BR112013015213B1

BR112013015213B1 - Uso de um meio de cultura de células seco granulado

Info

Publication number: BR112013015213B1
Application number: BR112013015213-3A
Authority: BR
Inventors: Michael Howard Rayner-Brandes; Xiaojian (David) Zhao
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2010-12-16
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2021-11-03
Also published as: CN105274047B; EP2652123B1; CN103261404B; MX343113B; ES2565349T3; US20130267027A1; CA2821799C; JP5907988B2; KR101899175B1; MX2013005140A; BR112013015213A2; JP2013545484A; CA2821799A1; WO2012079679A1; US9399757B2; CN103261404A; CN105274047A; EP2652123A1; KR20140032370A

Abstract

meios de cultura de células granuladas a seco a presente invenção refere-se aos meios de cultura de células granuladas a seco que não compreendem as peptonas ou as triptonas, especialmente as formulações dos meios de cultura de células granuladas a seco que suportam o crecimento de mamíferos, e/ou insetos e/ou de células de planta. a presente invenção refere-se ainda a rodução desses meios de cultura de células granuladas a seco e a sua utilização.

Description

[001] A presente invenção refere-se aos meios de cultura de cé lulas seco granulado que não incluam peptonas ou triptonas, especialmente no que diz respeito às formulações de meios de cultura de células seco granulado que suportam o crescimento de mamíferos, e/ou insetos e/ou de células de plantas. A presente invenção refere-se ainda a produção desses meios de cultura de células granuladas a seco e a sua utilização.

Antecedentes da Invenção

[002] Os meios de cultura de célula apoiam e mantêm o cresci mento de células em um ambiente artificial.

[003] Dependendo do tipo de organismo cujo crescimento deve ser suportado, os meios de cultura de células podem conter mais de 10, algumas vezes mais de uma centena de diferentes componentes.

[004] Os meios de cultura necessários para a propagação de cé lulas de mamífero, inseto, ou planta são geralmente muito mais complexos do que os meios mínimos suficientes para suportar o crescimento de bactérias e leveduras.

[005] Os primeiros estudos da cultura de células utilizaram os meios que consistem em componentes indefinidos, tais como plasma, soro, extratos de embriões, outros extratos biológicos não definidos ou peptonas. Um progresso importante foi, portanto, realizado no que diz respeito ao desenvolvimento de meios definidos quimicamente. Os meios definidos quimicamente compreendem geralmente, mas não estão limitados exclusivamente a aminoácidos, vitaminas, íons metálicos, antioxidantes, quelantes, fatores de crescimento, hormônios, tampões, cloretos e muitas outras substâncias conhecidas por aquelas pessoas que são versadas na técnica.

[006] Alguns meios de cultura de célula são oferecidos como lí- quidos aquosos estéreis. A desvantagem dos meios de cultura de células líquidos é a sua vida de prateleira reduzida e as dificuldades para o transporte e armazenamento. Como consequência, muitos meios de cultura de células estão sendo atualmente oferecidos como misturas em pó a seco finamente moídas. Eles são fabricados com a finalidade de dissolver em soluções em água e/ou aquosas e no estado dissolvido são concebidos, frequentemente com outros suplementos, no que diz respeito ao fornecimento de células biológicas com uma base substancial de nutrientes para o crescimento e/ou para a produção de produtos biofarmacêuticos das mesmas referidas células.

[007] A manipulação de pós finamente moídos tem desvantagens significativas. Por exemplo, eles são muito poeirentos para manipular, ainda mais em grandes quantidades, o que pode conduzir a problemas de saúde dos trabalhadores que manuseiam os materiais especialmente se algumas das matérias-primas individuais forem perigosas para a saúde. Mesmo que os componentes individuais não sejam diretamente tóxicos, pode haver problemas de saúde causados aos trabalhadores por altos níveis de poeira no ar respirável por si só e as quantidades de poeira no ar são estritamente reguladas em muitos países devido a este problema. Além disso, a poeira de materiais orgânicos, especialmente a poeira mais fina, pode facilmente resultar em explosões se as quantidades forem excessivas e as medidas advertência não são suficientes para evitar a ignição por meio da faísca.

[008] Além disso, pode ocorrer mediante as condições desvanta josas de transporte, por exemplo, durante as condições de transporte de comprimento, que um ou mais dos componentes individuais mais leves dos meios em pó a seco migram em direção à superfície ou um ou mais componentes mais pesados migram em direção à base da embalagem primária. O resultado desta concentração local mais elevada ou, no centro físico do material a granel, a depleção de determi- nado (s) componente (s) individual (is), pode ser negativa, em muitos aspectos sobre a qualidade do produto dos meios. Além disso, a des- mistura pode ter efeitos muito além do esgotamento físico e da concentração de componentes individuais, por exemplo, nas quantidades de produção da molécula biofarmacêutica alvo por lote ou mais sutilmente na padronização de oligossacarídeo em biofármacos por si mesmos fazendo a qualidade do meio absolutamente crítica para a qualidade biofarmacêutica certa até o paciente.

[009] Outro aspecto quando utiliza-se os meios em pó a seco fi namente moídos é a dificuldade para dissolver o pó fino em soluções aquosas para preparar o meio de cultura de célula aquosa final. É muito difícil molhar um pó finamente moído e dissolvê-lo em um líquido aquoso. Dessa maneira, o manuseamento dos meios em pó e a sua utilização é bastante complicado.

[010] Devido à limitação dos meios em pó a seco para a estabili dade, a mistura e a dissolução, os meios em formato seco são geralmente produzidos sem alguns complementos fundamentais, tais como o carbonato, hidrolisados, fatores de crescimento e outros elementos vestigiais, os quais os utilizadores finais irão complementar quando eles preparam o líquido a partir do meio em pó a seco. A manipulação e a suplementação adicional vai aumentar o potencial de erros muitos custosos e de mão de obra.

[011] Sabe-se que os meios de cultura de células bacterianas em pó podem ser granulados por meio da prensagem do pó a grânulos pequenos. Os resultados são pequenas partículas com vantagens em termos de segurança, manuseio e desempenho. Este procedimento pode ser facilmente realizado por meio de cultura de células bacterianas uma vez que eles compreendem as peptonas ou triptonas ou componentes peptídicos quimicamente mal definidas equivalentes que suportam a aderência dos componentes dos meios através de sua viscosidade inerente.

[012] Os meios de cultura de células de mamífero, e/ou de insetos e/ou de plantas normalmente não contêm peptonas ou seus equivalentes e são, portanto, muito mais difícil de manusear desta maneira.

[013] EUA 6.383.810 B2 por Invitrogen Corporation descreve um método de produção do meio de cultura em pó aglomerado da célula eucariótica. O método compreende molhar um meio de cultura de células em pó a seco com um solvente e depois a res-secagem do meio umedecido no que diz respeito à obtenção de um meio de cultura de células aglomeradas a seco.

[014] Uma grande desvantagem deste procedimento é o fato de os componentes inteiros do meio terem de ser postos em contato com água e os mesmos precisam ser aquecidos com a finalidade de remover a água posteriormente. Isto pode causar efeitos secundários consideráveis das reações entre os componentes do meio ou a destruição ou a modificação dos componentes sensíveis, com um resultado imprevisível na qualidade do meio.

[015] Consequentemente, existe uma clara necessidade para en contrar uma nova forma de meios de cultura de células de mamífero, e/ou de insetos e/ou de plantas que sejam fáceis de manusear e podem ser produzidos sem causar reações de destruição e/ou de efeito colateral entre os componentes do meio.

Breve Descrição da Invenção

[016] Verificou-se também que os meios de cultura de células de mamífero, e/ou insetos e/ou de plantas, livres de peptona livre, quimicamente definidos podem ser produzidos em uma forma granulada por meio da compactação do pó finamente moído da mistura dos componentes do meio a seco. A compactação é alcançada por meio da aglomeração imprensa em prensas de papel. Nenhum aditivo deve ser usado para auxiliar o processo. Os meios de cultura de células secos granulados de acordo com a presente invenção têm uma vida útil longa, são fáceis de manusear e são produzidos sob condições muito suaves para que não ocorram as reações secundárias devido a molhar ou aquecer os componentes do meio durante o processo de fabricação.

[017] Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um méto do para produzir um meio de cultura de célula granulado a seco que não compreende as peptonas ou triptonas por meio dea) proporcionar um meio de cultura de célula sob a forma de um pó misto dos componentes do meio, pelo que o pó misturado não compreende as peptonas ou triptonasb) compactação do referido pó misturado em uma prensa de rolo

[018] Em uma modalidade preferida, o meio de cultura de célu las que é fornecido na etapa a) é um meio de cultura de células de mamíferos.

[019] Em uma modalidade preferida, o meio de cultura de células que é fornecido na etapa a) compreende um ou mais componentes de sacarídeos, um ou mais aminoácidos, em uma ou mais vitaminas, um ou mais sais, um ou mais componentes tampão, e um ou mais cofato- res e um ou mais componentes de ácido nucleico.

[020] Em uma modalidade muito preferida, a etapa b) é realizada por meio deb1) compactar o referido pó misturado em uma prensa de rolob2) reintroduzir todas as partes do meio de cultura de células compactadas obtidas na etapa b1) que têm um tamanho de partícula inferior a 0,2 mm para dentro do meio de cultura de célula sob a forma de um pó misto dos componentes do meio para ser preenchido em uma prensa de rolo.

[021] Em uma modalidade preferida, a capacidade de pressão da prensa de rolo está entre 30 e 80 kN / cm de largura de rolo.

[022] A presente invenção é ainda dirigida a um meio de cultura de células de granulado a seco que não compreendem as triptonas ou as peptonas que podem ser preparadas de acordo com o método de acordo com a presente invenção.Em uma modalidade preferida, mais de 80 % das partículas do meio de cultura de células granuladas tem um tamanho maior do que 0,5 mm.

[023] Em uma modalidade muito preferida, mais de 90 % das par tículas do meio de cultura de células granuladas tem um tamanho maior do que 0,5 mm.

[024] Em uma outra modalidade preferida, o meio de cultura de célula seco granulado que não compreende peptonas ou triptonas é um meio de cultura de células de mamífero quimicamente definido.

[025] Em uma outra modalidade preferida, o meio de cultura de célula seco granulado que não compreende as peptonas ou as tripto- nas compreende um ou mais componentes de sacarídeos, um ou mais aminoácidos, em uma ou mais vitaminas, um ou mais sais, um ou mais componentes tampão, e um ou mais cofatores e um ou mais componentes de ácido nucleico.

[026] A presente invenção é ainda dirigida à utilização de um meio de cultura de células seco granulado que não compreende as peptonas ou as triptonas para a cultura de células de acordo com a presente invenção por meio de:a) dissolver o meio de cultura de célula seco granulado, que não compreende as peptonas ou as triptonas em um solvente com a finalidade de formar um meio líquido de cultura de célulasb) contactar o referido meio de cultura de células líquido com as referidas células a serem cultivadas

[027] Em uma modalidade preferida as referidas células a serem cultivadas são células de mamífero.

[028] Em uma modalidade preferida, o solvente na etapa a) é água.

[029] Além das modalidades e aspectos da presente invenção individuais referidos acima, a presente invenção também pode ser realizada e posta em prática, em cada combinação de duas ou mais das modalidades ou aspectos descritos.

Descrição da Invenção

[030] A Figura 1 mostra uma vista esquemática de um equipamento de compactação a seco adequado para a presente invenção.

[031] A granulação a seco de acordo com a presente invenção cria grânulos ou partículas por meio da compactação dos pós sob pressão - sem a adição de água ou outros solventes. Normalmente, a prensa de rolo, que é usada de acordo com a presente invenção gera também os compactos ou flocos maiores. Estes compactos formados dessa maneira são tipicamente divididos gentilmente, por exemplo, por um crivo vibratório, com a finalidade de produzir as partículas granuladas ((aglomeradas).De acordo com a presente invenção, um pó ou um pó finamente moído é uma composição de partículas, das quais mais de 80 % têm um tamanho de partícula ((Diâmetro)) de menos de 0,2 mm. De preferência, o pó é seco e de fluxo livre. Com a expressão "pó de fluxo livre" entende-se um pó ((feito por meio da fresagem, micrope- letização ou técnica semelhante)), ao qual as partículas não aderirem umas às outras. Todos os pós que apresentam um ângulo de repouso de cerca de 50 graus abaixo mostram tipicamente as propriedades de fluxo adequadas, mas, tal como utilizados na presente invenção, os termos a seco e de fluxo livre, também devem referir-se a aparência bruta do pó - o que significa que o pó parece seco e de fluxo livre .

[032] Um meio de cultura de célula de acordo com a presente invenção é qualquer mistura de componentes, que mantém e/ou suportam o crescimento in vitro de células. O meio de cultura de célula pode compreender todos os componentes necessários com a finalidade de manter e/ou apoiar o crescimento in vitro de células ou apenas alguns componentes de modo a que outros componentes são adicionados de uma maneira separada. Exemplos de meios de cultura de células de acordo com a presente invenção são os meios completos que compreendem todos os componentes necessários com a finalidade de manter e/ou apoiar o crescimento in vitro de células, ou os meios de alimentações ou de suplementos. Em uma modalidade preferida, o meio de cultura de células é um meio completo.

[033] Tipicamente, os meios de cultura de células de acordo com a presente invenção são utilizados com a finalidade de manter e/ou apoiar o crescimento de células em um biorreator.

[034] Um meio de cultura de células de mamífero é uma mistura de componentes que mantêm e/ou apoiam o crescimento in vitro de células de mamíferos. Exemplos de células de mamífero são as células de origem humana ou animal, de preferência as células de CHO, células COS, células VERO I, as células BHK, AK-1, as células SP2 / 0, as células de L5.1, as células de hibridoma ou as células humanas.

[035] As células a serem cultivadas com os meios de comunicação de acordo com a presente invenção podem ser as células normais, as células doentes, as células transformadas, as células mutan- tes, as células somáticas, as células germinais, as células estaminais, as células precursoras ou as células embrionárias, qualquer uma das quais as linhagens de célula podem ser estabelecidas transformadas obtidas a partir de fontes naturais.

[036] Um meio de cultura de células que não compreende as peptonas ou as triptonas é um meio de cultura de células que não contêm quaisquer peptonas ou triptonas ou outros peptídeos produzidos por meio da hidrólise parcial de proteínas.

[037] Em uma modalidade preferida, o meio de cultura de células que não compreendem as peptonas ou as triptonas também não compreendem quaisquer proteínas ou outros polímeros derivados natural- mente como ágar. Em uma modalidade muito preferida, o meio de cultura de células que não compreende as peptonas ou as triptonas é um meio de cultura de células definido quimicamente.

[038] Os meios de cultura de células definidos quimicamente são os meios de cultura de células que não compreendem quaisquer substâncias quimicamente indefinidas. Isso significa que a composição química e a estrutura de todos os produtos químicos utilizados nos meios quimicamente definidos são conhecidos. Os meios quimicamente definidos não contemplam qualquer tecido levedura, animal ou planta, pois eles não compreendem as células alimentadoras, soro, extratos ou digestivos ou outros componentes que possam contribuir as proteínas quimicamente mal definidas para o meio. As estruturas químicas quimicamente indefinidas ou mal definidas,são aquelas cuja composição e estrutura química não é conhecida ou apenas poderiam ser definidas com um enorme esforço experimental - comparável à avaliação da composição química e estrutura de proteínas, como albumina ou caseína.

[039] Em uma modalidade, o meio de cultura de células que não compreende as peptonas ou as triptonas de acordo com a presente invenção contém apenas um ou mais componentes de sacarídeos, um ou mais aminoácidos, em uma ou mais vitaminas, um ou mais sais, de um ou mais componentes tampão, um ou mais cofatores e um ou mais componentes de ácido nucleico.

[040] O tamanho de uma partícula significa o diâmetro do meio da partícula. O diâmetro das partículas é determinado por meio da dispersão de luz a laser em óleo de silicone.

[041] Os componentes de sacarídeo são todos os mono- ou dis- sacarídeos, como a glicose, a galactose, a ribose ou frutose (exemplos de monossacarídeos) ou sacarose, lactose ou maltose (exemplos de dissacarídeos).

[042] Exemplos de aminoácidos de acordo com a presente in venção são os aminoácidos proteinogênicos, especialmente os amino- ácidos essenciais, leucina, isoleucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e valina, bem como os aminoácidos não proteino- gênicos como os D-aminoácidos.

[043] Exemplos de vitaminas são a vitamina A ((retinol, retinal, vários retinóides, e quatro carotenóides)), vitamina B1 ((tiamina)), vitamina B2 ((riboflavina)), vitamina B3 ((niacina, niacinamida)), vitamina B5 (ácido pantotênico), vitamina B6 (Piridoxina, piridoxamina, pirido- xal), Vitamina B7 (biotina), Vitamina B9 (ácido fólico, ácido folínico), vitamina B12 (cianocobalamina, hidroxicobalamina, metilcobalamina), Vitamina C (ácido ascórbico), vitamina D (ergocalciferol, colecalciferol), vitamina E (tocoferóis, tocotrienóis) e vitamina K (filloquinona, mena- quinonas). Os precursores de vitamina também estão incluídos.

[044] Exemplos de sais são os componentes que compreendem os íons inorgânicos, tais como bicarbonato, cálcio, cloreto de magnésio, fosfato de potássio e de sódio ou de elementos vestigiais tais como Co, Cu, C, Fe, Mn, Mo, Ni, Se, Si, Ni, Bi, V e Zn.

[045] Exemplos de tampões são C02 / HC03, HEPES, PIPES, ACES, BES, TES, MOPS e TRIS.

[046] Exemplos de cofatores são os derivados de tiamina, biotina, vitamina C, NAD / NADP, cobalamina, mononucleótido de flavin e derivados, glutationa, nucleotídeos fosfatos de heme e derivados.

[047] Os componentes dos ácidos nucleicos, de acordo com a presente invenção, são as nucleobases, como citosina, guanina, ade- nina, timina ou uracila, tais como os nucleosídeos de citidina, uridina, adenosina, timidina e guanosina, e os nucleotídeos, como monofosfato de adenosina ou difosfato de adenosina ou trifosfato de adenosina .

[048] Um meio de cultura de célula estável é um meio que após armazenagem durante um certo período de tempo mostra pelo menos 80 %, de preferência pelo menos 90 %, de preferência pelo menos 97 %, ainda mais de preferência, a mesma atividade biológica e bioquímica quando comparado com um meio fresco da mesma formulação.

[049] A presente invenção baseia-se na constatação de que tam bém os meios que não incluam as peptonas ou triptonas ou os componentes semelhantes, podem ser fornecidos sob uma forma de granulado a seco. Isso foi muito inesperado, pois até agora o único meio de cultura de células com peptonas ou triptonas poderia ser granulado a seco. Presumiu-se que as propriedades adesivas das peptonas ou das triptonas eram essenciais no que diz respeito à produção de suportes de granulados a seco.

[050] Verificou-se que um procedimento de compactação especi al também permite a produção de suportes de granulados a seco que não compreendem as peptonas ou as triptonas.

[051] O processo de compactação de acordo com a presente in venção é realizado em duas etapas principais.a) proporcionar um meio de cultura de célula sob a forma de um pó misto dos componentes do meiob) compactação do referido pó misturado em uma prensa de rolo

[052] Na etapa a), um pó a seco finamente moído dos componentes do meio é fornecido. Todos os componentes são misturados de modo a que todas as partes da mistura em pó têm quase a mesma composição. A mistura deve ter a mesma qualidade no que diz respeito à sua uniformidade da composição como um meio de cultura de células de pó a seco comercial. Quanto maior a uniformidade da composição, melhor será a qualidade do meio de granulado a seco resultante no que diz respeito ao crescimento de célula homogênea. Os moídos que são adequados para a produção de pós-moídos finos são, por exemplo, moídos de bolas, moídos de pinho, moídos de jato ou moí- dos de peneira de lâmina rotativa. O tamanho das partículas dos pós é normalmente inferior a 500 pm, de preferência inferior a 200 pm.

[053] Para se obter um pó misto dos componentes do meio os componentes podem, por exemplo, ser primeiro misturados e depois finamente moídos ou como uma mistura eles podem ser moídos individualmente ou em subgrupos e combinados e misturados depois.

[054] De preferência, todos os componentes da mistura são secos. Isso significa que, se eles compreendem água, eles só compreendem a água de cristalização, mas não mais do que 5 %, de preferência não mais do que 2 % mais preferido não mais do que 1 % em peso de moléculas de água não ligada ou não coordenada.

[055] Se um ou mais dos componentes da mistura é sensível à oxi dação, a mistura e moagem podem ser realizadas sob um gás protetor inerte.

[056] Na segunda etapa, a etapa b), a mistura em pó é compac tada em uma prensa de rolo.

[057] Uma prensa de rolo, também chamada rolo compactador, é conhecida de uma pessoa versada na técnica. Normalmente uma prensa de rolo compreende dois rolos em contrarrotação, que estão localizados a uma pequena distância de cerca de 0,5 a 3 mm, de preferência 1 a 2 mm ao lado do outro. As prensas de rolo adequadas normalmente têm rolos com uma largura entre 10 cm e 50 cm, resultando na abertura entre o cilindro que tem um comprimento entre 10 cm e 50 cm. No entanto, o tamanho dos cilindros e, portanto, o comprimento do intervalo entre os rolos podem variar dependendo do tamanho da prensa de rolo. Em uma modalidade preferida, a abertura tem um comprimento entre 10 e 5 cm.

[058] O material em pó misturado é aspirado entre os rolos em contrar- rotação e compactado no espaço entre os rolos. A distância entre os rolos e a sua estrutura de superfície tem uma influência sobre o tamanho final e a estrutura das partículas granuladas resultantes.

[059] A superfície dos rolos é de preferência agitada. As agita ções ajudam a fazer a vara em pó com o rolo e o puxe através da imprensa.

[060] A capacidade de pressão da prensa de rolo é geralmente entre 20 e 150 kN / cm de largura do rolo, de preferência, os rolos são pressionados em conjunto com uma força de entre 30 e 80 kN, mais preferido entre 40 e 60 kN.

[061] Se os componentes do meio de cultura de células são mui to sensíveis, o processo de compactação pode ser efetuado sob uma atmosfera protetora de gás inerte. Além disso, os rolos da prensa de rolo são geralmente resfriados com a finalidade de manter uma temperatura constante, uma vez que muitas vezes alguns componentes são sensíveis ao calor e não suportaria a temperatura ligeiramente aumentada, que pode ocorrer devido à compactação.

[062] Em uma modalidade preferida, o meio de cultura de célula compactada que é liberado a partir da prensa de rolo é dimensionado de uma maneira direta. Isto pode ser feito, por exemplo, por meio da peneiração, por exemplo, com uma ou mais peneiras vibratórias. O diâmetro dos furos da peneira depende do tamanho dos grânulos a serem recolhidos. Para o processo de acordo com a presente invenção, um diâmetro típico situa-se entre 0,5 a 5 mm, de preferência cerca de 1 para 3 mm. Especialmente se a granulação a seco na prensa de rolo resulta em flocos compactos ou maiores, de preferência, um moinho de peneira é utilizado com a finalidade de granular os compactos ou os flocos, para os grânulos de tamanho adequado. Um moinho de peneira adequado é o moinho de peneira oscilante, tipo FC 200, Bepex GmbH, com uma dimensão de crivo entre 1 e 3 mm.

[063] As prensas de rolo, que são adequadas para o processo de acordo com a presente invenção, podem, por exemplo, ser adquiridas a partir de Alexanderwerk, Sahut Coreur, Hosokawa ou Fitzpatrick Company.

[064] Como já foi explicado, o tamanho das partículas do meio de cultura de células seco granulado depende da forma do meio compactado que sai da prensa de rolo que é tratada. Se o meio está diretamente coletado a partir da prensa de rolo, o mesmo normalmente compreende compactos ou flocos maiores. Se o meio é peneirado, o tamanho das partículas é determinado por meio do tamanho da peneira. Mas também o manuseamento de embalagens como tipicamente influencia o tamanho médio de partícula como algumas partículas do meio de cultura de células granuladas podem quebrar em pedaços.

[065] Em uma modalidade preferida, após a compactação e a peneiração, mais de 80% das partículas do meio de cultura de células granuladas tem um tamanho maior do que 0,5 mm.

[066] Em uma modalidade muito preferida, mais de 90 % das par tículas do meio de cultura de células granuladas tem um tamanho maior do que 0,5 mm.

[067] Foi constatado que a qualidade do meio de cultura de célu las granuladas de acordo com a presente invenção pode ser ainda melhorada se a fração do material compactado, que é liberado a partir da prensa de rolo, que tem dimensões de partículas menores que 0,5, de preferência menores que 0,2 mm é continuamente reintroduzido na alimentação da prensa de rolo mais uma vez para voltar a ser misturado com a mistura em pó, e para ser repressionado. Isto reduz a fração em pó do meio de cultura de células seco granulado final e, adicionalmente melhora a homogeneidade do produto.

[068] A Figura 1 apresenta uma vista esquemática de uma mon tagem de produção possível. A prensa de rolo é mostrada como rolo R1 e rolo R2. A mistura em pó P1 é alimentada a partir de um reservatório dentro da prensa de rolo. A mistura compactada, que é liberada a partir da prensa de rolo é dimensionada com a peneira S. A fração de produto é removida para posterior tratamento e de embalagem, a fração P2 em pó que tem um tamanho de partícula inferior a 0,2 mm é continuamente reintroduzida na alimentação da prensa de rolo.

[069] Verificou-se que a granulação a seco de acordo com a pre sente invenção pode ser realizada sem a adição de substâncias para aumentar a viscosidade da mistura.

[070] O meio de cultura de células seco granulado resultants pode então ser ainda mais processado. O meio pode ser empacotado e/ou esterilizado. Os recipientes adequados são conhecidos por uma pessoa que seja versada na técnica. Exemplos são sacos, caixas, garrafas, caixas de papelão, formulários embalados a vácuo, etc. A embalagem pode ser realizada antes ou após a esterilização. Preferida é proporção-radiação após a sua embalagem adequada.

[071] Os meios de cultura de células secos granulados de acordo com a presente invenção podem também ser utilizados favoravelmente para a produção de outros tipos de meios compactados como comprimidos ou flocos maiores. Para isso, os meios de cultura de células secos granulados de acordo com a presente invenção são submetidos à compactação em uma prensa adequada, por exemplo, uma prensa de comprimidos. O meio granulado pode ser utilizado como sem a adição de outros componentes ou pode ser misturado com outros componentes, como auxiliares de formação de comprimidos ou misturados ou, mais tarde, revestidos com componentes específicos para, por exemplo, retardar os comprimidos de liberação. Por outro lado, o meio de cultura de célula seco granulado pode ser misturado com os componentes que suportam a rápida dissolução dos comprimidos, tal como bicarbonato de sódio.

[072] Os meios de cultura de células secos granulados que são compactados ou de acordo com o método da presente invenção tipi- camente compreendem pelo menos um ou mais componentes de sa- carídeos, um ou mais aminoácidos, uma ou mais vitaminas e precursores de vitamina, um ou mais sais, um ou mais os componentes do tampão, um ou mais cofatores e um ou mais componentes de ácido nucleico.

[073] Os meios de comunicação podem também compreender os ácidos graxos e/ou derivados de ácidos graxos e/ou ácido plurônico e/ou componentes de superfície ativos do tipo tensoativos não iônicos quimicamente preparados. Um exemplo de um agente tensoativo não iônico adequado são os tensoativos de copolímeros em bloco difunci- onais de terminação em grupos hidroxila primários, por exemplo, disponível sob o nome comercial de Pluronic ® da BASF, Alemanha.

[074] Os meios de granulados a seco de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para os mesmos fins que os meios em pó ou meios líquidos conhecidos na técnica. Eles podem ser, preferencialmente, usados na produção biofarmacêutica como também grandes quantidades de meios granulados podem ser facilmente manipulados, sem as desvantagens discutidas para os meios em pó.

[075] Para utilização em um solvente, de preferência água ((mais particularmente destilada e/ou desionizada ou água para injeção ou água purificada)), ou um tampão aquoso é adicionado aos meios granulados a seco e os componentes são misturados até que o meio seja totalmente dissolvido no solvente.

[076] O solvente também pode compreender a solução salina, ácido solúvel ou os íons de base proporcionando uma proporção de pH de 1,0 a 10. 0, estabilizadores, tensoativos, conservantes, e os álcoois ou outros solventes orgânicos polares.

[077] É também possível adicionar outras substâncias, tais como substâncias tampão para ajustamento do pH, o soro fetal de vitelo, açúcares, etc., para a mistura do meio de cultura de células e o sol- vente. O meio líquido de cultura de células resultante é então posto em contato com as células a serem cultivadas ou mantidas.

[078] Os meios de granulados a seco de acordo com a presente invenção são fáceis de manusear. Em comparação com os meios de comunicação de pó, a quantidade de pó que se forma durante a manipulação dos meios de comunicação é significativamente reduzida.

[079] Os meios de comunicação de acordo com a presente in venção podem ser facilmente dissolvidos em solventes. A reconstituição é rápida, de preferência menos de 30 minutos, mais preferencialmente menos de 15 minutos.

[080] A composição dos meios de granulados a seco de acordo com a presente invenção permanece homogênea, mesmo em caso de agitação ou de vibração durante o transporte.

[081] Além disso, em contraste com os meios granulados úmidos, as condições mais amenas de granulação a seco para permitir o pro-cessamento fácil e direto dos meios compreendem ainda as substâncias sensíveis à calor e/ou à oxidação como por exemplo, vitaminas (vitamina B1), glicose, tiamina, sais de ferro ou componentes compreendendo as pontes dissulfeto.

[082] A presente invenção é ainda ilustrada por meio das seguin tes figuras e exemplos, no entanto, sem ser restrita aos mesmos.

[083] As descrições completas de todas as aplicações, paten tes e publicações citadas acima e abaixo e do correspondente Pedido de Patente Provisório U. S. 61 / 423, 700, depositado em 16 de dezembro de 2010, são incorporados na presente invenção por meio da referência.

Exemplos

[084] Os exemplos seguintes representam as aplicações práticas da presente invenção.

1. Compactação a seco do Meio Eagle Modificado de Dulbecco

[085] O Meio Eagle Modificado de Dulbecco também conhecido como DMEM, é um meio geralmente utilizado para o cultivo de células de animais. Os ingredientes de DMEM são em mg / l:Sais inorgânicos:CaCI2 (sem água) : 200,00Fe (NO3) • 9 H2O : 0,10KCI : 400,00MgSO4 (sem água) : 97,67NaCl : 6400,00NaH2PO4 ■ H2O : 125,00Outros componentes:D-Glicose : 4500,00Fenol : 15,00Natriumpiruvato : 110,00Aminoácidos:L-Arginina HCI : 84,00L-cistina 2HCI : 63,00L-Glutamina : 584,00Glicina : 30,00L-histidina HCI H2O : 42,00L-lsoleucina : 105,00L-Leucina : 105,00L-lisina HCI : 146,00L-metionina : 30,00L-Fenilalanina : 66,00L-Serina : 42,00L-Treonina : 95,00L-Triptofano : 16,00L-Tirosina 2Na ■ 2H2O : 104,33L-Valina : 94,00 Vitaminas:D-Calciumpantotenato : 4,00Cloreto de colina : 4,00Ácido fólico : 4,00i-lnositol : 7,20Niacinamida : 4,00Riboflavina : 0,40Tiamina HCI : 4,00

[086] Todos os ingredientes do meio de DMEM são misturados e moídos em um moinho de pinos para se obter um pó seco, homogêneo. 30 kg do pó são alimentados para uma prensa rolo com as seguintes características:- rolos planos côncavos- A distância entre os rolos: 1,5 milímetro- Duração do intervalo entre os rolos: 10 centímetros- Força da pressão: 50 kN

[087] O material obtido apresenta uma elevada percentagem decompactos maiores. O material resultante é peneirado em um moinho de peneira oscilante, tipo FC 200, Bepex GmbH, com uma dimensão de peneira de 3 mm.

[088] A fração de grânulos com um tamanho (diâmetro) inferior a0,2 milímetro é reintroduzida na prensa de rolo. Obtém-se um meio DMEM granulado a seco com mais do que 75 % dos grânulos com dimensões compreendidas entre 1 e 3 mm.

Claims

1. Uso de um meio de cultura de célula seco granulado que não compreende peptonas ou triptonas preparável por meio dea) proporcionar um meio de cultura de célula compreendendo um ou mais componentes de sacarídeos, um ou mais aminoá- cidos, uma ou mais vitaminas, um ou mais sais, um ou mais componentes de tampão, um ou mais cofatores e um ou mais componentes de ácido nucleico, sob a forma de um pó misto dos componentes do meio, pelo que o meio não compreende peptonas ou triptonasb) compactação do referido pó misto em uma prensa de rolo,caracterizado pelo fato de que a etapa b) é realizada por meio dec) ) compactar o referido pó misturado em uma prensa de rolod) ) reintroduzir todas as partes do meio de cultura de células compactado obtido na etapa b1) que têm um tamanho de partícula inferior a 0,5 mm no meio de cultura de célula sob a forma de um pó misto dos componentes do meio para ser preenchido na prensa de roloem que o referido uso é para cultivo de células por:e) dissolver o meio de cultura de célula seco granulado que não compreende peptonas ou triptonas em um solvente com a finalidade de formar um meio de cultura de células líquidof) contactar o referido meio líquido de cultura de células com as referidas células a serem cultivadas.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura de células seco granulado que não compreende peptonas ou triptonas é um meio de cultura de células de mamíferos.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a capacidade de pressão da prensa de rolo é entre 30 e 80 kN/cm de largura de rolo.

4. Uso de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o tamanho do espaço entre os rolos da prensa de rolo é entre 0,5 e 3 mm.

5. Uso de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de na etapa c), o material obtido a partir da compactação do referido pó misto em uma prensa de rolo é processado em um moinho de peneira.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de mais de 80 % das partículas do meio de cultura de células granuladas ter um tamanho maior do que 0,5 mm.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de mais de 90% das partículas do meio de cultura de células granulado têm um tamanho maior do que 0,5 mm.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de o solvente para dissolver o meio de cultura de célula seco granulado que não compreende peptonas ou tripto- nas para formar um meio de cultura de células líquido é água.