CN107356462A - 消除福沙匹坦双葡甲胺细菌内毒素检查干扰因素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种消除福沙匹坦双葡甲胺细菌内毒素检查干扰因素的方法,主要利用干扰物质可以通过超滤离心管的滤膜,而内毒素被截留的原理,将干扰物质与内毒素分离,从而在不存在干扰的条件下,准确测定离心管内回收的内毒素。本发明的方法操作过程简单,易于控制,样品中内毒素的回收率高达50%以上。
Description
技术领域
本发明属于医药产品质量控制领域,尤其涉及消除福沙匹坦双葡甲胺细菌内毒素检查干扰因素的方法。
背景技术
细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的一种成分――脂多糖,位于细胞壁的最外层,由O-特异性链、核心多糖、类脂A三部分组成。O-特异性链是由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链,有特异性。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸等组成。类脂A是脂化的葡萄胺二糖,通过焦磷酸酯键组成的一种糖脂化合物,具有致热性,是细菌内毒素的毒性成分。
含内毒素或被内毒素污染的制剂进入人体或其它哺乳动物的循环系统会引起多种变态反应。如高烧、寒战、甚至休克。因此药典对非肠道用药以及医疗器材中内毒素的含量作了严格限定,只有这些产品细菌内毒素检查合格后才能使用。然而由于受到很多生化因素的影响,以及内毒素本身容易被吸附和集聚的特性,有很大部分的药品存在干扰影响检查结果的准确性。因此,消除干扰因素十分必要。
在建立药品细菌内毒素检查方法时通常采用以下方法消除干扰因素,但这些方法都存在这一定缺陷:
1、加热灭活:可以消除样品中蛋白质或酶的干扰,但对非蛋白质或酶的样品,或对热稳定高的干扰因素不起作用。
2、样品稀释:可以通过稀释降低样品溶液的浓度或同时使用高灵敏度鲎试剂消除干扰因素,但由于受最大有效稀释倍数的限制,稀释的办法并不能解决所有的样品干扰问题。
3、调节pH:因样品溶液pH偏高或偏低造成的试验干扰,通过调节pH在6~8,结合稀释和选择高灵敏度鲎试剂可以非常有效消除干扰因素,但对于本身有缓冲作用难以调节的样品溶液,或调节后样品析出,析出物中包裹部分内毒素,造成溶液中内毒素浓度下降的样品不适合。
4、调节金属离子:对二价金属离子有螯合作用的样品,会结合鲎试剂中的钙、镁离子,使鲎试剂灵敏度下降造成干扰,加入二价离子可以增强鲎试剂的灵敏度,过高的二价离子水平会增强内毒素反应。
5、采用特异性鲎试剂:能够解决含有1,3-β-D葡聚糖的样品的增强作用,但无法解决其它鲎试剂反应物质的增强作用。
6、采用重组C因子内毒素定量测定法:反应机理同鲎试剂,无法彻底消除样品的干扰作用。
7、采用赛多利斯UltrasartD20滤器:能够解决分子量小于UltrasartD20滤器截留分子量的物质的干扰,但费用高、操作相对复杂。
福沙匹坦双葡甲胺属于P物质/神经激肽1(NK-1)选择性高亲和性受体阻断剂,主要通过阻断大脑恶心和呕吐信号新颖的作用机制发挥作用,用于预防化疗诱导的恶心和呕吐及术后恶心和呕吐,其化学结构式为1-脱氧-1-(甲基氨基)-D-葡萄糖醇[3-[[(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙氧基]-3-(4-氟苯基)-4-吗啉基]甲基]-2,5-二氢-5-氧代-1H-1,2,4-三唑-1-基]膦酸盐。由于其结构与内毒素的毒性成分类脂A有类似部分,会增强鲎试剂的反应,造成假阳性,因此采用通常消除内毒素检查干扰因素的方法,并不能排除干扰。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明要解决的是提供一种简单高效的消除福沙匹坦双葡甲胺细菌内毒素检查干扰因素的方法,该方法既能消除福沙匹坦双葡甲胺的干扰作用,又能使内毒素的回收率达到药典规定要求。
本发明方法是利用干扰物质分子量一般低于内毒素分子量(50K~500K),干扰物质可以通过超滤离心管的滤膜(截留分子量10K~30K),而内毒素被截留的原理,将干扰物质与内毒素分离,从而在不存在干扰的条件下,准确测定离心管内回收的内毒素的方法。
本发明所述福沙匹坦双葡甲胺细菌内毒素检查干扰因素的消除方法,步骤如下:
(1)将样品溶液1ml~5ml加入超滤离心管(截留分子量10K~30K)中,设定离心机转速2000rpm~6000rpm,对样品溶液离心10min~60min;
(2)向离心后剩有少量溶液的超滤离心管中加入1ml~5ml无细菌内毒素的检查用水,以转速2000rpm~6000rpm,对样品溶液离心10min~60min;
(3)重复步骤(2)1~5次,至样品中的干扰物质被充分洗脱;
(4)最后向离心后剩有少量溶液的超滤离心管中加入25℃~100℃无细菌内毒素的检查用水1ml~5ml,立即在漩涡混合器上混匀至少30秒,从而将超滤离心管内壁及滤膜上的细菌内毒素充分洗脱到检查用水中,得到无干扰因素的检测溶液;
(5)将步骤(4)得到的无干扰因素的检测溶液立即移入无热原的玻璃试管中,做细菌内毒素检查。
上述步骤中所述超滤离心管可根据样品中干扰物质分子量的不同进行选择,常用的有sartorius、Millipore、Pall的超滤离心管,超滤离心管截留分子量优选为10K~30K。
上述步骤中所述超滤离心管进一步优选为sartorius Vivaspin Turbo 4,截留分子量优选为10K。
上述步骤中所述离心机转速可根据样品溶液的浓度不同进行选择,转速优选为2000rpm~4000rpm。
上述步骤中所述离心机转速更进一步优选为2000rpm。
上述步骤(3)中所述重复操作的次数根据每次离心后溶液的剩余量以及溶液中干扰物质的干扰能力进行选择,剩余量多或干扰能力强可以多离心几次,优选2~3次。
上述步骤(1)~(4)中所述样品溶液加入量和检查用水加入量根据超滤离心管的容量选择,优选为1ml~5ml。
上述步骤(1)~(4)中所述样品溶液加入量和检查用水加入量,更进一步优选为Turbo 4超滤离心管加入2ml,Turbo 15超滤离心管加入5ml。
上述步骤(1)~(3)中所述离心时间根据样品溶液的离心快慢选择,离心时间优选为10min~40min。
上述步骤(1)~(3)中所述离心时间更进一步优选为15min~20min。
上述步骤(4)中所述超滤离心管中加入检查用水的温度根据残留样品的性质、超滤离心管管体和滤膜的材质,以及管体和滤膜对内毒素的吸附能力选择,优选为50℃~100℃。
上述步骤(4)中所述超滤离心管中加入检查用水的温度更进一步优选为80℃~100℃。
利用本发明方法,通过超滤离心管的超滤,将福沙匹坦双葡甲胺中的干扰物质与样品中内毒素分离开来,消除了样品对细菌内毒素检查的干扰作用。操作过程简单,易于控制,样品中内毒素的回收率高达50%以上,达到药典规定的细菌内毒素检查方法的要求;可用于滤除样品中分子量小于超滤离心管截留分子量的干扰物质,为消除样品中干扰因素建立细菌内毒素检查方法提供了技术基础。
具体实施方式
以下通过实施例对说明本发明进一步阐述,这些实施例不应作为本发明的限制。
实施例1:使用Pall截留分子量10K超滤离心管消除福沙匹坦双葡甲胺内毒素检查干扰因素的试验
(1)将含有已知浓度标准内毒素的样品溶液1ml加入超滤离心管中,设定离心机转速6000rpm,对样品溶液离心10min;
(2)向离心后剩有少量溶液的超滤离心管中加入1ml无细菌内毒素的检查用水,以转速6000rpm,对样品溶液离心10min;
(3)重复步骤(2)5次,至样品中的干扰物质被充分洗脱;
(4)最后向离心后剩有少量溶液的超滤离心管中加入25℃无细菌内毒素的检查用水1ml,立即在漩涡混合器上混匀至少30秒,回收超滤离心管内壁及滤膜上的细菌内毒素至检查用水中。
经检测,所得溶液的内毒素回收率为50%。
实施例2:使用Millipore截留分子量10K超滤离心管消除福沙匹坦双葡甲胺内毒素检查干扰因素的试验
(1)将含有已知浓度标准内毒素的样品溶液2ml加入超滤离心管中,设定离心机转速4000rpm,对样品溶液离心30min;
(2)向离心后剩有少量溶液的超滤离心管中加入2ml无细菌内毒素的检查用水,以转速4000rpm,对样品溶液离心30min;
(3)重复步骤(2)4次,至样品中的干扰物质被充分洗脱;
(4)最后向离心后剩有少量溶液的超滤离心管中加入25℃无细菌内毒素的检查用水2ml,立即在漩涡混合器上混匀至少30秒,回收超滤离心管内壁及滤膜上的细菌内毒素至检查用水中。
经检测,所得溶液的内毒素回收率为50%。
实施例3:使用sartorius Turbo 4截留分子量10K超滤离心管消除福沙匹坦双葡甲胺内毒素检查干扰因素的试验
(1)将含有已知浓度标准内毒素的样品溶液2ml加入超滤离心管中,设定离心机转速6000rpm,对样品溶液离心10min;
(2)向离心后剩有少量溶液的超滤离心管中加入2ml无细菌内毒素的检查用水,以转速6000rpm,对样品溶液离心10min;
(3)重复步骤(2)1次,至样品中的干扰物质被充分洗脱;
(4)最后向离心后剩有少量溶液的超滤离心管中加入25℃无细菌内毒素的检查用水2ml,立即在漩涡混合器上混匀至少30秒,回收超滤离心管内壁及滤膜上的细菌内毒素至检查用水中。
经检测,所得溶液的内毒素回收率为50%。
实施例4:使用sartorius Turbo 4截留分子量10K超滤离心管消除福沙匹坦双葡甲胺内毒素检查干扰因素的试验
(1)将含有已知浓度标准内毒素的样品溶液2ml加入超滤离心管中,设定离心机转速2000rpm,对样品溶液离心20min;
(2)向离心后剩有少量溶液的超滤离心管中加入2ml无细菌内毒素的检查用水,以转速2000rpm,对样品溶液离心20min;
(3)重复步骤(2)2次,至样品中的干扰物质被充分洗脱;
(4)最后向离心后剩有少量溶液的超滤离心管中加入80℃无细菌内毒素的检查用水2ml,立即在漩涡混合器上混匀至少30秒,回收超滤离心管内壁及滤膜上的细菌内毒素至检查用水中。
(5)将步骤(4)得到的回收溶液立即移入无热原的玻璃试管中,做细菌内毒素检查。
经检测,所得溶液的内毒素回收率为100%。
实施例5:使用sartorius Turbo 4截留分子量10K超滤离心管消除福沙匹坦双葡甲胺内毒素检查干扰因素的试验
(1)将含有已知浓度标准内毒素的样品溶液2ml加入超滤离心管中,设定离心机转速2000rpm,对样品溶液离心15min;
(2)向离心后剩有少量溶液的超滤离心管中加入2ml无细菌内毒素的检查用水,以转速2000rpm,对样品溶液离心15min;
(3)重复步骤(2)2次,至样品中的干扰物质被充分洗脱;
(4)最后向离心后剩有少量溶液的超滤离心管中加入100℃无细菌内毒素的检查用水1ml,立即在漩涡混合器上混匀至少30秒,回收超滤离心管内壁及滤膜上的细菌内毒素至检查用水中。
(5)将步骤(4)得到的回收溶液立即移入无热原的玻璃试管中,做细菌内毒素检查。
经检测,所得溶液的内毒素回收率为100%。
实施例6:使用sartorius Turbo 15截留分子量30K超滤离心管消除福沙匹坦双葡甲胺内毒素检查干扰因素的试验
(1)将含有已知浓度标准内毒素的样品溶液5ml加入超滤离心管中,设定离心机转速5000rpm,对样品溶液离心50min;
(2)向离心后剩有少量溶液的超滤离心管中加入5ml无细菌内毒素的检查用水,以转速5000rpm,对样品溶液离心50min;
(3)重复步骤(2)4次,至样品中的干扰物质被充分洗脱;
(4)最后向离心后剩有少量溶液的超滤离心管中加入50℃无细菌内毒素的检查用水5ml,立即在漩涡混合器上混匀至少30秒,回收超滤离心管内壁及滤膜上的细菌内毒素至检查用水中。
(5)将步骤(4)得到的回收溶液立即移入无热原的玻璃试管中,做细菌内毒素检查。
经检测,所得溶液的内毒素回收率为50%。
Claims (9)
1.一种消除福沙匹坦双葡甲胺细菌内毒素检查干扰因素的方法,包含如下步骤:
(1)将样品溶液1ml~5ml加入超滤离心管中,设定离心机转速2000rpm~6000rpm,对样品溶液离心10min~50min;
(2)向离心后剩有少量溶液的超滤离心管中加入1ml~5ml无细菌内毒素的检查用水,以转速2000rpm~6000rpm,对样品溶液离心10min~50min;
(3)重复步骤(2)2~5次,至样品中的干扰物质被充分洗脱。
(4)最后向离心后剩有少量溶液的超滤离心管中加入25℃~100℃无细菌内毒素的检查用水1ml~5ml,立即在漩涡混合器上混匀至少30秒,从而将超滤离心管内壁及滤膜上的细菌内毒素充分洗脱到检查用水中,得到无干扰因素的检测溶液;
(5)将步骤(4)得到的无干扰因素的检测溶液立即移入无热原的玻璃试管中,做细菌内毒素检查,所得溶液的内毒素回收率达50%以上。
2.根据权利要求1的方法,所述超滤离心管为sartorius、Millipore、Pall的超滤离心管,优选为sartorius Vivaspin Turbo 4,所述超滤离心管截留分子量为10K~30K,优选为10K。
3.根据权利要求1的方法,所述离心机转速优选为2000rpm~4000rpm,进一步优选为2000rpm。
4.根据权利要求1的方法,所述步骤(3)中所述重复操作的次数根据每次离心后溶液的剩余量以及溶液中干扰物质的干扰能力进行选择,剩余量多或干扰能力强可以多离心几次,优选2~3次。
5.根据权利要求1的方法,所述步骤(1)~(4)中所述样品溶液加入量和检查用水加入量为1ml~5ml。
6.根据权利要求1的方法,所述步骤(1)~(3)中所述离心时间为10min~40min,更进一步优选为15min~20min。
7.根据权利要求1的方法,所述步骤(4)中超滤离心管中加入检查用水的温度优选为50℃~100℃,更进一步优选为80℃~100℃。
8.使用sartorius Turbo 4截留分子量10K的超滤离心管消除福沙匹坦双葡甲胺内毒素检查干扰因素的方法,包括:
(1)将含有已知浓度标准内毒素的样品溶液2ml加入超滤离心管中,设定离心机转速2000rpm,对样品溶液离心20min;
(2)向离心后剩有少量溶液的超滤离心管中加入2ml无细菌内毒素的检查用水,以转速2000rpm,对样品溶液离心20min;
(3)重复步骤(2)2次,至样品中的干扰物质被充分洗脱;
(4)最后向离心后剩有少量溶液的超滤离心管中加入80℃无细菌内毒素的检查用水2ml,立即在漩涡混合器上混匀至少30秒,回收超滤离心管内壁及滤膜上的细菌内毒素至检查用水中。
(5)将步骤(4)得到的回收溶液立即移入无热原的玻璃试管中,做细菌内毒素检查。经检测,所得溶液的内毒素回收率为100%。
9.使用sartorius Turbo 4截留分子量10K超滤离心管消除福沙匹坦双葡甲胺内毒素检查干扰因素的方法,包括:
(1)将含有已知浓度标准内毒素的样品溶液2ml加入超滤离心管中,设定离心机转速2000rpm,对样品溶液离心15min;
(2)向离心后剩有少量溶液的超滤离心管中加入2ml无细菌内毒素的检查用水,以转速2000rpm,对样品溶液离心15min;
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