CN1079435C - 一种人红细胞培养基的制备方法 - Google Patents

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一种人红细胞培养基的制备方法，其特征在于水解酪蛋白琼脂15磅30分钟灭菌处理后冷却至45-55℃，与人红细胞液按体积比为5-20∶1混合均匀。该发明代替了常规羊血培养基，克服了传统细菌分离速度慢和敏感药物选择效果差的缺陷。

Description

一种人红细胞培养基的制备方法
本发明涉及一种用于细菌分离培养基的制备方法，尤其是一种用于细菌分离的人红细胞培养基的制备方法。
目前，用于临床细菌分离的培养基多采用羊血培养基以及传统的分离方法，这些方法已不适应临床细菌分离的需要，其分离速度太慢，取得的信息常因过时而失去作用。达不到临床理想病原体快速分离鉴定及敏感药物选择的效果，而且常规羊血来源不足，采用提浆后欲废弃的红细胞对羊血的替代，达到敏感方法选择及废物利用的目的。
本发明的目的在于克服上述已有技术的不足而提供一种细菌分离及药物敏感试验的快速准确的人红细胞培养基的制备方法。
本发明的目的可以通过如下措施来达到水解酪蛋白的琼脂15磅30分钟灭菌处理后冷却至45-55℃与人红细胞按体积比为5-20∶1混合均匀。
本发明的目的还可以通过如下措施来达到，水解酪蛋白琼脂是由4-24％牛肉浸汁粉，38-58％水解酪蛋白，1-15％的淀粉，14-34％的琼脂混合后加入蒸馏水水解而成。加入蒸馏水的量是牛肉浸汁粉、水解酪蛋白、淀粉、琼脂四种组份总重量的20-28倍。水解时调pH＝7.4-7.6。人红细胞液是由人静脉血提取血浆后的红细胞于无菌烧瓶中，以无菌生理盐水洗涤，静置，弃去上清液而成。用该方法可以得到A型红细胞液、B型红细胞液、O型红细胞液、AB型红细胞液以及ABO血型系统四种血红细胞各等量混合悬液。
本发明与已有技术相比具有如下优点：①用该方法制备的人红细胞培养基替代了羊血培养基，解决了常规羊血来源不足的问题。②大大缩短了细菌分离过程，由原来的18-72小时，缩为10-18小时。③提高了敏感药物选择的准确度。
下面是人红细胞培养基与羊血培养基效果比较
表(1)，32例溶血不动杆菌引起感染，分泌物直接用于A、B、O、AB、ABO8种异体培养基16h，生长速度与羊血24h生长速度评价
    培养基时点 A B O AB ABO 羊血平皿
菌落平均直径(mm)评价   2.45生长良好     2.52良好     2.60良好     2.47良好     2.44一般   2.59生长良好
表(2)，来自临床的溶血菌，在自身红细胞培养基上溶血环对比
培养基                              溶血环宽度(mm)
金黄色葡萄球菌   乙型链球菌   肺炎双球菌   甲型链球菌   嗜血杆菌
  5％红细胞培养基   0.44   1.68   0.36   0.22   0.32
  10％红细胞培养基   0.46   1.70   0.39   0.23   0.34
  20％红细胞培养基   0.43   1.66   0.35   0.21   0.31
  羊血培养基   0.45   1.70     0.39   0.23   0.33
表(3)，选择溶血菌株各30株，直接分离培养16h，测量计算出每个平皿1/4区域内，溶血菌产生溶血环宽度及菌落直径比较
    各种菌培养基                                   溶血环宽度(mm)
金黄色葡萄球菌   肺炎双球菌   乙型链球菌   甲型链球菌   淋病态瑟氏菌
     A 0.46(1.14) 0.36(1.12) 1.60(0.57) 0.21(0.43) 0.42(1.45)
     B 0.46(1.13) 0.39(1.14) 1.68(0.57) 0.20(0.45) 0.43(1.47)
     O 0.48(1.14) 0.40(1.13) 1.70(0.58) 0.22(0.48) 0.45(1.51)
     AB 0.47(1.14) 0.38(1.14) 1.69(0.58) 0.20(0.44) 0.42(1.47)
     ABO 0.46(1.14) 0.38(1.15) 1.67(0.57) 0.21(0.44) 0.44(1.49)
     羊血平皿 0.45(1.14) 0.39(1.15) 1.70(0.58) 0.23(0.49) 0.45(1.51)
    **溶血环宽度指菌落边缘至溶血环边缘的距离
表(4)，选择标准菌株稀释度为10-5，在各异体红细胞培养基上分离16h，测定菌落平均直径与羊血平皿对照比较。
    标准菌培养基   ATCC25923    ATCC25922   ATCC27853   平均直径mm    评价
  A型红细菌培养基   1.04     1.32   3.25     1.87 生长良好
  B型红细胞培养基   1.05     1.33   3.30     1.92 生长良好
  O型红细胞培养基   1.05     1.34   3.32     1.93 生长良好
  AB型红细胞培养基   1.038     1.31   3.17     1.906 生长良好
  ABO四型红细胞等量混合培养基 1.045 1.31 3.29 1.915 生长良好
  羊血培养基   1.046     1.335   3.30     1.927 生长良好
表(5)，致病菌金黄色葡萄球菌在各种人血平皿组份分离生长速度，菌落直径与羊血平皿比较
标准菌培养基                     各稀释度菌落平均数(株)
10-1 10-3 10-5 10-7   菌落平均直径(mm) 评价
  A型红细胞培养基 ++ 150 146 100     1.042   生长良好
  B型红细胞培养基 ++ 153 142 97     1.041   生长良好
  O型红细胞培养基 ++ 152 147 96     1.042   生长良好
  AB型红细胞培养基 + 149 143 101     1.040   生长良好
  ABO四型红细胞等 + 150 145 98     1.040   生长良好
    量混合培养基
    羊血培养基 ++ 153 145 99     1.041   生长良好
表(6)，标准菌株金黄色葡萄球菌(ATCC25923)在5％、10％人血平皿16h药敏抑菌环羊血平皿24h药敏抑菌环
    培养基抗菌药物(ug)                          抑菌环直径(mm)
5％红细胞培养基(16h) 10％红细胞培养基(16h)   羊血平皿对照(24h)
  青霉素G(10)     24.2     24.5     24.4
  苯唑青(75)     25.0     25.7     25.4
  红霉素(15)     23.6     25.4     25.3
  林可霉素(2)     25.2     26.6     26.3
  先锋2(15)     26.9     29.3     29.5
  四环素(30)     20.1     20.5     21.2
  丁胺卡那(30)     24.3     25.0     24.7
表(7)，136例、涂片G-双球菌阳性患者，分泌物标本直接药敏与纯化10-3菌药敏结果比较，两者复合率达95％以上。
培养基 直接药敏敏感抑菌环(直径mm) 纯化后药敏感抑菌环(直径mm)   符合率(％)
    异体A型红细菌培养基(25)     23.5     25.2     93.3
    异体B型红细胞培养基(26)     24.2     24.6     98.4
    异体O型红细胞培养基(30)     24.7     23.6     96.5
  异体AB型红细胞培养基(30)     23.6     24.0     98.3
  异体ABO四型红细胞等     24.1     24.7     97.5
  量混合培养基(26)
  羊血培养基(30)     24.5     24.9     98.3
下面详细说明本发明。
采集人静脉血，以无菌手续缓缓称至无菌烧瓶中，以无菌手续提取血浆后剩余红细胞，以无菌生理盐水洗涤2-3次，每次洗涤时采用轻轻旋转的手法，向同一方向摇20-30次，静置后以无菌吸管将上清液弃去，即得人红细胞液。
然后取重量比为4-24％牛肉浸汁粉，38-58％水解酪蛋白，1-15％的淀粉，14-34％的琼脂混合，然后加入重量为牛肉浸汁粉、水解酪蛋白、淀粉、琼脂总重量的20-28倍的蒸馏水调pH＝7.4-7.6，水解液，在15磅条件下30分钟灭菌处理而得水解酪蛋白琼脂。
取灭菌处理后冷却至45-55℃水解酪蛋白琼脂和人红细胞液，其体积比为5-20∶1混合均匀，即得用于细菌分离的人红细胞培养基。
实施例1，采集患者自身静脉血10ml，以无菌手续缓缓移至无菌烧瓶中，以无菌生理盐水洗涤2-3次，每次洗涤时要采用轻轻旋转的手法，向同一方向摇20-30次，静置后以无菌吸管将上清液弃去，即得人红细胞液。
取牛肉浸汁粉5g，水解酪蛋白17.5g，淀粉1.5g，琼脂12.5g，加入1000ml蒸馏水，调pH＝7.4，15磅30分钟灭菌处理的水解酪蛋白琼脂，取已灭菌处理冷至40℃的水解酪蛋白琼脂100ml，加入制备好的人红细胞液20ml，摇匀即得人红细胞培养基，倾制无菌平皿，一般按9cm直径的平皿加25ml培养液。
实施例2，取20ml血库中存3-7天无菌提浆后的血，分离出无菌红细胞，室温下以无菌生理盐水洗涤2-3次，每次洗涤时采取轻轻旋转的手法，向同一方向摇20-30次，勿用力过大，以免溶血，静置后以无菌吸管将上清液弃去，即得人红细胞液。
取牛肉浸汁粉4g，水解酪蛋白38g，淀粉1g，琼脂14g，加入1600ml蒸馏水，调pH＝7.6，15磅30分钟灭菌处理，得水解酪蛋白琼脂，取已灭菌处理冷至55℃的水解酪蛋白琼脂100ml，加入制备好的人红细胞液5ml，缓缓摇匀即得人红细胞培养基，倾制无菌平皿，一般按9cm直径的平皿加25ml培养液即可。
实施例3，取10ml血库中存3-7天无菌提浆后，分离出无菌红细胞，室温下以无菌生理盐水洗涤2-3次，每次洗涤时要采用轻轻旋转的手法，向同一方向摇20-30次，勿用力过大，以免溶血，静置后以无菌吸管将上清液弃去，即得人红细胞液。
取牛肉浸汁粉24g，水解酪蛋白58g，淀粉15g，琼脂34g，加入2620ml蒸馏水，调pH＝7.5，15磅30分钟灭菌处理，得水解酪蛋白琼脂，取已灭菌处理冷至50℃的水解酪蛋白琼脂80ml，加入制备好的人红细胞液8ml，缓缓摇匀即得人红细胞培养基，倾制无菌平皿，一般按9cm直径的平皿加25ml培养液即可。

Claims (2)

1、一种人红细胞培养基的制备方法，其特征在于取重量百分比为4-24％牛肉浸汁粉，38-58％水解酪蛋白，1-15％的淀粉，14-34％的琼脂混合后加入上述四种组分总重量的20-28倍的蒸馏水水解，使PH＝7.4-7.6，得水解略蛋白琼脂，30分钟灭菌处理后冷却至45-55℃，与人红细胞液按体积比为5-20∶1混合均匀。
2、按照权利要求1所述的一种人红细胞培养基的制备方法，其特征在于人红细胞是由人静脉血提取血浆后余红细胞于无菌烧瓶中，以无菌生理盐水洗涤，静置，弃去上清液而成。
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