DE3149117C2

DE3149117C2 -

Info

Publication number: DE3149117C2
Application number: DE19813149117
Authority: DE
Inventors: Abdul Razak Dipl.-Ing. Dr. 3400 Goettingen De Weiss
Original assignee: Sartorius AG
Current assignee: Sartorius AG
Priority date: 1981-12-11
Filing date: 1981-12-11
Publication date: 1988-06-23
Also published as: DE3149117A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, eine dazu geeignete Vorrichtung und die Verwendung dieser Vorrichtung zur Vorbereitung der qualitativen und quantitativen Bestimmung von bakteriellen Endotoxinen (Pyrogenen) in wäßrigen Lösungen, insbesondere zum Nachweis von Pyrogenen bei der Qualitätskontrolle von Ausgangsmate rialien, Vor- und Zwischenprodukten, bei der Herstellung von Injektions- und Infusionslösungen und bei der Über prüfung von Arzneimitteln, bei denen die zu prüfende Probe dem sogenannten Limulus-Amoebozyten-Lysat-Test (LAL-Test) unterzogen wird.

Bei der Analyse medizinischer Produkte zur Festlegung ihrer Qualität sind zahlreiche Tests notwendig. Mehrere dieser Tests werden von Produktbegleitstoffen mehr oder weniger beeinflußt. Der Pyrogen-Test (LAL-Test) z. B. ist einer der wichtigsten dieser Tests; er wird durch verschiedene niedermolekulare Verbindungen gestört. Diese sind z. B. Salze, Antibiotika, Nukleotide, Peptide und andere (siehe auch Gebrauchsinformation verschiedener LAL-Hersteller bzw. Vertreiber. Es ist bereits bekannt (US-PS 39 15 808 und DE-OS 26 01 160), den Nachweis störende Proteine durch Fällung zu entfernen bzw. die nachzuweisenden Endotoxine durch Adsorption an Plastikpolymeren zu immobilisieren. Diese Methoden sind jedoch nicht universell einsetzbar und durch die Verwendung verschiedenartiger Reagenzien und Mittel für den praktischen Gebrauch zu kompliziert.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, mit ein fachen Mitteln ein Verfahren und eine dazugehörige Vor richtung zur Durchführung des Verfahrens zu schaffen, um mit Hilfe der an sich bewährten LAL-Test-Technik auch solche Proben testen zu können, welche den LAL-Test störende und verfälschende Bestandteile aufweisen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß in verfahrensmäßiger Hinsicht durch die im Anspruch 1 und in vorrichtungsmäßiger Hinsicht durch die im Anspruch 6 angegebenen Merkmale gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet.

Eine zweckmäßige Verwendung der Vorrichtung ist im Anspruch 11 beschrieben.

Der Erfindungsgedanke ist anhand der Zeichnung verdeutlicht. Dabei zeigen

Fig. 1 und 2 verschiedene Ausführungsformen der Proben behälter und

Fig. 3 in schematischer Darstellung eine Gesamt vorrichtung für Reihenuntersuchungen.

Der Probenbehälter 1 a gemäß Fig. 1 besteht aus Kunststoff. Das mit Füllstandsmarkierungen 3 versehene Gehäuseoberteil hat ein Fassungsvermögen von ca. 0,5 - 10 ml und einen Einlaß 2 mit einem Gewinde. Das Gehäuseoberteil endet in einem Gewindekragen 4. Zwischen dem Gehäuseunterteil 8 mit Innengewinde und Auslaß 9 mit Verschlußstopfen 20 ist eine Filterunterstützung 7, der Ultrafilter 6 und eine O-Ring- Dichtung 5 vorgesehen. Oberteil und Unterteil 8 werden gegeneinander verschraubt, so daß die Ultrafiltrations membran 6 leckdicht die einlaßseitige und auslaßseitige Kammer voneinander trennt.

Bei dem Probenbehälter 1 b aus Kunststoff gemäß Fig. 2 ist die Filterabstützung integraler Bestandteil des auslaß seitigen Gehäuseteils, wobei die auf der Filterabstützung aufliegende Ultrafiltrationsmembran 6 leckdicht zwischen dem Gehäuseoberteil und Unterteil eingeklemmt bzw. mindestens mit einem der beiden am Außenrand leckdicht verschweißt oder verklebt ist. Der Probenbehälter 1 b gemäß Fig. 2 hat z. B. ein Volumen von 1 bis 5 ml bzw. bis 10 ml.

Die Gesamtvorrichtung gemäß Fig. 3 dient hauptsächlich für Reihenuntersuchungen und besteht aus einer Verteiler leiste 10 mit mehreren absperrbaren Anschlüssen 11 mit Gewinde oder Luer-lok oder Schnellverschluß, welche das Pendant zum Gewinde an den Einlässen 2 der Probenbe hälter 1 a bis 1 b bildet. Über die Leitungen 12, das 3-Wegeventil V und die Leitungen 14, 16 ist die Verteiler leiste 10 mit dem Vorratsbehälter 15 verbunden, welcher zur Aufnahme einer größeren Menge von pyrogenfreier Spül flüssigkeit dient. Der Vorratsbehälter 15 ist ebenso wie die Leitung 16 und das 3-Wegeventil V unter Zwischen schaltung eines Luftfilters 17 über die Leitung 18 mit einer Druckmittelquelle z. B. einer Luftpumpe 19 verbunden. Mit Hilfe des 3-Wegeventils V kann die Druckluftquelle 19 direkt über die Leitung 18, 16, 12 mit der Verteilerleiste verbunden werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt unter Benutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung folgende Verfahrensschritte. Die sterilisierten und pyrogenfreien Probenbehälter gemäß Fig. 1 und/oder 2 werden mit der zu untersuchenden Probe gefüllt. Dabei kann es sich beispielsweise im Produktions wasser, Injektions- und Infusionslösungen, Impfstoffe, Antibiotika, Radiopharmaka, Interferonen, Enzyme oder um biochemische Substanzen für die Diagnostik handeln. Die Füllstandsmarkierungen 3 erleichtern das Abmessen der Probenvolumina. Unter Sterilbedingungen erfolgt das Anschließen der Probenbehälter 1 a bzw. 1 b gemäß Fig. 3 an die Anschlüsse 11 der Verteilerleiste 10. Durch Druckbe aufschlagung über die Leitung bzw. Verbindung 18, 17, 14, 16, 15, 13, V, 12 erfolgt in kürzester Zeit eine Ultrafiltration der Proben in den Probenbehältern, wobei das aus dem Auslaß 9 austretende Filtrat für weitere Untersuchungen aufgefangen oder sofort verworfen wird und die Probe ständig mit der Spülflüssigkeit aus dem Vorratsbehälter 15 verdünnt wird. Die Ultrafiltrationsmembrane 6 in den Pro benbehältern hat dabei eine Porengröße, die vorhandene Pyrogene zurückhält, jedoch im Vergleich dazu niedermole kulare Verbindungen durchläßt. Als Membranen eignen sich dabei alle Membranen, die auf der der Probe zugewandten Seite keine oder möglichst nur eine kleine Adsorption zulassende Oberfläche aufweisen und in der Lage sind Pyrogene zurückzuhalten.

Es ist aber auch grundsätzlich möglich, den zunächst ohne Spülvorgang erzeugten, auf der Ultrafiltrationsmembrane auf der Einlaßseite zurückbleibenden Rückstand mit Hilfe der pyrogenfreien Spülflüssigkeit aus dem Vorratsbehälter 15 über die Leitung 13, 12 und über das 3-Wegeventil V zu beschicken und auf eine für den LAL-Test geeignete Konzentrationsstufe zu bringen. Es ist aber auch möglich, die bis zu einer gewissen Stufe aufkonzentrierte Probe, mit den Reagenzien für die Durchführung des LAL-Tests zu be schicken. Letztere Möglichkeit ist derzeit aufgrund der für den LAL-Test vorgeschriebenen Testmenge (0,1 ml) technisch bei relativ großer Filterfläche nicht möglich und muß daher in einem volumenmäßig sehr viel kleinerem Teströhrchen bzw. in einem Probenbehälter mit möglichst kleiner Filterfläche und kleinem Volumen durchgeführt werden.

Der LAL-Test als solcher ist bekannt und wird nachfolgend nur kurz erwähnt. Für den Nachweis von Pyrogenen wird die nach dem vorbeschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren in einem Probenbehälter gemäß Fig. 2 bzw. in einem Proben behälter noch kleinerer Abmessung und mit noch kleinerer Filterfläche aufbereitete Probe, in diesem Probenbehälter direkt mit Hilfe von Verdünnungen des Standard-Endotoxin angesetzt. Dabei erfolgt ein Zusammengeben der Standard- und Probenlösungen mit dem LAL zur Test-Mischung, Inkubation der Mischung für 60 Min. bei 37°C und schließlich Messung der OD für jede Mischung im Spektralphotometer bei 360 nm.

Für Einzeluntersuchungen ist es selbstverständlich möglich, die Probenbehälter 1 a bis 1 c gemäß Fig. 1 bis 3 auch an eine Druckmittelquelle in Form einer Kolbenspritze zu verbinden und auf diese Weise eine schnelle Ultrafiltration der Probe zu erreichen.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungs gemäße Vorrichtung ist der bisher für einige Bereiche noch nicht zugelassene LAL-Test auch für die Bereiche einsetzbar, die bisher nur dem sogenannten Kaninchentest vorbehalten waren, um Pyrogene in Arzneimitteln oder dergleichen nachzuweisen.

Claims

1. Verfahren zur Vorbereitung der qualitativen und quanti tativen Bestimmung von bakteriellen Endotoxinen (Pyrogenen) in wäßrigen Lösungen, bei dem die zu prüfende Probe dem sogenannten Limulus-Amoebozyten- Lysat-Test (LAL-Test) unterzogen wird, dadurch gekenn zeichnet, daß

- die Probe vor dem eigentlichen LAL-Test durch Ultra filtration von den den LAL-Test störenden und ver fälschenden und im Verhältnis zu den Pyrogenen nie dermolekularen Verbindungen wie Salzen, Antibiotika, Nukleotiden, Peptiden, Alkaloiden,
- mittels eines vorhandene Pyrogene in der wäßrigen Lösung zurückhaltenden und niedermolekulare Verbin dungen durchlassenden Ultrafilters und durch mehr malige Spülung und Aufkonzentrierung befreit wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

- die durch die Ultrafiltration aufkonzentrierte Probe durch pyrogenfreies Verdünnungsmittel auf eine für die Durchführung des LAL-Testes optimierte bzw. vorge schriebene Konzentration gebracht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

- der nach der Ultrafiltration gewonnene Probenrück stand durch pyrogenfreie Verdünnungsmittel auf eine für den LAL-Testes optimierte bzw. vorgeschriebene Konzentration gebracht wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

- der nach der Ultrafiltration gewonnene Probenrück stand durch den LAL-Testes einleitende Reagenzien beschickt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der LAL-Test in einem eine Ultrafiltrationsmembran aufweisenden Probenbehälter durchgeführt wird.

6. Vorrichtung zur Vorbereitung für den LAL-Test geeigneter Proben gemäß Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß

- sie einen Ultrafiltrationsmembran (6) enthaltenen Probenbehälter (1 a, 1 b) in Form einer sterilisierten, pyrogenfreien und einmal verwendbaren Wegwerfeinheit umfaßt,
- die Ultrafiltrationsmembran (6) eine Pyrogene zurückhaltende und niedermolekulare Verbindungen durchlassende Porengröße bzw. definierte Abscheide leistung und minimaler Adsorptionseigenschaften aufweist,
- die Ultrafiltrationsmembran den Probenbehälter (1 a, 1 b) in eine volumen mäßig bestimmte Probenkammer und in eine Filtrat kammer leckdicht trennt und
- beide Kammern einen Einlaß (2) bzw. Auslaß (9) aufweisen.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß

- die einlaßseitige Kammer des Probenbehälters (1 a, 1 b) ein Volumen von 0,5 bis 20 ml aufweist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 6 und 7, dadurch gekenn zeichnet, daß

- der Probenbehälter (1 a, 1 b) einlaßseitig über ein Außengewinde an eine Druckmittelquelle und Spülmittel quelle (18, 15, 10) anschließbar ist.

9. Vorrichtung zur Vorbereitung des LAL-Tests mittels Probenbehälter nach Anspruch 6 bis 8, gekennzeichnet durch

- eine Verteilerleiste (10), welche mehrere Anschlüsse (11 bzw. 12) zum Verbinden mit der Einlaßseite mehrerer Probenbehälter (1 a, 1 b) für die Beschickung mit Druckmittel und pyrogenfreier Spülflüssigkeit und zum Verbinden mit einem Vorratsbehälter (15) für die Spülflüssigkeit und mit einer Druckmittel quelle (18) aufweist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Verteilerleiste (10) ein Wegeventil (V) zugeordnet ist und die Verteilerleiste (10) über das Wegeventil (V) mittels einer Bypassleitung (13) wahlweise mit der Druckmittelquelle (19) oder mit dem Vorratsbehälter (15) verbindbar ist.

11. Verwendung der Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6-8 zum Nachweis von Pyrogenen bei Qualitätskontrollen von Ausgangsmate rialien, Vor- und Zwischenprodukten, bei der Her stellung von Injektions- und Infusionslösungen und bei der Überprüfung von Arzneimitteln, bei dem die zu prüfende Probe dem sogenannten Limulus-Amoebozyten- Lysat-Test (LAL-Test) unterzogen wird.