FR2468648A1 - Procede pour mesurer la difference de potentiel entre electrodes afin de determiner la croissance de bacteries - Google Patents

Abstract

Procédé pour mesurer la différence de potentiel entre électrodes afin de déterminer la croissance de bactéries. La différence de potentiel entre deux électrodes (C, métal) plongées dans un milieu nutritif ne varie pas (courbe 1) en l'absence de bactéries. La croissance des bactéries fait varier le potentiel d'oxydo-réduction du milieu et donc la différence de potentiel (courbes 2 et 3). Application : évaluation de la population de bactéries; identification des espèces présentes au départ; étude de leur résistance à l'action de molécules actives.

Description

La présente invention concerne un procédé pour me-

surer le degré de croissance de bactéries inoculées à l'inté-

rieur ou à la surface d'un milieu nutritif liquide. Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé pour mesurer le degré de croissance de bactéries par l'inser- tion, dans un milieu nutritif liquide, d'une électrode de carbone et d'une électrode métallique (dont aucune n'exerce

d'influence sur le milieu nutritif liquide ou n'est endomma-

gée par celui-ci), ce qui permet de déceler au cours de la

multiplication des bactéries une variation du potentiel d'oxydo-

réduction d milieu nutritif liquide sous forme d'une varia-

tion de la différence de potentiel entre les deux électrodes précitées. Actuellement, lors d'un examen bactériologique clinique comme un test de sensibilité à des molécules actives, des médicaments ou des produits pharmaceutiques, lors de la discrimination entre des bactéries inactives ou mortes et

des bactéries actives, lors de l'estimation par dosage biolo-

gique de l'activité d'un milieu, lors de l'identification de bactéries, du dépistage de bactéries dans l'urine ou dans des milieux analogues, on recherche avec acharnement, en plus de la précision de la mesure, la facilité et la vitesse

de la mise en oeuvre d'un mode opératoire ainsi que l'auto-

matisation de la mesure. La poursuite des recherches dans ce sens est grandement nécessaire, notamment dans le domaine des essais de sensibilité des micro-organismes à l'action des médicaments ou produits pharmaceutiques en vue de mettre

au point de nouvelles molécules ou de nouveaux produits pou-

vant agir contre les bactéries dont la résistance aux médi-

caments est récemment apparue, ainsi que dans les domaines analogues.. De façon générale, on peut réaliser de la façon la plus précise un examen bactériologique en observant au microscope les bactéries que l'on désire étudier et qui ont

été inoculées à l'intérieur ou à la surface d'un milieu nutri-

tif dans ou sur lequel on les laisse croître. De toute façon,

ce type de technique demande beaucoup de temps pour la crois-

sance des bactéries, il exige de la patience et de l'expé-

rience ainsi qu'une grande attention pour les mesures et, ce qui est pire, il est extrêmement inefficace. En pratique, il demande de nombreuses heures lorsqu'il faut effectuer des

mesures sur une grande quantité d'échantillons.

C'est pourquoi un autre type de technique a été mis au point jusqu'à présent dans le but de permettre une

automatisation dans le domaine des examens bactériologiques.

Ce second type implique deux genres de procédés pour mesurer une variation du degré de trouble ou de turbidité, d'une part, ou de la conductivité électrique, d'autre part, d'un milieu nutritif auquel les bactéries ont été inoculées. L'un des procédés est appelé le procédé de mesure de la turbidité, cependant que l'autre est désigné comme étant le procédé de mesure de l'impédance. Le premier genre de procédé se

fonde sur la croissance logarithmique, en fonction de l'écou-

lement du temps, des bactéries inoculées à l'intérieur ou à

la surface d'un milieu nutritif liquide, ce qui rend ce mi-

lieu trouble. Le degré de trouble ou de turbidité du milieu

nutritif sera mesuré par la mesure de la dispersion ou dif-

fusion, d'une part, ou de la transmission, d'autre part, de la lumière. Dans le procédé par impédance, on mesure, à l'aide

d'un pont d'impédances la variation de conductivité électri-

que d'un milieu nutritif liquide due à la formation d'un pro-

duit de métabolisme au cours de la croissance des bactéries,

arin de déterminer le degré de croissance des bactéries.

Cependant, les procédés classiques précités ont divers défauts. Dans le procédé de mesure de la turbidité (turbidimétrie), il est indispensable de mélanger le milieu nutritif par agitation à l'aide d'un dispositif vibrant ou d'un appareil analogue lorsque des souches de bactéries créent une turbidité dont l'uniformité est défectueuse. Il devient

parfois également pénible de maintenir et de contrôler l'uni-

formité de la turbidité du milieu parce qu'il faut alors y appliquer un certain nombre de systèmes optiques. De plus,

lorsqu'il s'agit de déceler la population de bactéries anaéro-

bies dont le taux de croissance est lent, il faut beaucoup de temps pour la détection, ce qui implique parfois des erreurs de mesure dues à ce qu'on compte et décèle en même temps des

bactéries inactives ou mortes.

Dans le procédé de mesure d'impédance, d'autre part, les valeurs mesurées subissent l'influence des aires de surface des électrodes, de la distance séparant celles-ci et de l'intensité et de la fréquence du courant électrique

appliqué au milieu nutritif liquide au moment de la mesure.

Il en résulte que les valeurs mesurées sont sujettes à des erreurs liées à la quantité d'échantillons étudiés au moment

de la mesure, à la fluctuation dés caractéristiques des élec-

trodes et à une variation des caractéristiques du courant électrique. De plus, la durabilité des électrodes intervient également dans ce cas. Afin de répondre à la demande tendant à accélérer l'obtention des résultats du test de sensibilité à des molécules actives ou à des produits pharmaceutiques dans le domaine de l'examen bactériologique, on a également

mis au point, pour mesurer le degrié de croissance des bacté-

ries, un procédé fondé sur la réductibilité de l'hémoglobine.

Le principe de ce procédé de mesure consiste à juger le moment et l'amplitude de la variation de la forme oxydée de l'hémoglobine contenue dans le milieu nutritif liquide et qui passe à l'état de forme réduite de l'hémoglobine, la nuance de teinte du milieu nutritif liquide virant de l'écarlate

au rouge foncé. Puisque la réduction de l'hémoglobine, c'est-

à-dire la dissociation des molécules d'oxygène se séparant

de l'hémoglobine, se produit en raison d'une chute du poten-

tiel d'oxydo-réduction de la solution d'hémoglobine, on peut penser que la réduction de l'hémoglobine pourra être provoquée

par la chute du potentiel d'oxydo-réduction.

En tenant compte des éléments précités de l'art antérieur, des expériences de divers genres ont ét.é effectuées de manière répétée en se fondant sur les découvertes selon lesquelles le potentiel d'oxydo- réduction du milieu nutritif liquide varie au cours de la croissance des bactéries et

que cette variation peut être mesurée sous forme de la varia-

tion de potentiel (ou la différence de potentiel) entre deux électrodes solides. La poursuite de ces recherches a permis la mise au point de la présente invention, Un objet de la présente invention vise à proposer un procédé pour mesurer le degré de croissance des bactéries, sans subir l'influence de la coloration ou de la turbidité d'un milieu nutritif, de la dimension et de la forme des électrodes, de la présence de bactéries mortes et d'autres facteurs ou paramètres. Selon le procédé de l'invention, on insère, dans un milieu nutritif liquide auquel des bactéries ont été inoculées, une électrode de carbone et une électrode métallique dont aucune n'exerce une influence sur le milieu nutritif liquide ou n'est endommagée par celui-ci, et l'on

peut ainsi mesurer une variation du potentiel d'oxydo-réduc-

tion apparaissant entre les deux électrodes.

Un autre objet de la présente invention consiste à proposer un procédé à utiliser pour identifier des espèces et des populations de bactéries, pour effectuer des tests de sensibilité à des molécules actives et à des produits pharmaceutiques, pour dépister des bactéries contenues dans

des échantillons et pour effectuer des opérations analogues.

Un exemple nullement limitatif de mise en oeuvre de l'invention sera décrit plus en détail en regard de la figure unique annexée montrant trois courbes représentant la croissance de Escherichia coli, mesurée par le procédé

selon l'invention. Dans cet exemple, on a utilisé comme mi-

lieu nutritif du bouillon d'infusion de cervelle et de coeur et, comme électrodes, on a utilisé une électrode de platine comme électrode de référence et une électrode en carbone pour la détection. Les courbes 1 à 3 de la figure unique annexée (ordonnées: potentiel, en millivolts; abscisses temps écoulé, en heures) correspondent aux cas suivants: la courbe 1 correspond à un essai à blanc dans lequel on a ajouté 0,2 'O de NaN3 au milieu nutritif. Dans le cas de la courbe 2, on a inoculé 2 x 10 Escherichia coli dans ou à la surface de 45 ml de milieu nutritif. Et dans le cas de la courbe No 3, on a inoculé 2 x 106 Escherichia coli dans ou

à la surface de 45 ml d'un milieu nutritif.

La présente invention se fonde sur l'idée selon laquelle la réduction de l'hémoglobine contenue dans un milieu nutritif liquide,auquel des bactéries ont été inoculées1doit être attribuée à la chute du potentiel d'oxydo-réduction de ce milieu nutritif. On est ensuite arrivé à l'idée que le degré de croissance des bactéries peut être rapidement mesuré par mesure directe de la variation du potentiel d'oxydo-

réduction. Des études et essais expérimentaux ont alors com-

mencé. Pour mesurer le potentiel d'oxydo-réduction, on a tout d'abord combiné une électrode de platine, jouant le rôle d'électrode indicatrice, avec des demi-cellules comme

une électrode à hydrogène, une électrode au calomel, une élec-

trode au chlorure d'argent, et des électrodes analogues des-

tinées à jouer le rôle de contre-électrode. Puis l'on a

mesuré la différence de potentiel entre l'électrode indicatri-

ce et la contre-électrode. Cependant, on ne peut éviter une forme compliquée de la contre-électrode, ce qui la met en

présence d'air et lui donne des raccords comportant du liquide.

On peut donc craindre que cela n'altère les caractéristiques du milieu nutritif lors de la culture des bactéries et que

n'apparaissent également divers genres de problèmes de struc-

ture et de fonctionnement, comme l'intrusion des bactéries dans les raccords liquides lorsqu'une expérience dure de

nombreuses heures, les difficultés de lavage ou de stérilisa-

tion après une expérience et au moment d'en commencer une

nouvelle, et des problèmes analogues.

C'est pourquoi il a été essayé de mesurer le po-

tentiel d'oxydo-réduction à l'aide de diverses combinaisons d'électrodes pleines ou solides comme du platine (Pt), de l'argent (Ag), du carbone (C) , du tungstène (W), du titane

(Ti), etc., dans l'espoir de pouvoir simplifier la cons-

truction'de l'appareillage.

Pour les études fondamentales, on a mesuré la variation du potentiel électrique d'une solution 1M de chlorure ferrique et d'un milieu nutritif liquide (infusion de cervelle et de coeur) lors de l'addition de 0,1 M d'acide ascorbique pour provoquer une réduction. On a alors obtenu

les résultats suivants.

en comparaison de la non-addition d'acide ascorbi-

que, on a trouvé que la différence de potentiel augmente dans le chlorure ferrique de 35 millivolts lorsqu'on utilise une combinaison Pt-Ag pour les électrodes; elle augmente de 167 millivolts avec une combinaison C-Ag, de 65 millivolts

avec une combinaison C-W, de 120 millivolts avec une combi-

naison C-Ti, de 114 millivolts avec C-Pt, de 35 millivolts avec Pt-Ti et de O millivolt avec Ti-Ag, cependant que, dans une infusion de cervelle et de coeur, la différence de potentiel augmente de 165 millivolts lorsqu'on utilise C-Ag, de 57 millivolts avec C-Ti, de 216 millivolts avec C-Pt et

de 124 millivolts avec C-W.

On a ensuite étudié la stabilité du potentiel ou

de la différence de potentiel électrique pour chaque combinai-

son d'électrodes, dans le cas d'une infusion de cervelle et de coeur à laquelle on avait ajouté 0,2 n d'azoture de sodium comme antiseptique. Il s'est avéré que le potentiel ou la différence de potentiel de chaque paire d'électrodes s'est maintenue pratiquement constante après une période initiale

de 30 minutes (courbe 1 de la figure annexée).

La variation de la différence de potentiel électri-

que due à la croissance des bactéries se traduit par une courbe à deux étapes (et trois paliers) qui s'élève légèrement au début de la croissance des bactéries et, après un court instant de stabilité, change brusquement d'inclinaison en

donnant une courbe très inclinée (c'est-à-dire que la diffé-

rence de potentiel augmente alors), comme on le voit sur

les courbes 2 et 3 de la figure annexée représentant les va-

riations de la différence de potentiel électrique dans le cas de C-Pt, par exemple, lorsque, après inoculation de Escherichia coli à 45 ml d'infusion de cervelle et de coeur, il y a eu culture à 370C. On doit cependant noter qu'il arrive parfois que la courbe précitée descende un peu avant de présenter

une brusque variation d'inclinaison ascendante.

Les deux courbes 2 et 3, varient parallèlement, l'une corres-

pundant à un processus rapide et l'autre à un processus plus lent. Si la population respective de bactéries inoculées a été réduite à 1'10 ou à 1/100,

respectivement, avant le début de la croissance, le moment du début de varia-

tion d'inclinaison de la courbe est retardé selon le taux de réduction de la population initiale, mais les courbes obtenues gardent une forme semblable à celle des courbes 2 et 3 de la figure unique. On note qu'il n'y a pas cependant de grande différence pour l'amplitude de la variation du potentiel (ou la différence de potentiel)

électrique qui est dans les deux cas d'environ 150 millivolts.

Le fait que la différence de potentiel entre les électrodes varie de cette façon remarquablement à un moment avancé de la croissance des bactéries, peut être considéré comme correspondant au phénomène de variation soudaine du potentiel électrique lorsque, dans un système d'oxydo-réduction, la substance sous forme oxydée ou la substance sous forme réduite atteint une très faible concentration. Au moment de la

nette variation de la différence de potentiel, on peut consi-

dérer comme pratiquement constant le nombre des bactéries, en supposant que la souche des bactéries, la composition du milieu nutritif Lt la nature des électrodes soient spécifiées à l'avance. Donc, lorsqu'une observation au microscope permet un dénombrement, il est possible de trouver le moment o les bactéries, inoculées dans ou sur le milieu nutritif au début de l'essai, croissent jusqu'à atteindre le nombre précité (qui est la population des bactéries au moment o la différence de potentiel varie notablement). Inversement, sï l'on a déterminé à l'avance pour chaque cas possible le nombre de bactéries à l'origine et le temps nécessaire pour que leur

croissance les amène au nombre précité de populations bacté-

riennes, on peut Facilement et rapidement déduire, à partir du temps nécessaire aux bactéries pour subir une croissance les portant au nombre précité de la population des bactéries,

le nombre de bactéries qui ont été inoculées au début.

Il est également possible d'identifier les bacté-

ries en se fondant sur la forme de la courbe représentant la différence de potentiel, c'est-à-dire la courbe de croissance des bactéries, et aussi d'effectuer non seulement un examen bactériologique particulier, mais également un dépistage à grande échelle des bactéries présentes dans les échantillons

d'essai comme de l'urine et d'autres échantillons.

Par ailleurs, en se fondant sur le temps écoulé

depuis le moment de référence précité, il est possible d'ef-

fectuer rapidement et de manière précise l'essai de la sensi-

bilité des bactéries à l'action des molécules ou médicaments.

On peut d'ailleurs mesurer de façon simple l'efficacité d'une molécule ou d'un produit pharmaceutique ou médicament en divisant un échantillon d'essai en deux parties. Rien n'est

ajouté à l'une1mais l'on ajoute à l'autre une certaine molé-

cule ou un certain médicament et l'on compare les différents temps nécessaires pour que les deux parties atteignent séparé-

ment l'instant de la nette variation d'une différence de -

potentiel entre elles. On peut ainsi évaluer ou même décider

de la posologie, c'est-à-dire de la dose du médicament à pres-

crire à un patient.

Ainsi qu'il ressort des résultats expérimentaux décrits ci-dessus, il a été établi que lorsqu'une électrode en carbone constitue un côté de la paire d'électrodes, la différence de potentiel que l'on note est supérieure à celle obtenue lorsque des électrodes exclusivement métalliques constituent les deux côtés de la paire d'électrodes. Donc, une paire d'électrodes dont l'une est en carbone présente une

meilleure sensibilité pour les mesures.

On peut également noter que l'utilisation d'une électrode en Ag a provoqué une diminution de la croissance

des bactéries. On pense que cela est dû à l'effet de stérili-

sation exercé par les ions argent produits par la dissolution de l'électrode dans le milieu nutritif. C'est pourquoi il n'a pas été possible d'utiliser une électrode en argent dans

les mesures précitées.

Il est donc souhaitable de n'utiliser toujours

qu'une électrode en carbone (C) d'un côté d'une paire d'élec-

trodes et, de l'autre côté, un métal stable qui n'est pas troublé par le milieu nutritif et n'exerce pas d'influence sur celui-ci.On peut citer par exemple comme métal intéressant le platine (Pt), le tungstène (W), le titane (Ti), etc. Parmi eux, le platine semble correspondre au cas idéal du point de vue de la résistance à la corrosion, etc., mais si l'on

regarde le problème sous l'angle économique ou de la combinai-

son avec le milieu nutritif, on constate que les autres métaux sont, également, d'une utilisation intéressante. On peut noter que l'électrode utilisée dans l'expérience précitée a été réalisée en carbone vitreux, mais il va sans dire que l'on peut également utiliser une électrode en graphite, en carbone pyrolytique, et en d'autres formes de carbone. Elles peuvent toutes être bien utilisées dans le milieu nutritif

et y rester stables. Comme antérieurement décrit, la varia-

tion de potentiel (ou de différence de potentiel) qui se pro-

duit lors de la croissance des bactéries peut être décelée de façon reproductible et stable lorsqu'on utilise les paires d'électrodes solides ou pleines indiquées ci-dessus. Cela contribue très bien à simplifier l'essai de sensibilité des

bactéries à l'action d'une molécule.

On peut donc s'attendre à ce qu'un appareil construit pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention

soit compact, de petite dimension et robuste sans qu'il né-

cessite de faire appel à toutes sortes de contre-électrodes à structure compliquée comme des électrodes à hydrogène, une électrode au calomel, etc. Le procédé de l'invention n'exige pas de détection optique et n'est donc pas soumis à l'influence

de la coloration ou de la turbidité ou trouble du milieu nu-

tritif. Contrairement au procédé utilisant un pont

d'impédances, le procédé de l'invention n'exige pas une ali-

mentation par un courant électrique spécial.

Le potentiel d'oxydo-réduction entre l'électro-

de et le milieu nutritif peut être lu directement sans néces-

siter d'interposition et sans subir d'influence due à la

dimension et à la forme des électrodes.

Le procédé de l'invention saisit et décèle l'augmentation et la chute de l'activité métabolique elle-même des bactéries. Ce procédé permet de déceler rapidement même une variation de la croissance de bactéries anaérobies, par exemple, dont la croissance est lente, et il peut également servir à effectuer une discrimination entre des bactéries inactives ou mortes d'une part, et des bactéries actives,

d'autre part, et également à évaluer par un processus ou dosa-

ge biologique l'efficacité d'une molécule ou d'un produit

pharmaceutique ou médicament.

Il va de soi que, sans sortir du cadre de l'invention, de nombreuses modifications peuvent être apportées

au procédé de mesure de la croissance des bactéries décrit ci-dessus.

Claims (3)

REVENDICATIONS

1. Procédé pour mesurer la croissance d'une

bactérie, caractérisé en ce qu'on décèle le degré de cro-is-

sance de la bactérie en décelant la variation du potentiel d'oxydoréduction d'un milieu nutritif liquide auquel la

bactérie a été inoculée, et en ce qu'on mesure cette varia-

tion de potentiel sous forme de la différence de potentiel en-

tre une électrode de carbone et une électrode métallique.

2. Procédé selon la revendication 1, caracté-

risé en ce qu'on utilise comme électrode métallique une élec-

trode réalisée en platine, en titane ou en tungstène.

3. Procédé selon la revendication 1, caracté-

risé en ce qu'il consiste également à établir au préalable une corrélation entre le temps écoulé depuis le début de la mesure jusqu'à des variations notables de la différence de

potentiel entre l'électrode de carbone et l'électrode métal-

lique, d'une part, et la population de bactéries en ce ou ces

moments, d'autre part.