを変化する色素
の例である。ブロムチモールブルーは、先に開発された
市販の同定系で有効であることが実証された。また、ブ
ロムクレシルパープルが使用し得る。両方の色素は易水
溶性であり、有効濃度で無毒であり、中性付近のpKa を
有し、高い吸光係数を有し、安価であり、可視の色変化
を有し、好ましい分析色素と良好な重なりを有し、本発
明に従って迅速同定試験に関して作用することが示され
た。好適であるその他のpH指示薬化合物の例はフェノー
ルレッド及びクロロフェノールレッドである。
【００２２】pHを変化させる微生物代謝の例は、増殖培
地への特定の炭水化物の添加であり、これらは或る種の
微生物により酸性の最終生産物に醗酵される。酸性の最
終生産物は増殖培地のpHを変化させる。また、尿素が増
殖培地に添加でき、これはウレアーゼを含む微生物によ
りアンモニアに酵素変換される。生産されたアンモニア
は環境のpHを上げる。
地への特定の炭水化物の添加であり、これらは或る種の
微生物により酸性の最終生産物に醗酵される。酸性の最
終生産物は増殖培地のpHを変化させる。また、尿素が増
殖培地に添加でき、これはウレアーゼを含む微生物によ
りアンモニアに酵素変換される。生産されたアンモニア
は環境のpHを上げる。
【００２３】また、代謝色素の物理化学的環境は、環境
の還元−酸化電位を変化させることにより変化させるこ
とができ、第一色素は環境の還元−酸化電位の変化に応
答して変化する吸光度スペクトルを有する。感受性の還
元−酸化電位指示薬である代謝色素の例は、レサズリ
ン、チオニン、メチレンブルー、ジクロロフェノールイ
ンドフェノール、ニュートラルレッド、インジゴカルミ
ン、Ｎ，Ｎジメチルインドアニリンである。
の還元−酸化電位を変化させることにより変化させるこ
とができ、第一色素は環境の還元−酸化電位の変化に応
答して変化する吸光度スペクトルを有する。感受性の還
元−酸化電位指示薬である代謝色素の例は、レサズリ
ン、チオニン、メチレンブルー、ジクロロフェノールイ
ンドフェノール、ニュートラルレッド、インジゴカルミ
ン、Ｎ，Ｎジメチルインドアニリンである。
【００２４】レサズリンは、それが安価であり、熱分解
及び光分解に対して不感受性であり、水溶性であり、高
い吸光係数を有し、還元の際に可視の明瞭な色変化を有
し、殆どまたは全ての微生物により還元され、下記の好
ましい分析色素と良好なスペクトルの重なりを有するの
で、使用し得る。レサズリンは通常の抗生物質の作用に
影響しないことが明らかであり、それ故それはMIC 測定
に使用するのに優れている。
及び光分解に対して不感受性であり、水溶性であり、高
い吸光係数を有し、還元の際に可視の明瞭な色変化を有
し、殆どまたは全ての微生物により還元され、下記の好
ましい分析色素と良好なスペクトルの重なりを有するの
で、使用し得る。レサズリンは通常の抗生物質の作用に
影響しないことが明らかであり、それ故それはMIC 測定
に使用するのに優れている。
【００２５】或る種の代謝色素は酵素開裂基質として選
ぶことができる。例えば、インドキシル化合物及びブロ
モ−クロロ−インドイル化合物が、pH指示薬としての代
謝色素の使用に関して記載したのと同じ理由から酵素開
裂基質として選ぶことができる。有益なpKa を有するの
ではなく、これらの色素は、化合物に化学結合される場
合に無色であり、それらが開裂された場合に着色される
能力を有し、しかも易溶解性である。この性質は、これ
らの代謝色素が結合の開裂の際に未消光状態から消光状
態になることを可能にする。
ぶことができる。例えば、インドキシル化合物及びブロ
モ−クロロ−インドイル化合物が、pH指示薬としての代
謝色素の使用に関して記載したのと同じ理由から酵素開
裂基質として選ぶことができる。有益なpKa を有するの
ではなく、これらの色素は、化合物に化学結合される場
合に無色であり、それらが開裂された場合に着色される
能力を有し、しかも易溶解性である。この性質は、これ
らの代謝色素が結合の開裂の際に未消光状態から消光状
態になることを可能にする。
【００２６】分析色素は多種の蛍光化合物から選ばれ
る。分析色素の例は、スルフォーホダミン101 、ローダ
ミンＢ、ローダミン６、フルオロセイン、及びエオシン
Ｙである。スルフォーホダミン(SR101) が蛍光色素とし
て好ましいものであった。何となれば、それは水溶性で
あり、レサズリン蛍光( レサズリンは好ましい代謝色素
の一つである) と異なる励起波長及び発光波長を有し、
それは比較的安価であり、それはレサズリン、ブロムク
レシルパープル、ブロムチモールブルー、インドキシ
ル、及びブロモ−クロロインドイルと重なる励起スペク
トル及び発光スペクトルを有するからである。また、SR
101 は良好な量子発生量を有し、本発明により使用され
る現行濃度で微生物に無毒性であり、しかも温度及び光
照射に対して全く安定である。その化合物は蛍光の損失
なしに42℃で完全乾燥まで乾燥された。また、SR101 は
妥当なストークスシフトを有する。励起波長及び発光波
長は可視の範囲であり、使い捨て型のキュベット系及び
装置ウインドー用のUV透過性材料よりも発光観察用の安
価なガラス容器及びプラスチック容器の使用を可能にす
る。
る。分析色素の例は、スルフォーホダミン101 、ローダ
ミンＢ、ローダミン６、フルオロセイン、及びエオシン
Ｙである。スルフォーホダミン(SR101) が蛍光色素とし
て好ましいものであった。何となれば、それは水溶性で
あり、レサズリン蛍光( レサズリンは好ましい代謝色素
の一つである) と異なる励起波長及び発光波長を有し、
それは比較的安価であり、それはレサズリン、ブロムク
レシルパープル、ブロムチモールブルー、インドキシ
ル、及びブロモ−クロロインドイルと重なる励起スペク
トル及び発光スペクトルを有するからである。また、SR
101 は良好な量子発生量を有し、本発明により使用され
る現行濃度で微生物に無毒性であり、しかも温度及び光
照射に対して全く安定である。その化合物は蛍光の損失
なしに42℃で完全乾燥まで乾燥された。また、SR101 は
妥当なストークスシフトを有する。励起波長及び発光波
長は可視の範囲であり、使い捨て型のキュベット系及び
装置ウインドー用のUV透過性材料よりも発光観察用の安
価なガラス容器及びプラスチック容器の使用を可能にす
る。
【００２７】分析色素は、励起波長、発光波長、または
励起波長及び発光波長の両方が代謝色素の吸光度スペク
トルと一致し、または重なるように選ばれる。重なりは
代謝形態または未代謝形態の代謝色素のいずれであって
もよいが、両方と重なってはならない。本発明を特徴づ
けるのは、代謝色素の性質と分析色素の性質のこの特定
の組み合わせである。更に、以下に説明されるように、
本発明を更に特徴づけるのは、分析される微生物に対し
毒性ではなく、本発明に従って協同するこれらの色素の
能力である。
励起波長及び発光波長の両方が代謝色素の吸光度スペク
トルと一致し、または重なるように選ばれる。重なりは
代謝形態または未代謝形態の代謝色素のいずれであって
もよいが、両方と重なってはならない。本発明を特徴づ
けるのは、代謝色素の性質と分析色素の性質のこの特定
の組み合わせである。更に、以下に説明されるように、
本発明を更に特徴づけるのは、分析される微生物に対し
毒性ではなく、本発明に従って協同するこれらの色素の
能力である。
【００２８】二つの色素のスペクトルの重なりは、代謝
形態または未代謝形態の代謝色素のいずれであってもよ
いが、両方と重なってはならない。発光スペクトルが代
謝色素の吸光度と重なる分析色素の仮説の例が図２に示
されている。励起スペクトルが代謝色素の励起スペクト
ルと重なる分析色素の仮説の例が図３に示されている。
示されたこれらの二つの場合のいずれかに於いて、分析
色素の測定された蛍光は図１に示されるような代謝色素
の不在下で測定された蛍光よりも小さい。即ち、分析色
素の蛍光は重なり条件下で代謝色素の存在により消光さ
れる。代謝色素のスペクトルが図４に示されるように分
析色素と殆ど重ならない場合、この系の蛍光は分析色素
の蛍光と同じ程度に高い。これは未消光状況である。
形態または未代謝形態の代謝色素のいずれであってもよ
いが、両方と重なってはならない。発光スペクトルが代
謝色素の吸光度と重なる分析色素の仮説の例が図２に示
されている。励起スペクトルが代謝色素の励起スペクト
ルと重なる分析色素の仮説の例が図３に示されている。
示されたこれらの二つの場合のいずれかに於いて、分析
色素の測定された蛍光は図１に示されるような代謝色素
の不在下で測定された蛍光よりも小さい。即ち、分析色
素の蛍光は重なり条件下で代謝色素の存在により消光さ
れる。代謝色素のスペクトルが図４に示されるように分
析色素と殆ど重ならない場合、この系の蛍光は分析色素
の蛍光と同じ程度に高い。これは未消光状況である。
【００２９】実際に、微生物を含む試験試料は、分析色
素及び代謝色素と一緒に、上記の適当な増殖培地を含む
ウェルに導入される。混合物を含むウェルが増殖温度
（ヒト病原体に対して約30〜35℃) でインキュベーター
に入れられ、蛍光が２〜８時間の期間にわたって監視さ
れる。本願の図面に於いて時間とともに蛍光の増加を示
すグラフの夫々は、試料中の生物の量に依存することが
測定された初期の遅滞時間（曲線の初期の平らな相）を
示す。即ち、遅滞時間の長さは、特別な生物に関して、
標準曲線をつくることができるように、試料中の生物の
数に直接比例する。遅滞時間の期間は培地中の微生物の
数の指示として観察される。こうして、本発明は試験試
料中の微生物を計数するのに使用し得る。
素及び代謝色素と一緒に、上記の適当な増殖培地を含む
ウェルに導入される。混合物を含むウェルが増殖温度
（ヒト病原体に対して約30〜35℃) でインキュベーター
に入れられ、蛍光が２〜８時間の期間にわたって監視さ
れる。本願の図面に於いて時間とともに蛍光の増加を示
すグラフの夫々は、試料中の生物の量に依存することが
測定された初期の遅滞時間（曲線の初期の平らな相）を
示す。即ち、遅滞時間の長さは、特別な生物に関して、
標準曲線をつくることができるように、試料中の生物の
数に直接比例する。遅滞時間の期間は培地中の微生物の
数の指示として観察される。こうして、本発明は試験試
料中の微生物を計数するのに使用し得る。
【００３０】初期の遅滞時間後に、上記の試料中の微生
物の量に依存して、微生物が存在する場合に、蛍光は迅
速に増加する。促進の開始は、本明細書中検出点と称さ
れる。細菌がその系中に存在しない場合、蛍光曲線はわ
ずかにそれることがあるが、細菌の存在により得られる
高い蛍光水準を促進しないし、それに達しない。従っ
て、検出点の観察は試料中の微生物の存在の即時の注意
である。従来技術の試験のように微生物の存在を示すた
めに試料の濁度に影響するのに充分な微生物の増殖の存
在を待つ必要はなく、むしろ、代謝色素の環境に影響す
るのに充分な微生物による代謝を待つことのみを必要と
し、それにより代謝色素の光学スペクトルのシフトを生
じ、それにより分析色素の蛍光発光を消光し、または消
光しないで、試料中の細菌の存在を測定する。これは、
従来技術の方法により必要とされるかなり長い期間とは
反対に、２〜８時間以内に行うことができる。
物の量に依存して、微生物が存在する場合に、蛍光は迅
速に増加する。促進の開始は、本明細書中検出点と称さ
れる。細菌がその系中に存在しない場合、蛍光曲線はわ
ずかにそれることがあるが、細菌の存在により得られる
高い蛍光水準を促進しないし、それに達しない。従っ
て、検出点の観察は試料中の微生物の存在の即時の注意
である。従来技術の試験のように微生物の存在を示すた
めに試料の濁度に影響するのに充分な微生物の増殖の存
在を待つ必要はなく、むしろ、代謝色素の環境に影響す
るのに充分な微生物による代謝を待つことのみを必要と
し、それにより代謝色素の光学スペクトルのシフトを生
じ、それにより分析色素の蛍光発光を消光し、または消
光しないで、試料中の細菌の存在を測定する。これは、
従来技術の方法により必要とされるかなり長い期間とは
反対に、２〜８時間以内に行うことができる。
【００３１】本願の抗生物質に対する微生物の感受性ま
たは抵抗性は、次第に増加する濃度の抗生物質を、微生
物を含む増殖培地の異なる試料に添加することにより試
験し得る。本発明の方法は本発明に従って行われ、分析
色素の蛍光発光の変化を阻止し得る抗生物質の最低濃度
が抗生物質に対する微生物の感受性を示すものとして観
察される。また、異なる抗生物質が、微生物を含む増殖
培地の異なる試料に添加し得る。この状況では、蛍光発
光の変化を阻止し、または分析色素の蛍光発光の変化を
生じる抗生物質は、特別な抗生物質に対する微生物の感
受性を示すものとして観察し得る。
たは抵抗性は、次第に増加する濃度の抗生物質を、微生
物を含む増殖培地の異なる試料に添加することにより試
験し得る。本発明の方法は本発明に従って行われ、分析
色素の蛍光発光の変化を阻止し得る抗生物質の最低濃度
が抗生物質に対する微生物の感受性を示すものとして観
察される。また、異なる抗生物質が、微生物を含む増殖
培地の異なる試料に添加し得る。この状況では、蛍光発
光の変化を阻止し、または分析色素の蛍光発光の変化を
生じる抗生物質は、特別な抗生物質に対する微生物の感
受性を示すものとして観察し得る。
【００３２】上記のように、代謝色素、分析色素、及び
アッセイに使用されるその他の試薬の濃度は、微生物の
増殖及び代謝を可能にするように微生物に無毒である必
要がある。例えば、シャッファーの米国特許第4,743,56
1 号(1988 年、５月10日に発行) は、試験試料中のリガ
ンドの濃度を検出するための二つの色素系の使用を開示
している。全ての彼らのアッセイは、微生物の代謝及び
増殖を阻止する毒性の試薬を含む。例えば、彼らは強力
な消毒薬及び殺菌薬( その全てが接触の際に殆どの微生
物を死滅させる) である種々の薬品、例えば過酸化水
素、ホルムアルデヒド、フェノール、シアン化カリウ
ム、水酸化カリウム、チオシアン化カリウム、８−キノ
リノールスルフェート、塩化第二水銀、チメルソール、
等を使用している。彼らのアッセイは、微生物の代謝を
阻止するpHを生じる強酸（硫酸、スルファミン酸）また
は塩基（水酸化ナトリウム）を使用している。同様に、
その他の従来技術の情報は、色素それ自体が微生物を死
滅または抑制し、それにより本発明の有用性をなくす色
素系を開示している。リガンドの存在を測定するのでな
く、微生物の代謝活性を測定する本件出願人は、微生物
増殖を阻止しない代謝色素及び分析色素のみを使用す
る。
アッセイに使用されるその他の試薬の濃度は、微生物の
増殖及び代謝を可能にするように微生物に無毒である必
要がある。例えば、シャッファーの米国特許第4,743,56
1 号(1988 年、５月10日に発行) は、試験試料中のリガ
ンドの濃度を検出するための二つの色素系の使用を開示
している。全ての彼らのアッセイは、微生物の代謝及び
増殖を阻止する毒性の試薬を含む。例えば、彼らは強力
な消毒薬及び殺菌薬( その全てが接触の際に殆どの微生
物を死滅させる) である種々の薬品、例えば過酸化水
素、ホルムアルデヒド、フェノール、シアン化カリウ
ム、水酸化カリウム、チオシアン化カリウム、８−キノ
リノールスルフェート、塩化第二水銀、チメルソール、
等を使用している。彼らのアッセイは、微生物の代謝を
阻止するpHを生じる強酸（硫酸、スルファミン酸）また
は塩基（水酸化ナトリウム）を使用している。同様に、
その他の従来技術の情報は、色素それ自体が微生物を死
滅または抑制し、それにより本発明の有用性をなくす色
素系を開示している。リガンドの存在を測定するのでな
く、微生物の代謝活性を測定する本件出願人は、微生物
増殖を阻止しない代謝色素及び分析色素のみを使用す
る。
【００３３】本発明に従って、微生物代謝を検出し、こ
の方法を微生物同定、検出、計数、及び感受性試験に利
用するためのキットが提供し得る。そのキットは、増殖
培地、微生物の存在下で微生物の代謝に応答して変化す
る吸光度スペクトルを有する第一色素、及び第一色素の
未変化または変化した吸光度スペクトルの一つと重なる
励起スペクトルまたは発光スペクトルを有する第二蛍光
色素を含み、それにより増殖培地への第一色素及び第二
色素の添加が、微生物を代謝しない場合には第二色素の
観察される蛍光発光の変化を生じず、そして微生物を代
謝する場合には第二色素の発光の観察される蛍光の変化
を生じる。
の方法を微生物同定、検出、計数、及び感受性試験に利
用するためのキットが提供し得る。そのキットは、増殖
培地、微生物の存在下で微生物の代謝に応答して変化す
る吸光度スペクトルを有する第一色素、及び第一色素の
未変化または変化した吸光度スペクトルの一つと重なる
励起スペクトルまたは発光スペクトルを有する第二蛍光
色素を含み、それにより増殖培地への第一色素及び第二
色素の添加が、微生物を代謝しない場合には第二色素の
観察される蛍光発光の変化を生じず、そして微生物を代
謝する場合には第二色素の発光の観察される蛍光の変化
を生じる。
【００３４】下記のものは、本発明に従って選ばれた色
素対の系の蛍光の消光／未消光の実施例である。何とな
れば、それはその環境に応答するからである。SR101/レ
サズリン溶液への少量のナトリウムジチオニトの添加
は、蛍光をかなり増加させる。何となれば、青色の消光
レサズリンが赤色のレソルフィン化合物または無色のジ
ヒドロレソルフィン化合物に還元されるからである。こ
れらの化合物はSR101 蛍光を消光しない。同じ現象が、
pH感受性指示薬ブロムチモールブルー及びブロムクレシ
ルパープルで示される。高pH(7.5より大きい) では、ブ
ルー指示薬はSR101 の蛍光を消光する。低pH(6.5未満)
では、黄色色素形態は消光しない。こうして、環境は色
素対の溶液から検出される全蛍光に影響することを示す
ことができる。
素対の系の蛍光の消光／未消光の実施例である。何とな
れば、それはその環境に応答するからである。SR101/レ
サズリン溶液への少量のナトリウムジチオニトの添加
は、蛍光をかなり増加させる。何となれば、青色の消光
レサズリンが赤色のレソルフィン化合物または無色のジ
ヒドロレソルフィン化合物に還元されるからである。こ
れらの化合物はSR101 蛍光を消光しない。同じ現象が、
pH感受性指示薬ブロムチモールブルー及びブロムクレシ
ルパープルで示される。高pH(7.5より大きい) では、ブ
ルー指示薬はSR101 の蛍光を消光する。低pH(6.5未満)
では、黄色色素形態は消光しない。こうして、環境は色
素対の溶液から検出される全蛍光に影響することを示す
ことができる。
【００３５】下記のものは、微生物の検出、計数、同
定、及び感受性試験に使用される本発明の特別な実施例
である。
定、及び感受性試験に使用される本発明の特別な実施例
である。
【００３６】
実施例１：色素対による蛍光に関するpH及び酸化還元電
位の効果 水100 μl 中のスルフォーホダミン101(SR101)10μM 及
びレサズリン20μM の混合物を調製した。初期の蛍光(
励起＝586nm 、発光＝607nm)を、フロー・フルオロスキ
ャン(Flow Fluoroscan)II 蛍光光度計を使用してマイク
ロタイタ・トレー中で読み取った。少量のナトリウムジ
チオニトを添加してレサズリンを還元して初期の青色か
らピンクにした。蛍光は著しく上昇して( 表１）即時の
酸化還元環境に対する応答を示す。レサズリンをブロム
チモールブルーまたはブロムクレゾールパープルに代
え、溶液のpHを変えると、pHに対する色素対の系の応答
を示す（表１）。
位の効果 水100 μl 中のスルフォーホダミン101(SR101)10μM 及
びレサズリン20μM の混合物を調製した。初期の蛍光(
励起＝586nm 、発光＝607nm)を、フロー・フルオロスキ
ャン(Flow Fluoroscan)II 蛍光光度計を使用してマイク
ロタイタ・トレー中で読み取った。少量のナトリウムジ
チオニトを添加してレサズリンを還元して初期の青色か
らピンクにした。蛍光は著しく上昇して( 表１）即時の
酸化還元環境に対する応答を示す。レサズリンをブロム
チモールブルーまたはブロムクレゾールパープルに代
え、溶液のpHを変えると、pHに対する色素対の系の応答
を示す（表１）。
【００３７】実施例２：微生物の存在の検出及びそれら
の数の概算 本発明の方法は細菌の増殖を検出し得る。SR101(10μM)
及びレサズリン(20 μM)をミューラー・ヒントンブロー
ス( ジフコ(Difco))に添加する。その培地を次第に増加
する数の細菌の植菌物で接種する。接種した培養液100
μl をマイクロタイタ・トレーのウェルに入れ、35℃で
インキュベートし、実施例１に記載した装置で所定間隔
で読み取る。図５及び図６は、接種細菌が夫々緑膿菌及
び大腸菌である場合に生じた曲線である。植菌細胞数に
依存する初期遅滞期間の後、蛍光はプラトーまで迅速に
増加する。何となれば、レサズリンが増殖細菌の代謝に
より青色からピンク（レソルフィン）または無色に還元
されるからである。107 個の大腸菌細胞はこれらの条件
下で２時間で信号を生じ、一方、10個の細胞は10時間で
わずかに検出し得る。細菌がその系中に存在しない場
合、蛍光の著しい増加は観察されない。
の数の概算 本発明の方法は細菌の増殖を検出し得る。SR101(10μM)
及びレサズリン(20 μM)をミューラー・ヒントンブロー
ス( ジフコ(Difco))に添加する。その培地を次第に増加
する数の細菌の植菌物で接種する。接種した培養液100
μl をマイクロタイタ・トレーのウェルに入れ、35℃で
インキュベートし、実施例１に記載した装置で所定間隔
で読み取る。図５及び図６は、接種細菌が夫々緑膿菌及
び大腸菌である場合に生じた曲線である。植菌細胞数に
依存する初期遅滞期間の後、蛍光はプラトーまで迅速に
増加する。何となれば、レサズリンが増殖細菌の代謝に
より青色からピンク（レソルフィン）または無色に還元
されるからである。107 個の大腸菌細胞はこれらの条件
下で２時間で信号を生じ、一方、10個の細胞は10時間で
わずかに検出し得る。細菌がその系中に存在しない場
合、蛍光の著しい増加は観察されない。
【００３８】細菌の計数は、図７に示された曲線と同様
の較正曲線をつくることにより行い得る。検出時間（促
進点に達するのに必要とされる時間）が、プレート・カ
ウント法により得られる１ml当たりのコロニー形成単位
の数に関連づけられる。この較正曲線から、試料中の生
物の数が誘導し得る。 実施例３：食品中の細菌の検出及び計数 食品100gをブレインハートインフュージョン(BHI) ブロ
ース( ジフコ) に添加し、大腸菌約107cfu/ml で接種
し、テクマー(Tekmar)食品ストマッカーを使用してブレ
ンドした。黒コショウ及びハンバーガー原料を試験し
た。SR101 10μM 及びレサズリン 20 μM を、消化前に
BHI ブロースに添加した。得られた懸濁液の試料100 μ
l を希釈し、マイクロタイタ・トレーのウェルに入れ、
蛍光を時間とともに追跡した。食品は、増大されたバッ
クグラウンド傾斜により見られるように、かなりの還元
能力を有する。再度、それ程希釈されていない試料は、
バックグラウンド範囲にわたる蛍光の急激な上昇により
実証されるように、早い検出時間を生じた( 図８及び図
９）。それ故、微生物で汚染された食品は蛍光の増加を
追跡することにより検出でき、早く現れる促進点（遅滞
期間より短い）は多くの細菌がその系中に存在すること
を示す。
の較正曲線をつくることにより行い得る。検出時間（促
進点に達するのに必要とされる時間）が、プレート・カ
ウント法により得られる１ml当たりのコロニー形成単位
の数に関連づけられる。この較正曲線から、試料中の生
物の数が誘導し得る。 実施例３：食品中の細菌の検出及び計数 食品100gをブレインハートインフュージョン(BHI) ブロ
ース( ジフコ) に添加し、大腸菌約107cfu/ml で接種
し、テクマー(Tekmar)食品ストマッカーを使用してブレ
ンドした。黒コショウ及びハンバーガー原料を試験し
た。SR101 10μM 及びレサズリン 20 μM を、消化前に
BHI ブロースに添加した。得られた懸濁液の試料100 μ
l を希釈し、マイクロタイタ・トレーのウェルに入れ、
蛍光を時間とともに追跡した。食品は、増大されたバッ
クグラウンド傾斜により見られるように、かなりの還元
能力を有する。再度、それ程希釈されていない試料は、
バックグラウンド範囲にわたる蛍光の急激な上昇により
実証されるように、早い検出時間を生じた( 図８及び図
９）。それ故、微生物で汚染された食品は蛍光の増加を
追跡することにより検出でき、早く現れる促進点（遅滞
期間より短い）は多くの細菌がその系中に存在すること
を示す。
【００３９】実施例４：血液中の細菌の検出 色素対の系が血液中の細菌（菌血症）の存在を検出する
のに使用できるか否かを調べるための実験を行った。10
％の無菌ヒツジ赤血球をコロンビアブロース(ジフコ)
中で調製した。レサズリン(20 μM)及びSR101(10μM)を
添加し、そのブロースを黄色ブドウ球菌で種々の濃度で
接種した。夫々の懸濁液100 μl をマイクロタイタ・プ
レートに入れ、蛍光を前記のように追跡した。興味のあ
ることに、生物の増殖は先の実施例とは反対に蛍光の減
少を生じた。１ml当たり100 個及び10個の細菌をこの系
中で夫々約10時間及び12時間で検出した( 図10) 。
のに使用できるか否かを調べるための実験を行った。10
％の無菌ヒツジ赤血球をコロンビアブロース(ジフコ)
中で調製した。レサズリン(20 μM)及びSR101(10μM)を
添加し、そのブロースを黄色ブドウ球菌で種々の濃度で
接種した。夫々の懸濁液100 μl をマイクロタイタ・プ
レートに入れ、蛍光を前記のように追跡した。興味のあ
ることに、生物の増殖は先の実施例とは反対に蛍光の減
少を生じた。１ml当たり100 個及び10個の細菌をこの系
中で夫々約10時間及び12時間で検出した( 図10) 。
【００４０】実施例５：抗菌感受性試験 SR101 10μM 及びレサズリン 20 μM を含むミューラー
・ヒントンブロースを調製した。0.0625〜16μg/mlの抗
生物質ペニシリンの二重希釈液の添加を行った。これら
の溶液の100 μl アリコートをマイクロタイタ・トレー
のウェルに入れ、エンテロコッカス・ファエカリス(Ent
erococcus faecalis) で106cfu/ml で接種した。また、
同抗生物質及び生物を含むがSR101 またはレサズリンを
含まない平行対照パネルをつくった。色素を含むパネル
を蛍光により追跡した( 図11) 。別のパネルを、増殖の
測定として18時間で可視の濁度を使用して読み取った。
ペニシリン最小阻止濃度、即ちMIC は、色素対の系及び
濁度測定系の両方に関して２μg/mlであることがわかっ
た。MIC は、試験生物の肉眼的増殖を阻止する最低の抗
生物質濃度であり、特別な抗生物質に対する菌株の感受
性の目安である。蛍光測定( 図10) に於いて、増殖する
ウェル中の蛍光はペニシリンを含まない陽性対照の蛍光
に匹敵するが、一方、阻止されたウェルは試験期間にわ
たって著しい蛍光の増加を示さない。この生物に関する
ペニシリンMIC は色素対技術を使用して３時間程度に早
く測定することができた。
・ヒントンブロースを調製した。0.0625〜16μg/mlの抗
生物質ペニシリンの二重希釈液の添加を行った。これら
の溶液の100 μl アリコートをマイクロタイタ・トレー
のウェルに入れ、エンテロコッカス・ファエカリス(Ent
erococcus faecalis) で106cfu/ml で接種した。また、
同抗生物質及び生物を含むがSR101 またはレサズリンを
含まない平行対照パネルをつくった。色素を含むパネル
を蛍光により追跡した( 図11) 。別のパネルを、増殖の
測定として18時間で可視の濁度を使用して読み取った。
ペニシリン最小阻止濃度、即ちMIC は、色素対の系及び
濁度測定系の両方に関して２μg/mlであることがわかっ
た。MIC は、試験生物の肉眼的増殖を阻止する最低の抗
生物質濃度であり、特別な抗生物質に対する菌株の感受
性の目安である。蛍光測定( 図10) に於いて、増殖する
ウェル中の蛍光はペニシリンを含まない陽性対照の蛍光
に匹敵するが、一方、阻止されたウェルは試験期間にわ
たって著しい蛍光の増加を示さない。この生物に関する
ペニシリンMIC は色素対技術を使用して３時間程度に早
く測定することができた。
【００４１】実施例６：細菌の同定 未知の細菌の同定に於ける色素対の系の使用を調べた。
ハートインフュージョンブロース( ジフコ) ( pH7.4)に
三種の炭水化物、トレハロース、マンニトール、または
マンノースの一種１％（重量／容量）を補充した。ま
た、培地はSR10110μM 及びブロムクレシルパープル24
μM を含んでいた。炭水化物ブロースをマイクロタイタ
・トレーのウェルにピペットで入れ(100μl/ウェル) 、
細菌の純粋培養物106cfu/ml で接種し、蛍光を時間とと
もに追跡した。炭水化物の醗酵は培地中の酸の生成をも
たらした。炭水化物利用を伴うブロースの酸性度の増加
は、青色pH指示薬を黄色にさせた。これは未消光及びSR
101 の蛍光の著しい増加をもたらした( 図12及び図13、
マンノース曲線) 。試験下の生物による炭水化物の利用
の欠如は、色または蛍光の変化を生じなかった( 図13、
トレハロース及びマンニトール、並びに図14) 。試験し
た三種による炭水化物のこの異なる利用は生物を区別す
るID系の基礎を形成する。それ故、一連の試験を確立す
ることができ、これらの試験では増殖培地は或る種の細
菌により利用でき、または利用できない主要成分を含
む。これらの陽性結果または陰性結果の組み合わせは、
迅速な時間枠( これらの植菌量で約７時間）で得られる
結果でもって簡単な同定系の基礎として利用できる。同
様に、或る種の細菌の増殖を阻止するがその他の細菌の
増殖を阻止しないインヒビターを培地に添加することが
できる。例えば、塩（NaCl) を培地に添加することがで
き、或る種の細菌の増殖に影響し得る。
ハートインフュージョンブロース( ジフコ) ( pH7.4)に
三種の炭水化物、トレハロース、マンニトール、または
マンノースの一種１％（重量／容量）を補充した。ま
た、培地はSR10110μM 及びブロムクレシルパープル24
μM を含んでいた。炭水化物ブロースをマイクロタイタ
・トレーのウェルにピペットで入れ(100μl/ウェル) 、
細菌の純粋培養物106cfu/ml で接種し、蛍光を時間とと
もに追跡した。炭水化物の醗酵は培地中の酸の生成をも
たらした。炭水化物利用を伴うブロースの酸性度の増加
は、青色pH指示薬を黄色にさせた。これは未消光及びSR
101 の蛍光の著しい増加をもたらした( 図12及び図13、
マンノース曲線) 。試験下の生物による炭水化物の利用
の欠如は、色または蛍光の変化を生じなかった( 図13、
トレハロース及びマンニトール、並びに図14) 。試験し
た三種による炭水化物のこの異なる利用は生物を区別す
るID系の基礎を形成する。それ故、一連の試験を確立す
ることができ、これらの試験では増殖培地は或る種の細
菌により利用でき、または利用できない主要成分を含
む。これらの陽性結果または陰性結果の組み合わせは、
迅速な時間枠( これらの植菌量で約７時間）で得られる
結果でもって簡単な同定系の基礎として利用できる。同
様に、或る種の細菌の増殖を阻止するがその他の細菌の
増殖を阻止しないインヒビターを培地に添加することが
できる。例えば、塩（NaCl) を培地に添加することがで
き、或る種の細菌の増殖に影響し得る。
【００４２】上記の実施例は、微生物の検出、計数、同
定、及び抗菌感受性試験に使用される本発明の有用性を
説明する。本発明は従来技術の比色アッセイよりも利点
を更に与える。本発明は、第二の（エピフルオレセンス
(epifluorescence))、簡単な装置( ランプ及び光検出器
及び必要により感度を改良するためのフィルター) 、顧
客習熟及び蛍光法による容認に対する要求なしに単一の
光学ウインドーを利用でき、有用性であることがわかっ
た。蛍光測定は、迅速に、明確にすれば、ミリ秒の時間
枠で行い得る。
定、及び抗菌感受性試験に使用される本発明の有用性を
説明する。本発明は従来技術の比色アッセイよりも利点
を更に与える。本発明は、第二の（エピフルオレセンス
(epifluorescence))、簡単な装置( ランプ及び光検出器
及び必要により感度を改良するためのフィルター) 、顧
客習熟及び蛍光法による容認に対する要求なしに単一の
光学ウインドーを利用でき、有用性であることがわかっ
た。蛍光測定は、迅速に、明確にすれば、ミリ秒の時間
枠で行い得る。
【００４３】更に、蛍光は、夫々の読み取りで試験試料
を含むウェルに物理的に入る必要がないような非侵入性
である。これは、装置及び試験試料を含むキュベットの
汚染をなくす。本発明により使用される色素対の技術
は、簡単な単一の波長装置でもって、還元酸化電位、p
H、及び開裂反応、並びに種々の酵素系により生じるそ
の他の反応の使用を可能にする。これらの反応が分析色
素の消光を生じ、または減少する限り、これらの反応を
追跡するためにフィルターまたは波長を変える必要がな
い。
を含むウェルに物理的に入る必要がないような非侵入性
である。これは、装置及び試験試料を含むキュベットの
汚染をなくす。本発明により使用される色素対の技術
は、簡単な単一の波長装置でもって、還元酸化電位、p
H、及び開裂反応、並びに種々の酵素系により生じるそ
の他の反応の使用を可能にする。これらの反応が分析色
素の消光を生じ、または減少する限り、これらの反応を
追跡するためにフィルターまたは波長を変える必要がな
い。
【００４４】本発明は迅速な微生物同定及び感受性試験
を提供する。抗菌感受性パターンは、106cfu/ml の植菌
を使用して、2.5 時間程度に早く、更に典型的には４〜
９時間で識別し得る。107cfu/mlの植菌量を使用して、
幾つかの同定反応は植菌後１〜２時間で読み取ることが
できる。これは、非常に遅い従来技術の系よりもかなり
の利点である。
を提供する。抗菌感受性パターンは、106cfu/ml の植菌
を使用して、2.5 時間程度に早く、更に典型的には４〜
９時間で識別し得る。107cfu/mlの植菌量を使用して、
幾つかの同定反応は植菌後１〜２時間で読み取ることが
できる。これは、非常に遅い従来技術の系よりもかなり
の利点である。
【００４５】本発明に従って行われ処理されるこの技術
は自動化できる。機械を手動で負荷するのではなく、キ
ュベットを所定の間隔で装置により自動的に単に読み取
ることにより、分析の全自動化が達成し得る。コンピュ
ーターをプログラミングして、反応進行曲線から誘導さ
れる同定結果及び抗菌感受性結果を予測することができ
る。
は自動化できる。機械を手動で負荷するのではなく、キ
ュベットを所定の間隔で装置により自動的に単に読み取
ることにより、分析の全自動化が達成し得る。コンピュ
ーターをプログラミングして、反応進行曲線から誘導さ
れる同定結果及び抗菌感受性結果を予測することができ
る。
【００４６】分析の一体部分として可視波長の着色反応
を有することにより、ユーザーは装置破損の場合に系の
手動のバックアップを行うことができる。本発明のこの
特徴によれば、ユーザーは蛍光を機械により読み取るの
ではなく、明らかな色の変化を単に読み取り、書き込み
コードブックに記載された結果を解読する。本発明が例
示的に記載され、そして使用された専門用語は限定では
なく、その性質上説明を目的とすることが理解されるべ
きである。
を有することにより、ユーザーは装置破損の場合に系の
手動のバックアップを行うことができる。本発明のこの
特徴によれば、ユーザーは蛍光を機械により読み取るの
ではなく、明らかな色の変化を単に読み取り、書き込み
コードブックに記載された結果を解読する。本発明が例
示的に記載され、そして使用された専門用語は限定では
なく、その性質上説明を目的とすることが理解されるべ
きである。
【００４７】明らかに、本発明の多くの改良及び変更が
上記の教示に鑑みて可能である。それ故、本発明は特許
請求の範囲内で明細書に記載された以外に実施し得るこ
とが理解されるべきである。
上記の教示に鑑みて可能である。それ故、本発明は特許
請求の範囲内で明細書に記載された以外に実施し得るこ
とが理解されるべきである。
【図１】分析色素の発光スペクトルと重なる吸光度スペ
クトルを有する代謝色素の存在により消光される分析蛍
光色素の吸収強さまたは蛍光強さ対波長のグラフであ
る。
クトルを有する代謝色素の存在により消光される分析蛍
光色素の吸収強さまたは蛍光強さ対波長のグラフであ
る。
【図２】発光スペクトルが代謝色素の吸光度スペクトル
と重なる分析色素の例の吸収強さまたは蛍光強さ対波長
のグラフである。
と重なる分析色素の例の吸収強さまたは蛍光強さ対波長
のグラフである。
【図３】励起スペクトルが代謝色素の励起スペクトルと
重なる分析色素の例の吸収強さまたは蛍光強さ対波長の
グラフである。
重なる分析色素の例の吸収強さまたは蛍光強さ対波長の
グラフである。
【図４】分析色素の蛍光スペクトルと殆ど重ならない代
謝色素スペクトルの吸収強さまたは蛍光強さ対波長のグ
ラフである。
謝色素スペクトルの吸収強さまたは蛍光強さ対波長のグ
ラフである。
【図５】増殖培地中に次第に減少する数の細菌を含み、
本発明に従って分析色素及び代謝色素を含む試料に関す
る蛍光単位対時間のグラフである。培養菌がインキュベ
ートされ、所定間隔で読み取られ、細菌は緑膿菌であ
る。
本発明に従って分析色素及び代謝色素を含む試料に関す
る蛍光単位対時間のグラフである。培養菌がインキュベ
ートされ、所定間隔で読み取られ、細菌は緑膿菌であ
る。
【図６】増殖培地中に次第に減少する数の細菌を含み、
本発明に従って分析色素及び代謝色素を含む試料に関す
る蛍光単位対時間のグラフである。培養菌がインキュベ
ートされ、所定間隔で読み取られ、細菌は大腸菌であ
る。
本発明に従って分析色素及び代謝色素を含む試料に関す
る蛍光単位対時間のグラフである。培養菌がインキュベ
ートされ、所定間隔で読み取られ、細菌は大腸菌であ
る。
【図７】細菌計数を行うのに使用し得る較正曲線を表
す、蛍光検出時間（時間）対１ml当たりのコロニー形成
単位の対数のグラフである。
す、蛍光検出時間（時間）対１ml当たりのコロニー形成
単位の対数のグラフである。
【図８】食品、即ち黒コショウ中の細菌の検出及び計数
を示す、蛍光単位対時間のグラフである。
を示す、蛍光単位対時間のグラフである。
【図９】食品、即ちハンバーガー中の細菌の検出及び計
数を示す、蛍光単位対時間のグラフである。
数を示す、蛍光単位対時間のグラフである。
【図１０】血液試料中の細菌の検出を示す、蛍光単位対
時間のグラフである。
時間のグラフである。
【図１１】抗菌感受性の試験を示す、蛍光単位対時間の
グラフである。
グラフである。
【図１２】細菌、即ちエンテロコッカス・ファエカリス
の同定のために本発明の使用を示す、蛍光単位対時間の
グラフである。
の同定のために本発明の使用を示す、蛍光単位対時間の
グラフである。
【図１３】細菌、即ちステプトコッカス・アガラクチア
エ(Steptococcus agalactiae) の同定のために本発明の
使用を示す、蛍光単位対時間のグラフである。
エ(Steptococcus agalactiae) の同定のために本発明の
使用を示す、蛍光単位対時間のグラフである。
【図１４】細菌、即ち表皮ブドウ球菌の同定のために本
発明の使用を示す、蛍光単位対時間のグラフである。
発明の使用を示す、蛍光単位対時間のグラフである。
Claims (23)
- 【請求項１】 培地、微生物の存在下で微生物の代謝に
応答して変化する吸光度スペクトルを有する第一色素、
及び第一色素の変化または未変化の吸光度スペクトルの
一つと重なる励起スペクトルまたは発光スペクトルを有
する第二色素を組み合わせる工程（前記の培地は代謝微
生物を含むことについて分析される試料溶液を含む）、
及び試料中の代謝微生物の不在を示す第二色素の蛍光発
光の未変化または試料中の代謝微生物の存在を示す変化
を観察する工程を含むことを特徴とする微生物代謝の検
出方法。 - 【請求項２】 前記の組み合わせ工程は、微生物が培地
から栄養素を代謝する際に第一色素の物理化学的環境を
変化させ、第一色素の吸光度スペクトルをシフトし、第
二色素の発光スペクトルを消光し、または消光しないこ
ととして更に規定され、前記の観察工程が代謝微生物の
存在または不在を示す第二色素の消光または未消光を観
察することとして更に規定される請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】 増殖培地が特定の微生物により代謝され
る場合に培地の物理化学的性質を変化させる特定の栄養
素を含み、前記の変化工程は特定の型の微生物のみが培
地中の特定の栄養素を代謝する際に第一色素の物理化学
的環境を変化させ、特定の型の微生物の同定として第二
色素の発光の変化を観察することとして更に規定される
請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 異なる特定の栄養素を含む幾つかの異な
る培地に関して前記の組み合わせ工程を反復する工程、
第二色素の発光スペクトルの変化または変化の不在を観
察する工程、及び幾つかの観察に基いて特定の微生物の
同定フィンガープリントをつくる工程を更に含む請求項
３に記載の方法。 - 【請求項５】 前記の変化工程が溶液のpHを変化させる
こととして更に規定され、第一色素が環境のpHの変化に
応答して変化する吸光度スペクトルを有する請求項２に
記載の方法。 - 【請求項６】 前記の変化工程が或る種の微生物により
酸性最終生産物に醗酵される特定の炭水化物を添加し培
地のpHを変化させることとして更に規定される請求項５
に記載の方法。 - 【請求項７】 前記の変化工程が、ウレアーゼを含む微
生物により酵素変換されアンモニアと二酸化炭素に開裂
される尿素を添加し、こうして環境のpHを変化させるこ
ととして更に規定される請求項５に記載の方法。 - 【請求項８】 前記の変化工程が、微生物を増殖させ環
境の還元−酸化電位を変化させることとして更に規定さ
れ、第一色素が還元−酸化電位の変化に応答して変化す
る吸光度スペクトルを有する請求項２に記載の方法。 - 【請求項９】 環境が細胞内である請求項５または８に
記載の方法。 - 【請求項１０】 環境が細胞外である請求項５または８
に記載の方法。 - 【請求項１１】 微生物が培地に添加される際に蛍光発
光の変化の促進の前に第二色素の蛍光発光の未変化の遅
滞期間を生じる工程、及び培地中の微生物の数の指示と
して遅滞期間の時間を観察する工程を更に含む請求項１
に記載の方法。 - 【請求項１２】 遅滞期間の時間を使用して培地中の微
生物の数の標準曲線をつくる工程、及び未知の量の微生
物を含む増殖培地の遅滞期間を培地中の微生物の数を示
す標準曲線に関連させる工程を更に含む請求項11に記載
の方法。 - 【請求項１３】 前記の組み合わせ工程が、第一色素を
微生物により直接代謝させ、第一色素の吸光度スペクト
ルをシフトすることとして更に規定される請求項１に記
載の方法。 - 【請求項１４】 前記の組み合わせ工程が、次第に増加
する濃度の抗生物質を微生物を含む培地の異なる試料に
添加することとして更に規定され、前記の観察工程が、
第二色素の蛍光発光の変化を阻止し得る抗生物質の最低
濃度を抗生物質に対する微生物の感受性を示すものとし
て観察することとして更に規定される請求項１に記載の
方法。 - 【請求項１５】 前記の組み合わせ工程が、異なる抗生
物質及び／または増殖抑制物質を微生物を含む培地の異
なる試料に添加することとして更に規定され、前記の観
察工程は、どの抗生物質及び／または抑制物質が第二色
素の蛍光発光の変化を阻止するかを異なる抗生物質及び
／または抑制物質に対する微生物の感受性または抵抗生
を示すものとして観察することとして更に規定される請
求項１に記載の方法。 - 【請求項１６】 組み合わせた培地及び色素を30℃〜35
℃で２〜８時間インキュベートし、その間蛍光の変化を
監視する工程を更に含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項１７】 前記の組み合わせ工程が、５〜30マイ
クロモル濃度の第一色素及び２〜20マイクロモル濃度の
第二色素を添加することとして更に規定される請求項１
に記載の方法。 - 【請求項１８】 前記の観察工程が、第二色素の蛍光発
光の変化の促進の前もって決めた値の初期の開始を培地
中の微生物の存在の指標として検出することとして更に
規定される請求項１に記載の方法。 - 【請求項１９】 培地；微生物の存在下で微生物の代謝
に応答して変化する吸光度スペクトルを有する第一色
素；第一色素の未変化または変化した吸光度スペクトル
の一つと重なる励起スペクトルまたは発光スペクトルを
有する第二色素を含み、それにより培地への第一色素及
び第二色素の添加が、代謝微生物がない場合には前記の
第二色素の観察される蛍光発光の変化を生じず、代謝微
生物がある場合には前記の第二色素の観察される蛍光発
光の変化を生じることを特徴とする微生物代謝の検出キ
ット。 - 【請求項２０】 前記の第一色素が環境中の物理化学的
変化に応答して変化する吸光度スペクトルを有する請求
項19に記載のキット。 - 【請求項２１】 前記の第一色素が環境中のpHの変化に
応答して変化する吸光度スペクトルを有する請求項20に
記載のキット。 - 【請求項２２】 前記の第一色素が環境の還元−酸化電
位に応答して変化する吸光度スペクトルを有する請求項
20に記載のキット。 - 【請求項２３】 前記の第一色素は、前記の第一色素が
特定の微生物により代謝される場合に変化する吸光度ス
ペクトルを有する請求項19に記載のキット。
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