CN104928240A - 一种自体或异体红细胞培养基的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种自体或异体红细胞培养基的制备方法，其包括(1)采集自体或异体静脉血，无菌分离弃去血浆，将得到的红细胞经磷酸盐PBS洗涤，离心分离后，弃上清液，得自体红细胞悬液；(2)取质量比为5％～25％的牛肉浸汁粉、38％～58％的水解酪蛋白、1％～1.5％的淀粉、15％～35％的琼脂混合后，加入磷酸盐PBS缓冲液溶解，调成PH7.4-7.6的水解液，灭菌处理制得水解酪蛋白琼脂；(3)取45℃～55℃的水解酪蛋白琼脂与自体红细胞悬液按体积比5～20：1混合均匀，无菌制备自体红细胞培养基平皿。本发明替代了常规羊血培养基，细菌分离及药物敏感实验快速准确，提高了敏感药物选择的准确度，克服了传统细菌分离速度慢和敏感药物选择效果差等缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于临床细菌分离培养的制备方法，尤其涉及一种用于临床细菌分离的自体或异体红细胞培养基的制备方法。
背景技术
目前，用于临床细菌分离的血培养基多采用羊血培养基以及传统的分离方法，这些方法对于临床如急待选择敏感抗生素的人群往往跟不上临床感染人群细菌分离的要求，而且分离速度太慢，取得的信息常因过时而失去作用，达不到临床理想病原体快速分离鉴定及敏感药物选择的效果，而且常规羊血的来源不足。
上述可知，有必要对现有技术作进一步改进。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种操作流程简单，替代了常规羊血培养基，细菌分离及药物敏感实验快速准确，提高了敏感药物选择的准确度，克服了传统细菌分离速度慢和敏感药物选择效果差等缺陷的自体或异体红细胞培养基的制备方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
上述的一种自体或异体红细胞培养基的制备方法，其包括以下步骤：(1)采集自体或异体静脉血，然后无菌分离弃去血浆，将得到的红细胞，经磷酸盐PBS洗涤，再经离心分离后，再无菌弃去上清液后，得到自体红细胞悬液；(2)取质量比为5％～25％的牛肉浸汁粉、38％～58％的水解酪蛋白、1％～1.5％的淀粉、15％～35％的琼脂混合后，加入磷酸盐PBS缓冲液溶解，调成PH7.4-7.6的水解液，经灭菌处理后，制得水解酪蛋白琼脂；(3)取上述步骤(2)灭菌处理后的水解酪蛋白琼脂并冷却至45℃～55℃，与上述步骤(1)制备好的自体红细胞悬液按体积比5～20：1混合均匀，无菌制备自体红细胞培养基平皿。
所述自体或异体红细胞培养基的制备方法，其中：所述步骤(1)中红细胞是由人机体静脉采集自体或异体静脉血，然后经GMP环境于400-1000r/min无菌分离8～15min后，弃去血浆，得到红细胞。
所述自体或异体红细胞培养基的制备方法，其中：所述步骤(1)中是将得到的红细胞经PH7.4-7.6的磷酸盐PBS洗涤2～3次，依次于500r/min离心至多15min后，弃去上清液后得到自体红细胞悬液。
所述自体或异体红细胞培养基的制备方法，其中：所述步骤(2)是将调成PH7.4-7.6的水解液，经121℃，15磅高压，灭菌处理30min后，制得水解酪蛋白琼脂。
所述自体或异体红细胞培养基的制备方法，其中：所述步骤(2)中加入的磷酸盐PBS缓冲液的量是牛肉浸汁粉、水解酪蛋白、淀粉、琼脂四种组分总重量的20～28倍。
所述自体或异体红细胞培养基的制备方法，其中：所述步骤(3)是在GMP环境下制备无菌自体红细胞培养基平皿。
所述自体或异体红细胞培养基的制备方法，其中：所述制备方法可以得到自体或异体红细胞悬液以及异体A、B、O、AB、ABO混合不同的5种不同的血型红细胞悬液。
有益效果：
本发明自体或异体红细胞培养基的制备方法操作流程简单，替代了常规羊血培养基，细菌分离及药物敏感实验快速准确，克服了传统细菌分离速度慢和敏感药物选择效果差等缺陷，具体优点体现在以下几点：
(1)本发明制备的自体或异体红细胞培养基替代羊血培养基，解决了常规羊血来源不足的问题；
(2)大幅度缩短了细菌分离过程，由原来的18～72小时缩短到10～16小时；
(3)提高了敏感药物选择的准确度。
具体实施方式
本发明自体或异体红细胞培养基的制备方法，具体包括以下步骤：
S010、由人机体静脉采集自体或异体静脉血，然后经GMP环境于400-1000r/min无菌分离8～15min后，弃去血浆，将得到的红细胞，经PH7.4-7.6 的磷酸盐PBS洗涤2～3次，每次500r/min，离心至多8～15min后，再无菌弃去上清液，即得自体红细胞悬液；
S020、取重量比为5％～25％的牛肉浸汁粉、38％～58％的水解酪蛋白、1％～1.5％的淀粉、15％～35％的琼脂混合后，加入磷酸盐PBS缓冲液溶解，调成PH7.4-7.6的水解液，再经121℃，15磅高压下，灭菌处理30min后，制得水解酪蛋白琼脂；
S030、取上述步骤S020灭菌处理后的水解酪蛋白琼脂并冷却至45℃～55℃，与上述步骤S010制备好的自体红细胞悬液按体积比5～20：1混合均匀，在GMP环境下制备无菌自体红细胞培养基平皿。
其中，加入的磷酸盐PBS缓冲液的量是牛肉浸汁粉、水解酪蛋白、淀粉、琼脂四种组分总重量的20～28倍。同时，本发明的制备方法可以得到自体或异体红细胞悬液及异体A、B、O、AB、ABO混合不同的5种不同的血型红细胞悬液。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
本发明实施例1的自体或异体红细胞培养基的制备方法，具体包括以下步骤：
S110、采集患者自体静脉血10ml，无菌移至50ml锥形离心管中，在GMP环境以400-1000r/min离心8～15min后，无菌手法弃去血浆，后以PH7.4的磷酸盐PBS缓冲液洗涤2～3次，以每次500r/min，离心8min，再无菌弃去上清液，即得自体红细胞悬液；
S120、取牛肉浸汁粉5g，水解酪蛋白17.5g，淀粉1.5％，琼脂12.5％并加人PH7.4的磷酸盐PBS1000ml，调PH7.4，再经121℃，15磅高压，灭菌处理30min后，得到水解酪蛋白琼脂；
S130、取100ml已灭菌处理后水解酪蛋白琼脂，冷却至40℃，加入制备好的自体红细胞悬液20ml，缓缓加入顺时方向摇匀即得自体红细胞培养基，按9cm直径，每平皿25ml缓缓倾斜注入制备培养基，制得无菌自体红细胞培养基平皿。
实施例2
本发明实施例2的自体或异体红细胞培养基的制备方法，具体包括以下步骤：
S210、取20ml异体静脉血，无菌移至50ml锥形离心管中，在GMP环境以400-1000r/min离心8～15min后，无菌手法弃去血浆，后以PH7.6的磷酸盐PBS缓冲液洗涤2～3次，每次500r/min，离心8min，再无菌弃去上清液，即得异体红细胞悬液；
S220、取牛肉浸汁粉5g，水解酪蛋白38g，淀粉1g，琼脂15g并加人PH7.6的磷酸盐PBS1600ml，调PH7.6，再经121℃，15磅高压下，灭菌处理30min后，制得水解酪蛋白琼脂；
S230、取100ml已灭菌处理后水解酪蛋白琼脂，冷却至55℃，加入制备好的自体红细胞悬液5ml，缓缓加入顺时方向摇匀即得自体红细胞培养基，按9cm直径，每平皿25ml缓缓倾斜注入制备培养基，制得无菌自体红细胞培养基平皿即可。
实施例3
本发明实施例3的自体或异体红细胞培养基的制备方法，具体包括以下步骤：
S310、取10ml异体静脉血，无菌移至50ml锥形离心管中，在GMP环境以500r/min离心8min后，无菌手法弃去血浆，后以PH7.5的磷酸盐PBS缓冲液洗涤2～3次，每次400-1000r/min，离心8min～15min，再无菌弃去上清液，即得异体红细胞悬液；
S320、取牛肉浸汁粉25g，水解酪蛋白58g，淀粉1.5g，琼脂35g并加人PH7.5的磷酸盐PBS2620ml，调PH7.5,再经121℃，15磅，30分钟灭菌处理后，制得水解酪蛋白琼脂；
S330、取80ml已灭菌处理后水解酪蛋白琼脂，冷却至50℃，加入制备好的自体红细胞悬液8ml，缓缓加入顺时方向摇匀即得自体红细胞培养基，按9cm直径，每平皿25ml缓缓倾斜注入制备培养基，制得无菌自体红细胞培养基平皿即可。
下面是自体或异体红细胞培养基与羊血培养基效果比较：
表1：60例溶血不动杆菌引起泌尿系感染，分泌物直接涂患者自体红细胞培养基及异体A、B、O、AB、ABO血型羊血培养基24小时，细菌生长速度评价。
表1
表2：来自临床的溶血菌自体红细胞培养基上溶血环对比。
表3：选择溶血菌株各30株，直接分离培养16h，测量计算出每个平皿(9cm)1/4区域内，溶血菌产生溶血环宽度及菌落直径比较。
表3
表4：选择标准菌株稀释度为10-5，在自体或异体红细胞各培养基分离培养16h测定菌落平均直径与羊血培养基对照比较。
表4
表5：致病性金黄色葡萄球菌在自体或异体培养基与羊血培养基分离生长速度、培养24h菌落平均直径比较。
表5
表6：标准菌株金黄色葡萄球菌(ATCC25923)在5％、10％自体红细胞平皿16h药敏抑菌环羊血平皿24h药敏抑菌环比较。
表6
表7：197例涂片G—双球菌阳性患者，分泌物标本直接药敏与纯化10-3菌药敏结果比较，自体或异体红细胞培养基与羊血培养基两者符合率达99.95％。
表7
本发明操作流程简单，替代了常规羊血培养基，细菌分离及药物敏感实验快速准确，采用GMP实验室环境实验室分离自体或异体血液，离心弃浆后的红细胞对羊血的替代，达到敏感方法选择及临床快速使用的目的，克服了传统细菌分离速度慢和敏感药物选择效果差等缺陷。
Claims (7)
1.一种自体或异体红细胞培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)采集自体或异体静脉血，然后无菌分离弃去血浆，将得到的红细胞，经磷酸盐PBS洗涤，再经离心分离后，再无菌弃去上清液后，得到自体红细胞悬液；
(2)取质量比为5％～25％的牛肉浸汁粉、38％～58％的水解酪蛋白、1％～1.5％的淀粉、15％～35％的琼脂混合后，加入磷酸盐PBS缓冲液溶解，调成PH7.4-7.6的水解液，经灭菌处理后，制得水解酪蛋白琼脂；
(3)取上述步骤(2)灭菌处理后的水解酪蛋白琼脂并冷却至45℃～55℃，与上述步骤(1)制备好的自体红细胞悬液按体积比5～20：1混合均匀，无菌制备自体红细胞培养基平皿。
2.如权利要求1所述的自体或异体红细胞培养基的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中红细胞是由人机体静脉采集自体或异体静脉血，然后经GMP环境于400-1000r/min无菌分离8～15min后，弃去血浆，得到红细胞。
3.如权利要求1所述的自体或异体红细胞培养基的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中是将得到的红细胞经PH7.4-7.6的磷酸盐PBS洗涤2～3次，依次于500r/min离心至多15min后，弃去上清液后得到自体红细胞悬液。
4.如权利要求1所述的自体或异体红细胞培养基的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)是将调成PH7.4-7.6的水解液，经121℃，15磅高压，灭菌处理30min后，制得水解酪蛋白琼脂。
5.如权利要求1所述的自体或异体红细胞培养基的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中加入的磷酸盐PBS缓冲液的量是牛肉浸汁粉、水解酪蛋白、淀粉、琼脂四种组分总重量的20～28倍。
6.如权利要求1所述的自体或异体红细胞培养基的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)是在GMP环境下制备无菌自体红细胞培养基平皿。
7.如权利要求1所述的自体或异体红细胞培养基的制备方法，其特征在于：所述制备方法可以得到自体或异体红细胞悬液以及异体A、B、O、AB、ABO混合不同的5种不同的血型红细胞悬液。
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