WO2023126618A1 - Procédé et système pour détecter et identifier un micro-organisme contenu dans un échantillon - Google Patents

Procédé et système pour détecter et identifier un micro-organisme contenu dans un échantillon Download PDF

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Publication number
WO2023126618A1
WO2023126618A1 PCT/FR2022/052517 FR2022052517W WO2023126618A1 WO 2023126618 A1 WO2023126618 A1 WO 2023126618A1 FR 2022052517 W FR2022052517 W FR 2022052517W WO 2023126618 A1 WO2023126618 A1 WO 2023126618A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
potential
electrode
sample
measurement
potential difference
Prior art date
Application number
PCT/FR2022/052517
Other languages
English (en)
Inventor
Thibaut BABIN
Maxime GOUGIS
Pascal Mailley
Pierre Marcoux
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives filed Critical Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives
Publication of WO2023126618A1 publication Critical patent/WO2023126618A1/fr

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Definitions

  • the present invention belongs to the technical field of diagnostic microbiology and more particularly to the field of the detection and identification of microorganisms present in a liquid or solid sample.
  • the main advance of the present invention lies in the use of electrochemistry for the identification without a priori of a microorganism such as a pathogen.
  • the applications of the present invention relate in particular to sterility tests in the healthcare environment but also in other environments such as the pharmaceutical, biomedical, environmental or agrifood environment.
  • the operator takes approximately 10 mL of blood from a patient.
  • This test portion is placed in a bottle containing between 30 and 40 mL of a culture medium conducive to bacterial growth.
  • the principle of detection is based on bacterial respiration, by multiplying bacteria will produce a quantity of detectable carbon dioxide.
  • the bottom of the bottle can be made of a polymer, which will change color or fluorescence depending on the CO2 concentration of the liquid.
  • Blood culture automats then allow the flasks to be stirred at 37°C while using an optical method in order to check the variation in color or fluorescence of the polymer.
  • the operator must remove a small quantity of the culture broth in order to carry out a Gram stain.
  • This manipulation is not automated and requires dangerous products such as, for example, crystal violet or gentian violet, Lugol's solution (iodine), alcohol, acetone or fuchsin.
  • the identification is refined with the use of a MALDI-TOF mass spectrophotometer (for “Matrix Assisted Laser Desorption/lonization-Time Of Flight”) then an antibiogram.
  • Blood culture machines or CMBCS for "Continuous Monitoring Blood Culture System” are today all systems that are confined to the sterility test only: they detect the presence of a microorganism, even if it is a single cell, without giving the slightest information as to its nature as eukaryote or prokaryote, Gram+ or Gram-, or species.
  • the probe depends on the pathogen, the medium and the technique used. It is possible to graft an antibody, a bacteriophage, a thiol probe, an aptamer, a DNA probe, an RNA probe or a probe specific to a protein in order to detect a biological mechanism specific to the bacterium sought.
  • amperometry consisting in the detection of a variation in current
  • impedance spectroscopy consisting in the detection of a modification in the resistance of the electrode.
  • the inventors have set themselves the goal of proposing a method that meets the technical problems of the methods of the prior art, i.e. a method that is easy to implement, rapid, efficient, making it possible to detect and then identify a microorganism contained in a sample. liquid or solid.
  • the present invention makes it possible to achieve the goal that the inventors have set themselves. Indeed, the latter have shown that it is possible to propose a process that is easy to implement, fast, efficient, thanks to which it is possible to detect and then to identify a microorganism contained in a liquid or solid sample, using electrochemistry.
  • the invention is based on a variation of the electrochemical signal, in particular on the evolution of the electrochemical potential and, in particular, on the evolution of the derivative of the electrochemical potential with respect to time of at least one and typically of several electrodes of materials different.
  • suitable signal processing it is possible to detect the growth of a microorganism such as bacterial growth and then identify the microorganism to varying degrees of accuracy. This therefore allows a reduction in the time to result, a reduction in working time and risks for the operator.
  • the present invention relates to a method for detecting and identifying a microorganism contained in a sample comprising the steps consisting in a) placing the sample, in a liquid culture medium, in the presence of at least one measuring electrode and a reference electrode and under conditions suitable for the growth of microorganisms, b) measuring, over time, the potential difference between the measurement electrode(s) and the reference electrode, c ) optionally calculating the derivative of the potential difference from the measurement made in step b) whereby the profile of the derivative of the potential is obtained, and d) detecting and identifying a microorganism contained in said sample either from the profile of the potential obtained in step b), or from the profile obtained in step c).
  • the present invention relates to a method for detecting and identifying a microorganism contained in a sample comprising the steps of a) placing the sample, in a liquid culture medium, in the presence of at least a measurement electrode and a reference electrode and under conditions suitable for the growth of microorganisms, b) measuring, over time, the potential difference between the measurement electrode(s) and the reference electrode, and d) detecting and identifying a microorganism contained in said sample from the profile of the potential obtained in step b).
  • the detection and identification of the microorganism contained in the sample is done from the potentiometric signal obtained in step b).
  • the present invention relates to a method for detecting and identifying a microorganism contained in a sample comprising the steps consisting in a) placing the sample, in a liquid culture medium, in the presence of at least a measurement electrode and a reference electrode and under conditions suitable for the growth of microorganisms, b) measuring, over time, the potential difference between the measurement electrode(s) and the reference electrode, c) calculating the derivative of the potential difference from the measurement made in step b) whereby the profile of the derivative of the potential is obtained, and d) detecting and identifying a microorganism contained in said sample from the profile obtained in step c).
  • the sample used in the context of the method of the invention can be any sample that is usually sterile but likely to contain microorganisms following a particular event such as contamination, infection, pathology or malfunction of a filtration system. , decontamination or cleaning.
  • This sample can be in liquid or solid form.
  • the sample used in the method according to the invention is advantageously chosen from the group consisting of a biological fluid; water such as, for example, filtered water of sterile grade in particular used in installations and medical production, ground water, spring water or surface water; a sample taken from a liquid industrial effluent; a sample from air filtration; a sample taken from a food, cosmetic or pharmaceutical product and a sample taken from an object.
  • a biological fluid such as, for example, filtered water of sterile grade in particular used in installations and medical production, ground water, spring water or surface water
  • a sample taken from a liquid industrial effluent such as, for example, filtered water of sterile grade in particular used in installations and medical production, ground water, spring water or surface water
  • a sample taken from a liquid industrial effluent such as, for example, filtered water of sterile grade in particular used in installations and medical production, ground water, spring water or surface water
  • a sample taken from a liquid industrial effluent such as, for example, filtered
  • the biological fluid is advantageously chosen from the group consisting of blood such as whole blood or anti-coagulated whole blood, blood serum, blood plasma, lymph, tears, sperm, urine, milk, cerebrospinal fluid, interstitial fluid, joint fluid, pericardial fluid, isolated bone marrow fluid, cell extract, tissue extract, organ extract and mixtures thereof .
  • the biological fluid can be any fluid naturally secreted or excreted from a human or animal body or any fluid recovered, from a human or animal body, by any technique known to those skilled in the art such as extraction , sampling, puncture or washing. The steps for recovering and isolating these different fluids from the human or animal body are carried out prior to the implementation of the method according to the invention.
  • the liquid industrial effluent in which the sample is taken can be an effluent from an agro-food, pharmaceutical or cosmetics industry.
  • the object on which the sample is taken can be chosen from large installations such as an industrial object such as an electronic device or a machine used in agro-food, pharmaceutical or cosmetic industries, a tank, a restaurant kitchen, a cold room, a toilet, a container, and small objects such as medical devices or pipes.
  • sampling means any type of collection of samples, for example, by contact, scraping, swabbing, drilling, cutting, punching, grinding, washing, rinsing, suction, puncture or pumping.
  • the sample implemented in the method according to the invention is blood such as human or animal blood.
  • the latter is normally sterile but may contain microorganisms such as bacteria during non-pathological or pathological bacteremia.
  • bacteria can be present in the blood following theoretically harmless acts such as brushing teeth, dental care or medical acts involving probes or catheters. This is called non-pathological bacteremia.
  • Pathological bacteremia corresponds to the presence of bacteria in the blood following pneumonia, a wound or a urinary tract infection.
  • micro-organisms contained or likely to be contained in the sample there are both prokaryotic micro-organisms such as archaea or Gram+ or Gram- bacteria, and eukaryotic micro-organisms such as yeasts and other fungi. microscopic and protists such as algae or protozoa.
  • microorganisms contained or likely to be contained in the sample used in the context of the invention mention may be made of bacteria of the Enterobacteriaceae family, bacteria of the family Pseudomonadaceae, bacteria of the genus Staphylococcus, bacteria of the genus Streptococcus, bacteria of the genus Campylobacter, bacteria of the genus Haemophilus, bacteria of the genus Anaerococcus, bacteria of the genus Bacteroides, bacteria of the genus Acinetobacter, bacteria of the genus Stenotrophomonas, bacteria of the genus Achromobacter, bacteria of the genus
  • Fusobacterium bacteria of the genus Pasteurella, bacteria of the genus Bacillus, bacteria of the genus Listeria, bacteria of the genus Clostridium, bacteria of the genus Mycobacteria, bacteria of the genus Enterococcus and bacteria of the genus Pasteurella, yeasts of the genus Candida, yeasts of the genus Saccharomyces, fungi of the genus Aspergillus, fungi of the genus Penicillium and/or archaea of the genus Methanobrevibacter.
  • bacteria of the Enterobacteriaceae family contained or capable of being contained in the sample used in the context of the invention mention may be made of bacteria of the genera Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Morganella, Yersinia, Citrobacter and Providencia.
  • the sample Prior to bringing into contact with the liquid culture medium in the presence of the electrodes i.e. prior to step a) of the method according to the invention, the sample can be subjected to a preparation step by means of any preparation process of a sample likely to contain microorganisms, known to those skilled in the art.
  • This step may in particular consist, in a non-exhaustive manner, of a dilution, a concentration, a division into equivalent or non-equivalent portions or a suspension.
  • the sample is diluted in the liquid culture medium, when this sample is liquid.
  • this sample is liquid.
  • it is suspended in the liquid culture medium.
  • the liquid culture medium used during step a) of the method according to the invention can be any liquid medium suitable for the culture of microorganisms, known to those skilled in the art.
  • suitable for the cultivation of microorganisms is meant a preparation within which the microorganisms can multiply.
  • This medium comprises a carbon source, such as glucose, acetate or glycerol; a nitrogen source, such as ammonium, nitrates or amino acids; and salts and/or trace elements and vitamins for the growth of microorganisms.
  • this liquid culture medium may not be selective for a particular type of microorganism. Alternatively, it may be selective for a particular type of microorganism.
  • liquid culture media that can be used during step a) of the process according to the invention
  • These culture media are in particular available from the companies ThermoFisher, Bio-Rad Laboratories, bioMérieux and Sigma Aldrich.
  • step a) of the method according to the invention conditions suitable for the growth of microorganisms are implemented.
  • the microorganisms are maintained in an environment which allows them to increase in number by cell division.
  • This environment includes not only the culture medium in which the sample was diluted or resuspended, but also other conditions such as temperature and atmosphere that allow cell growth.
  • the temperature used during step a) is between 20°C and 40°C.
  • Specific examples of temperature used in step a) are 20°C, 25°C, 30°C, 32°C, 37°C and 39°C.
  • step a) can be carried out under an oxygen-free atmosphere, under air, in air + 5% CO2 or under a gas mixture composed of 5% 02.5 % CO2 and 90% N2.
  • An oxygen-free atmosphere i.e. an anoxic atmosphere
  • the method according to the invention is carried out in an instrumented bottle as described in international application WO 2021/032654 A1 [3], the atmospheric conditions therefore correspond to the air contained in the bottle following its hermetically sealed with a cap.
  • the culture medium comprising the sample capable of containing or containing microorganisms is in contact with at least two electrodes. These electrodes correspond to at least one measurement electrode, also designated by the expression “working electrode” and a reference electrode.
  • At least two, at least three, at least four, at least five, at least six, at least seven, at least eight, at least nine, at least ten measuring electrodes, identical or different, can be implemented.
  • the experimental part below presents a more particular embodiment with four different pairs of measurement electrodes and a reference electrode.
  • different measuring electrode is meant electrodes whose chemical nature differs. Any measurement electrode known to those skilled in the art can be used within the scope of the present invention.
  • the measurement electrode(s) used in the method according to the invention can be chosen from the group consisting of a solid metal electrode, a glass electrode, an electrode glassy carbon, an electrode made in the form of a deposit of a conductive ink and an electrode made in the form of an electrodeposit of a conductive element.
  • the conductive ink used is an ink based on metal ions or conductive organic polymers such as polythiophene (PT), polyaniline (PANI) optionally doped with dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA) , poly(3,4-ethylenedioxythiophene) coupled to sodium polystyrene sulfonate (PEDOT:PSS), polypyrrole or polyphthalocyanine.
  • PT polythiophene
  • PANI polyaniline
  • DBSA dodecylbenzenesulfonic acid
  • PEDOT:PSS poly(3,4-ethylenedioxythiophene) coupled to sodium polystyrene sulfonate
  • PDOT:PSS polypyrrole or polyphthalocyanine.
  • the conductive ink used in the context of the invention is a carbon ink optionally comprising an additional conductive element.
  • conductive element an element chosen from the group consisting of conductive organic polymers such as those listed above, and metal-based compounds such as, for example, a metal oxide such as oxide of iridium (IrOx), a metal-based pigment such as Prussian blue (Fe(lll) ferrocyanide) or else an organic or organo-inorganic catalyst such as cobalt phthalocyanine.
  • metal-based compounds such as, for example, a metal oxide such as oxide of iridium (IrOx), a metal-based pigment such as Prussian blue (Fe(lll) ferrocyanide) or else an organic or organo-inorganic catalyst such as cobalt phthalocyanine.
  • the reference electrode used in the context of the invention is produced in the form of a deposit of an Ag/AgCl ink covered with a layer of polymer such as a layer of polyurethane, to prevent the diffusion of particles of silver and an inhibition of the growth of microorganisms.
  • the liquid culture medium and the electrodes are sterile or have been sterilized before any contact with the sample, i.e. prior to step a) of the method.
  • the culture medium can be sterilized via various techniques known in the state of the art such as, but not limited to, the use of aseptic techniques to autoclave and/or prepare the culture medium.
  • the autoclaving technique can in particular be chosen to sterilize the electrodes possibly in the presence of the liquid culture medium intended to receive the sample.
  • Step b) of the method according to the invention corresponds to the monitoring of the evolution, in the liquid culture medium, of the potential difference between the measurement electrode(s) and the reference electrode.
  • this measurement of the potential difference is done continuously. Indeed, it is possible by using a multichannel potentiostat, to measure the potential difference between the measurement electrode(s) and the reference electrode continuously (modulo the sampling period of the potentiostat -eg a few ms ). In another particular embodiment, this measurement of the potential difference is done discontinuously.
  • step b) consists in measuring the potential difference between the measurement electrode(s) and the reference electrode at a plurality of time instants whereby potential measurement points are obtained.
  • multiple distinct time instants is meant more than 2, in particular more than 5, in particular, more than 10 and, more particularly, more than 20 distinct time instants. These different time instants can be chosen at regular intervals or at irregular intervals.
  • the measurements are carried out at regular intervals.
  • this interval may be between 1 min and 30 min, in particular between 2 min and 15 min and, in particular, of the order of 5 min (5 min ⁇ 1 min).
  • the measurements are carried out at irregular intervals. Indeed, it is possible to envisage making a measurement slaved to the temporal drift of the signal, thus making it possible to measure more points in the zones of strong variation versus the periods of stagnation of the potential.
  • the measurement is continuous or discontinuous, it is possible to carry out the first measurement of the potential difference at the time instant ti just after step a) of the method of the invention i.e. 1 min , 2 min, 3 min, 4 min or even 5 min after bringing the sample into contact in the liquid culture medium in the presence of the electrodes.
  • the first potential measurement at the time instant ti at least 1 h after the contacting of the sample in the liquid culture medium in the presence of the electrodes.
  • the interval between the time instant ti of the first measurement and the time instant td of the last potential measurement during step b) is variable and depends in particular on the sample to be studied, the microorganisms likely to to be present in the latter and of the temporal instant ti.
  • the time instant td of the last potential measurement is carried out at least 2 p.m., at least 4 p.m., at least 6 p.m., at least 8 p.m. or even at least 10 p.m. after step a).
  • step b) in terms of temperature and atmospheric conditions are identical to those implemented during step a) of the process according to the invention as previously described.
  • the culture medium may be subjected to stirring during steps a) and/or b) of the method according to the invention.
  • This agitation during step a) allows homogeneous mixing of the sample with the culture medium.
  • this agitation promotes a uniform composition of the culture medium and prevents any deposit of microorganisms on the electrodes.
  • Any known technique for stirring a medium and not interfering with the measurement of the potential can be used in the context of the present invention.
  • This agitation is in particular as envisaged in international application WO 2021/032654 A1 [3].
  • the potentiometric signals obtained in step b) are used to detect but above all to identify the microorganism(s) in culture.
  • the various points of inflection of the potentiometric signal obtained while the microorganisms coming from the sample develop in the culture medium are both dependent on the material of the measurement electrode chosen but also on the microorganism. organism itself.
  • This type of curve makes it possible to obtain information on the nature of the microorganism(s) in culture.
  • the potentiometric signal obtained in step b) makes it possible, on its own, ie not combined with any other information, in particular electrochemical information, to identify the microorganism(s) in culture.
  • step c) consists in calculating, continuously (case of a measurement of the continuous potential difference during step b)) or from the various measurements of potential obtained in step b) (case of a measurement of the discontinuous potential difference during step b)), the derivative of the potential.
  • the calculation of the derivative of the potential difference can be done in a sliding manner over a pre-determined number of points of measurements obtained in step b).
  • the derivative of the smoothed potential difference is calculated over a pre-determined number of potential difference measurement points (moving average over a pre-determined number of potential difference measurement points).
  • the pre-determined number of measurement points is equal to 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15.
  • the pre-determined number of measurement points is equal to 5 and this, in particular when the interval between two consecutive potential measurement points is of the order of 5 min.
  • Step c) of the method according to the invention can be carried out once step b) has been carried out, ie for a discontinuous measurement, once all the potential measurement points have been taken.
  • step c) of the method according to the invention can be carried out at the same time as step b) of the method and, for a discontinuous measurement, once the first pre-determined number of potential measurement points obtained .
  • the calculation carried out in step c) ie the data processing used in step c) generates an n-dimensional response corresponding to the profile of the derivative of the potential difference.
  • the method according to the invention comprises an additional step consisting in obtaining a normalized profile of the derivative of the potential from the profile of the derivative obtained in step c).
  • the method according to the invention may also comprise an additional step consisting in obtaining a normalized profile of the potential from the electrochemical profile obtained in step b).
  • the detection of the presence or absence of microorganisms in the sample can be done by comparing the profile of the potential or possibly the normalized profile of the potential with the profile of the potential or possibly the normalized profile of the potential obtained with a negative control, ie devoid of microorganisms and under the same operating conditions and in particular the same working electrode(s), the same reference electrode and the same culture medium .
  • the detection of the presence or absence of microorganisms in the sample can be done by comparing the profile of the derivative of the potential or possibly the normalized profile of the derivative of the potential with the profile of the derivative of the potential or possibly the normalized profile of the derivative of the potential obtained with a negative control, ie devoid of microorganisms and under the same operating conditions and in particular the same working electrode(s) , the same reference electrode and the same culture medium.
  • the identification of a particular microorganism can be done by comparing the profile of the potential or possibly the normalized profile of the potential with different profiles of the potential or possibly different normalized profiles of the potential obtained, each, with a known microorganism and under the same operating conditions and in particular the same working electrode(s), the same reference electrode and the same culture medium.
  • the identification of a particular microorganism can be done by comparing the profile of the derivative of the potential or possibly the normalized profile of the derivative of the potential with different profiles of the derivative of the potential or possibly different normalized profiles of the derivative of the potential obtained, each, with a known microorganism and under the same operating conditions and in particular the same working electrode(s), the same reference electrode and the same culture medium.
  • the present invention also relates to a system for detecting and identifying a microorganism contained in a sample capable of being implemented during the method as previously defined comprising i) a device configured for cell culture in a liquid medium comprising at least one measuring electrode and a reference electrode, ii) a unit for measuring the potential difference between the measuring electrode(s) and the reference electrode and configured to measure the potential difference, continuously and/or at a plurality of temporal instants, iii) an electronic unit for acquiring the measurement of the potential difference, connected to the potential measurement unit, iv) a power supply unit for supplying the electronic acquisition unit, and v) a unit processing unit connected to the electronic acquisition unit and configured to process the measurement of the potential difference and possibly calculate, from the latter, the derivative of the potential difference and comprising a detection and identification module a microorganism by analysis of the potential difference or optionally by analysis of the derivative of the potential difference.
  • the processing unit is configured to process the measurement points of the potential difference and calculate, from the latter, the derivative of the potential difference and/or configured to process the continuous measurement of the potential difference and calculate, from the latter, the derivative of the potential difference.
  • Figure 3 presents the smoothed derivatives of the potential of the polyaniline-based electrode, obtained in human blood after growth of various bacteria and for a negative control.
  • Figure 4 presents the smoothed derivatives of the potential of the polyaniline-based electrode, obtained in human blood after growth of all the bacteria tested, time normalized to center the maximums.
  • Figure 5 presents the 3D space allowing the orientation of the identification of the bacteremia from the potential derivatives obtained.
  • Figure 6 presents the 2D space allowing the orientation of the identification of the bacteremia from the potential derivatives obtained.
  • Figure 7 presents the modulus as a function of frequency, calculated from the Fourier transform of the smoothed derivative of the potential of the polyaniline-based electrode, obtained in human blood after growth of all the bacteria tested.
  • Figure 8 presents the Gram-correct typing rate (%) versus additional incubation time after culture positivity from the obtained potential derivatives.
  • the measuring device is a PCB platform (for “Printing Circuit Board”), with 10 gold electrodes: 8 working electrodes and a reference electrode (.
  • the materials, in the form of ink, are deposited on the gold then dried in an oven, at 80° C., for 2 hours
  • the measuring device may optionally comprise a counter-electrode such as a counter-electrode in commercial carbon ink (Dupont BQ.242). 1.1. Working electrodes.
  • Each electrode is made in duplicate on the platform in order to avoid possible problems on a deposit.
  • inks i) polyaniline (PANI), doped with dodecylbenzenesulfonic acid (DBSA) (Pani-DBSA ink from Rescoll); ii) iridium oxide (IrOx), metallic oxide, integrated in a carbon ink (Dupont BQ.242); iii) SunChemical Gwent C2070424P2, commercial carbon ink with Prussian blue (Fe(III) ferrocyanide); and iv) commercial carbon ink (Dupont BQ.242).
  • PANI and IrOx inks have a known and stable sensitivity to pH variations while SunChemical Gwent C2070424P2 and Dupont BQ242 are chosen for the detection of other chemical reactions within the medium.
  • Each working electrode has an undercoat of Dupont BQ242 carbon ink to improve the mechanical resistance of the deposit.
  • Ag/AgCl ink is commonly used as a pseudo reference electrode material.
  • this electrode is particularly sensitive to oxidative stress induced by the sterilization method used (autoclave), it is also protected by a polyurethane membrane which is left to dry for 24 h, at room temperature, after deposition.
  • the platform is integrated into an Azlon' polypropylene bottle.
  • the slot used to pass the connectors outside the bottle is sealed by three successive methods: - addition of LOCTITE® 406TM cyanoacrylate adhesive, after application of an activator,
  • the bottle is filled with approximately 30 mL of BACT/ALERT® culture medium, it is autoclaved in a Tuttnauer 2540 EL autoclave using a “Liquid” cycle. It therefore undergoes a temperature increase to a plateau at 121° C. for 15 min. This method makes it possible to ensure the sterility of the electrodes and the culture medium.
  • the bottle is inoculated with a certain quantity of bacteria according to the protocol explained below, all manipulations taking place under PSM with the security measures in force.
  • Bacterial colonies are added to a vial filled with 3 mL of pharmaceutical diluent (European Pharmacopoeia diluent - 9 mL tube, VWR AX011144).
  • the turbidity of this mixture is regularly measured by a turbidimeter in order to reach a value of 0.5 McFarland.
  • Colonies are added using a loop (or inoculation loop) from a culture on a Petri dish that has been prepared and then placed at 37°C for 24 hours. Once the value of 0.5 McFarland has been reached, a cascade dilution is carried out in pharmaceutical diluent until the desired theoretical bacterial concentration is reached.
  • a volume of 0.4 mL of this latter dilution is taken and then added to the measuring bottle previously filled with 30 mL of BACT/ALERT culture medium and 10 mL of blood. It is therefore a seeding at l/ 100th .
  • plate counts are carried out. For this, a volume of 0.1 mL of a dilution is taken and then spread on a Petri dish with a rake.
  • This count is carried out on the last two dilutions, in triplicate in order to be able to make an average.
  • the electrochemical measurement method used is potentiometry, ie a potential difference between a working electrode and a reference electrode whose potential does not vary over time.
  • the device being composed of 8 working electrodes, the measurement is multiplexed: every 5 minutes, the potential of each electrode is recorded for 0.1s.
  • This method makes it possible to obtain 8 curves of potential as a function of time.
  • the experiment was repeated with several different bacteria, several initial quantities and even without any bacteria in order to obtain negatives providing information on the stability of the measurement.
  • the biological media such as the blood used not being inert, the electrodes record potential variations even without the presence of bacteria.
  • the smoothed derivative of the potential is only looked at from 4 hours of recording.
  • bacteria have an incompressible latency time during which any detection is unthinkable because bacterial growth has not yet started.
  • V Creation of a descriptor.
  • a descriptor from the different curves measured on polyaniline electrodes has been created. However, it is quite possible to create a descriptor for each electrode.
  • This descriptor makes it possible to determine the bacterial species according to the profile of the curve of the smoothed derivative of the potential. To do this, we use a database obtained from experiments carried out on human blood with different bacteria. The details of these experiments are provided in Table 1 below.
  • the Tanagra software can be used to perform an unsupervised principal component analysis (PCA). This analysis makes it possible to represent the different points in a space in 3D ( Figure 5) or 2D ( Figure 6).
  • PCA principal component analysis
  • the method according to the invention therefore makes it possible to determine the Gram of the bacterium without any other manipulation or any product, contrary to the hospital reality where the Gram staining is done under a microscope after addition of chemical products. Thirty minutes after detection, there is an accuracy of 82%, 2 h after detection, 90% accuracy and, 3 h after detection, 99% accuracy. The more information one obtains, the more it is possible to specify the nature of the detected pathogen.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé pour détecter et identifier un micro-organisme contenu dans un échantillon comprenant les étapes consistant à (a) placer l'échantillon, dans un milieu de culture liquide, en présence d'au moins une électrode de mesure et d'une électrode de référence et dans des conditions adaptées à la croissance des micro-organismes, (b) mesurer, au cours du temps, la différence de potentiel entre ladite au moins une électrode de mesure et l'électrode de référence, (c) éventuellement calculer la dérivée de la différence de potentiel à partir de la mesure effectuée à l'étape (b) moyennant quoi le profil de la dérivée du potentiel est obtenu, et (d) détecter et identifier un micro-organisme contenu dans ledit échantillon soit à partir du profil du potentiel obtenu à l'étape b), soit à partir du profil obtenu à l'étape c). La présente invention concerne également un système susceptible d'être mis en œuvre lors de ce procédé.

Description

PROCÉDÉ ET SYSTÈME POUR DÉTECTER ET IDENTIFIER UN MICRO-ORGANISME CONTENU DANS UN ÉCHANTILLON
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention appartient au domaine technique de la microbiologie diagnostique et plus particulièrement au domaine de la détection et de l'identification de micro-organismes présents dans un échantillon liquide ou solide.
L'avancée principale de la présente invention réside dans l'utilisation de l'électrochimie pour l'identification sans a priori d'un micro-organisme tel qu'un pathogène. Les applications de la présente invention concernent notamment les tests de stérilité dans le milieu de la santé mais également dans d'autres milieux comme le milieu pharmaceutique, biomédical, environnemental ou agroalimentaire.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE
En microbiologie clinique, et plus particulièrement dans le domaine de l'hémoculture, l'opérateur/trice prélève environ 10 mL de sang sur un patient. Cette prise d'essai est placée dans un flacon contenant entre 30 et 40 mL d'un milieu de culture propice à la croissance bactérienne. Le principe de la détection repose sur la respiration bactérienne, en se multipliant les bactéries produiront une quantité de dioxyde de carbone détectable.
Par exemple, le fond du flacon peut être composé d'un polymère, qui changera de couleur ou de fluorescence en fonction de la concentration en CO2 du liquide. Les automates d'hémoculture permettent alors l'agitation des flacons à 37°C tout en utilisant une méthode optique afin de vérifier la variation de couleur ou de fluorescence du polymère.
Une fois le flacon décelé comme positif, l'opérateur/trice doit prélever une petite quantité du bouillon de culture afin d'effectuer une coloration de Gram. Cette manipulation n'est pas automatisée et nécessite des produits dangereux tels que, par exemple, cristal violet ou violet de gentiane, solution de Lugol (iode), alcool, acétone ou fuchsine. Après cette première orientation, l'identification est affinée avec l'utilisation d'un spectrophotomètre de masse MALDI-TOF (pour « Matrix Assisted Laser Desorption/lonization-Time Of Flight ») puis un antibiogramme.
Il ressort de ce procédé à plusieurs étapes longues que le temps entre la prise d'essai et le résultat est, au mieux, de plusieurs dizaines d'heures. Ce délai important ne pouvant être associé à une absence de traitement, une antibiothérapie à spectre large est débutée sans attendre le résultat de l'hémoculture. Or, des antibiotiques peu ou pas adaptés au pathogène peuvent entrainer une antibiorésistance, un des plus grands dangers pour la santé mondiale.
Les automates d'hémoculture ou CMBCS pour « Continuous Monitoring Blood Culture System » sont aujourd'hui tous des systèmes qui se cantonnent au test de stérilité uniquement : ils détectent la présence d'un micro-organisme, même s'il s'agit d'une cellule unique, sans donner le moindre renseignement quant à sa nature comme eucaryote ou procaryote, Gram+ ou Gram-, ou encore espèce.
On peut citer les systèmes de respirométrie radiométrique (Bactec™ 460, BD), de détection du CO2 en infrarouge (Bactec™ 660/730/860, BD), de détection du CO2 en fluorescence (Bactec™ 9240, BD), de détection du CO2 en colorimétrie (BacT/ALERT', bioMérieux) ou de détection manométrique (VersaTREK™, ThermoScientific et SIGNAL™, ThermoScientific).
Peu d'automates d'hémoculture ont proposé à la fois la détection et l'identification, ou tout au moins, une orientation. On peut citer :
- en phase gaz : l'emploi d'un CSA (pour « Colorimetric Sensor Array »), nez artificiel à transduction colorimétrique, inséré dans le bouchon du flacon [1];
- en phase liquide : l'emploi de réseaux d'anticorps sur un prisme de SPR au contact de l'hémoculture [2].
En électrochimie, il est courant d'utiliser des électrodes sensibles au pH. Plusieurs matériaux sont connus pour leur variation de potentiel caractéristique dans une gamme donnée de pH, parmi eux, des polymères conducteurs comme la polyaniline et des oxydes métalliques comme l'oxyde d'iridium. La demande internationale WO 2021/032654 Al [3] propose un dispositif du type automate autonome permettant de détecter la présence de microorganismes dans un échantillon en suivant, par électrochimie, les variations de pH.
La majorité des équipes de recherche travaillant sur ces technologies utilisent l'électrochimie pour la détection a priori d'un pathogène. Grâce à l'utilisation d'une sonde immobilisée sur une électrode et en choisissant la méthode de mesure adaptée, il est en effet possible de détecter le couplage entre sonde et micro-organisme.
La sonde dépend du pathogène, du milieu et de la technique utilisée. Il est possible de greffer un anticorps, un bactériophage, une sonde thiol, un aptamère, une sonde ADN, une sonde ARN ou une sonde spécifique à une protéine afin de détecter un mécanisme biologique propre à la bactérie recherchée.
Les principales techniques utilisées sont l'ampérométrie consistant en la détection d'une variation de courant et la spectroscopie d'impédance consistant en la détection d'une modification de la résistance de l'électrode.
Le frein majeur à l'utilisation de ces technologies dans le domaine de la microbiologie diagnostique pour l'étape de détection est leur détection a priori, inenvisageable en terme clinique. De plus, bien que ces types d'électrodes permettent de discriminer les pathogènes entre celui recherché et d'autres microbes « parasites », il n'est pas possible d'identifier un pathogène autre que celui recherché.
Les inventeurs se sont fixé pour but de proposer un procédé répondant aux problèmes techniques des procédés de l'art antérieur i.e. un procédé facile à mettre en œuvre, rapide, efficace, permettant de détecter puis d'identifier un micro-organisme contenu dans un échantillon liquide ou solide.
EXPOSÉ DE L'INVENTION
La présente invention permet d'atteindre le but que se sont fixé les inventeurs. En effet, ces derniers ont montré qu'il est possible de proposer un procédé facile à mettre en œuvre, rapide, efficace, grâce auquel il est possible de détecter puis d'identifier un micro-organisme contenu dans un échantillon liquide ou solide et ce, en utilisant l'électrochimie.
L'invention repose sur une variation de signal électrochimique, notamment sur l'évolution du potentiel électrochimique et, en particulier, sur l'évolution de la dérivée du potentiel électrochimique par rapport au temps d'au moins une et typiquement de plusieurs électrodes de matériaux différents. Avec un traitement du signal adapté, il est possible de détecter la croissance d'un micro-organisme comme une croissance bactérienne puis d'identifier le micro-organisme à différents degrés de précision. Cela permet donc une réduction du temps avant résultat, une diminution du temps de travail et des risques pour l'opérateur/trice.
Le procédé objet de l'invention peut être mis en œuvre sur le flacon instrumenté tel que décrit dans la demande internationale WO 2021/032654 Al [3] dans lequel sont placées des électrodes composées de différents matériaux permettant une détection plus rapide pour deux raisons :
1) le flacon est déjà instrumenté et ne nécessite pas d'automate encombrant, le temps de transport requis habituellement n'est plus nécessaire et
2) la mesure est effectuée directement dans le flacon et non pas par l'intermédiaire d'un polymère sensible au dioxyde de carbone.
Ainsi, la présente invention concerne un procédé pour détecter et identifier un micro-organisme contenu dans un échantillon comprenant les étapes consistant à a) placer l'échantillon, dans un milieu de culture liquide, en présence d'au moins une électrode de mesure et d'une électrode de référence et dans des conditions adaptées à la croissance des micro-organismes, b) mesurer, au cours du temps, la différence de potentiel entre la ou les électrode(s) de mesure et l'électrode de référence, c) éventuellement calculer la dérivée de la différence de potentiel à partir de la mesure effectuée à l'étape b) moyennant quoi le profil de la dérivée du potentiel est obtenu, et d) détecter et identifier un micro-organisme contenu dans ledit échantillon soit à partir du profil du potentiel obtenu à l'étape b), soit à partir du profil obtenu à l'étape c).
Dans un premier mode de réalisation, la présente invention concerne un procédé pour détecter et identifier un micro-organisme contenu dans un échantillon comprenant les étapes consistant à a) placer l'échantillon, dans un milieu de culture liquide, en présence d'au moins une électrode de mesure et d'une électrode de référence et dans des conditions adaptées à la croissance des micro-organismes, b) mesurer, au cours du temps, la différence de potentiel entre la ou les électrode(s) de mesure et l'électrode de référence, et d) détecter et identifier un micro-organisme contenu dans ledit échantillon à partir du profil du potentiel obtenu à l'étape b).
Dans ce mode de réalisation, la détection et l'identification du microorganisme contenu dans l'échantillon se fait à partir du signal potentiométrique obtenu à l'étape b).
Dans un second mode de réalisation, la présente invention concerne un procédé pour détecter et identifier un micro-organisme contenu dans un échantillon comprenant les étapes consistant à a) placer l'échantillon, dans un milieu de culture liquide, en présence d'au moins une électrode de mesure et d'une électrode de référence et dans des conditions adaptées à la croissance des micro-organismes, b) mesurer, au cours du temps, la différence de potentiel entre la ou les électrode(s) de mesure et l'électrode de référence, c) calculer la dérivée de la différence de potentiel à partir de la mesure effectuée à l'étape b) moyennant quoi le profil de la dérivée du potentiel est obtenu, et d) détecter et identifier un micro-organisme contenu dans ledit échantillon à partir du profil obtenu à l'étape c). L'échantillon mis en œuvre dans le cadre du procédé de l'invention peut être tout échantillon habituellement stérile mais susceptible de contenir des microorganismes suite à un événement particulier comme une contamination, une infection, une pathologie ou un dysfonctionnement d'un système de filtration, de décontamination ou de nettoyage. Cet échantillon peut se présenter sous forme liquide ou solide.
L'échantillon mis en œuvre dans le procédé selon l'invention est avantageusement choisi dans le groupe constitué par un fluide biologique ; de l'eau comme, par exemple, de l'eau filtrée de grade stérile notamment utilisée dans les installations et la production médicale, de l'eau souterraine, de l'eau de source ou de l'eau de surface ; un prélèvement à partir d'un effluent industriel liquide ; un prélèvement provenant d'une filtration d'air ; un prélèvement dans un produit alimentaire, cosmétique ou pharmaceutique et un prélèvement sur un objet.
Dans un mode de réalisation particulier, le fluide biologique est avantageusement choisi dans le groupe constitué par le sang tel que du sang entier ou du sang entier anti-coagulé, le sérum sanguin, le plasma sanguin, la lymphe, les larmes, le sperme, l'urine, le lait, le liquide céphalo-rachidien, le liquide interstitiel, un liquide articulaire, un liquide péricardique, un fluide isolé de moelle osseuse, un extrait cellulaire, un extrait tissulaire, un extrait d'organes et un de leurs mélanges. Ainsi, le fluide biologique peut être tout fluide naturellement sécrété ou excrété d'un corps humain ou animal ou tout fluide récupéré, à partir d'un corps humain ou animal, par toute technique connue de l'homme du métier telle qu'une extraction, un prélèvement, une ponction ou un lavage. Les étapes de récupération et d'isolement de ces différents fluides à partir du corps humain ou animal sont réalisées préalablement à la mise en œuvre du procédé selon l'invention.
Dans un mode de réalisation particulier, l'effluent industriel liquide dans lequel le prélèvement est effectué peut être un effluent d'une industrie agro-alimentaire, pharmaceutique ou cosmétique.
Dans un mode de réalisation particulier, l'objet sur lequel le prélèvement est effectué peut être choisi parmi des installations de grande taille comme un objet industriel comme un appareil électronique ou une machine utilisée dans les industries agro-alimentaires, pharmaceutiques ou cosmétiques, une cuve, une cuisine de restaurant, une chambre froide, un sanitaire, un conteneur, et des objets de petite taille comme des dispositifs médicaux ou des tuyaux.
Dans le cadre de la présente invention, on entend par « prélèvement » tout type de collecte d'échantillons, par exemple, par contact, raclage, écouvillonnage, forage, découpage, poinçonnage, broyage, lavage, rinçage, aspiration, ponction ou pompage.
Dans un mode de réalisation plus particulier, l'échantillon mis en œuvre dans le procédé selon l'invention est du sang comme du sang humain ou animal. Ce dernier est normalement stérile mais peut contenir des micro-organismes comme des bactéries lors de bactériémie non pathologique ou pathologique. En effet, des bactéries peuvent être présentes dans le sang suite à des actes théoriquement inoffensifs tels que le brossage de dents, des soins dentaires ou des actes médicaux impliquant des sondes ou des cathéters. On parle alors de bactériémie non pathologique. La bactériémie pathologique correspond, quant à elle, à la présence de bactéries dans le sang suite à une pneumonie, une plaie ou une infection urinaire.
Parmi les micro-organismes contenus ou susceptibles d'être contenus dans l'échantillon, on trouve aussi bien des micro-organismes procaryotes tels que les archées ou les bactéries Gram+ ou Gram-, que des micro-organismes eucaryotes comme les levures et autres champignons microscopiques et les protistes comme les algues ou protozoaires.
A titre d'exemples illustratifs et non limitatifs de micro-organismes contenus ou susceptibles d'être contenus dans l'échantillon mis en œuvre dans le cadre de l'invention, on peut citer les bactéries de la famille des Enterobacteriaceae, les bactéries de la famille des Pseudomonadaceae, les bactéries du genre Staphylococcus, les bactéries du genre Streptococcus, les bactéries du genre Campylobacter, les bactéries du genre Haemophilus, les bactéries du genre Anaerococcus, les bactéries du genre Bactéroïdes, les bactéries du genre Acinetobacter, les bactéries du genre Stenotrophomonas, les bactéries du genre Achromobacter, les bactéries du genre
Fusobacterium, les bactéries du genre Pasteurella, les bactéries du genre Bacillus, les bactéries du genre Listeria, les bactéries du genre Clostridium, les bactéries du genre Mycobacteria, les bactéries du genre Enterococcus et les bactéries du genre Pasteurella, les levures du genre Candida, les levures du genre Saccharomyces, les champignons du genre Aspergillus, les champignons du genre Pénicillium et/ou les archées du genre Methanobrevibacter.
De plus, parmi les bactéries de la famille des Enterobacteriaceae contenues ou susceptibles d'être contenues dans l'échantillon mis en œuvre dans le cadre de l'invention, on peut citer les bactéries des genres Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Morganella, Yersinia, Citrobacter et Providencia.
Préalablement à la mise en contact avec le milieu de culture liquide en présence des électrodes i.e. préalablement à l'étape a) du procédé selon l'invention, l'échantillon peut être soumis à une étape de préparation au moyen de tout processus de préparation d'un échantillon susceptible de contenir des micro-organismes, connu par l'homme du métier. Cette étape peut notamment consister, de manière non exhaustive, en une dilution, une concentration, une division en portions équivalentes ou non ou une mise en suspension.
Typiquement, lors de l'étape a) du procédé selon l'invention, l'échantillon est dilué dans le milieu de culture liquide, lorsque cet échantillon est liquide. En variante, lorsqu'il est solide, il est mis en suspension dans le milieu de culture liquide.
Le milieu de culture liquide mis en œuvre lors de l'étape a) du procédé selon l'invention peut être tout milieu liquide adapté pour la culture des microorganismes, connu de l'homme du métier. Par « adapté pour la culture des microorganismes », on entend une préparation au sein de laquelle les micro-organismes peuvent se multiplier. Ce milieu comprend une source de carbone, comme du glucose, de l'acétate ou du glycérol ; une source d'azote, comme de l'ammonium, des nitrates ou des acides aminés ; et des sels et/ou des oligo-éléments et des vitamines pour la croissance de micro-organismes. En particulier, ce milieu de culture liquide peut ne pas être sélectif pour un type particulier de micro-organismes. En variante, il peut être sélectif d'un type particulier de micro-organismes. A titre d'exemples de milieux de culture liquides utilisables lors de l'étape a) du procédé selon l'invention, on peut citer le milieu de culture NB1 (« Nutrient Broth No. 1 »), le milieu de culture NB2 (« Nutrient Broth No. 2 »), le milieu de culture Mueller Hinton, le milieu de culture LB (« Lysogen Broth », également connu sous le nom de « Luria Bertani »), le milieu de culture TSB (« Tryptic Soybean Broth»), le milieu de culture BHI (« Brain Heart Infusion ») et le milieu de culture BACT/ALERT®. Ces milieux de culture sont notamment disponibles auprès des sociétés ThermoFisher, Bio-Rad Laboratories, bioMérieux et Sigma Aldrich.
Lors de l'étape a) du procédé selon l'invention, des conditions adaptées à la croissance des micro-organismes sont mises en œuvre. En d'autres termes, au cours de l'étape a) du procédé selon la présente invention, les micro-organismes sont maintenus dans un environnement qui leur permet d'augmenter en nombre par division cellulaire. Cet environnement comprend non seulement le milieu de culture dans lequel l'échantillon a été dilué ou remis en suspension, mais aussi d'autres conditions telles qu'une température et une atmosphère qui permettent la croissance cellulaire.
Typiquement, la température mise en œuvre lors de l'étape a) se situe entre 20°C et 40°C. Des exemples particuliers de température mise en œuvre à l'étape a) sont 20°C, 25°C, 30°C, 32°C, 37°C et 39°C.
En ce qui concerne les conditions atmosphériques, l'étape a) peut être effectuée sous une atmosphère sans oxygène, sous l'air, dans l'air + 5% de CO2 ou sous un mélange gazeux composé de 5% d'Û2, 5% de CO2 et 90% de N2. Une atmosphère sans oxygène i.e. une atmosphère anoxique est à privilégier lorsque le ou les micro-organismes contenus ou susceptibles d'être contenus dans l'échantillon se développent dans des conditions anaérobies strictes. Avantageusement, comme précédemment expliqué, le procédé selon l'invention est réalisé dans un flacon instrumenté tel que décrit dans la demande internationale WO 2021/032654 Al [3], les conditions atmosphériques correspondent donc à l'air contenu dans le flacon suite à sa fermeture hermétique par un bouchon.
Lors de l'étape a) du procédé selon l'invention, le milieu de culture comprenant l'échantillon susceptible de contenir ou contenant des micro-organismes est en contact avec au moins deux électrodes. Ces électrodes correspondent à au moins une électrode de mesure, également désignée par l'expression « électrode de travail » et une électrode de référence.
Dans un mode de réalisation particulier, au moins deux, au moins trois, au moins quatre, au moins cinq, au moins six, au moins sept, au moins huit, au moins neuf, au moins dix électrodes de mesure, identiques ou différentes, peuvent être mises en œuvre. La partie expérimentale ci-après présente un mode de réalisation plus particulier avec quatre paires différentes d'électrodes de mesure et une électrode de référence.
Par « électrode de mesure différentes », on entend des électrodes dont la nature chimique diffère. Toute électrode de mesure connue de l'homme du métier est utilisable dans le cadre de la présente invention.
Ainsi, la ou les électrode(s) de mesure utilisée(s) dans le procédé selon l'invention peu(ven)t être choisie(s) dans le groupe constitué par une électrode massive en métal, une électrode de verre, une électrode en carbone vitreux, une électrode réalisée sous forme d'un dépôt d'une encre conductrice et une électrode réalisée sous forme d'un électrodépôt d'un élément conducteur.
Toute encre conductrice connue de l'homme du métier peut être mise en œuvre dans le cadre de l'invention. Dans un mode de réalisation particulier, l'encre conductrice utilisée est une encre à base d'ions métalliques ou de polymères organiques conducteurs tels que le polythiophène (PT), la polyaniline (PANI) éventuellement dopée avec de l'acide dodecylbenzènesulfonique (DBSA), le poly(3,4-éthylènedioxythiophène) couplé au polystyrène sulfonate) de sodium (PEDOT:PSS), le polypyrrole ou le polyphthalocyanine. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'encre conductrice utilisée dans le cadre de l'invention est une encre carbone comprenant éventuellement un élément conducteur additionnel.
Par « élément conducteur », on entend un élément choisi dans le groupe constitué par les polymères organiques conducteurs tels que ceux listés ci-dessus, et les composés à base de métal comme, par exemple, un oxyde métallique tel que l'oxyde d'iridium (IrOx), un pigment à base de métal tel que le bleu de Prusse (Fe(lll) ferrocyanure) ou encore un catalyseur organique ou organo-inorganique tel que de la phtalocyanine de cobalt.
Toute électrode de référence classiquement utilisée en électrochimie peut être mise en œuvre dans le cadre de l'invention. Avantageusement, l'électrode de référence utilisée dans le cadre de l'invention est réalisée sous forme d'un dépôt d'une encre Ag/AgCI recouverte d'une couche de polymère comme une couche de polyuréthane, pour éviter la diffusion de particules d'argent et une inhibition de la croissance des micro-organismes.
Il est également possible de mettre une contre-électrode en contact avec le milieu de culture liquide durant le procédé selon l'invention. La présence d'une contre-électrode n'est nullement obligatoire.
Tout ce qui a été décrit dans la demande internationale WO 2021/032654 Al [3] quant aux électrodes de mesure et de référence s'applique également à la présente invention comme, par exemple, l'organisation en deux parties des électrodes et les contacts électriques mis en œuvre.
Avantageusement, le milieu de culture liquide et les électrodes sont stériles ou ont été stérilisés avant tout contact avec l'échantillon i.e. préalablement à l'étape a) du procédé. Le milieu de culture peut être stérilisé via différentes techniques connues dans l'état de la technique telles que, mais sans s'y limiter, l'utilisation de techniques aseptiques pour autoclaver et/ou préparer le milieu de culture. La technique d'autoclavage peut notamment être choisie pour stériliser les électrodes éventuellement en présence du milieu de culture liquide destiné à recevoir l'échantillon.
L'étape b) du procédé selon l'invention correspond au suivi de l'évolution, dans le milieu de culture liquide, de la différence de potentiel entre la ou les électrodes de mesure et l'électrode de référence.
Dans un mode de réalisation particulier, cette mesure de la différence de potentiel se fait de façon continue. En effet, il est possible en utilisant un potentiostat multivoie, de mesurer la différence de potentiel entre la ou les électrode(s) de mesure et l'électrode de référence de façon continue (modulo la période d'échantillonnage du potentiostat -e.g. quelques ms). Dans un autre mode de réalisation particulier, cette mesure de la différence de potentiel se fait de façon discontinue.
Pour ce faire, la différence de potentiel est mesurée à une pluralité d'instants temporels distincts. En d'autres termes, l'étape b) consiste à mesurer la différence de potentiel entre la ou les électrode(s) de mesure et l'électrode de référence à une pluralité d'instants temporels moyennant quoi des points de mesure de potentiel sont obtenus.
Par « pluralité d'instants temporels distincts », on entend plus de 2, notamment plus de 5, en particulier, plus de 10 et, plus particulièrement, plus de 20 instants temporels distincts. Ces différents instants temporels peuvent être choisis à intervalles réguliers ou à intervalles irréguliers. Dans une forme de mise en œuvre particulière, les mesures sont effectuées à intervalles réguliers. L'homme du métier saura déterminer, sans effort inventif, l'intervalle de temps le plus adéquat en fonction de l'échantillon à étudier et des micro-organismes susceptibles d'être présents dans ce dernier. A titre d'exemple particulier, cet intervalle peut être compris entre 1 min et 30 min, notamment entre 2 min et 15 min et, en particulier, de l'ordre de 5 min (5 min ± 1 min). Dans une autre forme de mise en œuvre particulière, les mesures sont effectuées à intervalles irréguliers. En effet, on peut envisager de faire une prise de mesure asservie à la dérive temporelle du signal permettant ainsi de mesurer plus de points dans les zones de forte variation versus les périodes de stagnation du potentiel.
Dans un mode de réalisation particulier et que la mesure soit continue ou discontinue, il est possible de réaliser la première mesure de la différence de potentiel à l'instant temporel ti juste après l'étape a) du procédé de l'invention i.e. 1 min, 2 min, 3 min, 4 min ou encore 5 min après la mise en contact de l'échantillon dans le milieu de culture liquide en présence des électrodes.
Dans un autre mode de réalisation particulier et que la mesure soit continue ou discontinue, il est possible de réaliser la première mesure de potentiel à l'instant temporel ti au moins 1 haprès la mise en contact de l'échantillon dans le milieu de culture liquide en présence des électrodes. L'intervalle entre l'instant temporel ti de la première mesure et l'instant temporel td de la dernière mesure de potentiel lors de l'étape b) est variable et fonction notamment de l'échantillon à étudier, des micro-organismes susceptibles d'être présents dans ce dernier et de l'instant temporel ti. Avantageusement, l'instant temporel td de la dernière mesure de potentiel est réalisé au moins 14 h, au moins 16 h, au moins 18 h, au moins 20 h ou encore au moins 22 h après l'étape a).
Avantageusement, les conditions opératoires lors de l'étape b) en terme de température et conditions atmosphériques sont identiques à celles mises en œuvre lors de l'étape a) du procédé selon l'invention telles que précédemment décrites.
Par ailleurs, le milieu de culture peut être soumis à une agitation durant les étapes a) et/ou b) du procédé selon l'invention. Cette agitation durant l'étape a) permet un mélange homogène de l'échantillon avec le milieu de culture. Durant l'étape b) et notamment en présence de micro-organismes, cette agitation favorise une composition uniforme du milieu de culture et empêche un éventuel dépôt de microorganismes sur les électrodes. Toute technique connue pour agiter un milieu et n'interférant pas avec la mesure du potentiel est utilisable dans le cadre de la présente invention. Cette agitation est notamment telle qu'envisagée dans la demande internationale WO 2021/032654 Al [3].
Dans le premier mode de réalisation tel que précédemment défini, les signaux potentiométriques obtenus à l'étape b) sont utilisés pour détecter mais surtout identifier le ou les micro-organisme(s) en culture.
En effet, les différents points d'inflexion du signal potentiométrique obtenu pendant que les micro-organismes provenant de l'échantillon se développent dans le milieu de culture sont à la fois dépendants du matériau de l'électrode de mesure chosi mais également du micro-organisme en lui-même. Ce type de courbe permet d'obtenir des informations sur la nature du ou des micro-organisme(s) en culture. En d'autres termes, le signal potentiométrique obtenu à l'étape b) permet, à lui seul i.e. non combiné à aucune autre information notamment électrochimique, d'identifier le ou les micro-organisme(s) en culture. Dans le second mode de réalisation tel que précédemment défini, l'étape c) consiste à calculer, de façon continue (cas d'une mesure de la différence de potentiel continue lors de l'étape b)) ou à partir des différentes mesures de potentiel obtenues à l'étape b) (cas d'une mesure de la différence de potentiel discontinue lors de l'étape b)), la dérivée du potentiel.
En effet, afin d'observer plus nettement le début des variations de potentiel lorsque des micro-organismes provenant de l'échantillon se développent dans le milieu de culture, la dérivée de la différence de potentiel pour chaque électrode est utilisée. Ainsi, on observe la vitesse de modification du potentiel, qui peut être plus parlante et lisible que les courbes potentiométriques brutes.
Dans ce mode de réalisation particulier et lorsque la mesure de la différence de potentiel lors de l'étape b) est discontinue, le calcul de la dérivée de la différence de potentiel peut se faire de manière glissante sur un nombre pré-déterminé de points de mesure obtenus à l'étape b). En d'autres termes, on calcule la dérivée de la différence de potentiel lissée sur un nombre pré-déterminé de points de mesure de différence de potentiel (moyenne glissante sur un nombre pré-déterminé de points de mesure de différence de potentiel).
Typiquement, le nombre pré-déterminé de points de mesure est égal à 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15. Avantageusement, le nombre pré-déterminé de points de mesure est égal à 5 et ce, notamment lorsque l'intervalle entre deux points de mesure de potentiel consécutifs est de l'ordre de 5 min.
Par « de manière glissante », on entend que le calcul de la dérivée est réalisée pour un nombre pré-déterminé n de points de mesure de potentiel en calculant la première valeur de la dérivée correspond à la moyenne des dérivées des points de mesure de potentiel de pi à pn, la deuxième valeur de la dérivée correspond à la moyenne des dérivées des points de mesure de potentiel de p? à pn+i, la troisième valeur de la dérivée correspond à la moyenne des dérivées des points de mesure de potentiel de ps à pn+2, et ainsi de suite... L'étape c) du procédé selon l'invention peut être réalisée une fois l'étape b) réalisée, i.e. pour une mesure discontinue, une fois l'ensemble des points de mesure de potentiel. En variante, l'étape c) du procédé selon l'invention peut être réalisée en même temps que l'étape b) du procédé et, pour une mesure discontinue, une fois le premier nombre pré-déterminé de points de mesure de potentiel obtenus. Le calcul réalisé à l'étape c) i.e. le traitement de données utilisé à l'étape c) génère une réponse à n dimensions correspondant au profil de la dérivée de la différence de potentiel.
Il est également possible de générer une réponse à n dimensions correspondant au profil de la différence de potentiel (ou profil du potentiel), dans le cadre du premier mode de réalisation tel que précédemment défini.
A partir de cette réponse à n dimensions, il est possible d'extraire un profil normalisé en utilisant des méthodes telles que PCA (pour « PluriComponent Analysis » ou analyse en composantes principales), MDS (pour « MultiDimensional Scaling » i.e. positionnement multidimensionnel) et réseaux neuronaux ou transformée de Fourier pour obtenir une dimensionnalité réduite.
En d'autres termes, le procédé selon l'invention comprend une étape supplémentaire consistant à obtenir un profil normalisé de la dérivée du potentiel à partir du profil de la dérivée obtenu à l'étape c).
Dans le cadre du premier mode de réalisation tel que précédemment défini, le procédé selon l'invention peut également comprendre une étape supplémentaire consistant à obtenir un profil normalisé du potentiel à partir du profil électrochimique obtenu à l'étape b).
Dans le cadre du premier mode de réalisation tel que précédemment défini, la détection de la présence ou non de micro-organismes dans l'échantillon peut se faire en comparant le profil du potentiel ou éventuellement le profil normalisé du potentiel avec le profil du potentiel ou éventuellement le profil normalisé du potentiel obtenu avec un contrôle négatif i.e. dénué de micro-organismes et dans les mêmes conditions opératoires et notamment la ou les même(s) électrode(s) de travail, la même électrode de référence et le même milieu de culture. Dans le cadre du second mode de réalisation tel que précédemment défini, la détection de la présence ou non de micro-organismes dans l'échantillon peut se faire en comparant le profil de la dérivée du potentiel ou éventuellement le profil normalisé de la dérivée du potentiel avec le profil de la dérivée du potentiel ou éventuellement le profil normalisé de la dérivée du potentiel obtenu avec un contrôle négatif i.e. dénué de micro-organismes et dans les mêmes conditions opératoires et notamment la ou les même(s) électrode(s) de travail, la même électrode de référence et le même milieu de culture.
Dans le cadre du premier mode de réalisation tel que précédemment défini, l'identification d'un micro-organisme particulier peut se faire en comparant le profil du potentiel ou éventuellement le profil normalisé du potentiel avec différents profils du potentiel ou éventuellement différents profils normalisés du potentiel obtenu, chacun, avec un micro-organisme connu et dans les mêmes conditions opératoires et notamment la ou les même(s) électrode(s) de travail, la même électrode de référence et le même milieu de culture.
Dans le cadre du second mode de réalisation tel que précédemment défini, l'identification d'un micro-organisme particulier peut se faire en comparant le profil de la dérivée du potentiel ou éventuellement le profil normalisé de la dérivée du potentiel avec différents profils de la dérivée du potentiel ou éventuellement différents profils normalisés de la dérivée du potentiel obtenu, chacun, avec un micro-organisme connu et dans les mêmes conditions opératoires et notamment la ou les même(s) électrode(s) de travail, la même électrode de référence et le même milieu de culture.
La présente invention concerne également un système pour détecter et identifier un micro-organisme contenu dans un échantillon susceptible d'être mis en œuvre durant le procédé tel que précédemment défini comprenant i) un dispositif configuré pour la culture cellulaire en milieu liquide comprenant au moins une électrode de mesure et une électrode de référence, ii) une unité de mesure de la différence de potentiel entre la ou les électrode(s) de mesure et l'électrode de référence et configurée pour mesurer la différence de potentiel, en continu et/ou à une pluralité d'instants temporels, iii) une unité électronique d'acquisition de la mesure de la différence de potentiel, reliée à l'unité de mesure du potentiel, iv) une unité d'alimentation électrique pour alimenter l'unité électronique d'acquisition, et v) une unité de traitement reliée à l'unité électronique d'acquisition et configurée pour traiter la mesure de la différence de potentiel et éventuellement calculer, à partir de cette dernière, la dérivée de la différence de potentiel et comportant un module de détection et d'identification d'un micro-organisme par analyse de la différence de potentiel ou éventuellement par analyse de la dérivée de la différence de potentiel.
Dans un mode de réalisation particulier, l'unité de traitement est configurée pour traiter les points de mesure de la différence de potentiel et calculer, à partir de ces derniers, la dérivée de la différence de potentiel et/ou configurée pour traiter la mesure continue de la différence de potentiel et calculer, à partir de cette dernière, la dérivée de la différence de potentiel.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
La Figure 1 présente les courbes potentiométriques obtenues dans du sang humain après inoculation, à t=0, de 38 cfu (pour « colony-forming units » ou unités formant des colonies) de Escherichia colï - ATCC 8739 (PANI = polyaniline / IrOx = oxyde d'iridium / P2 = encre SunChemical Gwent C2070424P2 / BQ. = encre Dupont BQ242).
La Figure 2 présente les courbes potentiométriques obtenues dans du sang humain en absence de tout micro-organisme (PANI = polyaniline / IrOx = oxyde d'iridium / P2 = encre SunChemical Gwent C2070424P2 / BQ = encre Dupont BQ242). La Figure 3 présente les dérivées lissées du potentiel de l'électrode à base de polyaniline, obtenues dans du sang humain après croissance de différentes bactéries et pour un contrôle négatif.
La Figure 4 présente les dérivées lissées du potentiel de l'électrode à base de polyaniline, obtenues dans du sang humain après croissance de toutes les bactéries testées, temps normalisé pour centrer les maximums.
La Figure 5 présente l'espace 3D permettant l'orientation de l'identification de la bactériémie à partir des dérivées de potentiel obtenues.
La Figure 6 présente l'espace 2D permettant l'orientation de l'identification de la bactériémie à partir des dérivées de potentiel obtenues.
La Figure 7 présente le module en fonction de la fréquence, calculé à partir de la transformée de Fourier de la dérivée lissée du potentiel de l'électrode à base de polyaniline, obtenues dans du sang humain après croissance de toutes les bactéries testées.
La Figure 8 présente le taux de typage Gram correct (%) par rapport au temps d'incubation supplémentaire après la positivité de la culture à partir des dérivées de potentiel obtenues.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS
I. Fabrication du dispositif mis en œuyre.
Afin d'obtenir plusieurs signaux électrochimiques et donc plusieurs signatures électrochimiques pour chaque pathogène, plusieurs matériaux d'électrodes ont été utilisés.
Le dispositif de mesure est une plateforme PCB (pour « Printing Circuit Board »), avec 10 électrodes en or : 8 électrodes de travail et une électrode de référence (. Les matériaux, sous forme d'encre, sont déposés sur l'or puis séchés à l'étuve, à 80°C, pendant 2 h. Le dispositif de mesure peut éventuellement comprendre une contre- électrode comme une contre-électrode en une encre carbone commerciale (Dupont BQ.242). 1.1. Electrodes de travail.
Chaque électrode est réalisée en double sur la plateforme afin de s'affranchir d'éventuels problèmes sur un dépôt. Il y a donc 4 encres différentes : i) la polyaniline (PANI), dopée avec de l'acide dodecylbenzènesulfonique (DBSA) (encre Pani -DBSA de Rescoll) ; ii) l'oxyde d'iridium (IrOx), oxyde métallique, intégré dans une encre carbone (Dupont BQ.242) ; iii) la SunChemical Gwent C2070424P2, encre carbone commerciale avec du bleu de Prusse (Fe(lll) ferrocyanure); et iv) l'encre carbone (Dupont BQ.242) commerciale.
Les encres PANI et IrOx ont une sensibilité connue et stable aux variations de pH tandis que la SunChemical Gwent C2070424P2 et la Dupont BQ242 sont choisies pour la détection d'autres réactions chimiques au sein du milieu.
Chaque électrode de travail possède une sous-couche d'encre carbone Dupont BQ242 afin d'améliorer la résistance mécanique du dépôt.
1.2. Electrode de référence.
Sur l'électrode en or prévue à cet effet, une sous-couche d'encre carbone Dupont BQ242 puis une couche d'encre Ag/AgCI sont déposées. L'encre Ag/AgCI est couramment utilisée en tant que matériau pour pseudo-électrode de référence.
Cette électrode étant particulièrement sensible au stress oxydatif induit par la méthode de stérilisation utilisée (l'autoclave), elle est également protégée par une membrane de polyuréthane qui est laissée à sécher pendant 24 h, à température ambiante, après dépôt.
1.3. Fabrication du flacon.
Une fois la plateforme préparée comme expliqué ci-dessus, elle est intégrée dans un flacon en polypropylène Azlon'. La fente utilisée pour faire passer la connectique à l'extérieur du flacon est étanchéifié par trois méthodes successives : - ajout de colle cyanoacrylate LOCTITE® 406™, après application d'un activateur,
- ajout de colle époxy RS PRO à prise rapide, et
- masquage des joints de colle par du ruban adhésif en Kapton ’ .
Grâce à ces précautions, le flacon est totalement étanche et des expériences sans risque de contamination sont possibles.
II. Préparation de l'expérience.
11.1. Stérilisation préalable.
Une fois le flacon rempli d'environ 30 mL de milieu de culture BACT/ALERT®, il est autoclavé dans un autoclave Tuttnauer 2540 EL par un cycle « Liquid ». Il subit donc une augmentation de température jusqu'à un plateau à 121°C pendant 15 min. Cette méthode permet de s'assurer de la stérilité des électrodes et du milieu de culture.
11.2. Protocole d'ensemencement.
Sous Poste de Sécurité Microbiologique (PSM), 10 mL de sang sont ajoutés dans le flacon. Si l'expérience choisie est un négatif (sans bactérie) alors la mesure est lancée.
Sinon, le flacon est ensemencé avec une certaine quantité de bactéries suivant le protocole expliqué ci-dessous, toutes les manipulations se déroulant sous PSM avec les mesures de sécurité en vigueur.
Des colonies bactériennes sont ajoutées dans un flacon rempli de 3 mL de diluant pharmaceutique (Diluant pharmacopée européenne - tube 9 mL, VWR AX011144). La turbidité de ce mélange est régulièrement mesurée par un turbidimètre afin d'atteindre une valeur de 0,5 McFarland.
L'ajout des colonies s'effectue à l'aide d'une oese (ou anse d'inoculation) à partir d'une culture sur boîte de Petri ayant été préparée puis placée à 37°C pendant 24 h. Une fois la valeur de 0,5 McFarland atteinte, une dilution en cascade est effectuée dans du diluant pharmaceutique jusqu'à atteindre la concentration bactérienne théorique recherchée.
Un volume de 0,4 mL de cette dernière dilution est prélevé puis ajouté au flacon de mesure préalablement rempli avec 30 mL de milieu de culture BACT/ALERT et 10 mL de sang. Il s'agit donc d'un ensemencement au l/100ème.
II.3. Protocole de comptage.
Afin de s'assurer de la quantité réelle inoculée à t = 0s dans le dispositif, des numérations sur boîtes sont réalisées. Pour cela, un volume de 0,1 mL d'une dilution est prélevé puis étalé sur boîte de Petri au râteau.
Cette numération est effectuée sur les deux dernières dilutions, en triplicat afin de pouvoir faire une moyenne.
III. La méthode de mesure.
La méthode de mesure électrochimique utilisée est la potentiométrie c'est-à-dire une différence de potentiel entre une électrode de travail et une électrode de référence dont le potentiel ne varie pas dans le temps.
Le dispositif étant composé de 8 électrodes de travail, la mesure est multiplexée : toutes les 5 minutes, le potentiel de chaque électrode est enregistré pendant 0,1s.
Cette méthode permet d'obtenir 8 courbes de potentiel en fonction du temps. L'expérience a été répétée avec plusieurs bactéries différentes, plusieurs quantités initiales et même sans aucune bactérie afin d'obtenir des négatifs renseignant sur la stabilité de la mesure.
La Figure 1 présente les courbes potentiométriques obtenues après avoir inoculé, à t = 0, du sang humain avec 38 cfu de Escherichia coli - ATCC 8739. On observe 2 profils caractéristiques de potentiel, un profil « polyaniline » où le potentiel augmente puis diminue lentement, et un profil « encre carbonée » où le profil chute plus ou moins brusquement. Il est clair, au vue des valeurs mesurées, que ce n'est pas la seule variation du pH du milieu de mesure qui est détectée mais d'autres réactions électrochimiques, probablement dues à la sécrétion de métabolites redox.
IV. L'exploitation des signaux.
Les milieux biologiques comme le sang utilisé n'étant pas inerte, les électrodes enregistrent des variations de potentiel même sans la présence de bactéries.
Pour un contrôle négatif de 5 jours qui correspond au temps standard, en milieu hospitalier, pour décréter la non présence de bactéries, on observe une dérive lente du potentiel pour toutes les électrodes (voir Figure 2). Ces variations sont très faibles comparées aux expériences avec bactéries.
Afin d'observer plus nettement le début des variations de potentiel dans les cas de bactériémies, la dérivée du potentiel lissée sur 5 points (moyenne glissante sur 5 points) pour chaque électrode peut être utilisée. Ainsi, on observe la vitesse de modification du potentiel, beaucoup plus parlante et lisible que les courbes potentiométriques brutes.
Avantageusement, la dérivée lissée du potentiel n'est regardée qu'à partir de 4h d'enregistrement. En effet, les bactéries ont un temps de latence incompressible pendant lequel toute détection est inenvisageable car la croissance bactérienne n'a pas encore commencé.
Les courbes présentées à la Figure 3 sont donc des dérivées (lissées sur 5 points) du potentiel, à partir de t = 4h. Comme illustré dans cette figure, la détection est nettement visible et il est possible de calculer un temps de détection.
De plus, ici avec l'électrode de polyaniline, on remarque un profil caractéristique de la courbe en fonction de la bactérie détectée. Cette différence de profil étant répétable, il est envisageable de l'utiliser pour orienter l'identification de la bactériémie en parallèle de sa détection.
Les différences de profil de courbe sont visibles sur toutes les électrodes mais la polyaniline semble la plus adaptée pour l'identification, les différences étant plus évidentes. En revanche, la détection est nette pour toutes les électrodes, voire même plus rapide pour les électrodes à base d'encre carbone : oxyde d'iridium, SunChemical Gwent C2070424P2 et Dupont BQ.242.
V. Création d'un descripteur. Un descripteur à partir des différentes courbes mesurées sur des électrodes de polyaniline a été créé. Il est cependant tout à fait envisageable de créer un descripteur pour chaque électrode.
Ce descripteur permet de déterminer l'espèce bactérienne en fonction du profil de la courbe de la dérivée lissée du potentiel. Pour ce faire, on utilise une base de données obtenue à partir d'expériences réalisées sur sang humain avec différentes bactéries. Le détail de ces expériences est fourni dans le Tableau 1 ci-après.
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Tableau 1
Pour chaque expérience, on a deux signaux de polyaniline car il y a deux électrodes de polyaniline par dispositif. Cela représente donc un total de 36 dérivées lissées du potentiel en fonction du temps.
On commence par supprimer la dépendance au temps des courbes. Par translation, les heures de détection sont placées au même temps (cf Figure 4). On obtient donc, pour chaque courbe, un certain nombre de points (1 point toutes les 5 minutes de 20h à 25h sur la Figure 4).
A partir de ces données, on peut utiliser le logiciel Tanagra afin d'effectuer une analyse en composantes principales (PCA) non supervisée. Cette analyse permet de représenter les différents points dans un espace en 3D (Figure 5) ou 2D (Figure 6).
On observe, dans la Figure 5, des zones bien distinctes pour chaque groupement bactérien, confirmant la pertinence de ce descripteur quant à son utilisation pour orienter l'identification du pathogène détecté.
Avec une telle base de données à compléter avec d'autres bactéries, il est possible de discriminer les bactéries Gram+ des bactéries Gram-, et envisageable d'identifier l'espèce bactérienne.
Afin de réduire le nombre de dimension du vecteur, il est également possible d'appliquer une transformée de Fourier à chaque courbe présentée Figure 4. Ainsi, on obtient, pour chaque expérience, 17 données correspondant aux 17 fréquences d'intérêt entre 0,1 et 2 Hertz comme montré Figure 7.
On observe une différence assez nette entre les différents groupements de bactéries : E.coli / Autres entérobactéries (KA31, EC8 et CF7) / S.epidermidis.
Grâce à ces données, il est possible de faire de l'apprentissage supervisé (ou « support vector machine ») afin d'obtenir un indice de confiance quant à la détermination du Gram de la bactérie en fonction du temps après la détection (Figure 8).
Le procédé selon l'invention permet donc de déterminer le Gram de la bactérie sans aucune autre manipulation ni aucun produit, contrairement à la réalité hospitalière où la coloration de Gram se fait au microscope après ajout de produits chimiques. Trente minutes après détection, il existe une précision de 82%, 2 h après détection, 90% de précision et, 3 h après détection, 99% de précision. Plus on obtient d'informations, plus il est envisageable de préciser la nature du pathogène détecté.
Il est possible de n'utiliser que la différence de potentiel sans passer par la dérivée de potentiel et de reproduire le même traitement de données.
Références bibliographiques
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[3] Demande internationale WO 2021/032654 Al au nom du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives, publiée le 25 février 2021.

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé pour détecter et identifier un micro-organisme contenu dans un échantillon comprenant les étapes consistant à a) placer l'échantillon, dans un milieu de culture liquide, en présence d'au moins une électrode de mesure et d'une électrode de référence et dans des conditions adaptées à la croissance des micro-organismes, b) mesurer, au cours du temps, la différence de potentiel entre ladite au moins une électrode de mesure et l'électrode de référence, c) éventuellement calculer la dérivée de la différence de potentiel à partir de la mesure effectuée à l'étape b) moyennant quoi le profil de la dérivée du potentiel est obtenu, et d) détecter et identifier un micro-organisme contenu dans ledit échantillon soit à partir du profil du potentiel obtenu à l'étape b), soit à partir du profil obtenu à l'étape c).
2) Procédé selon la revendication 1, ledit procédé comprenant les étapes consistant à a) placer l'échantillon, dans un milieu de culture liquide, en présence d'au moins une électrode de mesure et d'une électrode de référence et dans des conditions adaptées à la croissance des micro-organismes, b) mesurer, au cours du temps, la différence de potentiel entre ladite au moins une électrode de mesure et l'électrode de référence, c) calculer la dérivée de la différence de potentiel à partir de la mesure effectuée à l'étape b) moyennant quoi le profil de la dérivée du potentiel est obtenu, et d) détecter et identifier un micro-organisme contenu dans ledit échantillon à partir du profil obtenu à l'étape c). 3) Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit échantillon est choisi dans le groupe constitué par un fluide biologique ; de l'eau comme, par exemple, de l'eau filtrée de grade stérile notamment utilisée dans les installations et la production médicale, de l'eau souterraine, de l'eau de source ou de l'eau de surface ; un prélèvement à partir d'un effluent industriel liquide ; un prélèvement provenant d'une filtration d'air ; et un prélèvement sur un objet.
4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit échantillon est du sang.
5) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit micro-organisme est choisi dans le groupe constitué par les microorganismes procaryotes tels que les archées ou les bactéries Gram+ ou Gram-, les microorganismes eucaryotes comme les levures et autres champignons microscopiques et les protistes comme les algues ou protozoaires.
6) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ladite au moins une électrode de mesure est choisie dans le groupe constitué par une électrode massive en métal, une électrode de verre, une électrode en carbone vitreux, une électrode réalisée sous forme d'un dépôt d'une encre conductrice et une électrode réalisée sous forme d'un électrodépôt d'un élément conducteur.
7) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ladite électrode de référence est réalisée sous forme d'un dépôt d'une encre Ag/AgCI recouverte d'une couche de polymère.
8) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ladite mesure de la différence de potentiel lors de l'étape b) se fait de façon continue. 9) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que ladite mesure de la différence de potentiel lors de l'étape b) se fait de façon discontinue, ladite étape b) consistant à mesurer la différence de potentiel entre ladite au moins une électrode de mesure et ladite électrode de référence à une pluralité d'instants temporels moyennant quoi des points de mesure de potentiel sont obtenus.
10) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ledit milieu de culture est soumis à une agitation durant lesdites étapes a) et/ou b).
11) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ledit procédé comprend une étape supplémentaire consistant à obtenir un profil normalisé du potentiel à partir du profil du potentiel obtenu à l'étape b) ou un profil normalisé de la dérivée du potentiel à partir du profil de la dérivée obtenu à l'étape c).
12) Système pour détecter et identifier un micro-organisme contenu dans un échantillon susceptible d'être mis en œuvre durant le procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 11 comprenant i) un dispositif configuré pour la culture cellulaire en milieu liquide comprenant au moins une électrode de mesure et une électrode de référence, ii) une unité de mesure de la différence de potentiel entre ladite au moins une électrode de mesure et ladite électrode de référence et configurée pour mesurer la différence de potentiel, en continu et/ou à une pluralité d'instants temporels, iii) une unité électronique d'acquisition de la mesure de la différence de potentiel, reliée à l'unité de mesure du potentiel, iv) une unité d'alimentation électrique pour alimenter l'unité électronique d'acquisition, et v) une unité de traitement reliée à l'unité électronique d'acquisition et configurée pour traiter la mesure de la différence de potentiel et éventuellement calculer, à partir de cette dernière, la dérivée de la différence de potentiel et comportant un module de détection et d'identification d'un micro-organisme par analyse de la différence de potentiel ou par analyse de la dérivée de la différence de potentiel.
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